화이트홀 재단이 이 사업을 수행한 스크립스 연구소의 자금 지원과 스타트업 기금에 진심으로 감사드립니다.

1. 복 부 신경의 준비, 전기 생리 측정, 및 Aplysia californica의 복부 신경절에서 단일 식별 된 뉴런의 격리
<ol><li>12:12 빛:어두운 조건에서 16°C에서 인공 해수(ASW)를 순환하는 실험실 수족관에서 액량증을 유지합니다.</li>
	<li>복부 신경절의 격리.<ol>
<li>5-10 분 (동물의 체중의 30-35 %에 해당)에 대한 380 mM MgCl2 용액을 주입하여 동물을 마취.</li>
		<li>중추 신경계의 위치에 따라 복부 신경절을 식별24,28.</li>
		<li>외과수술에 의한 신경담을 제거하고 450mM NaCl, 10mM KCl, 10mM MKCl 2, 55mM MgCl2,2.5mM NaHCO3,10mM HEPES(pH 7.4)로 구성된 인공 해수에 즉시 보관한다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>프로테아제 치료.<ol>
<li>상술한 ASW에서 희석된 0.1%의 프로테아제(dispase)를 가진 페트리 접시에서 34°C±0.5에서 30분 동안 복부 신경절을 배양한다. 참고: 사용되는 프로테아제의 양은 동물의 나이와 무게로 표준화되어야 합니다. 일반적으로, 더 오래 되고 더 큰 동물은 더 많은 protease를 요구할 것입니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>간리아 칼집의 제거.<ol>
<li>효소 치료 후, 세포 챔버의 실가드 실리콘 베이스에 간리아를 고정 (Ø = 1cm; vol. = 0.3 ml) 실온에서 ASW (유량 : 150 μl/min) 실온 (18 °C±2). 참고: 확인된 뉴런의 가시성을 높이기 위해, 20X 및 40X 배율을 가진 쌍안경 스테레오현미경을 사용하여 바닥에서 쉽게 발광할 수 있는 폴리카보네이트 유리 실린더(도1) (직경Ø= 2mm 변형 된 세포 챔버)의 상단에 신경절을 놓습니다.</li>
		<li>집게와 미세 시저를 사용하여 신경절에서 칼집을 조심스럽게 제거합니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>두 개의 뉴런에서 동시 전기 생리학적 기록.<ol>
<li>관심의 뉴런을 식별합니다.</li>
		<li>3 M KCl 용액으로 채워진 저항 10-15 MΩ으로 단일 세포 내 날카로운 마이크로 전극으로 뉴런을 임팔레.</li>
		<li>셀룰러 내 레코딩 시스템을 사용하여 기록된 신경 활동(10kHz 대역 패스).</li>
		<li>축사그래프와 같은 전기생리학 소프트웨어를 사용하여 기록 데이터를 처리합니다. 참고: 여러 뉴런에서 녹음을 쉽게 수행할 수 있습니다. 뉴런 L7, L11 또는 R15 및 R2는 자신의 위치에 따라 쉽게 식별됩니다. 2개의 증폭기 및 2개의 마이크로조작기는 2개의 L7 및 R15 뉴런(그림2)에서동시에 기록하기 위해 요구됩니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>약물 응용 프로그램.<ol>
<li>부드러운 파이펫팅으로 셀 챔버에 선택의 약물을 적용하거나 뉴런에 직접 주입.</li>
		<li>전기 생리학적 측정을 수행합니다. 참고: 실험 목표에 따라 약물 적용 전, 도중 및 이후에 막 전위(MP) 또는 작용 잠재력(AP)의 변화와 같은 뉴런의 다른 전기생리학적 파라미터를 측정할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
	<li>단일 뉴런의 격리.<ol>
<li>전기 생리학적 실험이 끝나면 ASW의 관류를 중단하고 100% 에탄올로 신경절을 씻는다.  에탄올에 노출되면 뉴런이 석화되고 미세 포셉을 사용하여 신경절에서 다른 뉴런을 손상시키지 않고 개별 뉴런을 쉽게 제거할 수 있습니다.</li>
		<li>스테레오현미경으로 단일 뉴런을 제거하고 얼음 감기 500 μl RNA 추출 시약을 포함하는 작은 Eppendorf 튜브로 이송하십시오. 고립 된 단일 뉴런은 향후 분석을 위해 -80 °C에서 RNA 추출 시약에 저장할 수 있습니다.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. 정량적 실시간 PCR에 의한 단일 뉴런 및 유전자 발현 분석에서 RNA 절연(qPCR)
<ol><li>RNA 분해를 최소화하기 위한 예방 조치: 리보누알리스 (RNases)는 RNA를 저하시키고 매우 안정적이고 활성 효소입니다. RNA를 처리하는 동안 다음 단계를 수행합니다.<ol>
<li>RNase 비활성화 에이전트로 작업 영역과 계측기 청소.</li>
		<li>RNA를 취급하는 동안 항상 장갑을 착용하고 장갑을 자주 교체하십시오.</li>
