Ringraziamo sinceramente la Whitehall Foundation per il supporto finanziario e i fondi di avvio dello Scripps Research Institute per aver svolto questo lavoro.

1. Preparazione di gangli addominali, misurazioni elettrofisiopatiche e isolamento di singoli neuroni identificati dal ganglio addominale di Alisia californica
<ol><li>Mantenere Aplysia nell'acquario di laboratorio con acqua di mare artificiale circolante (ASW) a 16 °C in condizioni di luce:buio 12:12.</li>
	<li>Isolamento del ganglio addominale.<ol>
<li>Anestetizzare gli animali iniettando soluzione mgcl2 da 380 mM per 5-10 minuti (equivalente al 30-35% del peso corporeo dell'animale).</li>
		<li>Identificare il ganglio addominale in base alla sua posizione nel sistema nervosocentrale 24,28.</li>
		<li>Rimuovere i gangli mediante intervento chirurgico e conservare immediatamente in acqua di mare artificiale composta da NaCl da 450 mM, 10 mM KCl, 10 mM CaCl2,55 mM MgCl2, 2,5 mM NaHCO3e 10 mM HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Trattamento proteasi.<ol>
<li>Incubare il ganglio addominale per 30 minuti a 34 °C±0,5 in una piastra di Petri con proteasi dello 0,1% (dispasi) diluita nell'ASW sopra descritta. NOTA: La quantità di proteasi utilizzata deve essere standardizzata con l'età e il peso degli animali. In generale, gli animali più vecchi e più grandi richiederebbero più proteasi.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Rimozione della cannalia ganglia.<ol>
<li>Dopo il trattamento enzimatico, fissare i gangli alla base di Silicone di Sylgard di una camera cellulare (Ø= 1 cm; vol. = 0,3 ml) e per infusione con ASW (portata: 150 μl/min) a temperatura ambiente (18 °C±2 ). NOTA: Al fine di aumentare la visibilità dei neuroni identificati, posizionare il ganglio sulla parte superiore di un cilindro di vetro in policarbonato (Figura 1) (diametro Ø = camera cellulare modificata da 2 mm) che può essere facilmente illuminato dal basso utilizzando uno stereomicroscopio binoculare con ingrandimento 20X e 40X.</li>
		<li>Rimuovere con cura la toraia dal ganglio usando forcep e microscissori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Registrazione elettrofisiologia simultanea da due neuroni.<ol>
<li>Identificare il neurone di interesse.</li>
		<li>Impalare il neurone con un singolo microelettrodo acuto intracellulare con resistenza 10-15 MΩ riempita con soluzione di 3 M KCl.</li>
		<li>Registra l'attività neuronale (passaggio a banda 10 kHz) usando un sistema di registrazione intracellulare.</li>
		<li>Elaborare i dati di registrazione utilizzando software di elettrofisiologia come Axograph. NOTA: Si può facilmente effettuare la registrazione da più neuroni. I neuroni L7, L11 o R15 e R2 sono facilmente identificabili in base alla loro posizione. Per la registrazione simultanea da due neuroni L7 e R15 (Figura 2) sono necessari due amplificatori e due micromanipolatori.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Applicazione di farmaci.<ol>
<li>Applicare il farmaco di scelta nella camera cellulare con pipettazione delicata o iniettare direttamente nei neuroni.</li>
		<li>Effettuare misurazioni elettrofisiopatiche. NOTA: A seconda dell'obiettivo sperimentale, si potrebbero misurare diversi parametri elettrofisiologici dei neuroni come i cambiamenti nel potenziale di membrana (MP) o nel potenziale di azione (AP) prima, durante e dopo l'applicazione del farmaco.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Isolamento di singoli neuroni.<ol>
<li>Al termine degli esperimenti elettrofisiologici, interrompere la perfusione di ASW e lavare il ganglio con etanolo al 100%.  L'esposizione all'etanolo pietrifica i neuroni e, usando forcep fini, rende facile rimuovere i singoli neuroni senza danneggiare altri neuroni dal ganglio.</li>
		<li>Rimuovere singoli neuroni sotto uno stereomicroscopio e trasferirli in un piccolo tubo Eppendorf contenente reagente di estrazione dell'RNA ghiacciato da 500 μl. Singoli neuroni isolati possono essere conservati nel reagente di estrazione dell'RNA a -80 °C per analisi future.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. Isolamento dell'RNA dai singoli neuroni e analisi dell'espressione genica da parte della PCR quantitativa in tempo reale (qPCR)
<ol><li>Precauzioni per ridurre al minimo la degradazione dell'RNA: Le ribonucleasi (RNasi) degradano l'RNA e sono enzimi molto stabili e attivi. Durante la gestione degli RNA, a seguire le procedure seguenti.<ol>
<li>Pulire l'area di lavoro e gli strumenti con agenti disattivanti RNasi.</li>
