Whitehall Vakfı'na, scripps araştırma enstitüsünden bu çalışmayı yürüttükleri için fon desteği ve başlangıç fonları için içtenlikle teşekkür ederiz.

1. Abdominal Ganglion Aplysia californica Abdominal Ganglion'dan Abdominal Ganglionların Hazırlanması, Elektrofizyolojik Ölçümler ve Tek Tanımlanmış Nöronların İzolasyonu
<ol><li>Aplysia'yı laboratuvar akvaryumunda 12:12 ışık:karanlık koşullar altında 16 °C'de dolaşan yapay deniz suyu (ASW) ile koruyun.</li>
	<li>Karın ganglionunun izolasyonu.<ol>
<li>5-10 dakika boyunca 380 mM MgCl2 çözeltisi enjekte ederek hayvanları uyuşturun (hayvanın vücut ağırlığının% 30-35'ine eşdeğer).</li>
		<li>Karın ganglionunu merkezi sinir sistemindeki konumuna göre tanımlayın24,28.</li>
		<li>Gangliyleri cerrahi operasyonla çıkarın ve hemen 450 mM NaCl, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2, 55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3ve 10 mM HEPES 'den (pH 7,4) oluşan yapay deniz suyunda saklayın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Proteaz tedavisi.<ol>
<li>Yukarıda açıklanan ASW'de seyreltilmiş% 0±1 proteaz (dispaz) ile bir Petri kabında 34 °C±0.5'te 30 dakika boyunca karın ganglionunu kuluçkaya yatır. NOT: Kullanılan proteaz miktarının hayvanların yaşı ve ağırlığı ile standartlaştırılması gerekir. Genel olarak, yaşlı ve daha büyük hayvanlar daha fazla proteaz gerektirir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Gangliyon kılıfa kaldırılması.<ol>
<li>Enzim tedavisinden sonra, gangliyolayı bir hücre odasının Sylgard Silikon tabanına sabitleyin (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) ve oda sıcaklığında (18 °C±2) ASW (akış hızı: 150 μl/ dk) ile perfuse. NOT: Tanımlanan nöronların görünürlüğünü artırmak için ganglionu, 20X ve 40X büyütmeli dürbün stereomikroskop kullanılarak alttan kolayca aydınlatılabilen polikarbonat cam silindirin(Şekil 1) (çap Ø= 2 mm modifiye hücre odası) üstüne yerleştirin.</li>
		<li>Kılıbını, kümesleri ve mikrosirsörler kullanarak gangliyondan dikkatlice çıkarın.</li>
	</ol>
</li>
	<li>İki nörondan eşzamanlı elektrofizyolojik kayıt.<ol>
<li>İlgi çekici nöronları tanımlayın.</li>
		<li>Nöron, 3 M KCl çözeltisi ile doldurulmuş 10-15 MΩ dirençli tek bir hücre içi keskin mikroelekrod ile impale edin.</li>
		<li>Hücre içi kayıt sistemi kullanarak nöronal aktiviteyi (10 kHz bant geçişi) kaydedin.</li>
		<li>Kayıt verilerini Axograph gibi elektrofizyoloji yazılımı kullanarak işleyin. NOT: Kişi birden fazla nörondan kaydı kolayca gerçekleştirebilir. Nöronlar L7, L11 veya R15 ve R2 konumlarına göre kolayca tanımlanır. İki L7 ve R15 nörondan aynı anda kayıt için iki amplifikatör ve iki mikromanipülatör gereklidir (Şekil 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>İlaç uygulaması.<ol>
