نشكر بصدق مؤسسة وايتهول على دعمها التمويلي وصناديق الشركات الناشئة من معهد سكريبس للأبحاث على تنفيذ هذا العمل.

1. إعداد العقد البطني، القياسات الكهربية، وعزل الخلايا العصبية المحددة واحدة من العقدة البطنية من كاليفورنيكا Aplysia
<ol><li>الحفاظ على Aplysia في الحوض المختبر مع تعميم مياه البحر الاصطناعية (ASW) في 16 درجة مئوية تحت 12:12 ضوء: ظروف مظلمة.</li>
	<li>عزل العقدة البطنية.<ol>
<li>تخدير الحيوانات عن طريق حقن 380 mM MgCl2 حل لمدة 5-10 دقيقة (أي ما يعادل 30-35٪ من وزن جسم الحيوان).</li>
		<li>تحديد العقدة البطنية بناء على موقعها في الجهاز العصبي المركزي24,28.</li>
		<li>إزالة ganglia عن طريق العملية الجراحية وتخزينها على الفور في مياه البحر الاصطناعية التي تتكون من 450 mM NaCl، 10 MM KCl، 10 mM CaCl2،55 mM MgCl2،2.5 mM NaHCO3،و 10 M HEPES (pH 7.4).</li>
	</ol>
</li>
	<li>علاج بروتياز.<ol>
<li>احتضان العقدة البطن لمدة 30 دقيقة في 34 درجة مئوية±0.5 في طبق بيتري مع 0.1٪ بروتياز (ديسباس) المخفف في ASW المذكورة أعلاه. ملاحظة: كمية البروتياز المستخدمة تحتاج إلى أن تكون موحدة مع عمر ووزن الحيوانات. بشكل عام ، فإن الحيوانات الأكبر سنا والأكبر تتطلب المزيد من البروتيز.</li>
	</ol>
</li>
	<li>إزالة غمد الجانجليا.<ol>
<li>بعد معالجة الإنزيم، قم بإلصاق العقدة بقاعدة سيلغارد السيليكون في غرفة الخلية (Ø= 1 سم؛ vol. = 0.3 مل) والتشويش مع ASW (معدل التدفق: 150 ميكرولتر/دقيقة) في درجة حرارة الغرفة (18 درجة مئوية±2). ملاحظة: من أجل زيادة رؤية الخلايا العصبية المحددة، ضع العقدة على الجزء العلوي من اسطوانة زجاجية متعددة الكربونات(الشكل 1)(قطر Ø = 2 مم غرفة الخلية المعدلة) التي يمكن أن تضيء بسهولة من أسفل باستخدام مجسم مناظير مع تكبير 20X و 40X.</li>
		<li>إزالة بعناية غمد من العقدة باستخدام ملقط وmicroscisors.</li>
	</ol>
</li>
	<li>تسجيل كهربي في وقت واحد من اثنين من الخلايا العصبية.<ol>
<li>تحديد الخلايا العصبية ذات الاهتمام.</li>
		<li>إمبالا الخلايا العصبية مع microelectrode حادة واحدة داخل الخلايا مع المقاومة 10-15 MΩ مليئة 3 M KCl الحل.</li>
		<li>سجل نشاط الخلايا العصبية (تمرير النطاق 10 كيلوهرتز) باستخدام نظام تسجيل داخل الخلايا.</li>
		<li>معالجة بيانات التسجيل باستخدام برامج الفيزيولوجيا الكهربية مثل أكسوغراف. ملاحظة: يمكن للمرء بسهولة تنفيذ تسجيل من الخلايا العصبية متعددة. الخلايا العصبية L7, L11 أو R15 و R2 يتم التعرف بسهولة على أساس موقفهم. مطلوب اثنين من مكبرات الصوت واثنين من micromanipulators لتسجيل في وقت واحد من اثنين من الخلايا العصبية L7 و R15 (الشكل 2).</li>
	</ol>
</li>
	<li>تطبيق المخدرات.<ol>
<li>تطبيق المخدرات من اختيار في غرفة الخلية عن طريق الأنابيب لطيف أو حقن مباشرة في الخلايا العصبية.</li>
		<li>إجراء القياسات الكهربية. ملاحظة: اعتمادا على الهدف التجريبي، يمكن للمرء قياس المعلمات الكهربية المختلفة للخلايا العصبية مثل التغيرات في إمكانات الأغشية (MP) أو إمكانات العمل (AP) قبل وأثناء وبعد تطبيق الدواء.</li>