		<li>RNA를 처리하기 위해 RNase 무료 플라스틱만 사용하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단일 뉴런에서 총 RNA를 격리:<ol>
<li>RNA 절연을 위한 표준 트리졸 프로토콜은 단 하나 뉴런에서 RNA를 격리하기 위하여 이용될 수 있습니다. 트리졸에 20% v/v의 클로로폼을 짧게 넣고 짧은 소용돌이로 잘 섞어드린다.</li>
		<li>튜브를 회전기에 4°C에서 10분 동안 배치합니다. 트리졸-클로로폼 믹스를 12,000 x g에서 4°C에서 15분 동안 회전시하십시오.</li>
		<li>수성 단계를 수집하고 신선한 튜브로 전송합니다.</li>
		<li>아세테이트 용액(pH 5.5)을 최종 농도0.3M, 100 ng/ml의 coprecipitant GlycoBlue, 및 RNA침전을 위해 100% 에탄올의 2.5부피를 첨가한다.</li>
		<li>샘플을 잘 섞고 하룻밤 동안 -80 °C에서 배양하십시오.</li>
		<li>4°C에서 20분 동안 12,000 x g의 샘플을 회전시키고 작은 파란색 펠릿이 튜브 의 바닥에 볼 수 있습니다.</li>
		<li>상체를 제거하고 펠릿을 75% 얼음 차가운 에탄올850μl로 4°C에서 10분 동안 12,000 x g로 세척합니다.</li>
		<li>상체를 조심스럽게 제거하고 RNA 펠릿을 최대 7-10분 동안 공기 건조시하십시오. 참고: RNA 펠릿을건조하면 용해도가 매우 어려워집니다.
</li>
		<li>일단 건조되면, RNA 펠릿을 RNA 자유 수의 10 μl에서 재중단하고 RNA 농도를 결정합니다. 참고: 분광계를 사용하여 RNA 농도를 결정합니다. 즉시 사용하지 않을 때는 RNA를 -80°C로 저장하십시오.</li>
	</ol></li>
	<li>단일 뉴런에서 aRNA 합성:<ol>
<li>시판되는 선형 RNA 증폭 시스템을 사용하여 RNA(실험 목적에 따라 하나 또는 두 개의 탄환)를 증폭시한다. 참고: 단일 뉴런의 총 RNA는 ~10-60 ng범위입니다. 증폭의 첫 번째 라운드의 예상 수율은 ~100-300 ng이며, 증폭의 두 번째 라운드는 RNA의 ~0.8-1.5 μg이다.</li>
	</ol></li>
	<li>RNA의 역 전사:<ol>
<li>aRNA에서 cDNA를 생성하려면 역전사 반응의 20 μl에 aRNA 1.0 μg를 사용하십시오. 이러한 목적으로 여러 키트를 시판할 수 있습니다. 참고: cDNA는 열 사이클러에서 다음 설정을 사용하여 제조업체의 프로토콜에 따라 합성되었습니다. 25°C에서 5분 42°C에서 30분 85°C에서 5분 4°C에서 유지</li>
		<li>역전사 단계 후, cDNA를 -20°C에 저장하여 장기 저장한다.</li>
	</ol></li>
	<li>프라이머 설계 및 표준화: 실시간 증폭을 위해 프라이머를 설계하기 위해 몇 가지 우수한 소프트웨어 프로그램을 무료로 사용할 수 있습니다.<ol>
<li>70-110 bp 앰플리통을 생성하고 상업적 인 소스를 사용하여 프라이머를 합성 하는 18-24 mer 올리고 뉴클레오티드를 선택합니다. 참고: 2~3개의 프라이머 쌍은 관심있는 각 유전자를 위해 설계되어야 합니다. 각 프라이머 세트는 qPCR에 의해 표준화되어야 합니다. 유전자 CREB1(그림 4)에사용되었던 전방 및 역 프라이머 쌍은 다음과 같습니다. 프라이머 세트 1 포워드: 5'-TGATTCTGACGCAAAAAAAAAAAAA-GA-3' 역: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTGGTAGGTAGA-3' 프라이머 세트 2 포워드: 5'-아가트GTCGATGA아가아가-3' 역: 5'-GACACACAGGAAGTCAAA-3'</li>
		<li>다운스트림 해석에 사용할 최적의 프라이머를 선택하려면 qPCR에서 Ct 값과 증폭 곡선의 모양을 모니터링합니다. 참고: PCR의 기하급수적 단계 동안 40개의 원형 증폭 및 매끄러운 곡선에서 Ct(사이클 임계값) 값을 제공하는 프라이머는 유전자 발현 분석을 위한 최적의 다.</li>
	</ol></li>
	<li>정량적 실시간 PCR (qPCR): 참고: qPCR 기계와 호환되는 적절한 튜브 또는 플레이트를 사용합니다.<ol>
<li>핵증 이없는 물로 cDNA를 5배로 희석시다.</li>
		<li>희석 된 cDNA의 2 μl에, H2O의 2 μl, 2 x SYBR 그린 마스터 믹스의 5 μl, 10 μM (각) 전방 및 역 프라이머를 포함하는 qPCR 마스터 믹스의 8 μl을 추가합니다.</li>
		<li>튜브를 닫고 cDNA와 마스터 믹스를 피펫팅 한 후 플레이트를 밀봉하십시오. 30초 동안 1,500rpm에서 부드러운 두드리고 회전하여 내용들을 섞습니다.</li>
		<li>qPCR 기계 설정으로 진행합니다.</li>
	</ol></li>
</ol>

저자는 경쟁적인 재정적 이해관계가 없습니다.