		<li>Indossare i guanti in ogni momento durante la manipolazione dell'RNA e cambiare spesso i guanti.</li>
		<li>Utilizzare solo plastica priva di RNasi per gestire gli RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Isolare l'RNA totale da singoli neuroni:<ol>
<li>Il protocollo Trizol standard per l'isolamento dell'RNA può essere utilizzato per isolare gli RNA da singoli neuroni. Aggiungere brevemente il 20% v/v di cloroformio al Trizolo, mescolare bene con un breve vortice.</li>
		<li>Posizionare i tubi sul rotatore per 10 min a 4 °C. Ruotare la miscela Trizolo-Cloroformio a 12.000 x g per 15 min a 4 °C.</li>
		<li>Raccogliere la fase acquosa e trasferirlo in un tubo fresco.</li>
		<li>Aggiungere la soluzione di acetato di sodio (pH 5.5) ad una concentrazione finale di 0,3 M, 100 ng/ml del coprecipitante GlycoBlue e 2,5 volumi di etanolo al 100% per far precipitare l'RNA.</li>
		<li>Mescolare bene i campioni e incubare a -80 °C durante la notte.</li>
		<li>Ruotare i campioni a 12.000 x g per 20 min a 4 °C e un piccolo pellet blu sarà visibile nella parte inferiore del tubo.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante e lavare il pellet con 850 μl di etanolo ghiacciato al 75% a 12.000 x g per 10 min a 4 °C.</li>
		<li>Rimuovere il supernatante con cura e asciugare all'aria il pellet di RNA per 7-10 minuti, massimo. NOTA: Assicurarsi che l'RNA non sia lasciato a lungo asciutto come oltre - asciugareil pellet di RNA rende la solubilizzazione molto difficile.
</li>
		<li>Una volta essiccato, rimescolare il pellet di RNA in 10 μl di acqua libera di RNAse e determinare la concentrazione di RNA. NOTA: Determinare la concentrazione di RNA utilizzando uno spettrofotometro. Quando non si utilizza subito, conservare l'RNA a -80 °C.</li>
	</ol></li>
	<li>sintesi dell'aRNA da singoli neuroni:<ol>
<li>Amplificare l'RNA (uno o due turni a seconda dell'obiettivo sperimentale) utilizzando il sistema di amplificazione dell'RNA lineare disponibile in commercio. NOTA: L'RNA totale dei singoli neuroni variava da ~10-60 ng. La resa prevista del primo ciclo di amplificazione è di ~100-300 ng e il secondo ciclo di amplificazione è ~0,8-1,5 μg di RNA.</li>
	</ol></li>
	<li>Trascrizione inversa dell'RNA:<ol>
<li>Per generare cDNA dall'aRNA, utilizzare 1,0 μg di aRNA in 20 μl di una reazione di trascrizione inversa. Diversi kit sono disponibili in commercio per questo scopo. NOTA: cDNA è stato sintetizzato secondo il protocollo del produttore utilizzando le seguenti impostazioni sul ciclore termico. 5 min a 25 °C 30 min a 42 °C 5 min a 85 °C Tenere premuto a 4 °C</li>
		<li>Dopo la fase di trascrizione inversa, conservare il cDNA a -20 °C per la conservazione a lungo termine.</li>
	</ol></li>
	<li>Progettazione e standardizzazione primer: Sono disponibili diversi eccellenti programmi software, gratuiti, per la progettazione di primer per amplificazioni in tempo reale.<ol>
<li>Selezionare oligonucleotidi da 18-24 anni che producono ampliconi da 70-110 bp e sintetizzare i primer utilizzando fonti commerciali. NOTA: Due o tre coppie di primer devono essere progettate per ogni gene di interesse. Ogni set di primer deve essere standardizzato da qPCR. Le coppie primer avanti e indietro utilizzate per il gene CREB1 (Figura 4) sono le seguenti: Primer set 1 Attaccante: 5'-TGATTCTGACGCAAAGAAAGA-3' Retromarcia: 5'-ACCGTGAGCAGTCAGTTGTAGA-3' Primer set 2 Attaccante: 5'-AGGGAATGTCGATGAAAGAAGA-3' Rovescio: 5'-GACACAGGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>Per selezionare il primer migliore da utilizzare per le analisi a valle, monitorare il valore Ct e la forma della curva di amplificazione in qPCR. NOTA: I primer che danno valori Ct (Cycle threshold) tra 10-35 nell'amplificazione rotonda 40 e curve lisce durante la fase esponenziale della PCR seguita da un plateau liscio sono ottimali per le analisi dell'espressione genica.</li>
	</ol></li>
	<li>PCR quantitativo in tempo reale (qPCR): Nota: utilizzare tubi o piastre appropriati compatibili con la macchina qPCR.<ol>
<li>Diluire cDNA a 5x con acqua priva di nucleasi.</li>
		<li>A 2 μl di cDNA diluito, aggiungere 8 μl di una miscela master qPCR contenente 2 μl di H2O, 5 μl di 2x SYBR Green master mix e 1,0 μl di 10 μM (ciascuno) primer avanti e indietro.</li>
		<li>Chiudere i tubi e sigillare la piastra dopo pipettazione cDNA e master mix. Mescolare il contenuto toccando delicatamente e girando verso il basso a 1.500 giri/min per 30 secondi.</li>
		<li>Procedere alla configurazione della macchina qPCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

