דנילו מדלו הוא מקבל מלגת מחקר כמו קבוצת לחוקר הצעיר (YIG) מהמכון הטכנולוגי של קרלסרוהה.

1. מתזמן את התאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני שמתחילים, לחמם את המדיום תרבות, 1X PBS ואת טריפסין באמבט מים 37 ˚ C </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קח את התאים מתוך החממה לשאוב את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעדינות להחיל 5 מ&quot;ל של PBS 1X על התאים כדי לשטוף אותם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשאוב 1X PBS וליישם 1 מ&quot;ל של טריפסין המכיל 0,025% EDTA. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לסובב בעדינות את הצלחת יש חלוקה שווה של טריפסין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המקום התאים החממה ב 37 ˚ C למשך 5-10 דקות (תלוי בסוג התא). מדי פעם לבדוק אם התאים מנותקים על ידי רועדת את הצלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Resuspend התאים 10-20 מ&quot;ל של מדיום ולאסוף אותם צינור בז 50 מ&quot;ל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ספירת התאים באמצעות דלפק Beckman. מספר תאים צריך להיות מספיק כדי להבטיח מפגש של כ 60-70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פלייט את התאים ולאפשר להם זרע במשך 6-8 שעות. </li></ol> 2. טרנסfection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני transfection, להתחמם aliquot של המדיום בסרום ללא באמבט מים ב 37 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביאו את X-treme ג&#39;ין 9 לטמפרטורת החדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet המדיום החופשי בסרום 2 צינורות Eppendorf (1 שפופרת = 1 transfection). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Pipet X-treme ג&#39;ין 9 תשומת לב בינוני בסרום החופשי משלמים כי טיפ אינו נוגע בקיר הפלסטיק של Eppendorf ו דגירה במשך 5 דקות. בינתיים להכין שתי תערובות DNA: בתוך הגליל האחד לערבב יחד את פלסמידים עבור renilla, גחלילית ואת פקד וקטור ריק, ב renilla עוד צינור, גחלילית ואת המלווה מולקולרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מוסיפים את תערובת DNA זה Eppendorf המכיל מדיום חופשי בדם + X-treme ג&#39;ין 9, מערבולת דגירה בטמפרטורת החדר למשך 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף dropwise כל תערובת לצלחת כל דגירה למשך 24 שעות ב 37 ° C ו 5% CO 2 </li></ol> 3. פיצול תאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 24 שעות אחרי, tryps transfectioninize התאים כמתואר 1.4-1.6 ו לדלל אותם confluency סופי של 60-70% על צלחת 6 באר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכינו צלחת אחת על השליטה הלא בהלם וכפי הצלחות רבות ככל הפעם נקודות שחזור כי צריך להיות מנותח, כמו הראו באיור. 2. </li></ol> 4. מחממים הלם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור הלם חום, טרום חם סרום המכיל בינוני באמבט מים ב 37 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן &quot;הלם החום חיץ&quot; על ידי דילול ב cycloheximide בסרום בינוני המכיל ריכוז סופי של 20 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​ו - מגבים ל 20 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כעת מוציאים את הצלחות מן החממה לשאוב את המדיום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 1 מ&quot;ל כל טוב של &quot;חיץ הלם חום&quot;, ו דגירה במשך 30 דקות ב 37 ˚ C ו 5% של CO 2 (כוללים גם את הצלחת הפניה לטיפול זה). זה יעצור דה נובו סינתזת החלבון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ב לעבור בינתיים על אמבט מים ולהגדיר את temperature ב 45 ˚ C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר דגירה, לאטום את המכסה של צלחות עם Parafilm בעבר לחתוך פסים. צלחת ההתייחסות (100% מכלל refolfed גחלילית) נשאר בחממה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה צלחות ב 45 ˚ C במשך 30 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצלחות מן האמבטיה במים, להסיר את parafilm ולשים את הצלחות בחזרה בחממה כדי לאפשר התאוששות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הקציר בכל פעם לנקודה תאים לשטוף אותם PBS 1X ידי centrifuging ב 2000Xg דקה 1 בשעה 4 ˚ C. </li></ol> 5. תא תמוגה ו assay בלוציפראז <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור תמוגה תא יעיל, הצמד להקפיא את התא גלולה בחנקן נוזלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 200 μl של חיץ תמוגה פסיבי בדילול 1:05 במים מזוקקים כפול בתוך שפופרת זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 30 μl של lysate התא בצלחת 96 באר. מדגם כל pipetted בשלושה עותקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רק &quot;לא מזועזע&quot; דגימות התייחסות ישמשלקרוא את פעילות בלוציפראז renilla, שכן צעד זה נעשה שימוש כדי לבדוק יעילות transfection שווים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את פתרונות assay. עבור הפתרון luciferin לדלל luciferin לריכוז סופי של mM 0.2 במאגר גלאי, גלאי. עבור למאגר התגובה לדלל DTT ו-ATP ריכוז 1mm הסופי חיץ גלאי, גלאי. בשביל חיץ התגובה coelenterazine, לדלל coelenterazine לריכוז סופי של 0.2 מיקרומטר במאגר coelenterazine. שמור על פתרון luciferin והתגובה coelenterazine חיץ אור מוגן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו