קיבלנו סיוע טכני ממתקן הביופולימרים בבית הספר לרפואה של הרווארד לביואנליזה. עבודה זו נתמכה על ידי מענק המחקר של האגודה הלאומית לטרשת נפוצה RG-1707-28516 (H.L.W. ו- S.L.).

כל השיטות המערבות חיות מחקר המתוארות כאן אושרו על ידי הוועדה המוסדית לטיפול ושימוש בבעלי חיים (IACUC) של בית החולים בריגהם אנד נשים, בית הספר לרפואה של הרווארד.
כל השיטות המערבות את נושאי המחקר בבני אדם המתוארות כאן הן בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי ועדת המחקר האנושית של השותפים.
1. איסוף דגימות צואה
<ol><li>Autoclave או להכין צינור מיקרוצנטריפוגה סטרילי ונטול נוקלאז 2 מ"ל עם מכסה בורג לכל נבדק בעל חיים בניסוי.<ol><li>עבור נבדקים אנושיים, ספק מכשיר איסוף דגימות צואה מתאים, ללא נוקלאז וסטרילי עבור כל נושא.</li>
	</ol></li>
	<li>לאסוף 25-100 מ"ג (כ 1-4 כדורי צואה עבור דגימות צואה עכבר) של דגימות צואה מכל נושא בעל חיים בסביבה סטרילית. הערה: שני כדורי צואה או יותר (~ 50 מ"ג או כבד יותר) מועדפים לקבלת RNA בטוהר הגבוה ביותר.<ol><li>השתמש בכל ציוד המגן האישי (PPE) והחומרים הדרושים, לדוגמה: זוג כפפות מעבדה, תרסיס חיטוי ומגבת נייר סטרילית, כדי לעקר את אזור העבודה, שבו מונח נושא המחקר בבעלי חיים, כדי למנוע זיהום דגימת צואה.<ol><li>עבור נבדקים אנושיים, הנחו כל נבדק/אספן מחקר לאסוף 100-200 מ"ג של דגימות צואה בסביבה סטרילית ככל האפשר. השתמש בפעולה סטרילית סטנדרטית והימנע מזיהום דגימת הצואה.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
	<li>אסוף דגימות צואה מכל נושא בעל חיים ישירות לתוך צינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מכסה בורג מבלי לגעת במשטחים אחרים כדי למנוע זיהום.<ol><li>עבור נבדקים אנושיים, הנחו כל נבדק לעשות את צרכיו ישירות לתוך מכשיר איסוף ישים המסופק (למשל, ערכת איסוף דגימות צואה סטרילית) כדי למנוע זיהום. הערה: יש להנחות את הנושא להימנע מזיהום על ידי משטחי אסלה, מים, שתן או כל משטח/חפץ אחר שאינו סטרילי.</li>
	</ol></li>
	<li>הקפיאו דגימות צואה שנאספו בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל באופן מיידי בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס או הניחו בדלי של קרח יבש לקבלת הכמות והאיכות הטובות יותר של RNA לפני חידוש הצואה כמתואר בשלבים הבאים.<ol><li>עבור דגימות צואה אנושיות, aliquot כל דגימה טרייה של 200 מ"ג לתוך צינורות microcentrifuge 2 מ"ל עם כובעי בורג ולהקפיא אותם ב -80 מעלות צלזיוס לפני צואה resuspension כמתואר להלן.<ol><li>לאחסון דגימות צואה שאינן בצינורות מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל עם מכסי בורג, שוקלים ומעבירים 100-200 מ"ג כל אחת מהדגימות הקפואות לצינורות מיקרוצנטריפוגה נפרדים של 2 מ"ל עם מכסי בורג לפני חידוש הצואה כמתואר להלן. הערה: עבור דגימות צואה אנושיות, הימנע מנטילת יותר מ-200 מ"ג של דגימות צואה לבידוד RNA, שכן הדבר עלול לגרום לקשיים בשלבים הבאים. עם דגימה עמוסה בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל, ייתכן שהפאזה המיימית, הפאזה האורגנית והאינטרפאזה לא ייווצרו ויופרדו בבירור. ניתן להשהות את ההליך כאן.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>2. הכנות של פתרונות לשטוף
<ol><li>הוסף 21 מ"ל של אתנול בדרגה 100% אתנול של האגודה האמריקאית לכימיה כימית (ACS) לתמיסת הכביסה 1 המסופקת בערכת הבידוד miRNA (ראו טבלת חומרים) כדי להגיע לנפח הסופי של 30 מ"ל, כפי שמוצג על הבקבוק. מערבולת עד שהכל מתמוסס בבקבוק.</li>
	<li>הוסף 40 מ"ל של אתנול בדרגה ACS 100% לתמיסת הכביסה 2/3 שסופקה כדי להגיע לנפח הסופי של 50 מ"ל, כפי שמוצג בבקבוק. מערבולת במשך 5 שניות או עד שהתערובת הסופית מעורבבת היטב.</li>
</ol>3. הכנת ציוד וחומרים
<ol><li>רססו את אזור העבודה והציוד, לדוגמה: ספסל המעבדה, אזור העבודה במכסה האדים הכימיים ומדפי צינורות המיקרו-צנטריפוגה, עם תמיסת פירוק ריבונוקלאז (RNase) (לדוגמה, תמיסת פירוק RNase הזמינה מסחרית). כדי למנוע זיהום, יש למרוח עם תמיסת הפירוק RNase על המשטחים בכל מקום ובכל זמן שיימצא לנכון.</li>
	<li>יש לעטות מעיל מעבדה נקי, לעטות מסכת פנים וללבוש כפפות מעבדה מתאימות כדי להגן על הרנ"א בדגימות הצואה מפני נוקלאזות הנמצאות על עור האדם. יש לרסס כפפות עם תמיסת RNase deontamination ולהחליף כפפות לעתים קרובות כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>הכינו דלי קרח יבש לדגימות צואה המאוחסנות בטמפרטורה של -80 מעלות צלזיוס כדי למנוע הפשרה לפני ההפשרה מחדש של הצואה ודלי קרח לחומרים, לדוגמה: חומצה-פנול: כלורופורם, להארכת חיי המדף. הערה: ודא שהחומרים כולל המדיה המשמשת בפרוטוקול הם סטריליים ללא זיהום של נוקלאים.</li>
</ol>4. החייאת צואה
<ol><li>יש לשלול 25-100 מ"ג של דגימות צואה ב-600 מיקרו-ליטר של תמיסת מלח סטרילית 1x Dulbecco (DPBS). אזהרה: דגימות צואה צריכות להיות מעובדות באופן מיידי כאשר הן מופשרות מ-80°C- ללא הפשרה חלקית אפילו כדי למזער את שחרורם של RNases ו-RNA תאי, שכן גבישי קרח קורעים תאים פנימיים וחיצוניים כאשר תאים בדגימה מפשירים.<ol><li>הוסף 600 μL של 1x DPBS לצינור microcentrifuge 2 מ"ל עם מכסה בורג המכיל דגימות צואה בטמפרטורת החדר (RT).</li>
		<li>דגירה של תערובת של דגימות צואה שקועה ב 600 μL של 1x DPBS בצינור microcentrifuge 2 מ"ל מכוסה במשך 30 דקות ב RT.</li>
		<li>השהה את התערובת על ידי מחית עם קצה פיפטה של 1 מ"ל ומערבולת היטב עם צינור microcentrifuge 2 מ"ל מכוסה. כדי לייעל ולהגדיל את הכמות והאיכות של RNA, להשעות את התערובת עם homogenizer עם ההגדרה עבור מחזור אחד ב S4000 (או 4000 סל"ד) ו 45 שניות.</li>
