אנו מודים מנואלה Weitkunat על רכישת הסרט S3. אנחנו מודים Reinhard Fässler לתמיכה נדיבה. עבודה זו נתמכה על ידי EMBO יאנג החוקר התוכנית (יצירות), המועצה האירופית למחקר תחת תכנית המסגרת השביעית של האיחוד האירופי (FP/2007-2013) / 310939 גרנט ERC (יצירות), חברת מקס פלנק (S.B.L., יצירות), את המרכז הלאומי דה לה רשרש של (CNRS) (יצירות), יוזמה מצוינות AMIDEX באוניברסיטת אקס-מרסיי (יצירות), הודיעו LabEX (יצירות) ו- Boehringer Ingelheim Fonds (S.B.L.).

1. שלב הגלמים
<ol><li>להגדיר את צלב עם 20-40 בתולה נקבות וזכרים כ-20 לכל בקבוק של אוכל לעוף (איור 1 א'). לחלופין, אם ייעשה שימוש במניות, להעיף כל מניה לתוך בקבוקים חדשים. כדי לקבל מספיק הגלמים, שקול להגדיר שני בקבוקים לכל גן # מושגים בסיסיים.</li>
	<li>תקופת דגירה את הבקבוקים-25 ° C (או 27 ° C לפי הדגם ניסיוני) של 5-6 ימים (איור 1B). הערה: תמשיך לדפדף הזבובים כל שלושה ימים כדי למנוע צפיפות יתר ולהבטיח אספקה רציפה של הגלמים.</li>
	<li>להשתמש במברשת רטובה לאסוף prepupae לבן מן הקירות של הבקבוקים ולהעביר אותם על השקופיות זכוכית (איור 1C). הגיע הזמן הזמני כך הגלמים להשיג את הרצוי גיל בעת התחלת חיים הדמיה במיקרוסקופ. הערה: prepupae האלה נראים כמו גלמים מבוגרת מבחינת צורתם, אבל הם עדיין לבן כמו הזחלים. תחילת השלב prepupal מוגדר 0 h לאחר היווצרות puparium (0 h APF).</li>
	<li>להסיר גושים של אוכל לטוס נדבקות הגלמים עם מברשת רטובה, אוריינט הצד הבטני של הגלמים לעבר השקופית זכוכית באמצעות של stereomicroscope (איור 1D). למחוק את הגלמים זה עדיין עוברים (גם צעירים) או זה החלו להיות חומים (זקן). פעולה זו מבטיחה כי כל גלמי יש באותו הגיל (0 - 1 h APF).</li>
	<li>תווית של השקופיות עם גנוטיפ, התאריך והשעה של אוסף. להעביר את השקופיות זכוכית אחד פטרי כל ולהוסיף ממחטה רטובה כדי למנוע הגלמים מתייבש (איור 1E).</li>
	<li>חנות הגלמים בתוך אינקובטור 25 ° C או 27 ° C עד שיגיעו לגיל הרצוי. להמשיך לשלבים הבאים h 1 לפני הדמיה, כך הגלמים יש את הרצוי גיל בעת הפעלת הדמיה בשידור חי (שלב 3), לדוגמה בשעה 13h APF בשביל הסרט שמוצג איור 2A-D. הערה: המוקדם ריאלי הזמן ונקודת ההתחלה היא לאחר ראש-eversion של הגלמים המתרחשים 8-10 h APF ב-27 º c</li>
</ol>2. מכינים את הגלמים עבור הדמיה
<ol><li>ודא כי הגלמים עכשיו לדבוק השקופית זכוכית בדיוק כמו הם מקל באופן טבעי הקירות של הבקבוקים בגלל שאריות אוכל לעוף. דבק נוספת נדרשת. אם הגלמים לא מקל מספיק טוב בגלל לחות גבוהה, פתח את צלחת פטרי למשך כמה דקות לאפשר להן להתייבש. לחלופין, להעביר אותם ל סרט הדבקה דו-צדדי על משטח זכוכית, אך בדרך כלל, זה לא נחוץ.</li>
	<li>
חלון פתוח במקרה הגולמי עבור הדמיה של שרירי תעופה עקיף (איור 1F; דלג לסעיף 2.3 עבור הדמיה של שרירי הבטן).<ol>
<li>אוריינט הגלמים נדבקות השקופית זכוכית עם הפונה הקדמי הרחק החוקר תחת stereomicroscope. כוונן את הזום 2 X.</li>
		<li>משתמש קצה אחד של ביולוגיה כיתה #5 מלקחיים, בעדינות דקרו לתוך החקירה הגולמי הגבי לאגף מסתיים בבטן, בית החזה מתחילה.</li>
		<li>כדי לחתוך פתח את התיק הגולמי, בעדינות להזיז את המלקחיים לקצה הקדמי של בית החזה לאורך האגף אך למנוע נזק לרקמת הכנף פגיע. הערה: אם נוזל ידלוף מן הגולם, ניזוק; למחוק אותו ולהתחיל מחדש עם גולם שונים.</li>
		<li>להרים את המקטע של המקרה הגולמי מעל בית החזה עם המלקחיים, ואז לחתוך את סעיף זה בעזרת מספריים בסדר, חדים בצד השני של הקו האמצעי הגבי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
חלון פתוח במקרה הגולמי עבור הדמיה של שרירי הבטן (איור 1 ג'י)<ol>