במקום צלחת 96-היטב luminometer ועל להפעיל את תוכנית &#39;Wallac 1420 תחנת עבודה &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להציג את Pump1 לתוך הצינור בז המכיל את פתרון coelenterazine. סגור את המכסה כך אור לא יכול לבוא במגע עם הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר מתוך התפריט &quot;תחזוקה Dispenser&quot; וסמן את האפשרות Pump1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר באפשרות &quot;מלא&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לערוך את פריסת צלחת לבחור באפשרות &quot;חקור פרוטוקול ותוצאות&quot; בתפריט. בחר את פרוטוקול לחץ פעמיים על זה. כעת בחר את בארות לקרוא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חזור אל &quot;Wallac מנהל&quot; ולחץ על &quot;התחל&quot;. התגובה בין בלוציפראז renilla ו coelenterazine המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 482 ננומטר השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר קריאת, ללכת על &quot;תחזוקה Dispenser &#39;ובחר&#39; ריק &#39;ו Pump1 לשחרר את כל הפתרון שיורית חזרה הצינור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכשיו להעביר את צינור לצינור בז המכיל מים לתקתק &quot;פלאש&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר שלב השטיפה לרוקן את הצינור על ידי בחירת &#39;ריקה&#39;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את הצינור מתוך Pump1 בתוך הצינור חיץ התגובה הבז ואת אחד מן Pump2 בצינור luciferin בז. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שינוי הפריסה צלחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;מלא&quot; עבור Pump1 ו Pump2 מ &#39;דיספנסר תחזוקה &quot;בתפריט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הפרוטוקול ואת תחילת הקריאה. התגובה בין בלוציפראז Firefly ו luciferin המצע שלה פולט אור עם אורך גל של 560 ננומטר השיא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בסוף הקריאה לחזור על התהליך בידיים ריקות, ריקון עבור Pump1 ו Pump2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות זמינים כעת ב &#39;Wallac 1420 Explorer &quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כל הניסוי קשורה למספר assay, שם משתמש, להתחיל ולסיים תאריך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תוצאות כעת ניתן לייצא כקובץ Excel. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור חישובים, התאים מתחלקים לשלוש קבוצות: 1. לא בהלם התייחסות דגימות (כמפורט 100% וקיפלתי גחלילית בלוציפראז); 2. תאים ללא המלווה בחום מולקולרית בהלם; 3. תאים עם המלווה בחום מולקולרית בהלם. </li></ol> 6. נציג תוצאות Refolding חלבון קשורה ישירות הזמן של ההתאוששות ולכן כדי לבדוק אם המערכת עובדת הפרו<html> perly, assay צריך להתבצע איסוף התאים בנקודות זמן שונות. קשר ישיר זמן / אחוז refolding מציין כי הניסוי שבוצעה כהלכה, ולכן מהווה גורם מגביל. עם זאת, יש להתייחס תמיד refolding לאחר הלם החום הוא אירוע להרוות ולכן ניתוח תקין כמובן זמן יש לבצע לפני תחילת כל ניסוי. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig1.jpg" alt="איור 1"/> באיור 1. סקירה של הניסוי. ב assay refolding vivo דורש 3 עד 4 ימים להסתיים. ביום 1 תאים seeded ו transfected. תאים למחרת הם splitted לפורמט קטן יותר ביום 3 הם חום בהלם. בשלב זה ניתן לבצע את assay בלוציפראז מיד לאחר קצירת התאים או לשמור את תא גלולה ב -80 ° C ו לבצע את assay עוד רגע _content &quot;&gt; <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig2.jpg" alt="איור 2"/> באיור 2. חלוקת התא. ביום 2 תאים מחולקים צלחת 6 באר. כל transfection יהיה מדולל היטב על מנת לקבל את כל transfection בצלחת אחת. כל צלחת יתאים זמן החלמה מסוים בתוספת צלחת ללא התייחסות בהלם. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig3.jpg" alt="איור 3"/> באיור 3. תוצאה טובה נציג. שיעור א &#39;של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות גחלילית בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר (קו שחור) ובנוכחות (הקו האדום) של המלווה. ערכי r בריבוע עולה מתאם טוב. ב Fig.3A מוצג תוצאות נציג שבו תאים שנאספו דקות 15, 30, 45, 60 ו - 120 לאחר הלם החום בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרית. אחוז וקיפלתי מגביר בלוציפראז עם זמן החלמה ממושך עם transfection של המלווה המולקולרית. המתאם בין refolding זמן לשליטה (איור 3B, קו שחור) לבין המלווה המולקולרי-transfected התאים (איור 3B, קו אדום) מוצגת. <img src="/files/ftp_upload/3540/3540fig4.jpg" alt="איור 4"/> איור 4. תוצאה רעה נציג. שיעור א &#39;של refolding נמדד ישירות על ידי פעילות בלוציפראז. כל תרשים בר מייצג את אחוז refolding בהעדר (פסים שחורים) ובנוכחות (מוטות אדום) של המלווה מולקולרי בנקודות זמן שונות התאוששות. ב קורלציה בין זמן refolding בהעדר ובנוכחות (אדום line) של המלווה. הערכים מצביעים על מתאם r בריבוע רע. איור 4 א. מראה תוצאה נציג של ניסוי לא ביצע כראוי. גם הביקורת (פסים שחורים) לבין המלווה המולקולרי-transfected תאים (ברים אדומה) לא הראה עלייה חלבון refolding עם הזמן. בנוסף, transfection של המלווה המולקולרי לא הביא לעלייה של refolding. מתאם זה עני הוא אישר באיור. 4B מראה ערך r בריבוע של 0.6619 ו 0.1882 בהתאמה לשליטה (קו שחור) המולקולרית המלווה-transfected תאים (קו אדום).