<li>Seçtiğiniz ilacı nazik pipetleme ile hücre odasına uygulayın veya doğrudan nöronlara enjekte edin.</li>
		<li>Elektrofizyolojik ölçümler yapmak. NOT: Deneysel hedefe bağlı olarak, ilaç uygulamasından önce, ilaç uygulaması sırasında ve sonrasında membran potansiyelindeki (MP) veya eylem potansiyelindeki (AP) değişiklikler gibi nöronların farklı elektrofizyolojik parametreleri ölçülebilir.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Tek nöronların izolasyonu.<ol>
<li>Elektrofizyolojik deneylerin sonunda, ASW'nin perfüzyonunu durdurun ve ganglionu% 100 etanol ile yıkayın.  Etanol maruziyeti nöronları taşlaştıracak ve ince kümesler kullanarak, gangliondan diğer nöronlara zarar vermeden bireysel nöronların çıkarılmasını kolaylaştıracaktır.</li>
		<li>Stereomikroskop altında tek nöronları çıkarın ve buz gibi 500 μl RNA ekstraksiyon reaktifi içeren küçük bir Eppendorf tüpüne aktarın. İzole tek nöronlar gelecekteki analizler için -80 °C'de RNA ekstraksiyon reaktifinde saklanabilir.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Kantitatif Gerçek Zamanlı PCR (qPCR) ile Tek Nöronlardan RNA İzolasyonu ve Gen Ekspresyon Analizi
<ol><li>RNA bozulmasını en aza indirmek için önlemler: Ribonikleazlar (RNazlar) RNA'yı bozar ve çok kararlı ve aktif enzimlerdir. RNA'ları işlerken aşağıdaki adımları uygulayın.<ol>
<li>Çalışma alanını ve aletleri RNase devre dışı bırakma ajanları ile temizleyin.</li>
		<li>RNA kullanırken her zaman eldiven giyin ve sık sık eldiven değiştirin.</li>
		<li>RNA'ları işlemek için yalnızca RNase içermeyen plastikler kullanın.</li>
	</ol></li>
	<li>Total RNA'nın Tek nöronlardan izole edilmesi:<ol>
<li>RNA izolasyonu için standart Trizol protokolü, RNA'ları tek nöronlardan izole etmek için kullanılabilir. Trizol'a kısaca% 20 v / v kloroform ekleyin, kısa girdap ile iyice karıştırın.</li>
		<li>Tüpleri 4 °C'de 10 dakika boyunca rotator üzerine yerleştirin. Trizol-Kloroform karışımını 12.000 x g'da 4 °C'de 15 dakika döndürün.</li>
		<li>Sulu fazı toplayın ve taze bir tüpe aktarın.</li>
		<li>RNA'yı çökeltmek için 0,3 M, 100 ng/ml coprecipitant GlycoBlue ve 2,5 hacim %100 etanol nihai konsantrasyonuna sodyum asetat çözeltisi (pH 5,5) ekleyin.</li>
		<li>Numuneleri iyice karıştırın ve gece boyunca -80 °C'de kuluçkaya yatırın.</li>
		<li>Numuneleri 4 °C'de 20 dakika boyunca 12.000 x g'da döndürün ve tüpün dibinde küçük mavi bir pelet görünecektir.</li>
		<li>Süpernatant çıkarın ve peletin 850 μl% 75 buz gibi etanol ile 12.000 x g'da 4 °C'de 10 dakika boyunca yıkayın.</li>
		<li>Üstnatant dikkatlice çıkarın ve RNA peletini maksimum 7-10 dakika boyunca havayla kurulayın. NOT: RNA'nın uzunsüre kurumaya bırakılmamasını bekleyin - RNA peletininkurutılması çözünürlüğü çok zorlaştırır.
</li>