뉴런 R15는 심혈관 조절, 소화, 호흡기 및 생식시스템(30)에관여한다. AP의 정기적으로 리듬 파열 활동은 R15의 특징입니다. 결과 섹션에 도시된 바와 같이, R15 및 L7의 페어링된 레코딩은 신경리아 제제가 R15 뉴런의 활성을 보존하고 있음을 보여준다. R15 및 L7 뉴런은 Ach에 적절하게 반응했습니다. 이 신경질 제제는 8-10 시간까지 유지 될 수 있고 전기 생리 활성은 지속적으로 모니터링 될 수있?...

인간의 뇌는 거의 1,000억 개의 뉴런과 수조 개의 시냅스 연결로 매우 복잡합니다. 뉴런과 상호 작용하고 뇌에서 의 기능을 조절하는 비 신경 세포의 거의 동일한 수가 있습니다. 뉴런은 특정 행동을 조절하는 회로로 구성됩니다. 뇌 기능 및 신경 회로에 대한 이해의 발전에도 불구하고 특정 동작을 제어하는 회로 구성 요소의 정체성에 대해서는 알려진 것이 거의 없습니다. 회로의 다양한 구성 요소의 정체성에 대한 지식은 크게 행동의 세포 및 분자 기초의 우리의 이해를 용이하게하고 신경 정신 장애에 대한 새로운 치료 전략을 개발하는 데 도움이.
해양 달팽이 Aplysia californica는 특정 행동1-14의근본적인 신경 회로를 결정하기위한 주력이었다. Aplysia 신경계는 9개의 다른 신경통으로 조직되는 대략 20,000의 신경세포를 포함합니다. Aplysia의 뉴런은 크고 그들의 크기, 전기 적 특성 및 신경리아의 위치에 따라 쉽게 식별 할 수 있습니다. Aplysia는 연구할 수 있는 행동의 풍부한 레퍼토리가 있습니다. 잘 연구 된 행동 중 하나는 아가미 철수 반사 (GWR)입니다. 이 반사의 중앙 구성 요소는 복부 신경통에 위치하고 있습니다. GWR 회로의 구성 요소가 매핑되고 다양한 구성 요소의 기여가 결정되었습니다. 중요한 것은, GWR 회로는 연관 및 비연관적 학습5,6,15-19를겪는다. 이 반사에 대한 연구의 수십 년은 또한 학습및 기억20-24에중요한 역할을 여러 신호 경로를 확인했다.
Aplysia의 몇몇 다른 준비는 기억 저장의 세포 그리고 분자 기초를 공부하기 위하여 이용되었습니다. 여기에는 온전한 동물2,3,반전준비1,7,13,14,16 및 신경 회로의 주요 성분의재구성이 포함된다 25-29. 확인된 신경 회로의 전기 생리학적 및 분자 분석을 위한 Aplysia 신경리아를 탐구하기 위한 감소된 준비는 여기에서 기술됩니다. 다음 4 개의 확인 된 뉴런 을 공부 했다. R15, 파열 뉴런, L7 및 L11, 두 개의 다른 모터 뉴런과 R2, 콜린성 뉴런을 연구했다. R2는 무척추 동물 신경계에 설명 된 가장 큰 뉴런입니다. 간단히 말해서, 이 방법론은 신경리아의 프로테아제 치료, 약리학적 치료 전후의 전기 생리학적 측정, 유전자 발현의 정량적 분석을 위한 단일 뉴런의 분리를 포함합니다. 이 방법론은 분자 분석을 여러 뉴런의 동시 기록과 결합할 수 있게 해줍니다. 이 방법론은 성공적으로 쌍 세포 내 기록에 의해 아세틸 콜린 (Ach)에 R15 및 L7 뉴런의 응답을 연구하는 데 사용되었다. 전기생리학적 측정 에 이어 R15 및 L7 및 L11 및 R2와 같은 다른 확인된 뉴런은 메모리 저장에 중요한 전사 인크레B1의 발현의 정량적 폴리머라제 연쇄 반응(qPCR) 분석을 위해 격리되었다.