<ol>
	<li>Bukau, B., Weissman, J., Horwich, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperones+and+protein+quality+control.">Molecular chaperones and protein quality control.</a> Cell. 125, 443-443 (2006).</li><li>Ritossa, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Discovery+of+the+heat+shock+response.">Discovery of the heat shock response.</a> Cell Stress Chaperones. 1, 97-97 (1996).</li><li>Hendrick, J. P., Hartl, F. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+chaperone+functions+of+heat-shock+proteins.">Molecular chaperone functions of heat-shock proteins.</a> Annu. Rev. Biochem. 62, 349-349 (1993).</li><li>Fuqua, S. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Heat+shock+proteins+and+drug+resistance.">Heat shock proteins and drug resistance.</a> Breast. Cancer. Res. Treat. 32, 67-67 (1994).</li><li>Guzhova, I., Margulis, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp70+chaperone+as+a+survival+factor+in+cell+pathology.">Hsp70 chaperone as a survival factor in cell pathology.</a> Int. Rev. Cytol. 254, 101-101 (2006).</li><li>Whitesell, L., Lindquist, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=HSP90+and+the+chaperoning+of+cancer.">HSP90 and the chaperoning of cancer.</a> Nat. Rev. Cancer. 5, 761-761 (2005).</li><li>Konstantinopoulos, P. A., Papavassiliou, A. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=17-AAG:+mechanisms+of+antitumour+activity.">17-AAG: mechanisms of antitumour activity.</a> Expert. Opin. Investig. Drugs. 14, 1471-1471 (2005).</li><li>Galluzzi, L., Giordanetto, F., Kroemer, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeting+HSP70+for+cancer+therapy.">Targeting HSP70 for cancer therapy.</a> Mol. Cell. 36, 176-176 (2009).</li><li>Ozacmak, V. H., Barut, F., Ozacmak, H. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Melatonin+provides+neuroprotection+by+reducing+oxidative+stress+and+HSP70+expression+during+chronic+cerebral+hypoperfusion+in+ovariectomized+rats.">Melatonin provides neuroprotection by reducing oxidative stress and HSP70 expression during chronic cerebral hypoperfusion in ovariectomized rats.</a> J. Pineal. Res. 47, 156-156 (2009).</li><li>Schroder, H., Langer, T., Hartl, F. U., Bukau, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=DnaK,+DnaJ+and+GrpE+form+a+cellular+chaperone+machinery+capable+of+repairing+heat-induced+protein+damage.">DnaK, DnaJ and GrpE form a cellular chaperone machinery capable of repairing heat-induced protein damage.</a> EMBO. J. 12, 4137-41 (1993).</li><li>Thulasiraman, V., Matts, R. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+geldanamycin+on+the+kinetics+of+chaperone-mediated+renaturation+of+firefly+luciferase+in+rabbit+reticulocyte+lysate.">Effect of geldanamycin on the kinetics of chaperone-mediated renaturation of firefly luciferase in rabbit reticulocyte lysate.</a> Biochemistry. 35, 13443-13443 (1996).</li><li>Howarth, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Hsp40+molecules+that+target+to+the+ubiquitin-proteasome+system+decrease+inclusion+formation+in+models+of+polyglutamine+disease.">Hsp40 molecules that target to the ubiquitin-proteasome system decrease inclusion formation in models of polyglutamine disease.</a> Mol. Ther. 15, 1110-1110 (2007).</li><li>Nollen, E. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bag1+functions+in+vivo+as+a+negative+regulator+of+Hsp70+chaperone+activity.">Bag1 functions in vivo as a negative regulator of Hsp70 chaperone activity.</a> Mol. Cell. Biol. 20, 1083-1083 (2000).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

בעבודה זו בפרוטוקול כדי למדוד את פעילות refolding תאיים של מלווים מולקולרית מוצג. Assay כולו ניתן לבצע 3 עד 4 ימים כפי שמוצג על ידי סקירה של איור. 1. עמידות ליניאריות של אות אור המיוצר על ידי גחלילית ואת בלוציפראז renilla מהווים בסיס ?...