		<li>Kuruduktan sonra, RNA peletini 10 μl RNAse serbest suya yeniden boşaltın ve RNA konsantrasyonu belirleyin. NOT: Spektrofotometre kullanarak RNA konsantrasyonunu belirleyin. Hemen kullanmadığınızda, RNA'yı -80 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>tek nöronlardan aRNA sentezi:<ol>
<li>Ticari olarak kullanılabilen doğrusal RNA amplifikasyon sistemini kullanarak RNA'yı (deneysel hedefe bağlı olarak bir veya iki tur) güçlendirin. NOT: Tek nöronlardan elde edilen toplam RNA ~10-60 ng arasında değişmektedir. İlk tur amplifikasyonun beklenen verimi ~100-300 ng ve ikinci amplifikasyon turu ~0.8-1.5 μg RNA'dır.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA'nın ters transkripsiyon:<ol>
<li>aRNA'dan cDNA oluşturmak için, 20 μl ters transkripsiyon reaksiyonunda 1,0 μg aRNA kullanın. Bu amaçla çeşitli kitler ticari olarak mevcuttur. NOT: cDNA, termal çevrimcide aşağıdaki ayarlar kullanılarak üreticinin protokolüne göre sentezlenmiştir. 25 °C'de 5 dk 42 °C'de 30 dk 85 °C'de 5 dk 4 °C'de tutun</li>
		<li>Ters transkripsiyon adımından sonra, cDNA'yı uzun süreli depolama için -20 °C'de saklayın.</li>
	</ol></li>
	<li>Astar tasarımı ve standardizasyonu: Gerçek zamanlı amplifikasyonlar için astarlar tasarlamak için ücretsiz olarak çeşitli mükemmel yazılım programları mevcuttur.<ol>
<li>70-110 bp amplicon üreten ve astarları ticari kaynakları kullanarak sentezleyen 18-24 mer oligonükleotid seçin. NOT: İlgi çekici her gen için iki ila üç astar çifti tasarlanmalıdır. Her astar setin qPCR tarafından standartlaştırılması gerekir. CREB1 geni için kullanılan ileri ve geri astar çiftleri (Şekil 4) aşağıdadır: Astar seti 1 İleri: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAAGA-3' Geri vites: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Astar seti 2 İleri: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Ters: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Aşağı akış analizleri için kullanılacak en iyi astarı seçmek için ct değerini ve qPCR'deki amplifikasyon eğrisinin şeklini izleyin. NOT: PCR'nin üstel fazında 40 yuvarlak amplifikasyonda 10-35 arasında Ct (Döngü eşiği) değerleri ve ardından pürüzsüz bir plato ile pürüzsüz eğriler veren primerler gen ekspresyon analizleri için en uygunudur.</li>
	</ol></li>
	<li>Nicel Gerçek Zamanlı PCR (qPCR): Not: qPCR makinesiyle uyumlu uygun tüpler veya plakalar kullanın.<ol>
<li>CDNA'yı çekirdeksiz su ile 5x'e seyreltin.</li>
		<li>2 μl seyreltilmiş cDNA'ya, 2 μl H 2 O, 5 μl2xSYBR Green master mix ve 10 μM (her biri) ileri ve ters astar içeren 8 μl qPCR ana karışımı ekleyin.</li>
		<li>Boruları kapatın ve cDNA ve ana karışımı pipetledikten sonra plakayı kapatın. 30 saniye boyunca 1.500 rpm'de hafifçe dokunup aşağı döndürerek içeriği karıştırın.</li>
		<li>qPCR makinesini kurmaya devam edin.</li>
	</ol></li>
</ol>