	</ol>
</li>
	<li>عزل الخلايا العصبية واحدة.<ol>
<li>في ختام التجارب الكهربية، وقف التغلغل ASW وغسل العقدة مع الإيثانول 100٪.  التعرض للإيثانول سوف تحجر الخلايا العصبية و, باستخدام ملقط غرامة, تجعل من السهل لإزالة الخلايا العصبية الفردية دون إتلاف الخلايا العصبية الأخرى من العقدة.</li>
		<li>إزالة الخلايا العصبية واحدة تحت مجسم ونقل إلى أنبوب Eppendorf الصغيرة التي تحتوي على الجليد الباردة 500 ميكرولتر الحمض النووي الريبي استخراج كاشف. يمكن تخزين الخلايا العصبية المعزولة في كاشف استخراج الحمض النووي الريبي عند -80 درجة مئوية للتحليل المستقبلي.</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. عزل الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة وتحليل التعبير الجيني من قبل PCR الوقت الحقيقي الكمي (qPCR)
<ol><li>الاحتياطات اللازمة لتقليل تدهور الحمض النووي الريبي: ريبونوكلياس (RNases) تتحلل الحمض النووي الريبي وهي إنزيمات مستقرة ونشطة جدا. اتخاذ الخطوات التالية أثناء معالجة RNAs.<ol>
<li>تنظيف منطقة العمل والأدوات مع RNase تعطيل وكلاء.</li>
		<li>ارتداء قفازات في جميع الأوقات أثناء التعامل مع الجيش الملكي النيبالي وتغيير القفازات في كثير من الأحيان.</li>
		<li>استخدم فقط البلاستيك الحر RNase للتعامل مع RNAs.</li>
	</ol></li>
	<li>عزل إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة:<ol>
<li>يمكن استخدام بروتوكول تريزول القياسي لعزل الحمض النووي الريبي لعزل الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية المفردة. إضافة لفترة وجيزة 20٪ v/v من الكلوروفورم إلى تريزول، مزيج جيدا عن طريق دوامة وجيزة.</li>
		<li>ضع الأنابيب على الدوار لمدة 10 دقائق عند 4 درجات مئوية. تدور مزيج تريزول-الكلوروفورم في 12،000 × ز لمدة 15 دقيقة في 4 درجة مئوية.</li>
		<li>جمع المرحلة المائية ونقل إلى أنبوب جديد.</li>
		<li>إضافة محلول خلات الصوديوم (pH 5.5) إلى تركيز نهائي من 0.3 M، 100 نانوغرام / مل من جليكوبلو coprecipitant، و 2.5 مجلدات من الإيثانول 100٪ لتسريع الحمض النووي الريبي.</li>
		<li>اخلطي العينات جيدا واحتضنيها عند -80 درجة مئوية بين عشية وضحاها.</li>
		<li>تدور العينات في 12000 س ز لمدة 20 دقيقة في 4 درجة مئوية ، وسوف بيليه زرقاء صغيرة تكون مرئية في الجزء السفلي من الأنبوب.</li>
		<li>إزالة supernatant وغسل بيليه مع 850 ميكرولتر من الإيثانول الجليد الباردة 75٪ في 12000 س ز لمدة 10 دقيقة في 4 درجة مئوية.</li>
		<li>إزالة supernatant بعناية والهواء الجاف بيليه الجيش الملكي النيبالي لمدة 7-10 دقيقة، كحد أقصى. ملاحظة: تأكد من أن لا يترك الجيش الملكي النيبالي لفترة طويلة لتجف كما أكثر-تجفيف بيليه الجيش الملكي النيبالي يجعل التشحيم صعبة للغاية. 
</li>