לצורך ניסוי זה &quot;אור וקטור&quot; צורה Luminometer פרקין אלמר &#39;1420 הארה מונה שימשה תוכניות Luminometer: Renilla: משאבה 1, 100 הזרקה μl מאגר התגובה: Pump1, 70 הזרקה μl Luciferin: Pump2, הזרקת 30μl עבור מאגרים להכין פתרונות אלו המניות מים מזוקקים כפול: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M MgSO 4: 246,48 גרם MgSO 4 * 7H 2 O ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0,5 M EGTA: 190,18 גרם EGTA ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M KH 2 PO 4: 136,09 גרם KH 2 PO 4 ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1M K2 HPO 4: 228,23 גרם K 2 HPO 4 * 3H 2 O ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - NaCl 5M: 292,2 גרם NaCl ב 1 ליטר </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0,5 M EDTA: 186,12 גרם EDTA * 2H 2 O ב 1 ליטר &nbsp;</li></ul> גלאי, גלאי-חיץ: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 25mm Glycylglycin </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 15mm MgSO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 4 מ&quot;מ EGTA </li></ul> עבור 1 ליטר להשתמש 3,3 גרם Glycylglycin, 15 מ&quot;ל של פתרון MgSO4 1M ו 8ml של פתרון 0,5 EGTA ז. לפתור במים, כדי להתאים את pH 7,8 ומביאים בהיקף כולל של 1 ליטר. תגובת חיץ חיץ עבור Renilla / Coelenterazine: <ul style="list-style:none;text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - &amp; Nbsp; 13,4 mM KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 86,6 mM KH 2 PO 4 </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 0.5 M NaCl </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> - 1mm EDTA </li></ul> עבור 1 מ&quot;ל להשתמש 13,4 ליטר פתרון 1M KH 2 PO 4, 86,6 מ&quot;ל של פתרון 1M K 2 HPO 4, 100 מ&quot;ל של תמיסת NaCl 2ml 5M של פתרון 0.5 EDTA M. <table border="1" style=";text-align:right;direction:rtl"><tr><td></td><td> חברה </td><td> קטלוג / מספר מוצר: </td></tr><tr><td> DMEM (השתנה Dulbecco הנשר בינוני 1X) </td><td> GIBCO </td><td> 41966029 </td></tr><tr><td> עוברית זהב בסרום שור </td><td> PAA </td><td> ת 15-151 </td></tr><tr><td> X-treme ג&#39;ין 9 Transfection DNA מגיב </td><td> רוש </td><td&gt; 06365809001 </td></tr><tr><td> PBS פוספט של Dulbecco בופר 1X </td><td> GIBCO </td><td> 14190-094 </td></tr><tr><td> מגבים 3 - (N-Morpholino) Propanesulfonic חומצה </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> M1254 </td></tr><tr><td> Cycloheximide </td><td> Sigma-Aldrich </td><td> C7698 </td></tr><tr><td> תמוגה הצפת פסיבי 5X </td><td> Promega </td><td> E194A </td></tr><tr><td> Glycylglycin EGTA MgSO 4 (4 * MgSO 7H 2 O) </td><td> Sigma-Aldrich רוט רוט </td><td> G7278 3054.2 P027.1 </td></tr><tr><td> KH 2 PO 4 K 2 HPO 4 (K 2 HPO 4 * 3H 2 O) NaCl EDTA </td><td> רוט רוט רוט רוט </td><td> 3904.1 6878.2 3957.1 8043.1 </td></tr><tr><td> Luciferin Firefly </td><td> ביוסינט </td><td> L8200 </td></tr><tr><td> Coelenterazine </td><td> ביוסינט </td><td> C7000 </td></tr><tr><td> DTT (Dithiothreitol) </td><td> רוט </td><td> 6908.2 </td></tr><tr><td> ה-ATP (אדנוזין טריפוספט) </td><td> רוש </td><td> 10519987001 </td></tr></table>

intracellular refolding assay

פרוטוקול זה מתאר שיטה כדי למדוד את הפעילות האנזימטית של מלווים מולקולרית במערכת התא מבוסס ואת ההשפעות האפשריות של תרכובות בעלות פעילות המעכבת / מגרה. מלווים מולקולרית הם חלבונים המעורבים בוויסות של החלבון המתקפל 1 יש תפקיד מכריע בקידום ההישרדות תא הלחץ על עלבונות כמו מכת חום 2, רעב מזין וחשיפה לכימיקלים / רעלים 3. מסיבה זו מלווים הם מצאו להיות מעורבים באירועים כמו התפתחות הגידול, chemioresistance של 4 תאים סרטניים, כמו גם ניוון מוחיים 5. עיצוב של מולקולות קטנות מסוגל לעכב או להמריץ את הפעילות של אנזימים אלה ולכן הוא אחת האסטרטגיות ביותר למד לטיפול בסרטן ומחלות ניווניות 7 9. Assay המתואר כאן מציע את האפשרות למדוד את פעילות refolding של המלווה מולקולרי מסוים ללמוד את ההשפעה של compounds על פעילותה. בשיטה זו הגן של המלווה המולקולרי הוא נחקר transfected יחד עם קידוד ביטוי עבור וקטור הגן בלוציפראז גחלילית. היא תוארה כבר denaturated בלוציפראז גחלילית ניתן וקיפלתי על ידי מלווים מולקולרית 10,11. כמו נורמליזציה מלאה transfection, קידוד וקטור עבור הגן בלוציפראז renilla הוא transfected. Transfections כל המתואר בפרוטוקול זה מבוצעות עם X-treme ג&#39;ין 11 (Roche) ב HEK-293 תאים. בשלב הראשון, סינתזת החלבון היא מעוכבת על ידי טיפול בתאי עם cycloheximide. לאחר מכן חלבון התגלגלות הוא המושרה על ידי הלם חום 45 מעלות צלזיוס במשך 30 דקות. לאחר התאוששות ב 37 ° C, חלבונים מחדש מקופל לתוך קונפורמציה פעילה שלהם את הפעילות של בלוציפראז גחלילית משמש לקריאה מתוך: האור יותר יופק, החלבון יותר יהיה מחדש זכתה קונפורמציה המקורי. ללא חום תאים בהלם מוגדרות כנקודת התייחסות (100% מכלל וקיפלתיבלוציפראז).