Gli autori non hanno interessi finanziari concorrenti.

Il neurone R15 è coinvolto nella regolazione dei sistemi cardiovascolare, digestivo, respiratorio e riproduttivo30. Un'attività di bursting regolarmente ritmica dell'AP è una caratteristica di R15. Come mostrato nella sezione dei risultati, la registrazione accoppiata di R15 e L7 mostra che la preparazione dei gangli ha preservato l'attività dei neuroni R15. I neuroni R15 e L7 hanno risposto in modo appropriato ad Ach. Questa preparazione dei gangli potrebbe essere mantenuta fino a 8-10 ore e l'attività e...

Il cervello umano è straordinariamente complesso con quasi 100 miliardi di neuroni e trilioni di connessioni sinaptiche. Ci sono quasi un numero uguale di cellule nonneuronali che interagiscono con i neuroni e regolano la loro funzione nel cervello. I neuroni sono organizzati in circuiti che regolano comportamenti specifici. Nonostante i progressi nella nostra comprensione delle funzioni cerebrali e dei circuiti neurali, poco si sa dell'identità dei componenti circuitali che controllano un comportamento specifico. La conoscenza delle identità di vari componenti di un circuito faciliterà notevolmente la nostra comprensione delle basi cellulari e molecolari del comportamento e aiuterà nello sviluppo di nuove strategie terapeutiche per i disturbi neuropsichiatrici.
La lumaca marina Aplysia californica è stata un cavallo di battaglia per determinare i circuiti neuronali alla base di comportamentispecifici 1-14. Il sistema nervoso dell'Alisia contiene circa 20.000 neuroni organizzati in 9 diversi gangli. I neuroni dell'Aplysia sono grandi e possono essere facilmente identificati in base alle loro dimensioni, proprietà elettriche e posizione nei gangli. Aplysia ha un ricco repertorio di comportamenti che possono essere studiati. Uno dei comportamenti ben studiati è il riflesso di astinenza branchiale (GWR). I componenti centrali di questo riflesso sono situati in gangli addominali. I componenti dei circuiti GWR sono stati mappati e sono stati determinati contributi di vari componenti. È importante sottolineare che i circuiti GWR subiscono l'apprendimento associativo e nonassociativo 5,6,15-19. Decenni di studio su questo riflesso hanno anche identificato diversi percorsi di segnalazione che hanno un ruolo chiave nell'apprendimento e nellamemoria 20-24.
Diversi preparativi di Aplysia furono usati per studiare le basi cellulari e molecolari della memorizzazione della memoria. Questi includono l'animaleintatto 2,3,la preparazione semi-intatta1,7,13,14,16 e la ricostituzione dei principali componenti dei circuiti neurali25-29. Qui viene descritta una preparazione ridotta per esplorare i gangli di Alisia per le analisi elettrofisiotiche e molecolari dei circuiti neuronali identificati. Sono stati studiati i seguenti quattro neuroni identificati. R15, un neurone che esplode, L7 e L11, due diversi motoneuroni e R2, un neurone colinergico. R2 è il più grande neurone descritto nel sistema nervoso invertebrato. In breve, questa metodologia prevede il trattamento proteasiale dei gangli, misurazioni elettrofisiologiche prima e dopo i trattamenti farmacologici e isolamento di singoli neuroni per l'analisi quantitativa dell'espressione genica. Questa metodologia ci consente di combinare le analisi molecolari con la registrazione simultanea da più neuroni. Questa metodologia è stata utilizzata con successo per studiare le risposte dei neuroni R15 e L7 all'acetilcolina (Ach) accoppiando registrazioni intracellulari. A seguito di misurazioni elettrofisiopatiche R15 e L7 e altri neuroni identificati come L11 e R2 sono stati isolati per l'analisi quantitativa della reazione a catena della polimerasi (qPCR) dell'espressione di CREB1, un fattore di trascrizione importante per la memorizzazione della memoria.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

