אנו מודים לכריס ובסטר לביצוע הניסויים הראשוניים שמוצגים באיור 3 תוצאות הנציג וג&#39;ייסון ווטס וכריס וובסטר על הערות מועילות על כתב היד. מימון למחקר זה מסופק על ידי מענק מהמכון הלאומי לבריאות (ארה&quot;ב) (R01DK074114) לJLW. זני נמטודות חלקם משמשים בעבודה זו סופקו על ידי המרכז לגנטיקת Caenorhabditis, אשר ממומן על ידי משרד NIH של תוכניות תשתיות מחקר (OD010440 P40).

חומצות שומן רב בלתי רוויות הן רגישות לחום, אור וחמצן. לכן, יש להקפיד בעת הכנת צלחות תוספי חומצת שומן כך שחומצות שומן אינן חשופות לחום והאור עודפים. תקשורת NGM מכילה 0.1% Tergitol (NP-40) היא autoclaved ומקורר באופן חלקי, לאחר שמלחי נתרן חומצת שומן נוספים עם ערבוב מתמיד. הצלחות להתייבש בחושך. ספיגה של חומצות שומן על ידי ג elegans תרבית על צלחות אלה אז יכולים להיות במעקב על ידי גז כרומטוגרפיה. 1. הכנה של חומצות שומן בתוספת תקשורת <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למדוד את רכיבי תקשורת לבקבוק בגודל מתאים. לכל 1 ליטר, להוסיף 17 גרם Bacto-אגר, 2.5 tryptone גרם, 3 גרם NaCl, 1 מיליליטר כולסטרול 5 מ&quot;ג / מיליליטר מומס באתנול, ו10 מיליליטר 10% Tergitol מומסים במים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 80% מנפח רצוי הסופי של המים Millipore וחיטוי התקשורת יחד עם בקבוקי זכוכית ריקה (שווה למספר שונהריכוז חומצות שומן להיבדק), כמו גם מתאים סיים צילינדרים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדיה מגניב באמבט מים מוגדר 55 ° C. בעוד התקשורת היא הקירור להכין פתרון המניות החוזרת בסך של מלח נתרן של חומצות שומן על ידי שבירה הפתוחה בקבוקון הזכוכית, תוך שימוש באמצעי בטיחות ולהבטיח חלקיקי זכוכית לא מתערבבים עם חומצות השומן. לשקול את חומצת שומן מספיק כדי להפוך את המניה עובדת 100 מ&quot;מ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תביא את פתרון חומצת שומן לריכוז סופי של במים מטוהרים 100 מ&quot;מ. מלא המסת מלח נתרן חומצת שומן בדרך כלל לוקחת בערך 20-30 דקות. טהר את המניות החוזרות של חומצת שומן עם ארגון או חנקן, בגלל מגע עם גז אינרטי מונע חמצון. מכסה את הבקבוקון ולאחסן את המניה עובדת בחושך עד התקשורת התקררה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) אם תקשורת RNAi היא רצויה, למדוד אמפיצילין ופתרונות איזופרופיל β-D-1-thiogalactopyranoside (IPTG) כאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר אגר מתקרר ל55 ° C להוסיף לL 1: 1מיליליטר של 1 M MgSO 4, 1 מיליליטר של 1 M CaCl 2, ו25 מיליליטר של חיץ פוספט (ז KH 108.3 2 PO 4 ו35.6 g K 2 HPO 4 לL 1 autoclaved). הוסף את אמפיצילין מעוקר המסנן ופתרונות IPTG אם עושה צלחות RNAi. לכל סוגי צלחות, להוסיף מים סטריליים כדי להביא את הנפח הסופי תקשורת ל1 ל &#39; </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליד להבה, להעביר את התקשורת לautoclaved והגודל מתאים גליל סיים ולאחר מכן להוסיף את המים סטריליים חמים לעצמה רצויה. להעביר את התקשורת בחזרה לבקבוק ראשוני ומערבבים על ידי ערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ליד להבה, להעביר את התקשורת למספר הבקבוקים שווים למספר של ריכוזים להיבדק על ידי מדידה עם autoclaved וגודל מתאים גליל סיים. לשמור על תקשורת aliquoted כנוזלי באמצעות אמבט מים עד שהמנייה פועלת חומצת השומן נמסה באופן מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח בקבוק אחד בצלחת ומערבבים ומערבבים עד שהתקשורת היא חמה למגע, אך לא חמה. הקפד להשאיר את עצמך מספיקזמן לבחוש בפתרון מניות חומצת שומן ויוצקים צלחות לפני התקשורת מתחילה לחזק. אם צלחת ומערבבים יש בקרת טמפרטורה, להגדיר אותו 55 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לדלל את המניות פועלות חומצת שומן 100 מ&quot;מ לתוך התקשורת לריכוז הסופי הרצוי. תקשורת ומערבבים עד שהמשקע הלבן היא בפתרון (כ 1 דק &#39;). תקשורת עדיין עשויה להיות מעט מעונן לאחר מכן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> (אופציונאלי) אם תקשורת RNAi היא רצויה אמפיצילין תוספת ל0.1 מ&quot;ג / מיליליטר ו IPTG ל2 מ&quot;מ ריכוז סופי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יוצקים תקשורת באמצעות סיוע פיפטה אוטומטית וטפטף מיליליטר סטרילי 25, והוסיף 8 מיליליטר של תקשורת ל60 צלחת מ&quot;מ או 25 מיליליטר של תקשורת לכל 100 צלחת מ&quot;מ. חזור בנוסף חומצת שומן וצלחת לשפוך צעדים לבקבוקים שנותרו. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר אגר יש הקרושה, לכסות את הצלחות בתוספת חומצת שומן עם תיבה או לאחסן בטמפרטורת חדר במגירה פרקה היטב כדי להגן מפני התחמצנות אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זרע E. coli OP50 לצלחות יומיים לאחר הצלחות התייבשו.