Watch this Scientific Journal Video about Intracellular Refolding Assay at JoVE.com

Intracellular Refolding Assay

בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.

שב וקיפל תאיים Assay

This protocol describes a method to measure the enzymatic activity of molecular chaperones in a cell-based system and the possible effects of compounds ...

Research

JoVE Journal

Biology

14.1K Views.  Karlsruhe Institute of Technology. בפרוטוקול בשיטה זו כדי למדוד refolding חלבון תאיים לאחר הלם החום מתואר. שיטה זו יכולה לשמש כדי ללמוד foldases כמו מלווים המולקולרית שלהם שיתוף גורמים או תרכובות מסוגל להשפיע על פעילותם. פעילות גחלילית בלוציפראז משמש ככתב למדוד refolding פעילות המלווה.

Video: Intracellular Refolding Assay

Measuring Near Plasma Membrane and Global Intracellular Calcium Dynamics in Astrocytes

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, increasing evidence suggests that astrocytes may also actively participate in brain function through functional interactions with neurons.  However, many fundamental aspects of astrocyte biology remain controversial, unclear and/or experimentally unexplored. One important issue is the dynamics of intracellular calcium transients in astrocytes. This is relevant because calcium is well established as an important second messenger and because it has been proposed that astrocyte calcium elevations can trigger the release of transmitters from astrocytes. However, there has not been any detailed or satisfying description of near plasma membrane calcium signaling in astrocytes. Total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy is a powerful tool to analyze physiologically relevant signaling events within about 100 nm of the plasma membrane of live cells. Here, we use TIRF microscopy and describe how to monitor near plasma membrane and global intracellular calcium dynamics almost simultaneously. The further refinement and systematic application of this approach has the potential to inform about the precise details of astrocyte calcium signaling. A detailed understanding of astrocyte calcium dynamics may provide a basis to understand if, how, when and why astrocytes and neurons undergo calcium-dependent functional interactions.

We describe how to measure near membrane and global intracellular calcium dynamics in cultured astrocytes using total internal reflection and epifluorescence microscopy.

מדידת הקרוב ממברנה פלזמה ו Global Dynamics סידן תאיים בתוך האסטרוציטים

The brain contains glial cells.  Astrocytes, a type of glial cell, have long been known to provide a passive supportive role to neurons. However, ...

A Method for Mouse Pancreatic Islet Isolation and Intracellular cAMP Determination

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing prevalence of diabetes, both immune-mediated type 1 and obesity-linked type 2, studies aimed at delineating diabetes pathophysiology and therapeutic mechanisms are of critical importance. The &#946;-cells of the pancreatic islets of Langerhans are responsible for appropriately secreting insulin in response to elevated blood glucose concentrations. In addition to glucose and other nutrients, the &#946;-cells are also stimulated by specific hormones, termed incretins, which are secreted from the gut in response to a meal and act on &#946;-cell receptors that increase the production of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP). Decreased &#946;-cell function, mass, and incretin responsiveness are well-understood to contribute to the pathophysiology of type 2 diabetes, and are also being increasingly linked with type 1 diabetes. The present mouse islet isolation and cAMP determination protocol can be a tool to help delineate mechanisms promoting disease progression and therapeutic interventions, particularly those that are mediated by the incretin receptors or related receptors that act through modulation of intracellular cAMP production. While only cAMP measurements will be described, the described islet isolation protocol creates a clean preparation that also allows for many other downstream applications, including glucose stimulated insulin secretion, [3H]-thymidine incorporation, protein abundance, and mRNA expression.

Assaying in vitro &#946;-cell function using isolated mouse islets of Langerhans is an important component in the study of diabetes pathophysiology and therapeutics. While many&#160;downstream applications are available, this protocol specifically describes the measurement of intracellular cyclic adenosine monophosphate (cAMP) as an essential parameter determining &#946;-cell function.

שיטה לבידוד עכבר הלבלב איילט וקביעת תאית cAMP

Uncontrolled glycemia is a hallmark of diabetes mellitus and promotes morbidities like neuropathy, nephropathy, and retinopathy. With the increasing ...