<table><tbody><tr><td>&lt;em&gt;Aplysia&lt;/em&gt;</td><td>National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td><td></td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>SIGMA</td><td>S 3014-1KG</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>SIGMA</td><td>P 9333-500G</td><td></td></tr><tr><td>CaCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;2H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>SIGMA</td><td>C5080- 500G</td><td></td></tr><tr><td>MgCl&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;&amp;bull;6H&lt;sub&gt;2&lt;/sub&gt;O</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP 214-501</td><td></td></tr><tr><td>NaHCO&lt;sub&gt;4&lt;/sub&gt;</td><td>SIGMA</td><td>S 6297-250G</td><td></td></tr><tr><td>HEPES</td><td>SIGMA</td><td>H 3375-500G</td><td></td></tr><tr><td>Protease</td><td>GIBCO</td><td>17105-042</td><td></td></tr><tr><td>Trizol</td><td>Ambion</td><td>15596-026</td><td></td></tr><tr><td>Chloroform</td><td>MP Biomedicals</td><td>2194002</td><td></td></tr><tr><td>100% Ethanol</td><td>ACROS</td><td>64-17-5</td><td></td></tr><tr><td>GlycoBlue</td><td>Ambion</td><td>AM9515</td><td></td></tr><tr><td>3 M NaOAc, pH 5.5</td><td>Ambion</td><td>AM9740</td><td></td></tr><tr><td>Nuclease free water</td><td>Ambion</td><td>AM9737</td><td></td></tr><tr><td>MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td><td>Ambion</td><td>AM1751</td><td></td></tr><tr><td>qScript cDNA SuperMix</td><td>Quanta Biosciences</td><td>95048-100</td><td></td></tr><tr><td>Power SYBR Green PCR Master Mix</td><td>Applied Biosystems</td><td>4367659</td><td></td></tr><tr><td>Forceps</td><td>Fine Science Tools</td><td>11252-20</td><td></td></tr><tr><td>Scissors</td><td>Fine Science Tools</td><td>15000-08</td><td></td></tr><tr><td>Stainless Steel Minutien Pins&amp;nbsp;</td><td>Fine Science Tools</td><td>26002-10 or</td><td></td></tr><tr><td>26002-20</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Veriti Thermal Cycler</td><td>Applied Biosystems</td><td>Veriti Thermal Cycler</td><td></td></tr><tr><td>5430R Centrifuge</td><td>Eppendorf</td><td>5430R Centrifuge</td><td></td></tr><tr><td>7900HT Fast Real-Time PCR</td><td>Applied Biosystems</td><td>7900HT Fast Real-Time PCR</td><td></td></tr><tr><td>Amplifier</td><td>BRAMP-01R</td><td>NPI Electronics</td><td></td></tr><tr><td>Digidata Converter</td><td>Instrutech ITC-18</td><td>HEKA ELEKTRONIK</td><td></td></tr><tr><td>Micro Manipulator</td><td>Patch Star</td><td>Scientifica</td><td></td></tr></tbody></table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

신경생물학의 주요 과제는 특정 행동을 지배하는 신경 회로의 분자 기초를 이해하는 것입니다. 특정 분자 메커니즘이 확인되면 퇴행성 질환이나 신경계 노화로 인한 특정 행동의 이상을 치료하기 위해 새로운 치료 전략을 개발할 수 있습니다. 해양 달팽이 Aplysia californica는 특정 행동의 근본적인 신경 회로가 쉽게 결정될 수 있고 회로의 개별 적인 분대가 쉽게 조작될 수 있기 때문에 행동의 세포 및 분자 기초의 조사에 적합합니다. Aplysia의 이러한 장점은 학습과 기억의 신경 생물학의 몇 가지 근본적인 발견으로 이어졌습니다. 여기에서 우리는 개별 적인 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia 신경계의 준비를 기술합니다. 간단히, 신경계에서 해부된 신경절은 신경세포가 노출되나 그대로 동물에서와 같이 신경 활성을 유지하도록 신경절 칼집을 제거하기 위해 프로테아제스에 노출된다. 이 준비는 단일 또는 다중 뉴런의 전기 생리학적 측정을 수행하는 데 사용됩니다. 중요한 것은, 간단한 방법론을 사용하여 기록을 따라, 뉴런은 유전자 발현 분석을 위해 신경질로부터 직접 분리될 수 있었다. 이러한 프로토콜은 L7 및 R15 뉴런으로부터 동시 전기 생리학적 기록을 수행하고, 아세틸콜린에 대한 반응과 분리된 단일 L7, L11, R15 및 Aplysia의R2 뉴런에서 CREB1 유전자의 양화 발현을 연구하는 데 사용되었습니다.

이 연구에서 사용 된 동물의 무게는 100-200 g에서 배열. 설명된 프로토콜에 따라, 우리는 2-5 g에서 200-300 g에 구역 수색하는 동물에서 분리된 복부 신경의 신경의 전기 생리학적 측정 및 분자 분석을 실시했습니다.
프로테아제 치료의 표준화는 신경교에서 뉴런의 성공적인 전기 생리학적 측정에 중요합니다. 처음에, 다중 프로테아제(Dispase) 농도 및 지속시간이 사용되었고 R15 뉴?...

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

아피시아 단일 뉴런의 전기 생리 및 분자 분석을 위한 신경리아 준비

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K 조회수.  The Scripps Research Institute, Florida. 해양 달팽이 Aplysia californica 널리 행동의 세포와 분자 기초에 연구에 대 한 신경 생물학 모델로 사용 되었습니다. 여기서 방법론은 확인된 신경 회로의 단일 뉴런의 전기 생리및 분자 분석을 위한 Aplysia의 신경계를 탐구하기 위해 설명된다.