	</ol></li>
</ol>5. מיצוי אורגני
אזהרה: השתמש במכסה האדים הכימי המסוכן לשלבים הבאים עד שלב 6 עם שימוש בחומצה-פנול: כלורופורם ואתנול בדרגה ACS 100% בשל רעילותם ודליקותם. שנה PPE לפי הצורך ופעל לפי אמצעי זהירות סטנדרטיים נאותים בעת טיפול בחומרים מסוכנים.
<ol><li>חלץ RNA עם 600 μL של חומצה-פנול: כלורופורם (נפח חומצה-פנול: כלורופורם נדרש שווה לנפח הראשוני של 1x DPBS נוסף בשלב 4.1).<ol><li>הוסף 600 μL של חומצה-פנול: כלורופורם לתרחיף משלב 4.1. הערה: למשוך חומצה-פנול: כלורופורם מהשלב התחתון בבקבוק כאשר השלב העליון מעורבב עם חיץ מימי. אם האינטרפאזה בין שני השלבים האלה מופרעת, אז לחכות ולסגת חומצה-פנול: כלורופורם רק כאשר interphase מחדש מבסס את עצמו כדי למנוע זיהום.</li>
	</ol></li>
	<li>מערבבים את התערובת במשך 60 שניות כדי לערבב היטב. לחלופין, כדי לייעל ולהגדיל את כמות הרנ"א בתפוקה, ערבבו באמצעות הומוגנייזר עם ההגדרה למחזור אחד ב-S4000 וב-45 שניות.</li>
	<li>צנטריפוגה למשך 15 דקות ב-10,000 x גרם ב-RT כדי להפריד בין הפאזות המימיות והאורגניות באמצעות מיקרוצנטריפוגה. לאחר צנטריפוגה, האינטרפאזה צריכה להיות קומפקטית. אם לא, חזור על הצנטריפוגה. הערה: אם האינטרפאזה לא יכולה להיות קומפקטית כפי הרצוי, אולי בגלל יחס לא אחיד של הנפח הראשוני לנפח של חומצה-פנול נוסף: כלורופורם לאחר מספר חזרות של צנטריפוגה, המשך לשחזר את השלב מימי בזהירות רבה יותר כדי למנוע זיהום.</li>
	<li>לשחזר את הפאזה המימית ולהעביר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש של 2 מ"ל עם מכסה ציר (לא מסופק על ידי ערכת בידוד miRNA).<ol><li>הסר את הפאזה המימית (או העליונה) בזהירות מבלי להפריע לפאזה התחתונה והעבר אותה לצינור מיקרוצנטריפוגה חדש בגודל 2 מ"ל עם מכסה ציר. שים לב לנפח שהועבר (לדוגמה, ~ 500 μL). הערה: כאשר האינטרפאזה קומפקטית והפאזה העליונה מופרדת בבירור, ייתכן שיש כמה חלקיקים שיוריים זעירים שצפים בחלק העליון של הפאזה המיימית. פיפטה בזהירות כדי להימנע משאריות אלה ולהתאושש רק בפאזה מימית מופרדת באופן גלוי וברור כדי להבטיח תפוקת RNA איכותית, גם אם ניתן להשיג רק נפח קטן של הפאזה המיימית.</li>
	</ol></li>
</ol>6. בידוד RNA סופי
<ol><li>הוסף 1.25 נפחים של 100% אתנול בדרגה RT ACS לפאזה המימית בצינור מיקרוצנטריפוגה של 2 מ"ל (לדוגמה, הוסף 625 μL של 100% אתנול אם 500 μL של פאזה מימית התאוששו משלב 5.4.). וורטקס 3 שניות.</li>
	<li>טען את תערובת הפאזה/אתנול המימית דרך מחסנית המסנן המסופקת בערכת הבידוד miRNA.<ol><li>עבור כל דגימה, הנח את מחסנית המסנן באחת מצינורות האיסוף המסופקים על ידי הערכה.<ol><li>פיפטה וטעינה של 600 μL של תערובת פאזה/אתנול מימית לתוך מחסנית המסנן. הערה: מערבבים את התערובת לזמן קצר כדי לערבב היטב את האתנול עם פאזה מימית לפני הפיפטה. לא ניתן לטעון יותר מ-700 μL של תערובת פאזה/אתנול מימית בכל פעם.</li>
		</ol></li>
		<li>צנטריפוגה בגודל 10,000 x גרם למשך 90 שניות כדי לסנן את התערובת. סיבוב במהירות גבוהה יותר עלול לגרום נזק למסנן.</li>
		<li>השליכו את התסנין וחזרו על שלבים 6.2.1 עד 6.2.2 עד שכל התערובת תסונן דרך אותה קרום מסנן ביישומים עוקבים. יש לשמור ולעשות שימוש חוזר באותו צינור איסוף לשטיפה בשלבים הבאים.</li>
		<li>שטפו את המסנן עם 700 μL של miRNA Wash Solution 1. אזהרה: תמיסת רחצה miRNA 1 מכילה גואנידין תיוציאנט שעלול לגרום לגירוי בעור ולנזק חמור לעיניים. ללבוש PPE הכרחי, למשל: כפפות, מגן פנים, מעיל מעבדה מגן. החלף כפפות לעתים קרובות לפי הצורך.<ol><li>החל 700 μL של miRNA Wash Solution 1, פתרון העבודה שהוכן עם אתנול 100% בדרגה ACS, לתוך מחסנית המסנן.</li>
			<li>צנטריפוגה למשך 60 שניות לסינון תמיסת הכביסה miRNA 1 דרך מחסנית המסנן.</li>
			<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.</li>
		</ol></li>
		<li>שטפו את המסנן עם Wash Solution 2/3 פעם אחת כל אחד בנפחים של 700 μL, 500 μL ו-250 μL ברציפות.<ol><li>החל 700 μL של Wash Solution 2/3, פתרון העבודה שהוכן עם אתנול 100% בדרגה ACS, לתוך מחסנית המסנן.<ol><li>צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.</li>
				<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.</li>
			</ol></li>
			<li>יש למרוח 500 μL של תמיסת כביסה 2/3 לתוך מחסנית המסנן.<ol><li>צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.</li>
				<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף והכניסו את אותה מחסנית מסנן לאותה שפופרת איסוף.</li>
			</ol></li>
			<li>החל 250 μL של תמיסת כביסה 2/3 לתוך מחסנית המסנן.<ol><li>צנטריפוגה ב-10,000 x גרם למשך דקה.</li>
				<li>השליכו את התסנין מצינור האיסוף.</li>
			</ol></li>
			<li>העבירו את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש וסובבו את המכלול למשך 5 דקות כדי להסיר שאריות נוזל מהמסנן.</li>
		</ol></li>
	</ol></li>
</ol>7. רנ"א אלוטי עם 50 μL מים נטולי נוקלאז
<ol><li>העבר את מחסנית המסנן לצינור איסוף חדש. פיפטה 50 μL של מים ללא נוקלאז למרכז המסנן ומכסה את צינור האיסוף.<ol><li>דגירה ב- RT במשך 10 דקות.</li>
		<li>סובבו במשך 5 דקות ב-8,000 x g כדי לשחזר RNA לתוך צינור האיסוף החדש.</li>
		<li>לקבוע את הריכוז והטוהר של RNA צואה משוחזר באמצעות פלואורומטר. RNA צואה משוחזר יכול להיות מאוחסן ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
</ol>