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must be maintained to avoid deleterious consequences 1. External or internal factors that disrupt this balance can lead to protein aggregation, toxicity and cell death. In humans this is a major contributing factor to the symptoms associated with neurodegenerative disorders such as Huntington's, Parkinson's, and Alzheimer's diseases 10. It is therefore essential that the proteins involved in maintenance of proteostasis be identified in order to develop treatments for these debilitating diseases. This article describes techniques for monitoring in vivo protein folding at near-real time resolution using the model protein firefly luciferase fused to green fluorescent protein (FFL-GFP). FFL-GFP is a unique model chimeric protein as the FFL moiety is extremely sensitive to stress-induced misfolding and aggregation, which inactivates the enzyme 12. Luciferase activity is monitored using an enzymatic assay, and the GFP moiety provides a method of visualizing soluble or aggregated FFL using automated microscopy. These coupled methods incorporate two parallel and technically independent approaches to analyze both refolding and functional reactivation of an enzyme after stress. Activity recovery can be directly correlated with kinetics of disaggregation and re-solubilization to better understand how protein quality control factors such as protein chaperones collaborate to perform these functions. In addition, gene deletions or mutations can be used to test contributions of specific proteins or protein subunits to this process. In this article we examine the contributions of the protein disaggregase Hsp104 13, known to partner with the Hsp40/70/nucleotide exchange factor (NEF) refolding system 5, to protein refolding to validate this approach.

Coupled Assays for Monitoring Protein Refolding in Saccharomyces cerevisiae

This article describes the use of a firefly luciferase-GFP fusion protein to investigate in vivo protein folding in Saccharomyces cerevisiae. Using this reagent, refolding of a model heat-denatured protein can be monitored simultaneously by fluorescence microscopy and an enzymatic assay to probe the roles of proteostasis network components in protein quality control.

מבחני יחד לrefolding החלבון בניטור<em&gt; Cerevisiae Saccharomyces</em

Proteostasis, defined as the combined processes of protein folding/biogenesis, refolding/repair, and degradation, is a delicate cellular balance that must ...

Intravital Microscopy for Imaging Subcellular Structures in Live Mice Expressing Fluorescent Proteins

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, we use the salivary glands of live mice since they provide several advantages. First, they can be easily exposed to enable access to the optics, and stabilized to facilitate the reduction of the motion artifacts due to heartbeat and respiration. This significantly facilitates imaging and tracking small subcellular structures. Second, most of the cell populations of the salivary glands are accessible from the surface of the organ. This permits the use of confocal microscopy that has a higher spatial resolution than other techniques that have been used for in vivo imaging, such as two-photon microscopy. Finally, salivary glands can be easily manipulated pharmacologically and genetically, thus providing a robust system to investigate biological processes at a molecular level.
In this study we focus on a protocol designed to follow the kinetics of the exocytosis of secretory granules in acinar cells and the dynamics of the apical plasma membrane where the secretory granules fuse upon stimulation of the beta-adrenergic receptors. Specifically, we used a transgenic mouse that co-expresses cytosolic GFP and a membrane-targeted peptide fused with the fluorescent protein tandem-Tomato. However, the procedures that we used to stabilize and image the salivary glands can be extended to other mouse models and coupled to other approaches to label in vivo cellular components, enabling the visualization of various subcellular structures, such as endosomes, lysosomes, mitochondria, and the actin cytoskeleton.

Intravital microscopy is a powerful tool that enables imaging various biological processes in live animals. In this article, we present a detailed method for imaging the dynamics of subcellular structures, such as the secretory granules, in the salivary glands of live mice.

מיקרוסקופית Intravital למבני ההדמיה subcellular בעכברים חיים לבטא חלבוני פלורסנט

Here we describe a procedure to image subcellular structures in live rodents that is based on the use of confocal intravital microscopy. As a model organ, ...

Imaging the Intracellular Trafficking of APP with Photoactivatable GFP

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the sequential cleavage of Amyloid Precursor Protein (APP) by &#946; and &#947;-secretases. Despite the importance of A&#946; to AD pathology, the subcellular localization of these cleavages is not well established. Work in our laboratory and others implicate the endosomal/lysosomal system in APP processing after internalization from the cell surface. However, the intracellular trafficking of APP is relatively understudied.
While cell-surface proteins are amendable to many labeling techniques, there are no simple methods for following the trafficking of membrane proteins from the Golgi. To this end, we created APP constructs that were tagged with photo-activatable GFP (paGFP) at the C-terminus. After synthesis, paGFP has low basal fluorescence, but it can be stimulated with 413 nm light to produce a strong, stable green fluorescence. By using the Golgi marker Galactosyl transferase coupled to Cyan Fluorescent Protein (GalT-CFP) as a target, we are able to accurately photoactivate APP in the trans-Golgi network. Photo-activated APP-paGFP can then be followed as it traffics to downstream compartments identified with fluorescently tagged compartment marker proteins for the early endosome (Rab5), the late endosome (Rab9) and the lysosome (LAMP1). Furthermore, using inhibitors to APP processing including chloroquine or the &#947;-secretase inhibitor L685, 458, we are able to perform pulse-chase experiments to examine the processing of APP in single cells.
We find that a large fraction of APP moves rapidly to the lysosome without appearing at the cell surface, and is then cleared from the lysosome by secretase-like cleavages. This technique demonstrates the utility of paGFP for following the trafficking and processing of intracellular proteins from the Golgi to downstream compartments.