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Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal. Simultaneously recording from multiple nerves and muscles gives us precise information about the timing of neural activity. Previous recording methods have worked for two electrodes, but the study of additional nerves or muscles required combining and averaging the recordings of multiple animals, which made it difficult to determine fine details of timing and phasing, because of variability from response to response, and from animal to animal. Implanting four individual electrodes has a very low success rate due to the formation of adhesions that prevent animals from performing normal feeding movements. We developed a new method of electrode fabrication that reduces the bulk of the electrodes inside the animal allowing for normal feeding movements. Using a combination of glues to attach the electrodes results in a more reliable insulation of the electrode which lasts longer, making it possible to record for periods as long as a week. The fabrication technique that we describe could be extended to incorporate several additional electrodes, and would be applicable to vertebrate animals.

Electrode Fabrication and Implantation in Aplysia californica for Multi-channel Neural and Muscular Recordings in Intact, Freely Behaving Animals

A technique is described for implanting four in vivo electrodes to monitor the neuromuscular control of feeding behavior in Aplysia californica.

의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

Recording from key nerves and muscles of Aplysia during feeding behavior allows us to study the patterns of neural control in an intact animal.  ...

연구

신경과학

Neuronal Cell Cultures from Aplysia for High-Resolution Imaging of Growth Cones

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information into directional movement towards the appropriate target cell. To fully understand how guidance information is transmitted from the cell surface to the underlying dynamic cytoskeletal networks, one needs a model system suitable for live cell imaging of protein dynamics at high temporal and spatial resolution. Typical vertebrate growth cones are too small to quantitatively analyze F-actin and microtubule dynamics. Neurons from the sea hare Aplysia californica are 5-10 times larger than vertebrate neurons, can easily be kept at room temperature and are very robust cells for micromanipulation and biophysical measurements. Their growth cones have very defined cytoplasmic regions and a well-described cytoskeletal system. The neuronal cell bodies can be microinjected with a variety of probes for studying growth cone motility and guidance. In the present protocol we demonstrate a procedure for dissection of the abdominal ganglion, culture of bag cell neurons and setting up an imaging chamber for live cell imaging of growth cones.

Aplysia californica neurons develop large growth cones in culture that are excellent for high-resolution imaging of growth cone motility and guidance. Here, we present a protocol for dissection and plating of Aplysia bag cell neurons as well as for setting up a chamber for live cell imaging.

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

Neuronal growth cones are the highly motile structures at the tip of axons that can detect guidance cues in the environment and transduce this information ...

생물학

Culturing and Electrophysiology of Cells on NRCC Patch-clamp Chips

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard of electrophysiology applied to disease models and pharmaceutical screens alike 1. The method traditionally involves gently contacting a cell with a glass pipette filled by a physiological solution in order to isolate a patch of the membrane under its apex 2. An electrode inserted in the pipette captures ion-channel activity within the membrane patch or, when ruptured, for the whole cell. In the last decade, patch-clamp chips have been proposed as an alternative 3, 4: a suspended film separates the physiological medium from the culture medium, and an aperture microfabricated in the film replaces the apex of the pipette. Patch-clamp chips have been integrated in automated systems and commercialized for high-throughput screening 5. To increase throughput, they include the fluidic delivery of cells from suspension, their positioning on the aperture by suction, and automated routines to detect cell-to-probe seals and enter into whole cell mode. We have reported on the fabrication of a silicon patch-clamp chip with optimized impedance and orifice shape that permits the high-quality recording of action potentials in cultured snail neurons 6; recently, we have also reported progress towards interrogating mammalian neurons 7. Our patch-clamp chips are fabricated at the Canadian Photonics Fabrication Centre 8, a commercial foundry, and are available in large series. We are eager to engage in collaborations with electrophysiologists to validate the use of the NRCC technology in different models. The chips are used according to the general scheme represented in Figure 1: the silicon chip is at the bottom of a Plexiglas culture vial and the back of the aperture is connected to a subterranean channel fitted with tubes at either end of the package. Cells are cultured in the vial and the cell on top of the probe is monitored by a measuring electrode inserted in the channel.The two outside fluidic ports facilitate solution exchange with minimal disturbance to the cell; this is an advantage compared to glass pipettes for intracellular perfusion.
<img alt="Figure 1" src="/files/ftp_upload/3288/3288fig1.jpg" />
Figure 1. Principle of measurement using the NRCC patch-clamp chip
We detail here the protocols to sterilize and prime the chips, load them with medium, plate them with cells, and finally use them for electrophysiological recordings.

We show how planar patch-clamp chips fabricated at the National Research Council of Canada are sterilized, primed, loaded with medium, plated with cells, and used for electrophysiological recordings.

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

Due to its exquisite sensitivity and the ability to monitor and control individual cells at the level of ion channels, patch-clamping is the gold standard ...