לצלחות 60 מ&quot;מ, פיפטה 300 μl של תרבות לילה OP50 (גדלה על 37 מעלות צלזיוס). אם צלחות RNAi נוצקו, זרע עם 300 μl של חיידקי RNAi לאחר הצלחות התייבשו במשך ארבעה ימים. זמן ייבוש פלייט ייתכן שיצטרך להיות מותאם, בשל הבדלים בלחות בסביבות מעבדה שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה הצלחות בסביבה חשוכה בטמפרטורת חדר ואילו דשא החיידקים מתייבש. </li></ol> 2. גרימת הרס תאים נבט על ידי תוספת של DGLA <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> C. elegans גדל על צלחות המכילות 0.3 מ&quot;מ DGLA (20:03 n-6) הפך עקר בשל ההרס של תאי נבט בשני נמטודות הבמה והמבוגר הזחל. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את אוכלוסייה מסונכרנת של זחלי L1 ידי טיפול הרמפרודיטים הרה להולדת עם פתרון היפוכלוריט אלקליין (לפתרון 10 מיליליטר: 0.5 מיליליטר של 5M NaOH, 2.5 מיליליטר של אקונומיקה, ו7 מיליליטר H 2 O). נער בעדינות את הרמפרודיטים הרה להולדת בפתרון זה עד שהתולעת הבוגרתים לפזר. ביצים יישמרו, וניתן pelleted על ידי צנטריפוגה במהירות הנמוכה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף הכנת ביצה 3 פעמים בחיץ M9 (ז KH 3 2 PO 4, 6 גרם Na 2 HPO 4, 5 גרם NaCl, 1 מיליליטר 1 M MgSO 4, H 2 O ל 1 ל הוסף 4 MgSO לאחר מעוקר). כדי לספק מספיק חמצן, resuspend את הביצים בצינור פלסטיק 15 מיליליטר לנפח סופי של 5 מיליליטר של חיץ M9 ורוק על שייקר לילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> זחלי L1 יש להוסיף לצלחות בתוספת שני ימים לאחר זריעה עם OP50, או יום אחד לאחר ציפוי חיידקי RNAi. דגירה תולעים ב20 מעלות צלזיוס למשך שלושה ימים או עד שהם מגיעים לשלב הבוגר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעים בוגרות יכולות להיות הבקיע על סטריליות באמצעות מיקרוסקופ לנתח עם הגדלה גבוהה מספיק כדי לדמיין את העוברים המתפתחים ברחם. אובדן תאי נבט מוצלח יופיע כחלל רחם ברור של ביצים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יכולים גם להיות הבקיע תולעים על ידי תיקון וצביעה עם הגרעיןdiamindinophenylindole CID צבע (DAPI), המאפשר ההדמיה של גרעינים בתאי נבט ועוברים מתפתחים. כתם DAPI מהיר מושגת על ידי בחירת תולעים לירידה של חיץ M9 על watchglass 9. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מבול שעון זכוכית עם 1 מיליליטר של 0.2 ng / m. DAPI ב95% אתנול פתרון, תנו לשבת במשך כ 5 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פיק תולעים לירידה של Vectashield בשקופית, ולאחר מכן לכסות עם coverslip. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> coverslip החותם ולאחסן ב 4 מעלות צלזיוס בלילה החשוך עבור מכתים אופטימלי, עם זאת, ניתן גם לראות שקופיות באופן מיידי. ציון לקיומו או העדרו של גרעין תא חיידק באמצעות מיקרוסקופ פלואורסצנטי מצויד במנורת UV ומסנן. </li></ol></li></ol> 3. המאשר את חומצת שומן ספיגה על ידי גז כרומטוגרפיה הרכב חומצות שומן כולל של ג elegans יכול להיקבע על ידי ייצור אסטרים מתילים של חומצות שומן (fames) אשר לאחר מכן הם נפרדו ולכמת באמצעות Chr גזomatography 4. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף 500-1,000 תולעים בוגרות על ידי שטיפתם מעל הצלחות עם מים והעברה לצינור silanized 13 מ&quot;מ x 100 מ&quot;מ בורג זכוכית עליון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בואו תולעים ליישב על ידי כוח הכבידה, ולאחר מכן להסיר כמה שיותר מים ככל האפשר עם זכוכית פיפטה פסטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף תולעי פעם אחת עם מים, ולאחר מכן שוב להסיר כמה שיותר מים ככל האפשר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Fames נוצרים על ידי הוספת 1 ​​מיליליטר של .2.5% H 2 SO 4 במתנול, ולאחר מכן חימום ב70 מעלות צלזיוס במשך שעה 1 באמבט מים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינורות מן אמבט המים ולקרר דקות 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלץ fames ידי הוספת 1.5 מיליליטר מים ו0.25 מיליליטר של הקסאן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צינורות וRecap לנער במרץ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה צינורות בצנטריפוגה קלינית שולחן 1 דקות במהירות המרבית כדי להפריד הקסאן מממס מימיים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העבר הקסאן (שכבה עליונה) כדי להוסיף בקבוקון GC בתוך בקבוקון GC, נזהר שלא להעביר כל השלב מימי. לGCnalysis, 1-2 μl של fames בהקסאן מוזרק על עמודת גז כרומטוגרפיה קוטב נימים מתאימה לניתוח fames. מזרק GC Agilent 7890 מוגדר ב250 מעלות צלזיוס, עם קצב זרימה של 1.4 מיליליטר / דקה, ותנור GC מתוכנת לטמפרטורה ההתחלתית של 130 ° C, המוחזקת על דקות 1. בהמשך לכך, הטמפרטורה היא ramped 10 ° C / min עד 190 מעלות צלזיוס, ולאחר מכן שוב בramped 5 ° C / min עד 210 מעלות צלזיוס והוחזקה במשך 1 דקות נוספות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להבטיח ספיגה של DGLA אירעה, לנתח fames ידי זיהוי להבת יינון (FID) או ספקטרומטריית מסת זיהוי (MS), תוך שימוש בסטנדרטים אותנטיים לזיהוי ג elegans חומצות שומן. </li></ol>