While the transport of cell surface proteins is relatively easily studied, visualizing the trafficking of intracellular proteins is much more difficult. Here, we use constructs incorporating photoactivatable GFP and demonstrate a method to accurately follow the amyloid precursor protein from the Golgi apparatus to down-stream compartments and follow its clearance.

הדמיה הסחר תאיים של APP עם GFP Photoactivatable

Beta-amyloid (A&#946;) is the major constituent of senile plaques found in the brains of Alzheimer&#8217;s disease patients. A&#946; is derived from the ...

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of (His)6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein belonging to the prion family. A chromatographic method for the purification of (His)6-tagged recombinant Shadoo expressed as inclusion bodies is described. The inclusion bodies are solubilized in 8 M urea and bound to a Ni2+-charged column to perform ion affinity chromatography. Bound proteins are eluted by a gradient of imidazole. Fractions containing Shadoo protein are subjected to size exclusion chromatography to obtain a highly purified protein. In the final step purified Shadoo is desalted to remove salts, urea and imidazole. Recombinant Shadoo protein is an important reagent for biophysical and biochemical studies of protein conformation disorders occurring in prion diseases. Many reports demonstrated that prion neurodegenerative diseases originate from the deposition of stable, ordered amyloid fibrils. Sample protocols describing how to fibrillate Shadoo into amyloid fibrils at acidic and neutral/basic pHs are presented. The methods on how to produce and fibrillate Shadoo can facilitate research in laboratories working on prion diseases, since it allows for production of large amounts of protein in a rapid and low cost manner.

Purification and Refolding to Amyloid Fibrils of His6-tagged Recombinant Shadoo Protein Expressed as Inclusion Bodies in E. coli

A two-step chromatographic method is described for the purification of recombinant Shadoo protein expressed as inclusion bodies in Escherichia coli, as well as a protocol to fibrillate purified Shadoo into amyloid structures.

טיהור וקפל שוב לעמילואיד סיבים של (שלו)<sub&gt; 6</sub&gt; חלבון רקומביננטי Shadoo -tagged מבוטא גופי הכללה ב<em&gt; חיידק</em

The Escherichia coli expression system is a powerful tool for the production of recombinant eukaryotic proteins. We use it to produce Shadoo, a protein ...

Identification of Intracellular Signaling Events Induced in Viable Cells by Interaction with Neighboring Cells Undergoing Apoptotic Cell Death

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent live cells. Vital activities, such as survival, proliferation, growth, and differentiation, are among the many cellular functions modulated by apoptotic cells. The ability to recognize and respond to apoptotic cells appears to be a universal feature of all cells, regardless of lineage or organ of origination. However, the diversity and complexity of the response to apoptotic cells mandates that great care be taken in dissecting the signaling events and pathways responsible for any particular outcome. In particular, one must distinguish among the multiple mechanisms by which apoptotic cells can influence intracellular signaling pathways within viable responder cells, including: receptor-mediated recognition of the apoptotic cell, release of soluble mediators by the apoptotic cell, and/or engagement of the phagocytic machinery. Here, we provide a protocol for identifying intracellular signaling events that are induced in viable responder cells following their exposure to apoptotic cells. A major advantage of the protocol lies in the attention it pays to dissection of the mechanism by which apoptotic cells modulate signaling events within responding cells. While the protocol is specific for a conditionally immortalized mouse kidney proximal tubular cell line (BU.MPT cells), it is easily adapted to cell lines that are non-epithelial in origin and/or derived from organs other than the kidney. The use of dead cells as a stimulus introduces several unique factors that can hinder the detection of intracellular signaling events. These problems, as well as strategies to minimize or circumvent them, are discussed within the protocol. Application of this protocol should aid our expanding knowledge of the broad influence that dead or dying cells exert on their live neighbors, both in health and in disease.

Here, we present a protocol for the determination of intracellular signaling events induced in viable cells by physical interaction with adjacent dead or dying cells. The protocol focuses on signaling events induced by receptor-mediated recognition of the dead cells, as opposed to their phagocytic uptake or release of soluble mediators.

זיהוי של איתות תאיים אירועים מושרה תאים קיימא על ידי אינטראקציה עם תאים שכנים מוות של תאים אפופטוטיים שעברו

Cells dying by apoptosis, also referred to as regulated cell death, acquire multiple new activities that enable them to influence the function of adjacent ...

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH (pHi) is influenced by many ion transporters and thus monitoring pHi is a useful tool for assessing transporter activity. Modern Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs) provide optical quantification of pHi in intact cells on a cellular and subcellular scale. This protocol describes real-time quantification of cellular pHi regulation in Malpighian Tubules (MTs) of Drosophila melanogaster through ex vivo live-imaging of pHerry, a pseudo-ratiometric GEpHI with a pKa well-suited to track pH changes in the cytosol. Extracted adult fly MTs are composed of morphologically and functionally distinct sections of single-cell layer epithelia, and can serve as an accessible and genetically tractable model for investigation of epithelial transport. GEpHIs offer several advantages over conventional pH-sensitive fluorescent dyes and ion-selective electrodes. GEpHIs can label distinct cell populations provided appropriate promoter elements are available. This labeling is particularly useful in ex vivo, in vivo, and in situ preparations, which are inherently heterogeneous. GEpHIs also permit quantification of pHi in intact tissues over time without need for repeated dye treatment or tissue externalization. The primary drawback of current GEpHIs is the tendency to aggregate in cytosolic inclusions in response to tissue damage and construct over-expression. These shortcomings, their solutions, and the inherent advantages of GEpHIs are demonstrated in this protocol through assessment of basolateral proton (H+) transport in functionally distinct principal and stellate cells of extracted fly MTs. The techniques and analysis described are readily adaptable to a wide variety of vertebrate and invertebrate preparations, and the sophistication of the assay can be scaled from teaching labs to intricate determination of ion flux via specific transporters.