<ol>
	<li>Das, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+extracellular+RNA+communication+consortium:+Establishing+foundational+knowledge+and+technologies+for+extracellular+RNA+research.">The extracellular RNA communication consortium: Establishing foundational knowledge and technologies for extracellular RNA research.</a> Cell. 177 (2), 231-242 (2019).</li><li>Ahmed, F. E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Diagnostic+microRNA+markers+for+screening+sporadic+human+colon+cancer+and+active+ulcerative+colitis+in+stool+and+tissue.">Diagnostic microRNA markers for screening sporadic human colon cancer and active ulcerative colitis in stool and tissue.</a> Cancer Genomics &amp; Proteomics. 6 (5), 281-295 (2009).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+host+shapes+the+gut+microbiota+via+fecal+microRNA.">The host shapes the gut microbiota via fecal microRNA.</a> Cell Host &amp; Microbe. 19 (1), 32-43 (2016).</li><li>Viennois, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Host-derived+fecal+microRNAs+can+indicate+gut+microbiota+healthiness+and+ability+to+induce+inflammation.">Host-derived fecal microRNAs can indicate gut microbiota healthiness and ability to induce inflammation.</a> Theranostics. 9 (15), 4542-4557 (2019).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Oral+administration+of+miR-30d+from+feces+of+MS+patients+suppresses+MS-like+symptoms+in+mice+by+expanding+Akkermansia+muciniphila.">Oral administration of miR-30d from feces of MS patients suppresses MS-like symptoms in mice by expanding Akkermansia muciniphila.</a> Cell Host &amp; Microbe. 26 (6), 779-794 (2019).</li><li>Masotti, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantification+of+small+non-coding+RNAs+allows+an+accurate+comparison+of+miRNA+expression+profiles.">Quantification of small non-coding RNAs allows an accurate comparison of miRNA expression profiles.</a> Journal of Biomedicine &amp; Biotechnology. 2009, 659028 (2009).</li><li>Green, M. R., Sambrook, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+win+the+battle+with+RNase.">How to win the battle with RNase.</a> Cold Spring Harbor Protocols. 2019 (2), 101857 (2019).</li><li>Franzosa, E. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Relating+the+metatranscriptome+and+metagenome+of+the+human+gut.">Relating the metatranscriptome and metagenome of the human gut.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 111 (22), 2329-2338 (2014).</li><li>Wohnhaas, C. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fecal+microRNAs+show+promise+as+noninvasive+Crohn's+disease+biomarkers.">Fecal microRNAs show promise as noninvasive Crohn's disease biomarkers.</a> Crohn's &amp; Colitis. 2 (1), 003 (2020).</li><li>Tomkovich, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+colon+mucosal+biofilms+and+murine+host+communicate+via+altered+mRNA+and+microRNA+expression+during+cancer.">Human colon mucosal biofilms and murine host communicate via altered mRNA and microRNA expression during cancer.</a> mSystems. 5 (1), (2020).</li><li>Tarallo, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Altered+fecal+small+RNA+profiles+in+colorectal+cancer+reflect+gut+microbiome+composition+in+stool+samples.">Altered fecal small RNA profiles in colorectal cancer reflect gut microbiome composition in stool samples.</a> mSystems. 4 (5), 70 (2019).</li><li>Xing, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breed+differences+in+the+expression+levels+of+gga-miR-222a+in+laying+hens+influenced+H2S+production+by+regulating+methionine+synthase+genes+in+gut+bacteria.">Breed differences in the expression levels of gga-miR-222a in laying hens influenced H2S production by regulating methionine synthase genes in gut bacteria.</a> Research Square. , (2020).</li><li>Teng, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Plant-derived+exosomal+microRNAs+shape+the+gut+microbiota.">Plant-derived exosomal microRNAs shape the gut microbiota.</a> Cell Host &amp; Microbe. 24 (5), 637-652 (2018).</li><li>Moloney, G. M., Viola, M. F., Hoban, A. E., Dinan, T. G., Cryan, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Faecal+microRNAs:+indicators+of+imbalance+at+the+host-microbe+interface.">Faecal microRNAs: indicators of imbalance at the host-microbe interface.</a> Beneficial Microbes. , 1-10 (2017).</li><li>Giannoukos, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Efficient+and+robust+RNA-seq+process+for+cultured+bacteria+and+complex+community+transcriptomes.">Efficient and robust RNA-seq process for cultured bacteria and complex community transcriptomes.</a> Genome Biology. 13 (3), 23 (2012).</li></ol>