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., homosynaptic facilitation) 1. These hypotheses can be tested by simultaneously monitoring changes in intracellular calcium and alterations in synaptic efficacy. We demonstrate how this can be accomplished by combining calcium imaging with intracellular recording techniques. Our experiments are conducted in a buccal ganglion of the mollusc Aplysia californica. This preparation has a number of experimentally advantageous features: Ganglia can be easily removed from Aplysia and experiments use adult neurons that make normal synaptic connections and have a normal ion channel distribution. Due to the low metabolic rate of the animal and the relatively low temperatures (14-16 &deg;C) that are natural for Aplysia, preparations are stable for long periods of time. 
To detect changes in intracellular free calcium we will use the cell impermeant version of Calcium Orange 2 which is easily 'loaded' into a neuron via iontophoresis. When this long wavelength fluorescent dye binds to calcium, fluorescence intensity increases. Calcium Orange has fast kinetic properties 3 and, unlike ratiometric dyes (e.g., Fura 2), requires no filter wheel for imaging. It is fairly photo stable and less phototoxic than other dyes (e.g., fluo-3) 2,4. Like all non-ratiometric dyes, Calcium Orange indicates relative changes in calcium concentration. But, because it is not possible to account for changes in dye concentration due to loading and diffusion, it can not be calibrated to provide absolute calcium concentrations. 
An upright, fixed stage, compound microscope was used to image neurons with a CCD camera capable of recording around 30 frames per second. In Aplysia this temporal resolution is more than adequate to detect even a single spike induced alteration in the intracellular calcium concentration. Sharp electrodes are simultaneously used to induce and record synaptic transmission in identified pre- and postsynaptic neurons. At the conclusion of each trial, a custom script combines electrophysiology and imaging data. To ensure proper synchronization we use a light pulse from a LED mounted in the camera port of the microscope. Manipulation of presynaptic calcium levels (e.g. via intracellular EGTA injection) allows us to test specific hypotheses, concerning the role of intracellular calcium in mediating various forms of plasticity.

Monitoring Changes in the Intracellular Calcium Concentration and Synaptic Efficacy in the Mollusc Aplysia

We demonstrate how changes in the intracellular free calcium concentration and synaptic efficacy can be simultaneously monitored in a ganglion preparation of Aplysia. We image intracellular calcium using a fluorescent dye, Calcium Orange, and induce and monitor synaptic transmission with sharp (intracellular) electrodes.

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경<em&gt; Aplysia</em

It has been suggested that changes in intracellular calcium mediate the induction of a number of important forms of synaptic plasticity (e.g., ...

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

Multifunctionality, the ability of one peripheral structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals to rapidly adapt their behaviors to changing environments. The marine mollusk Aplysia californica provides a tractable system for the study of multifunctionality. During feeding, Aplysia generates several distinct types of behaviors using the same feeding apparatus, the buccal mass. The ganglia that control these behaviors contain a number of large, identified neurons that are accessible to electrophysiological study. The activity of these neurons has been described in motor programs that can be divided into two types, ingestive and egestive programs, based on the timing of neural activity that closes the food grasper relative to the neural activity that protracts or retracts the grasper2. However, in isolated ganglia, the muscle movements that would produce these behaviors are absent, making it harder to be certain whether the motor programs observed are correlates of real behaviors. In vivo, nerve and muscle recordings have been obtained corresponding to feeding programs2,3,4, but it is very difficult to directly record from individual neurons5. Additionally, in vivo, ingestive programs can be further divided into bites and swallows1,2, a distinction that is difficult to make in most previously described in vitro preparations.
The suspended buccal mass preparation (Figure 1) bridges the gap between isolated ganglia and intact animals. In this preparation, ingestive behaviors - including both biting and swallowing - and egestive behaviors (rejection) can be elicited, at the same time as individual neurons can be recorded from and stimulated using extracellular electrodes6. The feeding movements associated with these different behaviors can be recorded, quantified, and related directly to the motor programs. The motor programs in the suspended buccal mass preparation appear to be more similar to those observed in vivo than are motor programs elicited in isolated ganglia. Thus, the motor programs in this preparation can be more directly related to in vivo behavior; at the same time, individual neurons are more accessible to recording and stimulation than in intact animals. Additionally, as an intermediate step between isolated ganglia and intact animals, findings from the suspended buccal mass can aid in interpretation of data obtained in both more reduced and more intact settings. The suspended buccal mass preparation is a useful tool for characterizing the neural control of multifunctionality in Aplysia.

An In Vitro Preparation for Eliciting and Recording Feeding Motor Programs with Physiological Movements in Aplysia californica

We describe a technique to extracellularly record and stimulate from nerves, muscles, and individual identified neurons in vitro while eliciting and observing different types of feeding behaviors in the feeding apparatus of Aplysia.

<em&gt; 체외에서</em의 생리적 운동과 수유 모터 프로그램을 도출하도록 의도하고 녹음&gt; 준비<em&gt; Aplysia californica</em

Multifunctionality, the ability of one peripheral  structure to generate multiple, distinct behaviors1, allows animals  to rapidly adapt their behaviors ...

