אנו מודים מעומק הלב לקרן וייטהול על תמיכתם במימון וקרנות הסטארט-אפ ממכון המחקר סקריפס על ביצוע עבודה זו.

1. הכנת גנגליה בטן, מדידות אלקטרופיזיולוגיות, ובידוד של נוירונים בודדים שזוהו מגנגליון הבטן של Aplysia californica
<ol><li>שמור על Aplysia באקווריום המעבדה עם מי ים מלאכותיים במחזור (ASW) ב 16 °C (60 °F) תחת 12:12 אור:תנאים כהים.</li>
	<li>בידוד של גנגליון בטן.<ol>
<li>הרדמה בעלי חיים על ידי הזרקת 380 mM MgCl2 פתרון במשך 5-10 דקות (שווה ערך 30-35% ממשקל הגוף של החיה).</li>
		<li>זהה את גנגליון הבטן בהתבסס על מיקומו במערכת העצבים המרכזית24,28.</li>
		<li>הסר את הגרעינים על ידי פעולה כירורגית ולאחסן מיד במי ים מלאכותיים המורכבים 450 מ"מ NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2.5 מ"מ NaHCO3, ו 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>טיפול פרוטאז.<ol>
<li>דגירה גנגליון בטן במשך 30 דקות ב 34 °C±0.5 בצלחת פטרי עם 0.1% פרוטאז (dispase) מדולל ASW המתואר לעיל. הערה: כמות הפרוטאז המשמש צריך להיות סטנדרטי עם הגיל והמשקל של בעלי החיים. באופן כללי, בעלי חיים מבוגרים וגדולים יותר ידרשו יותר פרוטאז.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הסרת נדן גרעיני.<ol>
<li>לאחר הטיפול באנזים, הצמד את הגרעינים לבסיס סיליקון סילגרד של תא תא (Ø = 1 ס"מ; vol. = 0.3 מיליליטר) ולחלחל עם ASW (קצב זרימה: 150 μl / min) בטמפרטורת החדר (18 °C (18 °F±2). הערה: על מנת להגביר את הראות של נוירונים מזוהים, הנח את הגנגליון על החלק העליון של גליל זכוכית פוליקרבונט (איור 1) (קוטר Ø = תא תא שונה 2 מ"מ) שניתן להאיר בקלות מלמטה באמצעות סטריאומיקרוסקופ משקפת עם הגדלה של פי 20 ו- 40.</li>
		<li>הסר בזהירות את הנדן מהגנגליון באמצעות מלקחיים ומיקרוסיסורים.</li>
	</ol>
</li>
	<li>הקלטה אלקטרופיזיולוגית בו זמנית משני נוירונים.<ol>
<li>לזהות נוירון של עניין.</li>
		<li>לשפד את הנוירון עם מיקרואלקטרודה חדה תאית אחת עם התנגדות 10-15 MΩ מלא פתרון 3 M KCl.</li>
		<li>הקלט פעילות עצבית (מעבר רצועה של 10 kHz) באמצעות מערכת הקלטה תאית.</li>
		<li>עבד את נתוני ההקלטה באמצעות תוכנת אלקטרופיזיולוגיה כגון אקסוגרף. הערה: ניתן לבצע בקלות הקלטה מתאי עצב מרובים. נוירונים L7, L11 או R15 ו R2 מזוהים בקלות על סמך מיקומם. שני מגברים ושני מיקרו-מניפולטורים נדרשים להקלטה בו זמנית משני נוירונים L7 ו-R15(איור 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>יישום סמים.<ol>
<li>החל תרופה של בחירה לתוך תא התא על ידי pipetting עדין או להזריק ישירות לתוך נוירונים.</li>