<ol>
	<li>Haeggstrom, J. Z., Funk, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipoxygenase+and+leukotriene+pathways:+biochemistry,+biology,+and+roles+in+disease.">Lipoxygenase and leukotriene pathways: biochemistry, biology, and roles in disease.</a> Chem. Rev. 111, 5866-5898 (2011).</li><li>de Lorgeril, M., Salen, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+health+effects+of+dietary+saturated+and+omega-6+and+omega-3+polyunsaturated+fatty+acids.">New insights into the health effects of dietary saturated and omega-6 and omega-3 polyunsaturated fatty acids.</a> BMC Med. 10, 50 (2012).</li><li>Spychalla, J. P., Kinney, A. J., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+an+animal+omega-3+fatty+acid+desaturase+by+heterologous+expression+in+Arabidopsis.">Identification of an animal omega-3 fatty acid desaturase by heterologous expression in Arabidopsis.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 94, 1142-1147 (1997).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+dissection+of+polyunsaturated+fatty+acid+synthesis+in+Caenorhabditis+elegans.">Genetic dissection of polyunsaturated fatty acid synthesis in Caenorhabditis elegans.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 99, 5854-5859 (2002).</li><li>Watts, J. L., Phillips, E., Griffing, K. R., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Deficiencies+in+C20+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Cause+Behavioral+and+Developmental+Defects+in+Caenorhabditis+elegans+fat-3+Mutants.">Deficiencies in C20 Polyunsaturated Fatty Acids Cause Behavioral and Developmental Defects in Caenorhabditis elegans fat-3 Mutants.</a> Genetics. 163, 581-589 (2003).</li><li>Kahn-Kirby, A. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Specific+Polyunsaturated+Fatty+Acids+Drive+TRPV-Dependent+Sensory+Signaling+In+Vivo.">Specific Polyunsaturated Fatty Acids Drive TRPV-Dependent Sensory Signaling In Vivo.</a> Cell. 119, 889-900 (2004).</li><li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genetic+regulation+of+unsaturated+fatty+acid+composition+in+C.+elegans.">Genetic regulation of unsaturated fatty acid composition in C. elegans.</a> PLoS Genet. 2, e108 (2006).</li><li>Webster, C. M., Deline, M. L., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stress+response+pathways+protect+germ+cells+from+omega-6+polyunsaturated+fatty+acid-mediated+toxicity+in+Caenorhabditis+elegans.">Stress response pathways protect germ cells from omega-6 polyunsaturated fatty acid-mediated toxicity in Caenorhabditis elegans.</a> Dev. Biol. 373, 14-25 (2013).</li><li>Kadyk, L. C., Lambie, E. J., Kimble, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=glp-3+is+required+for+mitosis+and+meiosis+in+the+Caenorhabditis+elegans+germ+line.">glp-3 is required for mitosis and meiosis in the Caenorhabditis elegans germ line.</a> Genetics. 145, 111-121 (1997).</li><li>Watts, J. L., Browse, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dietary+manipulation+implicates+lipid+signaling+in+the+regulation+of+germ+cell+maintenance+in+C.+elegans.">Dietary manipulation implicates lipid signaling in the regulation of germ cell maintenance in C. elegans.</a> Dev. Biol. 292, 381-392 (2006).</li><li>Pryor, W. A., Stanley, J. P., Blair, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Autoxidation+of+polyunsaturated+fatty+acids:+II.+A+suggested+mechanism+for+the+formation+of+TBA-reactive+materials+from+prostaglandin-like+endoperoxides.">Autoxidation of polyunsaturated fatty acids: II. A suggested mechanism for the formation of TBA-reactive materials from prostaglandin-like endoperoxides.</a> Lipids. 11, 370-379 (1976).</li><li>Kniazeva, M., Shen, H., Euler, T., Wang, C., Han, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Regulation+of+maternal+phospholipid+composition+and+IP(3)-dependent+embryonic+membrane+dynamics+by+a+specific+fatty+acid+metabolic+event+in+C.+elegans.">Regulation of maternal phospholipid composition and IP(3)-dependent embryonic membrane dynamics by a specific fatty acid metabolic event in C. elegans.</a> Genes Dev. 26, 554-566 (2012).</li><li>Edmonds, J. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Insulin/FOXO+signaling+regulates+ovarian+prostaglandins+critical+for+reproduction.">Insulin/FOXO signaling regulates ovarian prostaglandins critical for reproduction.</a> Dev. Cell. 19, 858-871 (2010).</li><li>O'Rourke, E. J., Kuballa, P., Xavier, R., Ruvkun, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=omega-6+Polyunsaturated+fatty+acids+extend+life+span+through+the+activation+of+autophagy.">omega-6 Polyunsaturated fatty acids extend life span through the activation of autophagy.</a> Genes Dev. 27, 429-440 (2013).</li><li>Taubert, S., Van Gilst, M. R., Hansen, M., Yamamoto, K. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+Mediator+subunit,+MDT-15,+integrates+regulation+of+fatty+acid+metabolism+by+NHR-49-dependent+and+-independent+pathways+in+C.+elegans.">A Mediator subunit, MDT-15, integrates regulation of fatty acid metabolism by NHR-49-dependent and -independent pathways in C. elegans.</a> Genes Dev. 20, 1137-1149 (2006).</li><li>Lesa, G. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Long+chain+polyunsaturated+fatty+acids+are+required+for+efficient+neurotransmission+in+C.+elegans.">Long chain polyunsaturated fatty acids are required for efficient neurotransmission in C. elegans.</a> J. Cell Sci. 116, 4965-4975 (2003).</li><li>Brock, T. J., Browse, J., Watts, J. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+and+the+regulation+of+adiposity+in+Caenorhabditis+elegans.">Fatty acid desaturation and the regulation of adiposity in Caenorhabditis elegans.</a> Genetics. 176, 865-875 (2007).</li><li>Goudeau, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fatty+acid+desaturation+links+germ+cell+loss+to+longevity+through+NHR-80/HNF4+in+C.+elegans.">Fatty acid desaturation links germ cell loss to longevity through NHR-80/HNF4 in C. elegans.</a> PLoS Biol. 9, e1000599 (2011).</li><li>Yang, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+ARC/Mediator+subunit+required+for+SREBP+control+of+cholesterol+and+lipid+homeostasis.">An ARC/Mediator subunit required for SREBP control of cholesterol and lipid homeostasis.</a> Nature. 442, 700-704 (2006).</li></ol>