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons. The neurons are large (up to 1 mm in diameter) and identifiable, with distinct sizes, shapes, positions and pigmentations, and the cell bodies are externally exposed in five paired ganglia distributed throughout the body of the animal. These properties have allowed investigators to delineate the circuitry underlying specific behaviors in the animal1. The monosynaptic connection between sensory and motor neurons is a central component of the gill-withdrawal reflex in the animal, a simple defensive reflex in which the animal withdraws its gill in response to tactile stimulation of the siphon. This reflex undergoes forms of non-associative and associative learning, including sensitization, habituation and classical conditioning. Of particular benefit to the study of synaptic plasticity, the sensory-motor synapse can be reconstituted in culture, where well-characterized stimuli elicit forms of plasticity that have direct correlates in the behavior of the animal2,3. Specifically, application of serotonin produces a synaptic strengthening that, depending on the application protocol, lasts for minutes (short-term facilitation), hours (intermediate-term facilitation) or days (long-term facilitation). In contrast, application of the peptide transmitter FMRFamide produces a synaptic weakening or depression that, depending on the application protocol, can last from minutes to days (long-term depression). The large size of the neurons allows for repeated sharp electrode recording of synaptic strength over periods of days together with microinjection of expression vectors, siRNAs and other compounds to target specific signaling cascades and molecules and thereby identify the molecular and cell biological steps that underlie the changes in synaptic efficacy.
An additional advantage of the Aplysia culture system comes from the fact that the neurons demonstrate synapse-specificity in culture4,5. Thus, sensory neurons do not form synapses with themselves (autapses) or with other sensory neurons, nor do they form synapses with non-target identified motor neurons in culture. The varicosities, sites of synaptic contact between sensory and motor neurons, are large enough (2-7 microns in diameter) to allow synapse formation (as well as changes in synaptic morphology) with target motor neurons to be studied at the light microscopic level.
In this video, we demonstrate each step of preparing sensory-motor neuron cultures, including anesthetizing adult and juvenile Aplysia, dissecting their ganglia, protease digestion of the ganglia, removal of the connective tissue by microdissection, identification of both sensory and motor neurons and removal of each cell type by microdissection, plating of the motor neuron, addition of the sensory neuron and manipulation of the sensory neurite to form contact with the cultured motor neuron.

Preparation of Aplysia Sensory-motor Neuronal Cell Cultures

Primary cultures of Aplysia sensory-motor neurons provide a model preparation for studying synapse formation and synaptic plasticity in vitro. This video demonstrates the identification and microdissection of sensory and motor neurons from Aplysia ganglia as well as the methods for establishing and maintaining sensory-motor neurons in culture.

의 준비 Aplysia 감각 - 모터의 연결을 셀 문화

The nervous system of the marine mollusk Aplysia californica is relatively simple, consisting of approximately 20,000 neurons.  The neurons are large (up ...

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.
This extracellular technique has advantages. First, extracellular electrodes can stimulate and record neurons through the sheath5, so it does not need to be removed. Thus, neurons will be healthier in extracellular experiments than in intracellular ones. Second, if ganglia are rotated by appropriate pinning of the sheath, extracellular electrodes can access neurons on both sides of the ganglion, which makes it easier and more efficient to identify multiple neurons in the same preparation. Third, extracellular electrodes do not need to penetrate cells, and thus can be easily moved back and forth among neurons, causing less damage to them. This is especially useful when one tries to record multiple neurons during repeating motor patterns that may only persist for minutes. Fourth, extracellular electrodes are more flexible than intracellular ones during muscle movements. Intracellular electrodes may pull out and damage neurons during muscle contractions. In contrast, since extracellular electrodes are gently pressed onto the sheath above neurons, they usually stay above the same neuron during muscle contractions, and thus can be used in more intact preparations.
To uniquely identify motor neurons for a motor pool (in particular, the I1/I3 muscle in Aplysia) using extracellular electrodes, one can use features that do not require intracellular measurements as criteria: soma size and location, axonal projection, and muscle innervation4,6,7. For the particular motor pool used to illustrate the technique, we recorded from buccal nerves 2 and 3 to measure axonal projections, and measured the contraction forces of the I1/I3 muscle to determine the pattern of muscle innervation for the individual motor neurons.
We demonstrate the complete process of first identifying motor neurons using muscle innervation, then characterizing their timing during motor patterns, creating a simplified diagnostic method for rapid identification. The simplified and more rapid diagnostic method is superior for more intact preparations, e.g. in the suspended buccal mass preparation8 or in vivo9. This process can also be applied in other motor pools10,11,12 in Aplysia or in other animal systems2,3,13,14.

Extracellularly Identifying Motor Neurons for a Muscle Motor Pool in Aplysia californica

In animals with large identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using intracellular techniques1,2,3,4. Recently, we developed a technique to extracellularly stimulate and record individual neurons in Aplysia californica5. We now describe a protocol for using this technique to uniquely identify and characterize motor neurons within a motor pool.

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인<em&gt; Aplysia californica</em

In animals with large  identified neurons (e.g. mollusks), analysis of motor pools is done using  intracellular techniques1,2,3,4. Recently,  we developed ...

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable history as a model of nervous system function, with particular significance in studies of learning and memory. The typical preparations for such studies are ones in which the sensory and motoneurons are left intact in a minimally dissected animal, or a technically elaborate neuronal co-culture of individual sensory and motoneurons. Less common is the isolated neuronal preparation in which small clusters of nominally homogeneous neurons are dissociated into single cells in short term culture. Such isolated cells are useful for the biophysical characterization of ion currents using patch clamp techniques, and targeted modulation of these conductances. A protocol for preparing such cultures is described. The protocol takes advantage of the easily identifiable glutamatergic sensory neurons of the pleural and buccal ganglia, and describes their dissociation and minimal maintenance in culture for several days without serum.