		<li>בצע מדידות אלקטרופיזיולוגיות. הערה: בהתאם למטרה הניסיונית, ניתן למדוד פרמטרים אלקטרופיזיולוגיים שונים של נוירונים כגון השינויים בפוטנציאל הממברנה (MP) או פוטנציאל הפעולה (AP) לפני, במהלך ואחרי יישום התרופה.</li>
	</ol>
</li>
	<li>בידוד של נוירונים בודדים.<ol>
<li>בסיום הניסויים האלקטרופיזיולוגיים, לעצור את הזחילה של ASW ולשטוף את הגנגליון עם 100% אתנול.  חשיפה לאתנול תפחיד את הנוירונים, ובאמצעות מלקחיים עדינים, תקל על הסרת נוירונים בודדים מבלי לפגוע בנוירונים אחרים מהגנגליון.</li>
		<li>הסר נוירונים בודדים תחת סטריאומיקרוסקופ ולהעביר צינור קטן Eppendorf המכיל קר כקרח 500 μl מיצוי RNA מגיב. נוירונים בודדים מבודדים ניתן לאחסן ריאגנט מיצוי RNA ב -80 מעלות צלזיוס לניתוח עתידי.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. בידוד RNA מתאי עצב בודדים וניתוח ביטוי גנים על ידי PCR כמותי בזמן אמת (qPCR)
<ol><li>אמצעי זהירות כדי למזער את השפלת RNA: ריבונוקלאאזות (RNases) משפילות RNA והן אנזימים יציבים ופעילים מאוד. בצע את השלבים הבאים במהלך הטיפול ב- RNAs.<ol>
<li>נקה את אזור העבודה ואת המכשירים עם סוכני השבתת RNase.</li>
		<li>ללבוש כפפות בכל עת בעת טיפול RNA ולהחליף כפפות לעתים קרובות.</li>
		<li>השתמש רק בפלסטיק ללא RNase לטיפול ב- RNAs.</li>
	</ol></li>
	<li>בידוד סה"כ RNA מתאי עצב בודדים:<ol>
<li>פרוטוקול טריזול סטנדרטי לבידוד RNA יכול לשמש לבידוד RNAs מתאי עצב בודדים. בקצרה להוסיף 20% v / v של כלורופורם כדי Trizol, לערבב היטב על ידי מערבולת קצרה.</li>
		<li>מניחים את הצינורות על מסובב במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס. סובבו את תערובת טריזול-כלורופורם ב-12,000 x גרם למשך 15 דקות ב-4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>לאסוף את השלב מימית ולהעביר צינור טרי.</li>
		<li>הוסף פתרון אצטט נתרן (pH 5.5) לריכוז הסופי של 0.3 M, 100 ng/ml של גליקובלו coprecipitant, ו 2.5 כרכים של 100% אתנול כדי לזרז RNA.</li>
		<li>מערבבים היטב את הדגימות ומדגירה ב -80 מעלות צלזיוס לילה.</li>
		<li>סובב את הדגימות ב 12,000 x g במשך 20 דקות ב 4 מעלות צלזיוס גלולה כחולה קטנה יהיה גלוי בתחתית הצינור.</li>
		<li>הסר את supernatant ולשטוף את גלולה עם 850 μl של 75% אתנול קר כקרח ב 12,000 x גרם במשך 10 דקות ב 4 מעלות צלזיוס.</li>
		<li>הסר את supernatant בזהירות אוויר לייבש את גלולת RNA במשך 7-10 דקות, מקסימום. הערה: ודא כי RNA לא נשאר זמן רב להתייבש כמו מעל-ייבוש גלולה RNA עושה solubilization קשה מאוד. 
</li>
		<li>לאחר התייבשות, resuspend גלולת RNA ב 10 μl של מים RNAse חינם ולקבוע ריכוז RNA. הערה: לקבוע ריכוז RNA באמצעות ספקטרופוטומטר. כאשר לא משתמשים מיד, לאחסן RNA ב -80 מעלות צלזיוס.</li>