Una grande sfida in neurobiologia è comprendere le basi molecolari dei circuiti neurali che governano un comportamento specifico. Una volta identificati i meccanismi molecolari specifici, è possibile sviluppare nuove strategie terapeutiche per trattare le anomalie in comportamenti specifici causati da malattie degenerative o invecchiamento del sistema nervoso. La lumaca marina Aplysia californica è adatta per le indagini sulle basi cellulari e molecolari del comportamento perché i circuiti neurali alla base di un comportamento specifico potrebbero essere facilmente determinati e le singole componenti dei circuiti potrebbero essere facilmente manipolate. Questi vantaggi dell'Aplysia hanno portato a diverse scoperte fondamentali della neurobiologia dell'apprendimento e della memoria. Qui descriviamo una preparazione del sistema nervoso di Alysia per le analisi elettrofisiofisioiche e molecolari dei singoli neuroni. In breve, il ganglio sezionato dal sistema nervoso è esposto alla proteasi per rimuovere la tona del ganglio in modo tale che i neuroni siano esposti ma mantengano l'attività neuronale come nell'animale intatto. Questa preparazione viene utilizzata per effettuare misurazioni elettrofisiopatiche di singoli o multipli neuroni. È importante sottolineare che, seguendo la registrazione utilizzando una semplice metodologia, i neuroni potrebbero essere isolati direttamente dai gangli per l'analisi dell'espressione genica. Questi protocolli sono stati utilizzati per effettuare registrazioni elettrofisiofisioiche simultanee dai neuroni L7 e R15, studiare la loro risposta all'acetilcolina e all'espressione quantitante del gene CREB1 in singoli neuroni isolati L7, L11, R15 e R2 di Aplysia.

I pesi degli animali utilizzati in questo studio variavano da 100-200 g. Seguendo i protocolli descritti, abbiamo condotto misurazioni elettrofisiotiche e analisi molecolari di neuroni di gangli addominali isolati da animali che vanno da 2-5 g a 200-300 g.
La standardizzazione del trattamento proteasi è importante per misurazioni elettrofisioniche di successo dei neuroni nei gangli. Inizialmente, sono state utilizzate concentrazioni e durate multiple di proteasi (Dispasi) e sono stati registr...

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Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

La lumaca marina Aplysia californica è stata ampiamente utilizzata come modello di neurobiologia per gli studi sulle basi cellulari e molecolari del comportamento. Qui viene descritta una metodologia per esplorare il sistema nervoso di Aplysia per le analisi elettrofisiologiche e molecolari di singoli neuroni di circuiti neurali identificati.

Alisia Preparazione ganglia per analisi elettrofisiotiche e molecolari di singoli neuroni

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Views.  The Scripps Research Institute, Florida. La lumaca marina Aplysia californica è stata ampiamente utilizzata come modello di neurobiologia per gli studi sulle basi cellulari e molecolari del comportamento. Qui viene descritta una metodologia per esplorare il sistema nervoso di Aplysia per le analisi elettrofisiologiche e molecolari di singoli neuroni di circuiti neurali identificati.

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In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

In Assemblea in vitro di semi-artificiale della macchina molecolare e il suo utilizzo per il rilevamento del danno al DNA

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Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

Molecolare Entanglement e Electrospinnability di biopolimeri

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

Tissue tritata in Compressed Collagene: A Biotransplant cellulare contenente per la riparazione singolo-messa in scena Ricostruttiva

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

Una tecnica senza etichetta per l&#39;Imaging spazio-temporale delle secrezioni monocellulari

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

Preparazione della Silicon Nanowire effetto di campo transistor per l&#39;industria chimica e biosensing Applicazioni

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

Ingegneria riconoscimento molecolare con polimeri bio-mimetici sui singoli Walled nanotubi di carbonio

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

Dissezione, microCT scansione e morfometriche analisi del Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

Preparazione, purificazione e l'uso dei liposomi contenenti acidi grassi

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

Assorbimento di nuove nanoparticelle rivestite con lipidi contenenti Falcarindiol di cellule staminali mesenchimali umane

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

Valutazione dei comportamenti fotosintetici mediante misurazioni simultanee della riflettanza delle foglie e delle analisi della fluorescenza della clorofilla

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...