Isolation of Sensory Neurons of Aplysia californica for Patch Clamp Recordings of Glutamatergic Currents

We describe the dissection of the nervous system of the marine sea hare Aplysia after anesthesia, the isolation of neurons for short term-tissue culture, and recordings of single cell ion currents via the patch clamp technique.

의 감각 뉴런의 분리<em&gt; 군소 californica</em&gt; 글루타메이트 전류의 패치 클램프 녹음을위한

The marine gastropod mollusk Aplysia californica has a venerable  history as a model of nervous system function, with particular significance in  studies ...

Characterizing RNA Modifications in Single Neurons Using Mass Spectrometry

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous system (CNS). Recent evidence has linked specific neuronal RNA modifications to learning and memory paradigms. Unfortunately, conventional methods for the detection of these epitranscriptomic features are only capable of characterizing highly abundant RNA modifications in bulk tissues, precluding the assessment of unique PTM profiles that may exist for individual neurons within the activated behavioral circuits. In this protocol, an approach is described&#8212;single-neuron RNA modification analysis by mass spectrometry (SNRMA-MS)&#8212;to simultaneously detect and quantify numerous modified ribonucleosides in single neurons. The approach is validated using individual neurons of the marine mollusk, Aplysia californica, beginning with surgical isolation and enzymatic treatment of major CNS ganglia to expose neuron cell bodies, followed by manual single-neuron isolation using sharp needles and a micropipette. Next, mechanical and thermal treatment of the sample in a small volume of buffer is done to liberate RNA from an individual cell for subsequent RNA digestion. Modified nucleosides are then identified and quantified using an optimized liquid chromatography-mass spectrometry method. SNRMA-MS is employed to establish RNA modification patterns for single, identified neurons from A. californica that have known morphologies and functions. Examples of qualitative and quantitative SNRMA-MS are presented that highlight the heterogeneous distribution of RNA modifications across individual neurons in neuronal networks.

Post-transcriptional modifications of RNA represent an understudied layer of translation regulation that has recently been linked to central nervous system plasticity. Here, sample preparation and liquid chromatography-tandem mass spectrometry approach is described for simultaneous characterization of numerous RNA modifications in single neurons.

질량 분광법을 사용하여 단일 뉴런의 RNA 변형 특성화

Post-transcriptional modifications (PTMs) of RNA represent an understudied mechanism involved in the regulation of translation in the central nervous ...

화학

Spiral Ganglion Neuron Explant Culture and Electrophysiology on Multi Electrode Arrays

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in the brain stem. Loss of hair cells is a major cause of sensory hearing loss. Prosthetic devices such as cochlear implants function by bypassing lost hair cells and directly stimulating SGNs electrically, allowing for restoration of hearing in deaf patients. The performance of these devices depends on the functionality of SGNs, the implantation procedure and on the distance between the electrodes and the auditory neurons. 
We hypothesized, that reducing the distance between the SGNs and the electrode array of the implant would allow for improved stimulation and frequency resolution, with the best results in a gapless position. Currently we lack in vitro culture systems to study, modify and optimize the interaction between auditory neurons and electrode arrays and characterize their electrophysiological response. To address these issues, we developed an in vitro bioassay using SGN cultures on a planar multi electrode array (MEA). With this method we were able to perform extracellular recording of the basal and electrically induced activity of a population of spiral ganglion neurons. We were also able to optimize stimulation protocols and analyze the response to electrical stimuli as a function of the electrode distance. This platform could also be used to optimize electrode features such as surface coatings.

We present a protocol to culture primary murine spiral ganglion neuron explants on multi electrode arrays to study neuronal response profiles and optimize stimulation parameters. Such studies aim to improve the neuron-electrode interface of cochlear implants to benefit hearing in patients as well as the energy consumption of the device.

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학

Spiral ganglion neurons (SGNs) participate in the physiological process of hearing by relaying signals from sensory hair cells to the cochlear nucleus in ...

아피시아 단일 뉴런의 전기 생리 및 분자 분석을 위한 신경리아 준비

요약

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의 전극 제작 및 주입 Aplysia californica 손상, 자유롭게 행동 동물의 다중 채널 및 신경 근육질 레코딩을위한

성장 콘스의 고해상도 이미징을위한 Aplysia에서의 연결을 셀 문화

NRCC 패치 - 클램프 칩에 대한 세포의 Culturing 및 전기 생리학

연체 동물에서 세포 내 칼슘 농도와 시냅틱 효능의 모니터링 변경

의 준비 Aplysia 감각 - 모터의 연결을 셀 문화

Extracellularly의 근육 모터 풀에 모터 뉴런을 확인

의 감각 뉴런의 분리

질량 분광법을 사용하여 단일 뉴런의 RNA 변형 특성화

다중 전극 배열에 나선 신경절 신경 이식편 문화 및 전기 생리학