	</ol></li>
	<li>סינתזת ארנ"א מתאי עצב בודדים:<ol>
<li>הגבר את ה-RNA (סיבוב אחד או שניים בהתאם למטרה הניסיונית) באמצעות מערכת הגברה ליניארית RNA זמינה מסחרית. הערה: סך ה-RNA של נוירונים בודדים נע בין ~ 10-60 ng. התשואה הצפויה של הסיבוב הראשון של הגברה היא ~ 100-300 ng ואת הסיבוב השני של הגברה הוא ~ 0.8-1.5 מיקרוגרם של RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>שעתוק הפוך של RNA:<ol>
<li>כדי ליצור cDNA מ- aRNA, השתמש 1.0 מיקרוגרם של aRNA ב 20 μl של תגובת שעתוק הפוכה. מספר ערכות זמינות מסחרית למטרה זו. הערה: cDNA סונתז על פי פרוטוקול היצרן באמצעות ההגדרות הבאות על מחזור תרמי. 5 דקות ב 25 מעלות צלזיוס 30 דקות ב 42 מעלות צלזיוס 5 דקות ב 85 מעלות צלזיוס להחזיק ב 4 °C (69 °F)</li>
		<li>לאחר שלב התמלול ההפוך, אחסן את ה- cDNA ב- -20 °C (70 °F) לאחסון לטווח ארוך.</li>
	</ol></li>
	<li>עיצוב ותקינה של פריימר: מספר תוכנות מצוינות זמינות, ללא תשלום, עבור עיצוב פריימרים עבור הגברות בזמן אמת.<ol>
<li>בחר 18-24 מר אוליגונוקלאוטידים המייצרים 70-110 bp amplicons ולסנתז את פריימרים באמצעות מקורות מסחריים. הערה: שניים עד שלושה זוגות פריימר צריך להיות מתוכנן עבור כל גן של עניין. כל ערכת פריימר צריכה להיות מתוקננת לפי qPCR. זוגות פריימר קדימה והפוך ששימשו עבור הגן CREB1 (איור 4) הם להלן: ערכת פריימר 1 קדימה: 5'-TGATTCTGACGAAGAAAAGA-3' הפוך: 5'-ACCGGAGACAGTCAGTTGTAGA-3' ערכת פריימר 2 קדימה: 5'-אגאטגאטגאטגאגאגהאגה-3' הפוך: 5'-GACACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>כדי לבחור את פריימר הטוב ביותר שישמש לניתוחים במורד הזרם, לפקח על ערך Ct ואת הצורה של עקומת הגברה ב qPCR. הערה: פריימרים המעניקים ערכי Ct (סף מחזור) בין 10-35 בהגברה העגולה 40 ועקומות חלקות במהלך השלב המעריכי של PCR ואחריו רמה חלקה הם אופטימליים לניתוח ביטוי גנים.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR כמותי בזמן אמת (qPCR): הערה: השתמש בצינורות או בלוחות המתאימים התואמים למכונת qPCR.<ol>
<li>לדלל cDNA ל 5x עם מים ללא גרעין.</li>
		<li>כדי 2 μl של cDNA מדולל, להוסיף 8 μl של תערובת הורים qPCR המכיל 2 μl של H2O, 5 μl של 2x SYBR גרין מאסטר לערבב, ו 1.0 μl של 10 מיקרומטר (כל) פריימר קדימה והפוך.</li>
		<li>סגור את הצינורות ולאטום את הצלחת לאחר pipetting cDNA ותערובת הורים. ערבבו את התוכן על ידי הקשה עדינה וסיבוב כלפי מטה במהירות של 1,500 סל"ד למשך 30 שניות.</li>
		<li>המשך בהגדרת מחשב ה- qPCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