Yazarların herhangi bir rakip finansal çıkarları yok.

Nöron R15 kardiyovasküler, sindirim, solunum ve üreme sistemlerinin düzenlenmesinde rol oynar30. AP'nin düzenli olarak ritmik bir patlama aktivitesi R15'in bir özelliğidir. Sonuçlar bölümünde gösterildiği gibi, R15 ve L7'nin eşleştirilmiş kaydı, gangliyon preparatının R15 nöronlarının aktivitesini koruduğunu göstermektedir. R15 ve L7 nöronları Ach'e uygun şekilde yanıt verdi. Bu gangliyon preparat 8-10 saate kadar sürdürülebilir ve elektrofizyolojik aktivite sürekli olarak izlen...

İnsan beyni, neredeyse 100 milyar nöron ve trilyonlarca sinaptik bağlantı ile olağanüstü karmaşıktır. Nöronlarla etkileşime giren ve beyindeki işlevlerini düzenleyen neredeyse eşit sayıda nonneuronal hücre vardır. Nöronlar belirli davranışları düzenleyen devreler halinde düzenlenir. Beyin fonksiyonlarını ve sinir devrelerini anlamamızdaki gelişmelere rağmen, belirli bir davranışı kontrol eden devre bileşenlerinin kimliği hakkında çok az şey bilinmektedir. Bir devrenin çeşitli bileşenlerinin kimliklerinin bilgisi, davranışın hem hücresel hem de moleküler temelini anlamamızı büyük ölçüde kolaylaştıracak ve nöropsikiyatrik bozukluklar için yeni terapötik stratejiler geliştirmeye yardımcı olacaktır.
Deniz salyangozu Aplysia californica, belirli davranışların altında kalan nöronal devreleri belirlemek için bir çalışma atı olmuştur1-14. Aplysia sinir sistemi, 9 farklı gangliyon halinde organize edilmiş yaklaşık 20.000 nöron içerir. Aplysia'nın nöronları büyüktür ve boyutlarına, elektriksel özelliklerine ve gangliyondaki konumlarına göre kolayca tanımlanabilir. Aplysia, çalışılabilen zengin bir davranış repertuarına sahiptir. İyi çalışılmış davranışlardan biri solungaç çekme refleksidir (GWR). Bu refleksin merkezi bileşenleri abdominal gangliyonlarda bulunur. GWR devresinin bileşenleri haritalandı ve çeşitli bileşenlerin katkıları belirlendi. Daha da önemlisi, GWR devresi ilişkilendirilebilir ve ilişkisiz öğrenmeden geçer5,6,15-19. Bu refleks üzerinde onlarca yıllık çalışma da öğrenme ve hafızada kilit bir role sahip birkaç sinyal yolu tanımlamıştır20-24.
Hafıza depolamanın hücresel ve moleküler temelini incelemek için Aplysia'nın birkaç farklı preparatı kullanıldı. Bunlar arasında sağlam hayvan2,3, yarı bozulmamış hazırlık1,7,13,14,16 ve nöral devrenin ana bileşenlerinin yeniden25-29. Tanımlanan nöronal devrelerin elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia gangliyonlarını keşfetmeye yönelik daha az hazırlık burada açıklanmıştır. Tespit edilen dört nöron incelendi. R15, patlayan bir nöron, L7 ve L11, iki farklı motor nöron ve bir kolinerjik nöron olan R2 incelendi. R2 omurgasız sinir sisteminde tanımlanan en büyük nörondur. Kısaca, bu metodoloji gangliyonların proteaz tedavisini, farmakolojik tedavilerden önce ve sonra elektrofizyolojik ölçümleri ve gen ekspresyonunun nicel analizi için tek nöronların izolasyonu içerir. Bu metodoloji, moleküler analizleri birden fazla nörondan eşzamanlı kayıtla birleştirmemizi sağlar. Bu metodoloji, R15 ve L7 nöronlarının asetilkoline (Ach) eşleştirilmiş hücre içi kayıtlarla verdiği yanıtları incelemek için başarıyla kullanılmıştır. Elektrofizyolojik ölçümler sonrasında R15 ve L7 ve L11 ve R2 gibi tanımlanan diğer nöronlar, bellek depolama için önemli bir transkripsiyon faktörü olan CREB1 ekspresyonunun nicel polimeraz zincir reaksiyonu (qPCR) analizi için izole edildi.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Nörobiyolojide önemli bir zorluk, belirli bir davranışı yöneten sinir devrelerinin moleküler temellerini anlamaktır. Spesifik moleküler mekanizmalar belirlendikten sonra, dejeneratif hastalıkların veya sinir sisteminin yaşlanmasının neden olduğu belirli davranışlardaki anormallikleri tedavi etmek için yeni terapötik stratejiler geliştirilebilir. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelinin araştırılması için çok uygundur, çünkü belirli bir davranışın altında kalan sinir devreleri kolayca belirlenebilir ve devrenin bireysel bileşenleri kolayca manipüle edilebilir. Aplysia'nın bu avantajları, öğrenme ve hafıza nörobiyolojisinin birkaç temel keşifine yol açmıştır. Burada, aplysia sinir sisteminin bireysel nöronların elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için bir hazırlığını açıklıyoruz. Kısaca, sinir sisteminden parçalanan ganglion, ganglion kılıfını çıkarmak için proteazlara maruz kalır, böylece nöronlar maruz kalır, ancak bozulmamış hayvanda olduğu gibi nöronal aktiviteyi korur. Bu preparat, tek veya birden fazla nöronun elektrofizyolojik ölçümlerini yapmak için kullanılır. Daha da önemlisi, basit bir metodoloji kullanılarak kaydı takiben, nöronlar gen ekspresyon analizi için doğrudan gangliyondan izole edilebilir. Bu protokoller, L7 ve R15 nöronlarından eşzamanlı elektrofizyolojik kayıtları gerçekleştirmek, aplysia'nınizole tek L7, L11, R15 ve R2 nöronlarında CREB1 geninin asetilkolin ve nicel ekspresyonlarına yanıtlarını incelemek için kullanıldı.

