שכפול ויראלי HBV ב extrahepatic ממלא תפקיד חשוב בפתוגנזה של תסמונות תשישות. נכון לעכשיו, מודלים של תרבות התאים להתחלת זיהום HBV חוץ-פתטי מוגבלים. אנו מציגים מודל זיהום במבחנה שאינו כבד כדי לסייע בזיהוי גורמים מארחים חדשניים המשפיעים על שכפול HBV ולחקור מחלות כליות הקשורות HBV.
בהשוואה למודלים מסורתיים של זיהום HBV, אימצנו והנדסנו קו תאים של 293T, 293T-NE-3NR, ותרבתנו אותו במשותף עם HepG2.2.15. זיהום HBV צריך להתבצע במעבדה ברמה biosafety 2 או biosafety רמה שלוש. יש לעקוב אחר נוהלי בטיחות במעבדה כדי להבטיח את בטיחותם של אנשי המעבדה וכל החוקרים צריכים להיות מחוסנים ולזהות נוגדן HBS חיובי לפני ביצוע ניסויים HBV.
התחל על ידי culturing התאים HepG2.2.15 תוך שמירה על כך על-טבעי התא, כמו גם את כל הטיפים, flasks, צלחות, צינורות שבאים במגע עם HepG2.2.15 צריך להיות ספוג 2%virucide לילה לפני סילוק. הסר את הבקבוקון המכיל HepG2.2.15 תאים מחנקן נוזלי ולהפשיר אותו מערבולת עדינה באמבט מים 37 מעלות צלזיוס. מעבירים את התאים לבקבוק תרבות רקמה מרובעת בגודל 25 ס"מ ומוסיפים ארבעה מיליליטר של מדיום תרבותי שלם.
תרבות תאי HepG2.2.15 ב 37 מעלות צלזיוס ו 5% פחמן דו חמצני באינקובטור לח. שנה את המדיום כל שלושה ימים. כאשר מוכן, לאסוף את התא על טבעי בצינור צנטריפוגה 50 מיליליטר.
סגור את המכסה בחוזקה ועטוף אותו עם סרט פרפין. כדי להסיר את שברי התא, סנן את ה- HepG2.2.15 על-טבעי עם קרום 0.45 מיקרומטר לתוך צינור צנטריפוגה חדש של 50 מיליליטר. לאחר מכן הוסיפו 14 מיליליטר של על-טבעי מסונן לעמודת רכז וירוסים וסגרו את המכסה.
צנטריפוגה הטור ב 3, 200 פעמים g במשך 35 דקות בצנטריפוגה מסתובב אופקי לאסוף את רכזת HepG2.2.15 על טבעי לתוך צינור 1.5 מיליליטר. הפעל PCR בזמן אמת כדי להבטיח כי הריכוז אם ה-DNA HBV ברכז על-טבעי HepG2.2.15 נמצא בטווח העקומה הסטנדרטי. לדלל את הריכוז 20-פי על ידי הוספת 10 microliters ל 190 microliters של DMEM בצינור מיקרוצנטריפוגה 1.5 מיליליטר.
יחד עם הריכוז העל-טבעי, הכינו שליטה שלילית, שליטה חיובית וארבעה דילולים של ההתייחסות הכמותית. הוסף 450 microliters של מאגר מיצוי DNA HBV לכל מדגם צנטריפוגה אותם ב 12, 000 פעמים g במשך חמש דקות בטמפרטורת החדר. שלב 27 מיקרוליטרים של תערובת ראשית PCR ושלושה מיקרוליטרים של אנזים פולימראז Taq לכל מדגם בצינורות PCR המונחים על קרח.
לאחר מכן הוסיפו 20 מיקרוליטרים של הדגימה הצנטריפוגית לכל צינור. בצע PCR בזמן אמת בהתאם לכיווני כתב היד וייצא את ערכי ה- CT כדי להשיג עקומה סטנדרטית. מחלקים את רכזת ההפ-ג2.2.15 לאלקוטים ומאחסנים אותה במינוס 80 מעלות צלזיוס עד שהם מוכנים לשימוש.