לסופרים אין אינטרסים כלכליים מתחרים.

הנוירון R15 מעורב בוויסות מערכות לב וכלי דם, עיכול, נשימה ורבייה30. פעילות מתפוצצת קצבית באופן קבוע של AP היא תכונה של R15. כפי שמוצג בסעיף התוצאות, הקלטה מזווגת של R15 ו- L7 מראה כי הכנת הגרעינים שמרה על פעילות של נוירונים R15. נוירונים R15 ו- L7 הגיבו כראוי לאח. הכנה גרעינית זו יכולה להישמר עד 8-10 ש?...

המוח האנושי מורכב בצורה יוצאת דופן עם כמעט 100 מיליארד נוירונים וטריליוני קשרים סינפטיים. ישנם מספר כמעט שווה של תאים nonneuronal כי אינטראקציה עם נוירונים לווסת את תפקידם במוח. נוירונים מאורגנים במעגלים המווסתים התנהגויות ספציפיות. למרות ההתקדמות בהבנתנו את תפקודי המוח והמעגלים העצביים, מעט מאוד ידוע על זהותם של מרכיבי מעגלים השולטים בהתנהגות מסוימת. ידע בזהויות של מרכיבים שונים של מעגלים יקל מאוד על הבנתנו הן של הבסיס התאי והן של הבסיס המולקולרי של התנהגות וסיוע בפיתוח אסטרטגיות טיפוליות חדשניות להפרעות נוירופסיכיאטריות.
חילזון ימי Aplysia californica כבר סוס עבודה לקביעת מעגלים עצביים ביסוד התנהגויות ספציפיות1-14. מערכת העצבים Aplysia מכיל כ 20,000 נוירונים המאורגנים לתוך 9 גרעינים שונים. הנוירונים של Aplysia הם גדולים וניתן לזהות בקלות על סמך גודלם, תכונות חשמליות, ואת המיקום הגרעיני. Aplysia יש רפרטואר עשיר של התנהגויות שניתן ללמוד. אחת ההתנהגויות הנחקרות היטב היא רפלקס משיכת הזימים (GWR). המרכיבים העיקריים של רפלקס זה ממוקמים גרעיני בטן. רכיבים של מעגלי GWR מופו ותרומות של רכיבים שונים נקבעו. חשוב לציין, מעגלי GWR עוברים למידה אסוציאטיבית ולא אסוציאטיבית5,6,15-19. עשרות שנים של מחקר על רפלקס זה זיהו גם כמה מסלולי איתות שיש להם תפקיד מפתח בלמידה וזיכרון20-24.
מספר תכשירים שונים של Aplysia שימשו כדי ללמוד בסיס תאי ומולקולרי של אחסון זיכרון. אלה כוללים את החיה שלם2,3, הכנה שלם למחצה1,7,13,14,16 ו reconstitution של מרכיבים עיקריים של מעגלים עצביים25-29. הכנה מופחתת לחקר הגרעינים Aplysia עבור ניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של מעגלים עצביים מזוהים מתואר כאן. ארבעת הנוירונים הבאים שזוהו נחקרו. R15, נוירון מתפרץ, L7 ו L11, שני נוירונים מוטוריים שונים R2, נוירון שימוש נחקרו. R2 הוא הנוירון הגדול ביותר המתואר במערכת העצבים חסרי החוליות. בקצרה, מתודולוגיה זו כוללת טיפול פרוטאז של גרעינים, מדידות אלקטרופיזיולוגיות לפני ואחרי טיפולים תרופתיים, ובידוד של נוירונים בודדים לניתוח כמותי של ביטוי גנים. מתודולוגיה זו מאפשרת לנו לשלב ניתוחים מולקולריים עם הקלטה בו זמנית של נוירונים מרובים. מתודולוגיה זו שימשה בהצלחה כדי ללמוד את התגובות של נוירונים R15 ו L7 אצטילכולין (Ach) על ידי זיווג הקלטות תאיים. בעקבות מדידות אלקטרופיזיולוגיות R15 ו- L7 ותאי עצב מזוהים אחרים כגון L11 ו- R2 בודדו לניתוח תגובת שרשרת פולימראז כמותית (qPCR) של ביטוי CREB1, גורם שעתוק חשוב לאחסון זיכרון.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