המחברים מצהירים על היעדר אינטרסים כספיים רלוונטיים או מהותיים הקשורים לשיטת המחקר המתוארת במאמר פרוטוקול זה.

חשוב להשתמש בטכניקה נטולת RNase כדי למנוע זיהום RNase במהלך הבידוד7. לאחר צנטריפוגה והיווצרות אינטרפאזה קומפקטית, חשוב להימנע מהאינטרפאזה, הפאזה התחתונה ומזיהום החלקיקים המרחף על החלק העליון של הפאזה המימית בעת שחזור הפאזה המיימית. בנוסף, מתווספים שני שלבי שטיפה עם 500 μL ו- 250 μL Wash S...

רנ"א חוץ-תאי מקבל הכרה כגורם משמעותי המתווך תהליכים ביולוגיים רבים1. RNA חוץ-תאי בצואה דווח לראשונה בשנת 2008 כסמן לסרטן המעי הגס ולקוליטיס כיבית פעילה2, והוא התגלה לאחרונה כמרכיב נורמלי של לומן המעיים והצואה ומתווך תקשורת בין חיידקים מארחים 3,4,5. מטרת פרוטוקול בידוד RNA זה היא לחלץ RNA חוץ-תאי באיכות גבוהה מדגימות צואה שנאספו מנבדקים בעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול הותאם מתוך ערכת בידוד miRNA מסחרית. הרנ"א הנרכש מנוצל לניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. הפרוטוקול כולל מספר טיפים חשובים ושימושיים כדי למקסם את הכמות והאיכות של RNA שנמצא בצואה של בעלי חיים ובני אדם. הסיבה לפתח ולייעל שיטה זו של בידוד RNA (כולל מיקרו-רנ"א) היא להקטין את הרנ"א המיקרוביאלי בצואה, להגביל את המשתנים במחקרים ולנתח את הרכב הרנ"א במעיים מבלי לקחת בחשבון גורמים מבלבלים שונים ומקורות זיהום. יש לציין שבידוד רנ"א זה ממזער את שחרור הרנ"א מתא חי וממיקרובים חיים (רנ"א תאי). הוא מתמקד ב-RNA חוץ-תאי ששוחררו על-ידי תאי מעיים או נרכשו באמצעות צריכת מזון. בעיקרון, שיטה זו אינה מתאימה למחקרים שבהם נחקר התעתיק המיקרוביאלי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Acid-Phenol: Chloroform, pH 4.5 (with IAA, 125:24:1)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9720</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>DPBS, no calcium, no magnesium</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>14190-144</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Gloves</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Microcentrifuge</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>mirVana miRNA Isolation Kit</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM1561</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free microcentrifuge tubes (1.5 mL, 2 mL)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Nuclease-Free Water (Not DEPC-treated)</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9937</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Pipettor and Nuclease-Free Pipette tips (with filter)</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>PowerLyzer 24 Homogenizer</td>
			<td>QIAGEN</td>
			<td>13155</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>RNaseZap RNase Decontamination Solution</td>
			<td>Thermo Fischer Scientific</td>
			<td>AM9780</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Vortex Shaker</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