הכינו מדיום זיהום בהתאם לכיווני כתב היד. ואז זרע HepG2-NE בשתי בארות, 293T-NE-3NR תאים בשתי בארות, ו 293T-NE באר אחת. אין לארוב את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור לח למשך 24 שעות.
לאחר הדגירה, להתבונן בתאים ולהמשיך עם זיהום אם הם בריאים. מוסיפים 500 מיקרוליטרים של מתחם הזיהום לכל באר ו דגירה התאים עוד 24 שעות. לשטוף את התאים פעמיים עם 500 microliters של PBS.
לאחר מכן מוסיפים מיליליטר אחד של בינוני לכל באר. משנים את המדיום בעדינות כל יומיים. ביום 11, בעדינות לשטוף את התאים פעמיים עם 500 microliters של PBS ולתקן את התאים עם מתנול קר כקרח עבור immunofluorescence.
זרעים 100, 000 תאים לכל באר של HepG-NE לשתי בארות, 293T-NE-3NRs לשתי בארות, ו 293T-NE לתוך באר אחת של הצלחת. זרעים 100, 000 תאים לתוך באר של HepG2.2.15 לתוך חמישה ממברנה מוסיף בצלחת נפרדת שש בארות. דגירה התאים במשך 24 שעות.
לאחר הדגירה, ודא כי התאים הם כל חסיד במצב טוב. השלך את המדיום בצלחת שש בארות ואת קרום התא מוסיף. לאחר מכן מניחים את מוסיף הממברנה עם HepG2.2.15 לתוך צלחת שש בארות זרע עם HepG-NE, 293T-NE-3NRs, ו 293T-NE.
חגר את התאים ב-37 מעלות צלזיוס ו-5% פחמן דו-חמצני באינקובטור לח, ומחליף את המדיום כל שלושה עד ארבעה ימים. לאחר 10 ימים, להסיר את ממברנה מוסיף, בעדינות לשטוף את התאים עם PBS פעמיים, ולתקן את התאים עם מתנול קר כקרח עבור immunofluorescence. הדגירה עם הנוגדן הראשי HBcAg ו DAPI הביא כתמים ברורים כאשר נצפתה עם מטרה 10X על מיקרוסקופ הפוך פלואורסצנטי.
לוקליזציה גרעינית אושרה על ידי כתמים עם DAPI וביטוי NTCP-EGFP זוהה עם פלואורסצנטיות ירוקה. אתרי הביטוי של HBcAg היו ממוקמים עם פלואורסצנטיות אדומה. כאשר DAPI, NTCP ו- HBcAg נמצאים באותו תא, התא נדבק בהצלחה ב- HBV.
הקבוצה Cyclosporin A הייתה הפקד השלילי מכיוון שהיא מונעת מ- HBV להזין תאים על-ידי חסימת NTCP. HBcAg זוהה ב 293T-NE-3NRs, אבל לא בתאי 293T-NE המציין NTCP אינו הגורם היחיד חיוני עבור זיהום HBV ב 293T. מצב תא טוב ותפעול יעיל הם נקודות המפתח להצלחת תוצאות הזיהום.
כביסה עדינה ושינוי התקשורת לאחר ההדבקה חשוב גם. כחלופה, שיטת זיהום HBV עם תאי HepG2-NE מבוססי הפאטומה יש יעילות זיהום גבוהה יותר מאשר שיטה זו והוא מתאים הקרנת תרופות נגד HBV. מידול זיהום HBV ב 293T-NE-3NR היא מחמאה שימושית למודל התא המסורתי בשל הרקע הלא הכבד של תאים אלה.
שיטה זו תקל על המחקר של זיהום HBV בתאים שאינם כבד, כמו גם גורמים מארחים הנדרשים עבור הכבד של HBV.