אתגר מרכזי בנוירוביולוגיה הוא להבין את היסודות המולקולריים של מעגלים עצביים השולטים בהתנהגות מסוימת. לאחר זיהוי המנגנונים המולקולריים הספציפיים, ניתן לפתח אסטרטגיות טיפוליות חדשות לטיפול במומים בהתנהגויות ספציפיות הנגרמות על ידי מחלות ניווניות או הזדקנות מערכת העצבים. חילזון ימי Aplysia californica מתאים היטב לחקירות של בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות כי מעגלים עצביים שבבסיס התנהגות מסוימת ניתן לקבוע בקלות את המרכיבים הבודדים של המעגלים יכולים להיות מניפולציה בקלות. יתרונות אלה של Aplysia הובילו למספר תגליות בסיסיות של נוירוביולוגיה של למידה וזיכרון. כאן אנו מתארים הכנה של מערכת העצבים Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים. בקצרה, גנגליון מנותח ממערכת העצבים נחשף פרוטאז כדי להסיר את נדן גנגליון כך נוירונים נחשפים אבל לשמור על פעילות עצבית כמו החיה שלם. הכנה זו משמשת לביצוע מדידות אלקטרופיזיולוגיות של נוירונים בודדים או מרובים. חשוב לציין, בעקבות ההקלטה באמצעות מתודולוגיה פשוטה, הנוירונים יכולים להיות מבודדים ישירות מן הגרעינים לניתוח ביטוי גנים. פרוטוקולים אלה שימשו לביצוע הקלטות אלקטרופיזיולוגיות בו זמנית של נוירונים L7 ו- R15, ללמוד את תגובתם אצטילכולין וביטוי כמותי של גן CREB1 מבודד יחיד L7, L11, R15, ו R2 נוירונים של Aplysia.

משקלם של בעלי החיים ששימשו במחקר זה נע בין 100-200 גרם. בעקבות הפרוטוקולים המתוארים, ערכנו מדידות אלקטרופיזיולוגיות וניתוח מולקולרי של נוירונים של גרעיני בטן מבודדים מבעלי חיים הנעים בין 2-5 גרם ל -200-300 גרם.
סטנדרטיזציה של טיפול פרוטאז חשוב למדידות אלקטרופיזיולוגיות מוצלחות של ...

Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

אקליפסיה (1991) הכנת גנגליה לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Views.  The Scripps Research Institute, Florida. חילזון ימי Aplysia californica כבר בשימוש נרחב כמודל נוירוביולוגיה למחקרים על בסיס תאי ומולקולרי של התנהגות. כאן מתוארת מתודולוגיה לחקר מערכת העצבים של Aplysia לניתוחים אלקטרופיזיולוגיים ומולקולריים של נוירונים בודדים של מעגלים עצביים מזוהים.

Video: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

בשנת העצרת במבחנה של מכונת חצי מלאכותית מולקולרית השתמש שלה עבור איתור של נזק לדנ&quot;א

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

מולקולרי הסתבכות וElectrospinnability של Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

רקמות טחונות ב הדחוס קולגן: A Biotransplant המכיל נייד עבור תיקון Reconstructive המבוים יחיד

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

טכניקה ללא תווית להדמית החלל-הזמן של פרשות תא בודדת

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

הכנת טרנזיסטור הסיליקון Nanowire שדה ותוצאה עבור יישומים כימיים biosensing

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

הכרה מולקולרית הנדסה עם פולימרים ביו-מימטיים על פחמן Walled יחיד

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

ניתוח Dissection, סריקה microCT ו morphometric של Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

הכנה, טיהור, השימוש ליפוזומים המכילים חומצת שומן

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

ספיגת של חלקיקים חדשים מצופים השומנים, המכיל Falcarindiol על ידי גזע אנושי Mesenchymal

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

הערכה של התנהגויות פוטוסינטתיים על ידי מדידות סימולטני של השתקפות עלה וניתוחים כלורופיל פלואורסצנטית

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...