fecal (micro) rna isolation

זה הולך ומתברר כי RNA קיים לומן המעיים וצואה בבעלי חיים ובני אדם. הפרוטוקול המתואר להלן מבודד את סך הרנ"א כולל מיקרו-רנ"א מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. המטרה היא לבודד RNA כולל עם טוהר וכמות גבוהים עבור ניתוחים במורד הזרם כגון ריצוף RNA, RT-PCR ומיקרו-מערך. היתרונות של פרוטוקול אופטימלי זה בבידוד miRNA הם היכולות של בידוד מוצרי RNA מטוהרים מאוד עם שלבי שטיפה נוספים שתוארו, כמות מוגברת של RNA המתקבלת בשיטה משופרת בחידוש הדגימה, וטיפים חשובים של פירוק. מגבלה אחת היא חוסר היכולת לעבד ולטהר מדגם גדול יותר של יותר מ -200 מ"ג מכיוון שגודלי דגימה אלה יגרמו לקושי בהיווצרות ברורה של האינטרפאזה. כתוצאה מכך, גודל המדגם הגדול עלול לזהם את הפאזה המימית שיש לחלץ כמתואר בפרוטוקול עם עניינים אורגניים המשפיעים על איכות הרנ"א המבודד בסופו של דבר. עם זאת, רנ"א מבודד מדגימה של עד 200 מ"ג מספיק לרוב הניתוחים במורד הזרם.

רנ"א מייצגים בודדו מדגימות של 50 מ"ג צואת עכברים (2 כדורי צואה של עכברים) ו-100 מ"ג של דגימות צואה אנושית בהתאמה, ונלקחו במים נטולי נוקלאז של 50 μL. מניתוח ספקטרופוטומטר של הריכוז עולה כי כמות כוללת של 49 מיקרוגרם ו-16 מיקרוגרם RNA בודדו בהתאמה (טבלה 1). טוהר הרנ"א היה גבוה כפי שצוין על ידי יחס A2...

Watch this Scientific Journal Video about Fecal micro RNA Isolation at JoVE.com

Fecal micro RNA Isolation

פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

צואה (מיקרו) בידוד RNA

It is becoming clear that RNA exists in the gut lumen and feces in animals and humans. The protocol described below isolates total RNA including microRNAs ...

Research

Education

JoVE Core

JoVE Journal

Medical-Surgical Nursing

Immunology and Infection

Unit 1

Fecal (micro) RNA Isolation

Diagnostic and Radiological Studies of the GI System

SCIENTISTS IN ACTION

4.4K Views.  Brigham and Women's Hospital and Harvard Medical School. פרוטוקול זה מבודד RNA כולל באיכות גבוהה מדגימות צואה של נבדקים בעלי חיים ובני אדם. ערכת בידוד miRNA מסחרית משמשת עם הסתגלות משמעותית לבידוד RNA טהור עם כמות ואיכות אופטימליות. מבודדי ה-RNA טובים לרוב מבחני ה-RNA במורד הזרם, כגון ריצוף, מיקרו-מערך ו-RT-PCR.

Video: Fecal micro RNA Isolation

RNA Interference in Ticks

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors of human diseases1 and the most important vectors affecting cattle industry worldwide2. Ticks are classified in the subclass Acari, order Parasitiformes, suborder Ixodida and are distributed worldwide from Arctic to tropical regions3. Despite efforts to control tick infestations, these ectoparasites remain a serious problem for human and animal health4,5.
RNA interference (RNAi)6 is a nucleic acid-based reverse genetic approach that involves disruption of gene expression in order to determine gene function or its effect on a metabolic pathway. Small interfering RNAs (siRNAs) are the effector molecules of the RNAi pathway that is initiated by double-stranded RNA (dsRNA) and results in a potent sequence-specific degradation of cytoplasmic mRNAs containing the same sequence as the dsRNA trigger7-9. Post-transcriptional gene silencing mechanisms initiated by dsRNA have been discovered in all eukaryotes studied thus far, and RNAi has been rapidly developed in a variety of organisms as a tool for functional genomics studies and other applications10.
RNAi has become the most widely used gene-silencing technique in ticks and other organisms where alternative approaches for genetic manipulation are not available or are unreliable5,11. The genetic characterization of ticks has been limited until the recent application of RNAi12,13. In the short time that RNAi has been available, it has proved to be a valuable tool for studying tick gene function, the characterization of the tick-pathogen interface and the screening and characterization of tick protective antigens14. Herein, a method for RNAi through injection of dsRNA into unfed ticks is described. It is likely that the knowledge gained from this experimental approach will contribute markedly to the understanding of basic biological systems and the development of vaccines to control tick infestations and prevent transmission of tick-borne pathogens15-19.