Optical Quantification of Intracellular pH in Drosophila melanogaster Malpighian Tubule Epithelia with a Fluorescent Genetically-encoded pH Indicator

Cellular ion transport can often be assessed by monitoring intracellular pH (pHi). Genetically Encoded pH-Indicators (GEpHIs)&#160;provide optical quantification of intracellular pH in intact cells. This protocol details the quantification of intracellular pH through cellular ex vivo live-imaging of Malpighian tubules of Drosophila melanogaster with pHerry, a pseudo-ratiometric genetically encoded pH-indicator.

PH כימות של תאיים אופטי בדרוזופילה melanogaster צנורית Malpighian Epithelia עם pH מקודד פלורסנט גנטית מחוון

Epithelial ion transport is vital to systemic ion homeostasis as well as maintenance of essential cellular electrochemical gradients. Intracellular pH ...

Lens-free Video Microscopy for the Dynamic and Quantitative Analysis of Adherent Cell Culture

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator and that it is possible to monitor and quantify single cells along several cell cycles. We describe the full protocol used to monitor and quantify a HeLa cell culture for 2.7 days. First, cell culture acquisition is performed with a lens-free video microscope, and then the data is analyzed following a four-step process: multi-wavelength holographic reconstruction, cell-tracking, cell segmentation and cell division detection algorithms. As a result, we show that it is possible to gather a dataset featuring more than 10,000 cell cycle tracks and more than 2 x 106 cell morphological measurements.

Lens-free video microscopy enables us to monitor cell cultures directly inside the incubator. Here we describe the full protocol used to acquire and analyze a 2.7 day long acquisition of cultured HeLa cells, leading to a dataset of 2.2 x 106 measurements of individual cell morphology and 10584 cell cycle tracks.

ללא עדשה מיקרוסקופ וידאו עבור הדינמיקה וניתוח כמותי של תרבית תאים חסיד

Here, we demonstrate that lens-free video microscopy enables us to simultaneously capture the kinetics of thousands of cells directly inside the incubator ...

Simultaneous Measurements of Intracellular Calcium and Membrane Potential in Freshly Isolated and Intact Mouse Cerebral Endothelium

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the lumen of blood vessels and command changes in vascular diameter as needed to meet the metabolic demand of neurons. Primary endothelial-dependent signaling pathways of hyperpolarization of membrane potential (Vm) and nitric oxide typically operate in parallel to mediate vasodilation and thereby increase blood flow. Although integral to coordinating vasodilation over several millimeters of vascular length, components of endothelium-derived hyperpolarization (EDH) have been historically difficult to measure. These components of EDH entail intracellular Ca2+ [Ca2+]i increases and subsequent activation of small- and intermediate conductance Ca2+-activated K+ (SKCa/IKCa) channels.
Here, we present a simplified illustration of the isolation of fresh endothelium from mouse cerebral arteries; simultaneous measurements of endothelial [Ca2+]i and Vm using Fura-2 photometry and intracellular sharp electrodes, respectively; and a continuous superfusion of salt solutions and pharmacological agents under physiological conditions (pH 7.4, 37 &#176;C). Posterior cerebral arteries from the Circle of Willis are removed free of the posterior communicating and the basilar arteries. Enzymatic digestion of cleaned posterior cerebral arterial segments and subsequent trituration facilitates removal of adventitia, perivascular nerves, and smooth muscle cells. Resulting posterior cerebral arterial endothelial &#34;tubes&#34; are then secured under a microscope and examined using a camera, photomultiplier tube, and one to two electrometers while under continuous superfusion. Collectively, this method can simultaneously measure changes in endothelial [Ca2+]i and Vm in discrete cellular locations, in addition to the spreading of EDH through gap junctions up to millimeter distances along the intact endothelium. This method is expected to yield a high-throughput analysis of the cerebral endothelial functions underlying mechanisms of blood flow regulation in the normal and diseased brain.

Demonstrated here are protocols for (1) freshly isolating intact cerebral endothelial "tubes" and (2) simultaneous measurements of endothelial calcium and membrane potential during endothelium-derived hyperpolarization. Further, these methods allow for pharmacological tuning of endothelial cell calcium and electrical signaling as individual or interactive experimental variables.

מדידות סימולטני של סידן תאיים, פוטנציאל ממברנה אנדותל מוחי העכבר טרי מבודדת ללא פגע

Cerebral arteries and their respective microcirculation deliver oxygen and nutrients to the brain via blood flow regulation. Endothelial cells line the ...