החוקרים מצהירים כי אין להם אינטרסים כלכליים מתחרים.

כאן אנו מתארים שיטה של תוספת של ג elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות בתזונה. כפי שהוזכר לעיל, יש להקפיד בהכנת צלחות PUFA תוספת בגלל אופי התגובה של הקשרים כפולים בPUFAs גורם לחומצות שומן אלו להיות רגישות לחמצון באמצעות חום ו11 אור. כדי למנוע חמצון, חשוב להוסיף PUFA למדי?...

חומצות שומן הם מרכיבים חיוניים מבניים של ממברנות, כמו גם מולקולות אחסון אנרגיה יעילה. בנוסף, יכולות להיות ביקע חומצות שומן מקרומים תאיים על ידי lipases ולהיות שונה אנזימים כדי לייצר effectors איתות 1. חומצות שומן רב בלתי רוויות באופן טבעי (PUFAs) מכילות שניים או יותר קשרים כפולים cis. אומגה 3, חומצות השומן וחומצות שומן אומגה 6 נבדלות זה מזה המבוססים על עמדותיהם של קשרים כפולים ביחס לסוף מתיל של חומצת השומן. תזונה בריאה דורשת שתי אומגה 3, חומצות שומן אומגה 6 ו. עם זאת, תזונה מערבית עשירה במיוחד באומגה 6 וחומצות שומן ודלות באומגה 3, חומצות שומן. גבוהה של אומגה 6 לאומגה 3 יחס חומצת שומן קשורה לסיכון מוגבר למחלות לב וכלי דם ודלקת, עם זאת, הפונקציות מועילות ומזיקות המדויקים של חומצות שומן מסוימות אינן מובנות 2 כן. Elega Caenorhabditis התולעת העגולהNS הוא שימושי בחקר התפקוד של חומצות שומן כי זה מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3, כולל desaturase אומגה 3, פעילות שאינה קיים ברוב בעלי החיים 3,4. מוטנטים חסרי אנזימי desaturase חומצת שומן מצליחים לייצר PUFAs הספציפית, מה שמוביל למגוון של ליקויים התפתחותיים ונוירולוגי 4-6. כדי לחקור את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו assay ביוכימיים בקנה אחד עם ניתוח גנטי הן באמצעות מוטציה וטכניקות לדפוק למטה RNAi בג elegans. תוספת של PUFAs הספציפית מושגת על ידי הוספת תמיסת מלח נתרן חומצת שומן למדיום אגר לפני המזיגה. התוצאה היא ספיגת PUFA על ידי א &#39; מקור מזון coli, שבו הוא מצטבר בקרומים חיידקיים. ג elegans לבלוע חיידקי PUFA המכיל, ותוספי תזונה די בכך כדי להציל את defects של מוטציות PUFA לקויות. תוספת של רוב חומצות שומן אין השפעות מזיקות על בעלי חיים מסוג בר, לעומת זאת, חומצות ספציפיות אומגה 6 וחומצות שומן, במיוחד חומצת dihomo גמא לינולנית (DGLA, 20:03 n-6) גורם להרס קבוע של ג תאי נבט elegans 7,8. גז כרומטוגרפיה משמשת כדי לפקח על הספיגה של חומצות שומן בתוספת במקור חיידקי מזון (או OP50 או HT115), כמו גם בנמטודות. התוספת של Tergitol חומר הניקוי (NP-40) בתקשורת מאפשרת חלוקה שווה של חומצות שומן דרך כל הצלחת והספיגה יעילה יותר של חומצות שומן על ידי א &#39; coli ונמטודות. מצאנו כי חומצות שומן בלתי רוויות נלקחות בקלות על ידי חיידקים וג elegans, אבל הספיגה של חומצות שומן רוויות היא הרבה פחות יעיל. מאמר זה יתאר צעד אחר צעד כיצד להשלים את התקשורת אגר עם חומצות שומן, כמו גם כיצד לפקח על ספיגת חומצת שומן בהנמטודות דואר באמצעות גז כרומטוגרפיה.