		<li>مرة واحدة المجففة، resuspend بيليه الجيش الملكي النيبالي في 10 ميكرولتر من المياه الحرة RNAse وتحديد تركيز الحمض النووي الريبي. ملاحظة: تحديد تركيز الحمض النووي الريبي باستخدام مطياف. عند عدم استخدام على الفور، تخزين الحمض النووي الريبي في -80 درجة مئوية.</li>
	</ol></li>
	<li>تخليق أرنا من الخلايا العصبية واحدة:<ol>
<li>تضخيم الحمض النووي الريبي (جولة أو جولتين اعتمادا على الهدف التجريبي) باستخدام نظام تضخيم الحمض النووي الريبي الخطي المتاح تجاريا. ملاحظة: تراوح إجمالي الحمض النووي الريبي من الخلايا العصبية واحدة من ~ 10-60 نانوغرام. العائد المتوقع من الجولة الأولى من التضخيم هو ~ 100-300 نانوغرام والجولة الثانية من التضخيم هو ~ 0.8-1.5 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي.</li>
	</ol></li>
	<li>النسخ العكسي من الحمض النووي الريبي:<ol>
<li>لتوليد cDNA من ARNA، استخدم 1.0 ميكروغرام من الحمض النووي الريبي في 20 ميكرولتر من رد فعل النسخ العكسي. وتتوفر عدة مجموعات من اللوازم تجاريا لهذا الغرض. ملاحظة: تم تصنيعها cDNA وفقا لبروتوكول الشركة المصنعة باستخدام الإعدادات التالية على دورة الحرارية. 5 دقائق عند 25 درجة مئوية 30 دقيقة عند 42 درجة مئوية 5 دقائق عند 85 درجة مئوية اضغط على درجة حرارة 4 °C</li>
		<li>بعد خطوة النسخ العكسي، قم بتخزين cDNA عند -20 درجة مئوية للتخزين على المدى الطويل.</li>
	</ol></li>
	<li>تصميم التمهيدي وتوحيد: تتوفر العديد من البرامج الممتازة مجانا لتصميم التهيئة للتضخيم في الوقت الحقيقي.<ol>
<li>حدد 18-24 مير أوليغونوكليوتيدات التي تنتج 70-110 bp amplicons وتوليف التمهيديات باستخدام مصادر تجارية. ملاحظة: يجب تصميم أزواج التمهيدي اثنين إلى ثلاثة لكل جين من الفائدة. كل مجموعة التمهيدي يحتاج إلى توحيدها من قبل qPCR. أزواج التمهيدي الأمامية والعكسية التي تم استخدامها للجين CREB1 (الشكل 4) هي أدناه: مجموعة التمهيدي 1 إلى الأمام: 5'-تاتكتغاكغاغاغاغا-3' عكس: 5'-ACCGTGAGAGTCAGTTGTAGA-3' مجموعة التمهيدي 2 خط الهجوم: 5'-أغغااتغاتغاغاغا-3' عكس: 5'-GACACACAGAAGTATGCCAAA-3'</li>
		<li>لتحديد أفضل التمهيدي ليتم استخدامه لتحليلات المصب، مراقبة قيمة Ct وشكل منحنى التضخيم في qPCR. ملاحظة: تعد المبرمجينات التي تعطي قيم Ct (عتبة الدورة) بين 10-35 في التضخيم المستدير الأربعين والمنحنيات السلسة خلال المرحلة الأسية من PCR متبوعة بهضبة ناعمة مثالية لتحليلات التعبير الجيني.</li>
	</ol></li>
	<li>الكمى في الوقت الحقيقي PCR (qPCR): ملاحظة: استخدم الأنابيب المناسبة أو اللوحات المتوافقة مع جهاز qPCR.<ol>
<li>تمييع cDNA إلى 5x مع ماء خال من النيوكليز.</li>
		<li>إلى 2 ميكرولتر من cDNA المخفف، أضف 8 ميكرولتر من مزيج رئيسي qPCR يحتوي على 2 ميكرولتر من H2O، و 5 ميكرولتر من مزيج رئيسي أخضر 2x SYBR، و 1.0 ميكرولتر من 10 ميكرومتر (لكل منهما) إلى الأمام وعكس التمهيدي.</li>
		<li>إغلاق الأنابيب وختم لوحة بعد الأنابيب cDNA ومزيج رئيسي. امزج المحتويات عن طريق النقر اللطيف والغزل عند 1500 دورة في الدقيقة لمدة 30 ثانية.</li>
		<li>انتقل إلى إعداد جهاز qPCR.</li>
	</ol></li>
</ol>