Bu çalışmada kullanılan hayvanların ağırlıkları 100-200 g arasında değişmektedir. Açıklanan protokollerin ardından 2-5 g ile 200-300 g arasında değişen hayvanlardan izole edilmiş abdominal gangliyon nöronlarının elektrofizyolojik ölçümlerini ve moleküler analizlerini yaptık.
Proteaz tedavisinin standardizasyonu, gangliyonlardaki nöronların başarılı elektrofizyolojik ölçümleri için önemlidir. Başlangıçta, birden fazla proteaz (Dispase) konsantrasyonu ve s...

Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Aplysia Tek Nöronların Elektrofizyolojik ve Moleküler Analizleri için Gangliyon Hazırlama

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Görüntüleme.  The Scripps Research Institute, Florida. Deniz salyangozu Aplysia californica, davranışın hücresel ve moleküler temelleri üzerine yapılan çalışmalar için nörobiyoloji modeli olarak yaygın olarak kullanılmaktadır. Burada, tanımlanan sinir devrelerinin tek nöronlarının elektrofizyolojik ve moleküler analizleri için Aplysia'nın sinir sistemini keşfetmek için bir metodoloji açıklanmaktadır.

Video: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

Yarı yapay Moleküler Makine ve Kullanımı DNA Hasar Tespiti için in vitro Meclisi

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Biyomühendislik

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Moleküler Dolaşıklık Biyopolimerlerin Electrospinnability

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Sıkıştırılmış Kolajen kıyılmış Doku: Tek aşamalı Rekonstrüktif Onarım için Cep içeren Biotransplant

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Tek Hücre Salgıları uzay-zamansal Görüntüleme için bir etiket içermeyen Tekniği

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

Kimya ve Biyoalgılayıcı Uygulamaları için Silikon Nanotel Alan etkili Transistör hazırlanması

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Tek Karbon Nanotüp Bio-mimetik Polimerler ile Mühendislik Moleküler Tanıma

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

Baculum diseksiyonu, mikroBT Tarama ve Morfometrik Analizleri

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Hazırlık, arıtma ve yağ asidi içeren lipozomlar kullanımı

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Falcarindiol tarafından insan mezenkimal kök hücre içeren yeni Lipid kaplı nano tanecikleri alımını

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Yaprak Reflektasyonu ve Klorofil Floresan Analizlerinin Eşzamanlı Ölçümleri ile Fotosentetik Davranışların Değerlendirilmesi

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...