<table><tbody><tr><td>Bacto-Agar</td><td>Difco</td><td>214010</td><td></td></tr><tr><td>Tryptone</td><td>Difco</td><td>211705</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>J.T. Baker</td><td>3624-05</td><td></td></tr><tr><td>Tergitol</td><td>Sigma</td><td>NP40S-500mL</td><td></td></tr><tr><td>Cholesterol</td><td>Sigma</td><td>C8667-25G</td><td>(5 mg/mL in ethanol)</td></tr><tr><td>MgSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>2504-01</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>1311-01</td><td></td></tr><tr><td>K&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;HPO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3254-05</td><td></td></tr><tr><td>KH&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;PO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>3246-05</td><td></td></tr><tr><td>Sodium dihomogamma linolenate</td><td>NuCHEK</td><td>S-1143</td><td></td></tr><tr><td>Warm sterile Millipore water</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sterile water for collecting worms</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Nuclease-free Water for DGLA stock solution</td><td>Ambion</td><td>AM9932</td><td></td></tr><tr><td>Ampicillin</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP1760-25</td><td>100 mg/ml in water (for RNAi plates)</td></tr><tr><td>Isopropyl-beta-D-thiogalactopyranoside (IPTG)</td><td>Gold Biotechnology</td><td>12481C100</td><td>1 M in water (for RNAi plates)</td></tr><tr><td>HSO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>J.T. Baker</td><td>9681-03</td><td></td></tr><tr><td>Methanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A452-4</td><td></td></tr><tr><td>Hexane</td><td>Fisher Scientific</td><td>H302-4</td><td></td></tr><tr><td>diamindinophenylindole (DAPI)</td><td>Sigma</td><td>D9542</td><td></td></tr><tr><td>VectaShield</td><td>Vector Laboratories</td><td>H-1000</td><td></td></tr><tr><td>Glass Flask</td><td>Corning</td><td>4980-2L</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaveable Glass bottles with stirbars</td><td>Fisherbrand</td><td>FB-800</td><td></td></tr><tr><td>Autoclaveable Glass Graduated Cylinder</td><td>Fisherbrand</td><td>08-557</td><td></td></tr><tr><td>Stir Plate</td><td>VWR</td><td>97042-642</td><td></td></tr><tr><td>Waterbath at 55+ &amp;deg;C</td><td>Precision Scientific Inc.</td><td>66551</td><td></td></tr><tr><td>Screwcap Brown Glass Vial</td><td>Sun SRI</td><td>200 494</td><td></td></tr><tr><td>Argon gas tank</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Automated Pipette aid</td><td>Pipette-Aid</td><td>P-90297</td><td></td></tr><tr><td>Sterile Serological Pipettes (25 ml)</td><td>Corning</td><td>4489</td><td></td></tr><tr><td>Bunsen Burner</td><td>VWR</td><td>89038-534</td><td></td></tr><tr><td>Dissection microscope</td><td>Leica</td><td>TLB3000</td><td></td></tr><tr><td>Silanized glass tube</td><td>Thermo Scientific</td><td>STT-13100-S</td><td>for FAMEs derivitization</td></tr><tr><td>PTFE Screw caps</td><td>Kimble-Chase</td><td>1493015D</td><td></td></tr><tr><td>Clinical tabletop centrifuge</td><td>IEC</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC Crimp Vial</td><td>SUN SRi</td><td>200 000</td><td></td></tr><tr><td>GC Vial Insert</td><td>SUN SRi</td><td>200 232</td><td></td></tr><tr><td>GC Vial cap</td><td>SUN SRi</td><td>200 100</td><td></td></tr><tr><td>Gas Chromatograph</td><td>Agilent</td><td>7890A</td><td></td></tr><tr><td>Mass Spectrometry Detector</td><td>Agilent</td><td>5975C</td><td></td></tr><tr><td>Column for gas chromatography</td><td>Suppelco</td><td>SP 2380</td><td>30 m x 0.25 mm fused silica capillary column</td></tr></tbody></table>

dietary supplementation of polyunsaturated fatty acids in caenorhabditis elegans

חומצות שומן חיוניות לתפקודים תאיים רבים. הם משמשים מולקולות אחסון אנרגיה יעילה כמו, מרכיבים את הליבה ההידרופובי של ממברנות, ולהשתתף במסלולי איתות שונים. Caenorhabditis elegans מסנתז את כל האנזימים הדרושים לייצור מגוון של חומצות אומגה -6 ואומגה -3. זה, בשילוב עם האנטומיה ומגוון של כלים גנטיים זמינים הפשוטים, להפוך אותו למודל אטרקטיבי ללמוד לתפקד של חומצות שומן. על מנת לחקור את המסלולים הגנטיים המתווכים את ההשפעות הפיזיולוגיות של חומצות שומן בתזונה, פיתחנו שיטה כדי להשלים את ג דיאטת elegans עם חומצות שומן בלתי רוויות. תוספת היא אמצעי יעיל כדי לשנות את הרכב חומצות שומן של תולעים ויכולה לשמש גם כדי להציל את הפגמים במוטנטים חומצת שומן לקוי. השיטה שלנו משתמשת באגר נמטודות צמיחה הבינוני (NGM) בתוספת מלחי acidsodium השומן. חומצות השומן בתוספת הצלחות הפכו incorporaטד לממברנות של מקור החיידקים שבמזון, אשר לאחר מכן הוא נלקח על ידי ג elegans שניזונים מהחיידקים בתוספת. גם אנו מתארים פרוטוקול גז כרומטוגרפיה לעקוב אחר השינויים בהרכב חומצות שומן המתרחשים בתולעים בתוספת. זוהי דרך יעילה כדי להשלים את התזונה של אוכלוסיות קטנות וגדולות של ג elegans, המאפשר מגוון רחב של יישומים לשיטה זו.

תוספת של ג דיאטת elegans היא מוגבלת על ידי יכולתו של מקור חיידקים שבמזון לספיג ולשלב חומצת שומן לתוך קרום החיידק. כדי לקבוע את היכולת של א &#39; coli OP50 להטמיע חומצות שומן שונות לקרומיו, OP50 היה מצופה על תקשורת ללא תוספת, 0.1 מ&quot;מ ו0.3 ריכוזי מ&quot;מ של חומצה סטארית (18...

Watch this Scientific Journal Video about Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans at JoVE.com

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Elegan &lt;em&gt; Caenorhabditis &lt;/ em&gt; הוא מודל שימושי כדי לחקור את הפונקציות של חומצות שומן רב בלתי רוויות בפיתוח ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להשלמת ג &lt;em&gt; elegans &lt;/ em&gt; דיאטה עם חומצות שומן רב בלתי רוויות.