ليس للمؤلفين أي مصالح مالية متنافسة.

وتشارك الخلايا العصبية R15 في تنظيم القلب والأوعية الدموية, الجهاز الهضمي, الجهاز التنفسي, والجهاز التناسلي30. نشاط الانفجار الإيقاعي بانتظام من وكالة أسوشيتد برس هو سمة من سمات R15. كما هو مبين في قسم النتائج، تسجيل مقترن من R15 و L7 تظهر أن إعداد ganglia حافظت على نشاط الخلايا العصبية R15. استج...

الدماغ البشري معقد بشكل غير عادي مع ما يقرب من 100 مليار خلية عصبية وتريليونات من الاتصالات متشابك. هناك ما يقرب من عدد متساو من الخلايا غير العصبية التي تتفاعل مع الخلايا العصبية وتنظيم وظيفتها في الدماغ. يتم تنظيم الخلايا العصبية في الدوائر التي تنظم سلوكيات محددة. على الرغم من التقدم في فهمنا لوظائف الدماغ والدوائر العصبية ، لا يعرف سوى القليل عن هوية مكونات الدوائر التي تتحكم في سلوك معين. معرفة هويات مكونات مختلفة من الدوائر سوف تسهل كثيرا فهمنا للأساس الخلوي والجزيئي على حد سواء من السلوك والمساعدة في تطوير استراتيجيات علاجية جديدة للاضطرابات العصبية والنفسية.
الحلزون البحري Aplysia californica كان العمود الفقري لتحديد الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوكيات محددة1-14. يحتوي الجهاز العصبي Aplysia على ما يقرب من 20،000 خلية عصبية يتم تنظيمها في 9 ganglia مختلفة. الخلايا العصبية من Aplysia كبيرة ويمكن التعرف عليها بسهولة على أساس حجمها، والخصائص الكهربائية، والموقف في العقدة. Aplysia لديها ذخيرة غنية من السلوكيات التي يمكن دراستها. أحد السلوكيات المدروسة جيدا هو رد الفعل الخياشيم الانسحابي (GWR). وتقع المكونات المركزية لهذا رد الفعل في العقد البطن. وقد تم رسم خرائط لمكونات دوائر الموارد العالمية وتحديد مساهمات مختلف المكونات. الأهم من ذلك، تخضع دوائر GWR لتعلم ترابطي وغير مرتبط5,6,15-19. عقود من الدراسة على هذا المنعكس كما حددت العديد من مسارات الإشارات التي لها دور رئيسي في التعلم والذاكرة20-24.
تم استخدام العديد من الاستعدادات المختلفة من Aplysia لدراسة الأساس الخلوي والجزيئي لتخزين الذاكرة. وتشمل هذه الحيوان سليمة2,3,إعداد شبهسليمة 1,7,13,14,16 وإعادة تشكيل المكونات الرئيسية للدوائر العصبية25-29. ويرد هنا إعداد مخفض لاستكشاف العقدة Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الدوائر العصبية المحددة. تمت دراسة الخلايا العصبية الأربعة التالية المحددة. R15, انفجار الخلايا العصبية, L7 و L11, تمت دراسة اثنين من الخلايا العصبية الحركية المختلفة وR2, الخلايا العصبية الكوليني. R2 هو أكبر خلية عصبية وصفها في الجهاز العصبي اللافقاريات. باختصار، تتضمن هذه المنهجية علاج البروتيز للجانجليا، والقياسات الكهربية قبل وبعد العلاجات الدوائية، وعزل الخلايا العصبية المفردة للتحليل الكمي للتعبير الجيني. هذه المنهجية تمكننا من الجمع بين التحليلات الجزيئية مع تسجيل متزامن من خلايا عصبية متعددة. وقد استخدمت هذه المنهجية بنجاح لدراسة استجابات الخلايا العصبية R15 و L7 إلى أستيل (أش) عن طريق تسجيلات داخل الخلايا المقترنة. بعد القياسات الكهربية R15 و L7 وغيرها من الخلايا العصبية المحددة مثل L11 و R2 تم عزلها لتحليل تفاعل البوليميراز المتسلسل الكمي (qPCR) للتعبير عن CREB1 ، وهو عامل نسخ مهم لتخزين الذاكرة.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="372">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="101">
			<td height="101" style="height:101px;width:120px;">Aplysia</td>
			<td style="width:123px;">National Aplysia Resource Facility, University of Miami</td>
			<td style="width:129px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">NaCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 3014-1KG</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">KCl</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">P 9333-500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">CaCl2&#8226;2H2O</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">C5080- 500G</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">MgCl2&#8226;6H2O</td>
			<td style="width:123px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:129px;">BP 214-501</td>
		</tr>
		<tr height="27">
			<td height="27" style="height:27px;width:120px;">NaHCO4</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">S 6297-250G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">HEPES</td>
			<td style="width:123px;">SIGMA</td>
			<td style="width:129px;">H 3375-500G</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Protease</td>
			<td style="width:123px;">GIBCO</td>
			<td style="width:129px;">17105-042</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">Trizol</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">15596-026</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Chloroform</td>
			<td style="width:123px;">MP Biomedicals</td>
			<td style="width:129px;">2194002</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">100% Ethanol</td>
			<td style="width:123px;">ACROS</td>
			<td style="width:129px;">64-17-5</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:120px;">GlycoBlue</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9515</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">3 M NaOAc, pH 5.5</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9740</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Nuclease free water</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM9737</td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:120px;">MessageAmp II aRNA Amplification Kit</td>
			<td style="width:123px;">Ambion</td>
			<td style="width:129px;">AM1751</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">qScript cDNA SuperMix</td>
			<td style="width:123px;">Quanta Biosciences</td>
			<td style="width:129px;">95048-100</td>
		</tr>
		<tr height="61">
			<td height="61" style="height:61px;width:120px;">Power SYBR Green PCR Master Mix</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">4367659</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Forceps</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">11252-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Scissors</td>
			<td style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">15000-08</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="41" rowspan="2" style="height:41px;width:120px;">Stainless Steel Minutien Pins&#160;</td>
			<td rowspan="2" style="width:123px;">Fine Science Tools</td>
			<td style="width:129px;">26002-10 or</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:129px;">26002-20</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">Veriti Thermal Cycler</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">Veriti Thermal Cycler</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">5430R Centrifuge</td>
			<td style="width:123px;">Eppendorf</td>
			<td style="width:129px;">5430R Centrifuge</td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:120px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
			<td style="width:123px;">Applied Biosystems</td>
			<td style="width:129px;">7900HT Fast Real-Time PCR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:120px;">Amplifier</td>
			<td>BRAMP-01R</td>
			<td style="width:129px;">NPI Electronics</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Digidata Converter</td>
			<td style="width:123px;">Instrutech ITC-18</td>
			<td style="width:129px;">HEKA ELEKTRONIK</td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;width:120px;">Micro Manipulator</td>
			<td style="width:123px;">Patch Star</td>
			<td style="width:129px;">Scientifica</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

aplysia ganglia preparation for electrophysiological and molecular analyses of single neurons