A method for RNA interference (RNAi) by injection of dsRNA into unfed ticks is described. RNAi is the most widely used gene-silencing technique in ticks where the use of other methods of genetic manipulation has been limited.

RNA התערבות קרציות

Ticks are obligate hematophagous ectoparasites of wild and domestic animals and humans, and are considered to be second worldwide to mosquitoes as vectors ...

Isolation of Fidelity Variants of RNA Viruses and Characterization of Virus Mutation Frequency

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the generation of extreme population diversity that facilitates virus adaptation and evolution. Increasing evidence shows that the intrinsic error rates, and the resulting mutation frequencies, of RNA viruses can be modulated by subtle amino acid changes to the viral polymerase. Although biochemical assays exist for some viral RNA polymerases that permit quantitative measure of incorporation fidelity, here we describe a simple method of measuring mutation frequencies of RNA viruses that has proven to be as accurate as biochemical approaches in identifying fidelity altering mutations. The approach uses conventional virological and sequencing techniques that can be performed in most biology laboratories. Based on our experience with a number of different viruses, we have identified the key steps that must be optimized to increase the likelihood of isolating fidelity variants and generating data of statistical significance. The isolation and characterization of fidelity altering mutations can provide new insights into polymerase structure and function1-3. Furthermore, these fidelity variants can be useful tools in characterizing mechanisms of virus adaptation and evolution4-7.

The present article describes the steps required to isolate and characterize RNA polymerase fidelity variants of RNA viruses and how to use mutation frequency data to confirm fidelity changes in tissue culture.

בידוד של פידליטי גרסאות של וירוסים RNA ו אפיון תדירות המוטציה וירוס

RNA viruses use RNA dependent RNA polymerases to replicate their genomes. The intrinsically high error rate of these enzymes is a large contributor to the ...

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with leukemia, severe burn wounds, or organ transplants1. In patients at high-risk for developing PA bloodstream infections, the gastrointestinal (GI) tract is the main reservoir for colonization2, but the mechanisms by which PA transitions from an asymptomatic colonizing microbe to an invasive, and often deadly, pathogen are unclear. Previously, we performed in vivo transcription profiling experiments by recovering PA mRNA from bacterial cells residing in the cecums of colonized mice 3 in order to identify changes in bacterial gene expression during alterations to the host&#x2019;s immune status.
As with any transcription profiling experiment, the rate-limiting step is in the isolation of sufficient amounts of high quality mRNA. Given the abundance of enzymes, debris, food residues, and particulate matter in the GI tract, the challenge of RNA isolation is daunting. Here, we present a method for reliable and reproducible isolation of bacterial RNA recovered from the murine GI tract. This method utilizes a well-established murine model of PA GI colonization and neutropenia-induced dissemination4. Once GI colonization with PA is confirmed, mice are euthanized and cecal contents are recovered and flash frozen. RNA is then extracted using a combination of mechanical disruption, boiling, phenol/chloroform extractions, DNase treatment, and affinity chromatography. Quantity and purity are confirmed by spectrophotometry (Nanodrop Technologies) and bioanalyzer (Agilent Technologies) (Fig 1). This method of GI microbial RNA isolation can easily be adapted to other bacteria and fungi as well.

RNA Isolation of Pseudomonas aeruginosa Colonizing the Murine Gastrointestinal Tract

A reliable method for the RNA isolation of Pseudomonas aeruginosa recovered from murine cecums is described. The RNA recovered is of sufficient quantity and quality for subsequent qPCR, transcription profiling, and RNA Seq experiments. This technique can be adapted for RNA isolation of other intestinal microbes.

RNA בידוד Pseudomonas aeruginosa מיישבים את מערכת העיכול Murine

Pseudomonas aeruginosa (PA) infections result in significant morbidity and mortality in hosts with compromised immune systems, such as patients with ...

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral proteins involved in the regulation of the virus activity recognize several nucleic acids. The nucleocapsid protein NCp7 (NC) is a key protein regulating several processes during virus replication. NC is in fact a chaperone destabilizing the secondary structures of RNA and DNA and facilitating their annealing. The inactivation of NC is a new approach and an interesting target for anti-HIV therapy. The Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis (NAME) assay was developed to identify molecules able to inhibit the melting and annealing of RNA and DNA folded in thermodynamically stable tridimensional conformations, such as hairpin structures of TAR and cTAR elements of HIV, by the nucleocapsid protein of HIV-1. The new assay employs either the recombinant or the synthetic protein, and oligonucleotides without the need of their previous labeling. The analysis of the results is achieved by standard polyacrylamide gel electrophoresis (PAGE) followed by conventional nucleic acid staining. The protocol reported in this work describes how to perform the NAME assay with the full-length protein or its truncated version lacking the basic N-terminal domain, both competent as nucleic acids chaperones, and how to assess the inhibition of NC chaperone activity by a threading intercalator. Moreover, NAME can be performed in two different modes, useful to obtain indications on the putative mechanism of action of the identified NC inhibitors.

Nucleocapsid Annealing-Mediated Electrophoresis NAME Assay Allows the Rapid Identification of HIV-1 Nucleocapsid Inhibitors

This protocol describes NAME, an assay that allows the rapid identification of molecules able to inhibit in vitro the chaperone activities of HIV-1 nucleocapsid protein.