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Fatty acids are essential for numerous cellular functions. They serve as efficient energy storage molecules, make up the hydrophobic core of membranes, ...

dietary-supplementation-polyunsaturated-fatty-acids-caenorhabditis

Research

JoVE Journal

Biology

Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

17.0K Views.  Washington State University.  Elegan Caenorhabditis הוא מודל שימושי כדי לחקור את הפונקציות של חומצות שומן רב בלתי רוויות בפיתוח ופיזיולוגיה. פרוטוקול זה מתאר שיטה יעילה להשלמת ג elegans דיאטה עם חומצות שומן רב בלתי רוויות. 

Video: Dietary Supplementation of Polyunsaturated Fatty Acids in Caenorhabditis elegans

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The large body of work on C. elegans makes it an ideal candidate to integrate into large-population, whole-animal studies to dissect the complex biological components and their relationships with another organism. In order to use C. elegans in collaborative -omics research, a method is needed to generate large populations of animals where a single sample can be split and assayed across diverse platforms for comparative analyses.
Here, a method to culture and collect an abundant mixed-stage C. elegans population on a large-scale culture plate (LSCP) and subsequent phenotypic data is presented. This pipeline yields sufficient numbers of animals to collect phenotypic and population data, along with any data needed for -omics experiments (i.e., genomics, transcriptomics, proteomics, and metabolomics). In addition, the LSCP method requires minimal manipulation to the animals themselves, less user preparation time, provides tight environmental control, and ensures that handling of each sample is consistent throughout the study for overall reproducibility. Lastly, methods to document population size and population distribution of C. elegans life stages in a given LSCP are presented.

Culture and Assay of Large-Scale Mixed-Stage Caenorhabditis elegans Populations

To use Caenorhabditis elegans (C. elegans) in omics research, a method is needed to generate large populations of worms where a single sample can be measured across platforms for comparative analyses. Here, a method to culture C. elegans populations on large-scale culture plates (LSCPs) and to document population growth is presented.

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Caenorhabditis elegans (C. elegans) has been and remains a valuable model organism to study developmental biology, aging, neurobiology, and genetics. The ...

Genetics

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide range of species, including mammals. It also causes a decrease in body weight and fertility, as well as lower levels of plasma glucose, insulin, and IGF-1 in these animals. This treatment is often referred to as dietary restriction (DR) or caloric restriction (CR). The nematode Caenorhabditis elegans has emerged as an important model organism for studying the biology of aging. Both environmental and genetic manipulations have been used to model DR and have shown to extend lifespan in C. elegans. However, many of the reported DR studies in C. elegans were done by propagating animals in liquid media, while most of the genetic studies in the aging field were done on the standard solid agar in petri plates. Here we present a DR protocol using standard solid NGM agar-based plate with killed bacteria.

Solid Plate-based Dietary Restriction in Caenorhabditis elegans

Here we present a protocol for performing solid plate-based dietary restriction in C. elegans with killed bacteria.

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans</em

Reduction of food intake without malnutrition or starvation is known to increase lifespan and delay the onset of various age-related diseases in a wide ...

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their locomotory patterns upon detection of diverse environmental stimuli and can modulate their suite of behavioral responses in response to starvation conditions. Nematodes typically exhibit a decreased aversive response when removed from a food source for over 30 min. Observation of behavioral changes in response to a changing nutritional status can provide insight into the mechanisms that regulate the transition from a well-fed to starved state.
We have developed an assay that measures a nematode&#39;s ability to cross an aversive barrier (i.e. copper) then reach a food source over a prolonged period of time. This protocol builds upon previous work by integrating multiple variables in a manner that allows for continued data collection as the organisms shift towards an increasingly starved condition. Moreover, this assay permits an increased sample size so that larger populations of nematodes can be simultaneously evaluated.
Organisms defective for the ability to detect or respond to copper immediately cross the chemical barrier, while wild type nematodes are initially repelled. As wild type worms are increasingly starved, they begin to cross the barrier and reach the food source. We designed this assay to evaluate a mutant that is incapable of responding to diverse environmental cues, including food sensation or detection of aversive chemicals. When evaluated via this protocol, the defective organisms immediately crossed the barrier, but were also incapable of detecting a food source. Hence, these mutants repeatedly cross the chemical barrier despite temporarily reaching a food source. This assay can straightforwardly test populations of worms to evaluate potential pathway defects related to aversion and starvation.

A Caenorhabditis elegans Nutritional-status Based Copper Aversion Assay

Here, we present a Caenorhabditis elegans-specific assay designed to evaluate changes in copper aversion behavior and the ability to locate a common food source, as the organism progresses from a well-fed to starved nutritional state.

א<em&gt; Caenorhabditis elegans</em&gt; מצב תזונתיים מבוססי Assay Assersion

To ensure survival, organisms must be capable of avoiding unfavorable habitats while ensuring a consistent food source. Caenorhabditis elegans alter their ...

Neuroscience

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

The nematode C. elegans has emerged as an important model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as it relates to human obesity and its associated pathologies. Several previous methodologies developed for the visualization of C. elegans triglyceride-rich fat stores have proven to be erroneous, highlighting cellular compartments other than lipid droplets. Other methods require specialized equipment, are time-consuming, or yield inconsistent results. We introduce a rapid, reproducible, fixative-based Nile red staining method for the accurate and rapid detection of neutral lipid droplets in C. elegans. A short fixation step in 40% isopropanol makes animals completely permeable to Nile red, which is then used to stain animals. Spectral properties of this lipophilic dye allow it to strongly and selectively fluoresce in the yellow-green spectrum only when in a lipid-rich environment, but not in more polar environments. Thus, lipid droplets can be visualized on a fluorescent microscope equipped with simple GFP imaging capability after only a brief Nile red staining step in isopropanol. The speed, affordability, and reproducibility of this protocol make it ideally suited for high throughput screens. We also demonstrate a paired method for the biochemical determination of triglycerides and phospholipids using gas chromatography mass-spectrometry. This more rigorous protocol should be used as confirmation of results obtained from the Nile red microscopic lipid determination. We anticipate that these techniques will become new standards in the field of C. elegans metabolic research.