يتمثل التحدي الرئيسي في علم الأحياء العصبية في فهم الأسس الجزيئية للدوائر العصبية التي تحكم سلوكا محددا. بمجرد تحديد الآليات الجزيئية المحددة ، يمكن تطوير استراتيجيات علاجية جديدة لعلاج التشوهات في سلوكيات محددة تسببها الأمراض التنكسية أو شيخوخة الجهاز العصبي. الحلزون البحري Aplysia californica مناسب تماما للتحقيقات في الأساس الخلوي والجزيئي للسلوك لأن الدوائر العصبية الكامنة وراء سلوك معين يمكن تحديدها بسهولة ويمكن التلاعب بسهولة المكونات الفردية للدوائر. وقد أدت هذه المزايا من Aplysia إلى العديد من الاكتشافات الأساسية لعلم الأعصاب من التعلم والذاكرة. هنا نحن نصف إعداد الجهاز العصبي Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية الفردية. لفترة وجيزة، يتعرض العقدة تشريح من الجهاز العصبي إلى بروتياز لإزالة غمد العقدة بحيث تتعرض الخلايا العصبية ولكن الاحتفاظ النشاط العصبي كما هو الحال في الحيوان سليمة. يستخدم هذا الإعداد لإجراء القياسات الكهربية للخلايا العصبية واحدة أو متعددة. الأهم من ذلك، بعد التسجيل باستخدام منهجية بسيطة، يمكن عزل الخلايا العصبية مباشرة من العقدة لتحليل التعبير الجيني. واستخدمت هذه البروتوكولات لتنفيذ التسجيلات الكهربية في وقت واحد من الخلايا العصبية L7 و R15, دراسة استجابتها للأستيل والتعبير الكمية من الجينات CREB1 في L7 واحدة معزولة, L11, R15, و R2 الخلايا العصبية من Aplysia.

تراوحت أوزان الحيوانات التي استخدمت في هذه الدراسة من 100-200 غرام. بعد البروتوكولات الموصوفة، أجرينا قياسات كهربية وتحليل جزيئي للخلايا العصبية من العقد البطنية المعزولة عن الحيوانات التي تتراوح بين 2-5 غرام إلى 200-300 غرام.
توحيد العلاج بروتياز مهم للقياسات الكهربية الناجحة م?...

Watch this Scientific Journal Video about Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons at JoVE.com

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

الحلزون البحري Aplysia californica وقد استخدمت على نطاق واسع كنموذج البيولوجيا العصبية للدراسات على أساس الخلوية والجزيئية للسلوك. هنا يتم وصف منهجية لاستكشاف الجهاز العصبي من Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الخلايا العصبية واحدة من الدوائر العصبية المحددة.

أأليسيا إعداد Ganglia للتحليلات الكهربية والجزيئية للخلايا العصبية المفردة

A major challenge in neurobiology is to understand the molecular underpinnings of neural circuitry that govern a specific behavior. Once the specific ...

aplysia-ganglia-preparation-for-electrophysiological-molecular

Research

JoVE Journal

Bioengineering

Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

9.0K Views.  The Scripps Research Institute, Florida. الحلزون البحري Aplysia californica وقد استخدمت على نطاق واسع كنموذج البيولوجيا العصبية للدراسات على أساس الخلوية والجزيئية للسلوك. هنا يتم وصف منهجية لاستكشاف الجهاز العصبي من Aplysia للتحليلات الكهربية والجزيئية من الخلايا العصبية واحدة من الدوائر العصبية الم?...

Video: Aplysia Ganglia Preparation for Electrophysiological and Molecular Analyses of Single Neurons

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular machines centers on devices capable of directional motion, i.e. molecular motors, and on their scaled-down mechanical parts (wheels, axels, pendants etc) 7-9. This imitates the macro-machines, even though the physical properties essential for these devices, such as inertia and momentum conservation, are not usable in the nanoworld environments 10. Alternative designs, which do not follow the mechanical macromachines schemes and use mechanisms developed in the evolution of biological molecules, can take advantage of the specific conditions of the nanoworld. Besides, adapting actual biological molecules for the purposes of nano-design reduces potential dangers the nanotechnology products may pose. Here we demonstrate the assembly and application of one such bio-enabled construct, a semi-artificial molecular device which combines a naturally-occurring molecular machine with artificial components. From the enzymology point of view, our construct is a designer fluorescent enzyme-substrate complex put together to perform a specific useful function. This assembly is by definition a molecular machine, as it contains one 12. Yet, its integration with the engineered part - fluorescent dual hairpin - re-directs it to a new task of labeling DNA damage12.
Our construct assembles out of a 32-mer DNA and an enzyme vaccinia topoisomerase I (VACC TOPO). The machine then uses its own material to fabricate two fluorescently labeled detector units (Figure 1). One of the units (green fluorescence) carries VACC TOPO covalently attached to its 3'end and another unit (red fluorescence) is a free hairpin with a terminal 3'OH. The units are short-lived and quickly reassemble back into the original construct, which subsequently recleaves. In the absence of DNA breaks these two units continuously separate and religate in a cyclic manner. In tissue sections with DNA damage, the topoisomerase-carrying detector unit selectively attaches to blunt-ended DNA breaks with 5'OH (DNase II-type breaks)11,12, fluorescently labeling them. The second, enzyme-free hairpin formed after oligonucleotide cleavage, will ligate to a 5'PO4 blunt-ended break (DNase I-type breaks)11,12, if T4 DNA ligase is present in the solution 13,14 . When T4 DNA ligase is added to a tissue section or a solution containing DNA with 5'PO4 blunt-ended breaks, the ligase reacts with 5'PO4 DNA ends, forming semi-stable enzyme-DNA complexes. The blunt ended hairpins will interact with these complexes releasing ligase and covalently linking hairpins to DNA, thus labeling 5'PO4 blunt-ended DNA breaks.
This development exemplifies a new practical approach to the design of molecular machines and provides a useful sensor for detection of apoptosis and DNA damage in fixed cells and tissues.