חישול בתיווך Nucleocapsid אלקטרופורזה (NAME) Assay מאפשר זיהוי המהיר של HIV-1 Nucleocapsid המעכבים

RNA or DNA folded in stable tridimensional folding are interesting targets in the development of antitumor or antiviral drugs. In the case of HIV-1, viral ...

Optimization of a Quantitative Micro-neutralization Assay

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. In this study, we present the protocol of an imaging-based MN assay to quantify the true antigenic relationships between viruses. Unlike typical plaque reduction assays that rely on visible plaques, this assay quantitates the entire infected cell population of each well. The protocol matches the virus type or subtype with the selection of cell lines to achieve maximum infectivity, which enhances sample contrast during imaging and image processing. The introduction of quantitative titration defines the amount of input viruses of neutralization and enables the results from different experiments to be comparable. The imaging setup with a flatbed scanner and free downloadable software makes the approach high throughput, cost effective, user friendly, and easy to deploy in most laboratories. Our study demonstrates that the improved MN assay works well with the current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses, without being significantly influenced by amino acid substitutions in the neuraminidase (NA) of A(H3N2) viruses. It is particularly useful for the characterization of viruses that either grow to low HA titer and/or undergo an abortive infection resulting in an inability to form plaques in cultured cells.

This study describes an imaging-based micro-neutralization assay to analyze the antigenic relationships between viruses. The protocol employs a flatbed scanner and has four steps, including titration, titration quantitation, neutralization, and neutralization quantitation. The assay works well with current circulating influenza A(H1N1)pdm09, A(H3N2), and B viruses.

אופטימיזציה של Assay כמותי מיקרו-נטרול

The micro-neutralization (MN) assay is a standard technique for measuring the infectivity of the influenza virus and the inhibition of virus replication. ...

Real-time Quaking-induced Conversion Assay for Detection of CWD Prions in Fecal Material

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant prion protein (PrP) substrate using prion seeds as a template for the conversion. RT-QuIC is a novel high-throughput technique which is analogous to real-time polymerase chain reaction (PCR). Detection of amyloid fibril growth is based on the dye Thioflavin T, which fluoresces upon specific interaction with &#7526;-sheet rich proteins. Thus, amyloid formation can be detected in real time. We attempted to develop a reliable non-invasive screening test to detect chronic wasting disease (CWD) prions in fecal extract. Here, we have specifically adapted the RT-QuIC technique to reveal PrPSc seeding activity in feces of CWD infected cervids. Initially, the seeding activity of the fecal extracts we prepared was relatively low in RT-QuIC, possibly due to potential assay inhibitors in the fecal material. To improve seeding activity of feces extracts and remove potential assay inhibitors, we homogenized the fecal samples in a buffer containing detergents and protease inhibitors. We also submitted the samples to different methodologies to concentrate PrPSc on the basis of protein precipitation using sodium phosphotungstic acid, and centrifugal force. Finally, the feces extracts were tested by optimized RT-QuIC which included substrate replacement in the protocol to improve the sensitivity of detection. Thus, we established a protocol for sensitive detection of CWD prion seeding activity in feces of pre-clinical and clinical cervids by RT-QuIC, which can be a practical tool for non-invasive CWD diagnosis.

Here, we present a protocol to describe a simple, fast and efficient prion amplification technique, the real-time quaking-induced conversion (RT-QuIC) method.

בזמן אמת רועד מפחד הנוצרות על-ידי המרה Assay גילוי של CWD Prions חומר צואתי

The RT-QuIC technique is a sensitive in vitro cell-free prion amplification assay based mainly on the seeded misfolding and aggregation of recombinant ...

An In Vitro Batch-culture Model to Estimate the Effects of Interventional Regimens on Human Fecal Microbiota

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are needed to decipher the utilization of microbiome modulators for human health benefits. However, the large-scale screening and optimization of modulators to validate microbiome modulation and predict related health benefits may be practically difficult due to the need for large number of animals and/or human subjects. To this end, in vitro or ex vivo models can facilitate preliminary screening of microbiome modulators. Herein, it is optimized and demonstrated an ex vivo fecal microbiota culture system that can be used for examining the effects of various interventions of gut microbiome modulators including probiotics, prebiotics and other food ingredients, aside from nutraceuticals and drugs, on the diversity and composition of the human gut microbiota. Inulin, one of the most widely studied prebiotic compounds and microbiome modulators, is used as an example here to examine its effect on the healthy fecal microbiota composition and its metabolic activities, such as fecal pH and the fecal levels of organic acids including lactate and short-chain fatty acids (SCFAs). The protocol may be useful for studies aimed at estimating the effects of different interventions of modulators on fecal microbiota profiles and at predicting their health impacts.

This protocol describes an in vitro batch-culture fermentation system of human fecal microbiota, using inulin (a well-known prebiotic and one of the most widely studied microbiota modulators) to demonstrate the use of this system in estimating effects of specific interventions on fecal microbiota composition and metabolic activities.

באצווה מחוץ לגופית-מודל תרבות להעריך את ההשפעות של משטרי התערבותית על האדם מיקרוביוטה בצואה

The emerging role of the gut microbiome in several human diseases demands a breakthrough of new tools, techniques and technologies. Such improvements are ...