Biochemical and High Throughput Microscopic Assessment of Fat Mass in Caenorhabditis Elegans

We present robust biochemical and microscopic methods for studying Caenorhabditis elegans lipid stores. A rapid, simple, fixing-staining procedure for fluorescent lipid droplet imaging leverages the spectral properties of the lipophilic dye Nile red. We then present biochemical measurement of triglycerides and phospholipids using solid phase extraction and gas chromatography-mass spectrometry.

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

The nematode C. elegans has emerged as an important  model for the study of conserved genetic pathways regulating fat metabolism as  it relates to human ...

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, which are lipid signals derived from polyunsaturated fatty acids (PUFAs)10-14. These signalling molecules are difficult to study because of their low abundance and reactive nature. The characteristic feature of prostaglandins is a cyclopentane ring structure located within the fatty acid backbone. In mammals, prostaglandins can be formed through cyclooxygenase enzyme-dependent and -independent pathways10,15. C. elegans synthesizes a wide array of prostaglandins independent of cyclooxygenases6,16,17. A large class of F-series prostaglandins has been identified, but the study of eicosanoids is at an early stage with ample room for new discoveries. Here we describe a procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids. Charged lipids are extracted from mass worm cultures using a liquid-liquid extraction technique and analyzed by liquid chromatography coupled to electrospray ionization tandem mass spectrometry (LC-ESI-MS/MS). The inclusion of deuterated analogs of prostaglandins, such as PGF2 &alpha;-d4 as an internal standard is recommended for quantitative analysis. Multiple reaction monitoring or MRM can be used to quantify and compare specific prostaglandin types between wild-type and mutant animals. Collision-induced decomposition or MS/MS can be used to obtain information on important structural features. Liquid chromatography mass spectrometry (LC-MS) survey scans of a selected mass range, such as m/z 315-360 can be used to evaluate global changes in prostaglandin levels. We provide examples of all three analyses. These methods will provide researchers with a toolset for discovering novel eicosanoids and delineating their metabolic pathways.

Prostaglandin Extraction and Analysis in Caenorhabditis elegans

In this paper, we describe an optimized procedure for extracting and analyzing prostaglandins and other eicosanoids from C. elegans using LC-MS/MS.

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין<em&gt; Elegans Caenorhabditis</em

Caenorhabditis elegans is emerging as a powerful animal model to study the biology of lipids1-9. Prostaglandins are an important class of eicosanoids, ...

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a nonmammalian animal model that is widely used as an assay system due to its short lifespan, transparency, cost-effectiveness, and lack of animal ethics issues. In this study, a method was developed to investigate the effects of different bacteria and 3,3'-diindolylmethane (DIM) on the intestinal permeability of C. elegans with a high-throughput image analysis system. The worms were infected with different gut bacteria or cotreated with DIM for 48 h and fed with fluorescein isothiocyanate (FITC)-dextran overnight. Then, the intestinal permeability was examined by comparing the fluorescence images and the fluorescence intensity inside the worm bodies. This method may also have the potential to identify probiotic and pathogenic intestinal bacteria that affect intestinal permeability in the animal model and is effective for examining the effects of harmful or health-promoting chemicals on intestinal permeability and intestinal health. However, this protocol also has some considerable limitations at the genetic level, especially for determining which genes are altered to control illness, because this method is mostly used for phenotypic determination. In addition, this method is limited to determining exactly which pathogenic substrates cause inflammation or increase the permeability of the worms' intestines during infection. Therefore, further in-depth studies, including investigation of the molecular genetic mechanism using mutant bacteria and nematodes as well as chemical component analysis of bacteria, are required to fully evaluate the function of bacteria and chemicals in determining intestinal permeability.

Measuring the Effects of Bacteria and Chemicals on the Intestinal Permeability of Caenorhabditis elegans

This protocol describes how to measure intestinal permeability of Caenorhabditis elegans. This method is helpful for basic biological research on intestinal health related to the interaction between intestinal bacteria and their host and for screening to identify probiotic and chemical agents to cure leaky gut syndrome and inflammatory bowel diseases.

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

In living organisms, intestinal hyperpermeability is a serious symptom that leads to many inflammatory bowel diseases (IBDs). Caenorhabditis elegans is a ...

Medicine

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These age-associated disorders are characterized by the appearance of protein aggregates with fibrillary structure in the brains of these patients. Exactly why normally soluble proteins undergo an aggregation process remains poorly understood. The discovery that protein aggregation is not limited to disease processes and instead part of the normal aging process enables the study of the molecular and cellular mechanisms that regulate protein aggregation, without using ectopically expressed human disease-associated proteins. Here we describe methodologies to examine inherent protein aggregation in Caenorhabditis elegans through complementary approaches. First, we examine how to grow large numbers of age-synchronized C. elegans to obtain aged animals and we present the biochemical procedures to isolate highly-insoluble-large aggregates. In combination with a targeted genetic knockdown, it is possible to dissect the role of a gene of interest in promoting or preventing age-dependent protein aggregation by using either a comprehensive analysis with quantitative mass spectrometry or a candidate-based analysis with antibodies. These findings are then confirmed by in vivo analysis with transgenic animals expressing fluorescent-tagged aggregation-prone proteins. These methods should help clarify why certain proteins are prone to aggregate with age and ultimately how to keep these proteins fully functional.