In vitro Assembly of Semi-artificial Molecular Machine and its Use for Detection of DNA Damage

We demonstrate the assembly and application of a molecular-scale device powered by a topoisomerase protein. The construct is a bio-molecular sensor which labels two major types of DNA breaks in tissue sections by attaching two different fluorophores to their ends.

الجمعية في المختبر من نصف اصطناعية آلة الجزيئية واستخدامها للكشف عن الحمض النووي من التلف

Naturally occurring bio-molecular machines work in every living cell and display a variety of designs 1-6. Yet the development of artificial molecular ...

Molecular Entanglement and Electrospinnability of Biopolymers

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope was found to be an essential prerequisite for successful electrospinning. Rheology is a powerful tool to probe the molecular conformation and interaction of biopolymers. In this report, we demonstrate the protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan, from their dimethyl sulfoxide (DMSO)/water dispersions. Well-formed starch and pullulan fibers with average diameters in the submicron to micron range were obtained. Electrospinnability was evaluated by visual and microscopic observation of the fibers formed. By correlating the rheological properties of the dispersions to their electrospinnability, we demonstrate that molecular conformation, molecular entanglement, and shear viscosity all affect electrospinning. Rheology is not only useful in solvent system selection and process optimization, but also in understanding the mechanism of fiber formation on a molecular level.

Electrospinning is a fascinating technique used to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. Molecular entanglement of the constituent polymers in the spinning dope is essential for successful electrospinning. We present a protocol for utilizing rheology to evaluate the electrospinnability of two biopolymers, starch and pullulan.

تشابك الجزيئية وElectrospinnability من البوليمرات الحيوية

Electrospinning is a fascinating technique to fabricate micro- to nano-scale fibers from a wide variety of materials. For biopolymers, molecular ...

Minced Tissue in Compressed Collagen: A Cell-containing Biotransplant for Single-staged Reconstructive Repair

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped human cell culture facilities. These methods include isolation of cells in single cell suspension and several laborious and time-consuming events before transplantation back to the patient. Previous studies suggest that the body itself could be used as a bioreactor for cell expansion and regeneration of tissue in order to minimize ex vivo manipulations of tissues and cells before transplanting to the patient. The aim of this study was to demonstrate a method for tissue harvesting, isolation of continuous epithelium, mincing of the epithelium into small pieces and incorporating them into a three-layered biomaterial. The three-layered biomaterial then served as a delivery vehicle, to allow surgical handling, exchange of nutrition across the transplant, and a controlled degradation. The biomaterial consisted of two outer layers of collagen and a core of a mechanically stable and slowly degradable polymer. The minced epithelium was incorporated into one of the collagen layers before transplantation. By mincing the epithelial tissue into small pieces, the pieces could be spread and thereby the propagation of cells was stimulated. After the initial take of the transplants, cell expansion and reorganization would take place and extracellular matrix mature to allow ingrowth of capillaries and nerves and further maturation of the extracellular matrix. The technique minimizes ex vivo manipulations and allow cell harvesting, preparation of autograft, and transplantation to the patient as a simple one-stage intervention. In the future, tissue expansion could be initiated around a 3D mold inside the body itself, according to the specific needs of the patient. Additionally, the technique could be performed in an ordinary surgical setting without the need for sophisticated cell culturing facilities.

Tissue engineering often includes in vitro expansion in order to create autografts for tissue regeneration. In this study a method for tissue expansion, regeneration, and reconstruction in vivo was developed in order to minimize the processing of cells and biological materials outside the body.

الأنسجة المفروم في المضغوط الكولاجين: وBiotransplant التي تحتوي على خلية لإصلاح الترميمية نظموا وحيد

Conventional techniques for cell expansion and transplantation of autologous cells for tissue engineering purposes can take place in specially equipped ...

A Label-free Technique for the Spatio-temporal Imaging of Single Cell Secretions

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning of such signaling can lead to many disorders. To understand cell-to-cell signaling, it is essential to study the spatial and temporal nature of the secreted molecules from the cell without disturbing the local environment. Various assays have been developed to study protein secretion, however, these methods are typically based on fluorescent probes which disrupt the relevant signaling pathways. To overcome this limitation, a label-free technique is required.
In this paper, we describe the fabrication and application of a label-free localized surface plasmon resonance imaging (LSPRi) technology capable of detecting protein secretions from a single cell. The plasmonic nanostructures are lithographically patterned onto a standard glass coverslip and can be excited using visible light on commercially available light microscopes. Only a small fraction of the coverslip is covered by the nanostructures and hence this technique is well suited for combining common techniques such as fluorescence and bright-field imaging.
A multidisciplinary approach is used in this protocol which incorporates sensor nanofabrication and subsequent biofunctionalization, binding kinetics characterization of ligand and analyte, the integration of the chip and live cells, and the analysis of the measured signal. As a whole, this technology enables a general label-free approach towards mapping cellular secretions and correlating them with the responses of nearby cells.