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician and the patient. A culture is also prone to false negative results from random loss of viability during specimen handling, overgrowth of other fecal flora, and poor growth of several pathogenic Campylobacter species on traditional media. These problems can confound clinical decisions on patient treatment and have limited the field from answering fundamental questions on Campylobacter growth and infections. We describe a procedure that estimates the lower limit of bacterial numbers that can be detected by a culture and a method for quantifying survival of C. jejuni in media used for transport of this fragile organism. Knowing this information, it becomes possible to set clinically relevant detection thresholds for diagnostic tests and address unstudied issues of whether non-symptomatic colonization is prevalent, if co-infection with other enteric pathogens is common, or if bacterial load correlates with symptoms or serious sequelae. The study also included testing of 1,552 prospectively collected patient diarrheal fecal specimens that were initially classified by conventional culture and further tested by a new enzyme immunoassay. Positive and discrepant specimens were then screened by four molecular methods to assign true-positive or true-negative status. The 5 non-culture methods showed complete agreement on all 48 positive and discrepant specimens, while the culture mis-identified 14 (28%). The specimens that were incorrectly identified by culture included 13 false negative and 1 false positive sample. This basic protocol can be used with multiple Campylobacter spp. and will allow the numbers of Campylobacter bacteria that produce symptoms of gastroenteritis in humans to be determined and for prevalence rates to be updated.

Culture Methods to Determine the Limit of Detection and Survival in Transport Media of Campylobacter Jejuni in Human Fecal Specimens

Although stool culture for Campylobacter is imprecise, it is still considered the gold standard for identification. Methods to determine the limit of detection and survival in transport media of C. jejuni in human stool are described and compared with a new immunoassay with better accuracy.

שיטות התרבות כדי לקבוע את הגבלת הגילוי וההישרדות במדיית התחבורה של קמפילובקטר Jejuni האדם בצואה

A culture from human stool for diagnosis of Campylobacter-based intestinal illness takes several days, a wait that taxes the fortitude of the physician ...

Supervised Machine Learning for Semi-Quantification of Extracellular DNA in Glomerulonephritis

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular deoxyribonucleic acid (ecDNA) is released during different forms of cell death including apoptosis, necrosis, necroptosis, neutrophil extracellular traps (NETs) and pyroptosis. Measurement of this cell death is time consuming with several different biomarkers required to identify the different biochemical forms of cell death. Measurement of ecDNA is generally conducted in serum and urine as a surrogate for renal damage, not in the actual target organ where the pathological injury occurs. The current difficulty in investigating ecDNA in the kidney is the lack of methods for formalin fixed paraffin embedded tissue (FFPE) both experimentally and in archived human kidney biopsies. This protocol provides a summary of the steps required to stain for ecDNA in FFPE tissue (both human and murine), quench autofluorescence and measure the ecDNA in the resulting images using a machine learning tool from the publicly available open source ImageJ plugin trainable Weka segmentation. Trainable Weka segmentation is applied to ecDNA within the glomeruli where the program learns to classify ecDNA. This classifier is applied to subsequent acquired kidney images, reducing the need for manual annotations of each individual image. The adaptability of the trainable Weka segmentation is demonstrated further in kidney tissue from experimental murine anti-MPO glomerulonephritis (GN), to identify NETs and ecMPO, common pathological contributors to anti-MPO GN. This method provides objective analysis of ecDNA in kidney tissue that demonstrates clearly the efficacy in which the trainable Weka segmentation program can distinguish ecDNA between healthy normal kidney tissue and diseased kidney tissue. This protocol can easily be adapted to identify ecDNA, NETs and ecMPO in other organs.

Extracellular DNA (ecDNA) released during cell death is proinflammatory and contributes to inflammation. Measurement of ecDNA at the site of injury can determine the efficacy of therapeutic treatment in the target organ. This protocol describes the use of a machine learning tool to automate measurement of ecDNA in kidney tissue.

לימוד מכונה ללימוד למחצה של דנ א של מסחטות בפקאוסולפטיס

Glomerular cell death is a pathological feature of myeloperoxidase anti neutrophil cytoplasmic antibody associated vasculitis (MPO-AAV). Extracellular ...

Therapeutic Evaluation of Fecal Microbiota Transplantation in an Interleukin 10-Deficient Mouse Model

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted considerable attention. Accumulating evidence suggests that dysbiotic microbiota plays an active role in triggering or worsening the inflammatory process in IBD and that fecal microbiota transplantation (FMT) is an attractive therapeutic strategy since transferring a healthy microbiota to IBD patient could restore the appropriate host-microbiota communication. However, the molecular mechanisms are unclear, and the efficacy of FMT has not been very well established. Thus, further studies in animal models of IBD are necessary. In this method, we applied FMT from wild-type C57BL/6J mice to IL-10 deficient mice, a widely used mouse model of colitis. The study elaborates on collecting fecal pellets from the donor mice, making the fecal solution/suspension, administering the fecal solution, and monitoring the disease. We found that FMT significantly mitigated the cardiac impairment in IL-10 knockout mice, underlining its therapeutic potential for IBD management.

The interaction of genetic susceptibility, mucosal immunity, and intestinal microecological environment is involved in the pathogenesis of inflammatory bowel disease (IBD). In this study, we applied fecal microbiota transplantation to IL-10 deficient mice and investigated its impact on colonic inflammation and heart function.

הערכה טיפולית של השתלת מיקרוביוטה בצואה במודל עכבר עם מחסור באינטרלוקין 10

With the development of microecology in recent years, the relationship between intestinal bacteria and inflammatory bowel disease (IBD) has attracted ...