Methods to Study Changes in Inherent Protein Aggregation with Age in Caenorhabditis elegans

The goal of the method presented here is to explore protein aggregation during normal aging in the model organism C. elegans. The protocol represents a powerful tool to study the highly insoluble large aggregates that form with age and to determine how changes in proteostasis impact protein aggregation.

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

In the last decades, the prevalence of neurodegenerative disorders, such as Alzheimer's disease (AD) and Parkinson's disease (PD), has grown. These ...

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved in humans and are associated with metabolic syndrome or other diseases. Examination of lipid accumulation in this organism can be carried out by fixative dyes or label-free methods. Fixative stains like Nile red and oil red O are inexpensive, reliable ways to quantitatively measure lipid levels and to qualitatively observe lipid distribution across tissues, respectively. Moreover, these stains allow for high-throughput screening of various lipid metabolism genes and pathways. Additionally, their hydrophobic nature facilitates lipid solubility, reduces interaction with surrounding tissues, and prevents dissociation into the solvent. Though these methods are effective at examining general lipid content, they do not provide detailed information about the chemical composition and diversity of lipid deposits. For these purposes, label-free methods such as GC-MS and CARS microscopy are better suited, their costs notwithstanding.

Quantification of Lipid Abundance and Evaluation of Lipid Distribution in Caenorhabditis elegans by Nile Red and Oil Red O Staining

Nile red staining of fixed Caenorhabditis elegans is a method for quantitative measurement of neutral lipid deposits, while oil red O staining facilitates qualitative assessment of lipid distribution among tissues.

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

Caenorhabditis elegans is an exceptional model organism in which to study lipid metabolism and energy homeostasis. Many of its lipid genes are conserved ...

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture a full picture of the multiple levels of molecular processing and changes between different conditions. This protocol presents the method of isolating DNA, RNA, and protein from the same sample of the nematode Caenorhabditis elegans to remove the variation introduced when these biomolecules are isolated from replicates of similarly treated but ultimately different samples. Nucleic acids and protein are extracted from the nematode using the acid guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform extraction method, with subsequent precipitation, washing, and solubilization of each. We show the successful isolation of RNA, DNA, and protein from a single sample from three strains of nematode and HeLa cells, with better protein isolation results in adult animals. Additionally, guanidinium thiocyanate-phenol-chloroform-extracted protein from nematodes improves the resolution of larger proteins, with enhanced detectable levels as observed by immunoblotting, compared to the traditional RIPA extraction of protein.
The method presented here is useful when investigating samples using a multiomic approach, specifically for the exploration of the proteome and transcriptome. Techniques that simultaneously assess multiomics are appealing because molecular signaling underlying complex biological phenomena is thought to occur at complementary levels; however, it has become increasingly common to see that changes in mRNA levels do not always reflect the same change in protein levels and that the time of collection is relevant in the context of circadian regulations. This method removes any intersample variation when assaying different contents within the same sample (intrasample.)

Combined Nucleotide and Protein Extractions in Caenorhabditis elegans

Here, we present a protocol for the isolation of RNA, DNA, and protein from the same sample, in an effort to reduce variation, improve reproducibility, and facilitate interpretations.

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

A single biological sample holds a plethora of information, and it is now common practice to simultaneously investigate several macromolecules to capture ...

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a growing number of age-associated diseases. For instance, proteins with polyglutamine expansions are prone to aggregation, as exemplified with the huntingtin protein and concomitant onset of Huntington&#8217;s disease. The age-associated deterioration of the proteome has been widely studied through the use of transgenic Caenorhabditis elegans expressing polyQ repeats fused to a yellow fluorescent protein (YFP). This polyQ::YFP transgenic animal model facilitates the direct quantification of the age-associated decline of the proteome through imaging the progressive formation of fluorescent foci (i.e., protein aggregates) and subsequent onset of locomotion defects that develop as a result of the collapse of the proteome. Further, the expression of the polyQ::YFP transgene can be driven by tissue-specific promoters, allowing the assessment of proteostasis across tissues in the context of an intact multicellular organism. This model is highly amenable to genetic analysis, thus providing an approach to quantify aging that is complementary to lifespan assays. We describe how to accurately measure polyQ::YFP foci formation within either neurons or body wall muscle during aging, and the subsequent onset of behavioral defects. Next, we highlight how these approaches can be adapted for higher throughput, and potential future applications using other emerging strategies for C. elegans genetic analysis.

Quantifying Tissue-Specific Proteostatic Decline in Caenorhabditis elegans

Proteostatic decline is a hallmark of aging, facilitating the onset of neurodegenerative diseases. We outline a protocol to quantifiably measure proteostasis in two different Caenorhabditis elegans tissues through heterologous expression of polyglutamine repeats fused to a fluorescent reporter. This model allows rapid in vivo genetic analysis of proteostasis.

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis

The ability to maintain proper function and folding of the proteome (protein homeostasis) declines during normal aging, facilitating the onset of a ...

תוספת תזונתית של חומצות שומן רב בלתי רוויות ב

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

תרבות ו Assay של בקנה מידה גדול מעורב שלב Caenorhabditis אוכלוסיות אלגנים

Solid פלייט מבוססי הגבלת תזונתיים ב Caenorhabditis elegans

א

הערכה ביוכימית ותפוקה גבוהה מיקרוסקופית של מסת שומן ב

הפקה וניתוח בפרוסטגלנדין

מדידת ההשפעות של חיידקים וכימיקלים על חדירות המעי של האלמרנים

שיטות מחקר לשינויים הגלום צבירת חלבון עם הגיל ב Caenorhabditis elegans

כימות של השומנים לשפע, הערכה של השומנים הפצה Caenorhabditis elegans ע י הנילוס אדום אדום שמן מכתים O

משולב נוקלאוטיד שיחולץ חלבון ב Caenorhabditis elegans

כימות ירידה פרוטאוסטטית ספציפית לרקמות ב elegans Caenorhabditis