Inter-cellular communication is critical for controlling various physiological activities within and outside the cell. This paper describes a protocol for measuring the spatio-temporal nature of single cell secretions. To achieve this, a multidisciplinary approach is used which integrates label-free nanoplasmonic sensing with live cell imaging.

تقنية تسمية خالية لتصوير المكانية والزمانية لإفرازات خلية واحدة

Inter-cellular communication is an integral part of a complex system that helps in maintaining basic cellular activities. As a result, the malfunctioning ...

Preparation of Silicon Nanowire Field-effect Transistor for Chemical and Biosensing Applications

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we describe the preparation of polycrystalline silicon nanowire field-effect transistors (pSNWFETs) that serve as biosensing devices for biomarker detection. A protocol for chemical and biomolecular sensing by using pSNWFETs is presented. The pSNWFET device was demonstrated to be a promising transducer for real-time, label-free, and ultra-high-sensitivity biosensing applications. The source/drain channel conductivity of a pSNWFET is sensitive to changes in the environment around its silicon nanowire (SNW) surface. Thus, by immobilizing probes on the SNW surface, the pSNWFET can be used to detect various biotargets ranging from small molecules (dopamine) to macromolecules (DNA and proteins). Immobilizing a bioprobe on the SNW surface, which is a multistep procedure, is vital for determining the specificity of the biosensor. It is essential that every step of the immobilization procedure is correctly performed. We verified surface modifications by directly observing the shift in the electric properties of the pSNWFET following each modification step. Additionally, X-ray photoelectron spectroscopy was used to examine the surface composition following each modification. Finally, we demonstrated DNA sensing on the pSNWFET. This protocol provides step-by-step procedures for verifying bioprobe immobilization and subsequent DNA biosensing application.

We describe key steps for biosensing by using polysilicon nanowire field-effect transistors, including the preparation of the device and the immobilization and confirmation of a DNA molecular probe on the nanowire surface, as well as conditions for DNA sensing.

إعداد السيليكون أسلاك متناهية الصغر حقل التأثير الترانزستور لتطبيقات كيميائية وBiosensing

Surveillance using biomarkers is critical for the early detection, rapid intervention, and reduction in the incidence of diseases. In this study, we ...

Engineering Molecular Recognition with Bio-mimetic Polymers on Single Walled Carbon Nanotubes

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the optical window where biological samples are most transparent. Here, we outline techniques to adsorb amphiphilic polymers and polynucleic acids onto the surface of SWNTs to engineer their corona phases and create novel molecular sensors for small molecules and proteins. These functionalized SWNT sensors are both biocompatible and stable. Polymers are adsorbed onto the nanotube surface either by direct sonication of SWNTs and polymer or by suspending SWNTs using a surfactant followed by dialysis with polymer. The fluorescence emission, stability, and response of these sensors to target analytes are confirmed using absorbance and near-infrared fluorescence spectroscopy. Furthermore, we demonstrate surface immobilization of the sensors onto glass slides to enable single-molecule fluorescence microscopy to characterize polymer adsorption and analyte binding kinetics.

We present a protocol for engineering the corona phase of near infrared fluorescent single walled carbon nanotubes (SWNTs) using amphiphilic polymers and DNA to develop sensors for molecular targets without known recognition elements.

الاعتراف الجزيئية والهندسة مع البوليمرات الحيوية المحاكاة على واحدة المسورة الكربون الأنابيب النانومترية

Semiconducting single-wall carbon nanotubes (SWNTs) are a class of optically active nanomaterial that fluoresce in the near infrared, coinciding with the ...

Dissection, MicroCT Scanning and Morphometric Analyses of the Baculum

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; however such coordinates must represent homologous structures across specimens. While many biological objects consist of easily identified landmarks to satisfy the assumption of homology, many lack such structures. One potential solution is to mathematically place semi-landmarks on an object that represent the same morphological region across specimens. Here, we illustrate a recently developed pipeline to mathematically define semi-landmarks from the mouse baculum (penis bone). Our methods should be applicable to a wide range of objects.

Many biological structures lack easily definable landmarks, making it difficult to apply modern morphometric methods. Here we illustrate methods to study the mouse baculum (a bone in the penis), including dissection and microCT scanning, followed by computational methods to define semi-landmarks that are used to quantify size and shape variation.

تشريح، المسح الضوئي MicroCT والمظهرية تحليلات من جذيل

Modern morphometrics provides powerful methods to quantify size and shape variation. A basic requirement is a list of coordinates that define landmarks; ...

Preparation, Purification, and Use of Fatty Acid-containing Liposomes

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of these amphiphiles. In particular, fatty acid liposomes enhance dynamic character, due to the relatively high solubility of single-chain amphiphiles. Similarly, liposomes containing free fatty acids are more sensitive to salt and divalent cations, due to the strong interactions between the carboxylic acid head groups and metal ions. Here we illustrate techniques for preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of single chain amphiphiles (e.g., oleic acids).

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due to the unique chemical properties of single chain amphiphiles. Here we describe techniques for the preparation, purification, and use of liposomes comprised in part or whole of these amphiphiles.

إعداد وتنقية، واستخدام الدهنية المحتوية على الأحماض الدهنية

Liposomes containing single-chain amphiphiles, particularly fatty acids, exhibit distinct properties compared to those containing diacylphospholipids due ...

Uptake of New Lipid-coated Nanoparticles Containing Falcarindiol by Human Mesenchymal Stem Cells

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and size by low-density lipoproteins (LDLs) because cancer cells have an increased need for cholesterol to proliferate, and this has been exploited as a mechanism for delivering anticancer drugs to cancer cells. Moreover, depending on drug chemistry, encapsulating the drug can be advantageous to avoid degradation of the drug during circulation in vivo. Therefore, in this&#160;study, this design is used to fabricate lipid-coated nanoparticles of the anticancer drug falcarindiol, providing a potential new delivery system of falcarindiol in order to stabilize its chemical structure against degradation and improve its uptake by tumors. Falcarindiol nanoparticles, with a phospholipid and cholesterol monolayer encapsulating the purified drug core of the particle, were designed. The lipid monolayer coating consists of 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DSPC), cholesterol (Chol), and 1,2-distearoyl-sn-glycero-3-phosphoethanolamine-N-[methoxy(polyethylene glycol)-2000] (DSPE PEG 2000) along with the fluorescent label DiI (molar ratios of 43:50:5:2). The nanoparticles are fabricated using the rapid injection method, which is a fast and simple technique to precipitate nanoparticles by good-solvent for anti-solvent exchange. It consists of a rapid injection of an ethanol solution containing the nanoparticle components into an aqueous phase. The size of the fluorescent nanoparticles is measured using dynamic light scattering (DLS) at 74.1 &#177; 6.7 nm. The uptake of the nanoparticles is tested in human mesenchymal stem cells (hMSCs) and imaged using fluorescence and confocal microscopy. The uptake of the nanoparticles is observed in hMSCs, suggesting the potential for such a stable drug delivery system for falcarindiol.

This article describes the encapsulation of falcarindiol in lipid-coated 74 nm nanoparticles. The cellular uptake of the nanoparticles&#160;by human stem cells into lipid droplets is monitored by fluorescent and confocal imaging. Nanoparticles are fabricated by the rapid injection method of solvent shifting, and their size is measured with the dynamic light scattering technique.

الامتصاص من جديد جسيمات نانوية المغلفة بالدهون التي تحتوي على فالكارينديول بالخلايا الجذعية البشرية الوسيطة

Nanoparticles are the focus of an increased interest in drug delivery systems for cancer therapy. Lipid-coated nanoparticles are inspired in structure and ...

Evaluation of Photosynthetic Behaviors by Simultaneous Measurements of Leaf Reflectance and Chlorophyll Fluorescence Analyses

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many parameters that efficiently measure photosynthesis. Leaf reflectance analysis provides several vegetation indices in ecology and agriculture, including the photochemical reflectance index (PRI), which can be used as an indicator of thermal energy dissipation during photosynthesis because it correlates with non-photochemical quenching (NPQ). However, since NPQ is a composite parameter, its validation is required to understand the nature of the PRI parameter. To obtain physiological evidence for evaluation of the PRI parameter, we simultaneously measured chlorophyll fluorescence and leaf reflectance in xanthophyll cycle defective mutant (npq1) and wild-type Arabidopsis plants. Additionally, the qZ parameter, which likely reflects the xanthophyll cycle, was extracted from the results of chlorophyll fluorescence analysis by monitoring relaxation kinetics of NPQ after switching the light off. These simultaneous measurements were carried out using a pulse-amplitude modulation (PAM) chlorophyll fluorometer and a spectral radiometer. The fiber probes from both instruments were positioned close to each other to detect signals from the same leaf position. An external light source was used to activate photosynthesis, and the measuring lights and saturated light were provided from the PAM instrument. This experimental system enabled us to monitor light-dependent PRI in the intact plant and revealed that light-dependent changes in PRI differ significantly between the wild type and npq1 mutant. Furthermore, PRI was strongly correlated with qZ, meaning that qZ reflects the xanthophyll cycle. Together, these measurements demonstrated that simultaneous measurement of leaf reflectance and chlorophyll fluorescence is a valid approach for parameter evaluation.

We describe a new technical approach to study photosynthetic responses in higher plants involving simultaneous measurements of chlorophyll a fluorescence and leaf reflectance using a PAM and a spectral radiometer for the detection of signals from the same leaf area in Arabidopsis.

تقييم السلوكيات التركيبية الضوئية من خلال القياسات المتزامنة لانعكاس الأوراق وتحليلات الفلورة الكلوروفيل

Chlorophyll a fluorescence analysis is widely used to measure photosynthetic behaviors in intact plants, and has resulted in the development of many ...