<li>אוריינט הגלמים נדבקות השקופית זכוכית עם הפונה הקדמי לכיוון החוקר תחת stereomicroscope. כוונן את הזום 2 X.</li>
		<li>משתמש קצה אחד של ביולוגיה כיתה #5 מלקחיים, בעדינות דקרו לתוך החקירה הגולמי הגבי לאגף מסתיים בית החזה, הבטן מתחילה.</li>
		<li>כדי לחתוך פתח את התיק הגולמי, הזז בעדינות המלקחיים לקראת הקצה האחורי של הבטן. הערה: אם נוזל ידלוף מן הגולם, ניזוק; למחוק אותו ולהתחיל מחדש עם גולם שונים.</li>
		<li>להרים את המקטע של המקרה הגולמי מעל הבטן עם המלקחיים, ואז לחתוך את סעיף זה בעזרת מספריים בסדר, חדים בצד השני של הקו האמצעי הגבי.</li>
	</ol>
</li>
	<li>
הגלמים הר (איור 1 H)<ol>
<li>השתמש במברשת רטובה להעברת הגלמים עד חמישה לשקופית פלסטיק עם חריץ (לפי הזמנה, לשימוש חוזר, ראה דיון ורשימת חומרים). להוסיף coverslips מרווח אחד או שניים בכל צד בהתאם העומק של groove ואת העובי של הגלמים. לשים טיפה קטנה של מים מתחת לכל coverslip מרווח כדי להפוך אותו לדבוק השקופית ולהשאיר קצת מקום בין החריץ על coverslips מרווח בכל צד. הערה: coverslips מרווח יכול גם להיות לצמיתות מצורף אל השקופית עם דבק סופר, מראש.</li>
		<li>אוריינט הגלמים כזה כי הפתח במקרה הגולמי פונה כלפי מעלה באמצעות המברשת. ודא מיצוב זהיר של הגלמים בזווית הנכונה עבור איכות הדמיה טובה. למטב את הזווית עבור כל רקמות ונקודת הזמן התפתחותית. הערה: כמות קטנה של מים ב- groove הופך מיצוב של הגלמים קל יותר. מרוקנים את המים העודפים עם המברשת לאחר מכן כדי למנוע טביעה.</li>
		<li>החזק של coverslip (18 פרק 18 מ מ) מעל הגלמים מבלי לגעת בהם. תרסיס (כ- 0.5 µL) של 50% גליצרול פתרון מעל כל מקרה הגולמי הנפתחות coverslip באמצעות פיפטה 20 µL של המקום. הערה: הליך זה מבטיח כי טיפות יש את המרווח זהה כמו הגלמים.</li>
		<li>. תהפוך את coverslip ומקם אותה מעל הגלמים ביד או בעזרת מלקחיים (#5) בזמן מנוחה צד אחד של coverslip על coverslips מרווח ליד הגלמים. בשלב הבא, ירידה בעדינות את coverslip על הגלמים. ודא כי הפתחים במקרה הגולמי, מכוסים כהלכה גליצרול 50% עבור איכות הדמיה טובה וכדי למנוע הגלמים מתייבשת.</li>
		<li>מקפלים קצה אחד של פיסת סקוטש ולתפוס את זה עם מלקחיים (#5) בקצה הזה. מניחים בעדינות את הקלטת כזה כי זה מכסה את קצה אחד של coverslip העליון של coverslip(s) את מרווח, השקופית פלסטיק בצד אחד. אל תלחץ הקלטת, עדיין. ראשית, תסתובב השקופית וחזור עבור הצד השני.</li>
		<li>השתמש בשתי אצבעות אינדקס כדי לחץ כלפי מטה הקלטת בו זמנית בשני הצדדים. הליך זה מבטיח כי הגלמים הם לא שנעקרו מבתיהם.</li>
		<li>בדוק אם הגלמים נמצאים גם coverslip. לקבלת איכות הדמיה מיטבית הגלמים צריך בעדינות להתמצות מתחת coverslip. להתאים את מספר מרווח coverslips במידת הצורך.</li>
		<li>תווית בשקופית על-ידי כתיבה בקלטת דביק.</li>
	</ol>
</li>
</ol>3. חיים הדמיה של הגלמים
<ol><li>שיטת הרכבה מאפשרת הדמיה של הגלמים על הפוך מיקרוסקופים (איור 1I), וגם על זקוף מיקרוסקופים (איור 1J). במיוחד מתאים עבור סריקת הדמיה חיה מיקרוסקופ קונפוקלי, מיקרוסקופ שני הפוטונים, מיקרוסקופ קונפוקלי דיסק מסתובב ללא קשר אם הם הם הפוכים או זקוף. סרטים לטווח ארוך, להשתמש במה מבוקרי טמפרטורה אם הם זמינים.</li>
	<li>באמצעות את העינים, מנורת UV או שידור אור, אתר של גולם ונוחות בתוך הגולם.</li>
	<li>שימוש במצלמה, למצוא את המבנה הרצוי, התאימו את רמת הזום.</li>
	<li>סרטים לטווח ארוך, להגדיר z-מחסנית שמקיף את המבנה של עניין טוב (לדוגמה, השרירים טיסה עקיף, האתרים שלהם מצורף, תאי גיד או שילוב האמור), לבחור מרווח זמן. שקול עושה ממוצע של איכות תמונה טובה יותר. סרטים במהירות גבוהה, לטווח קצר, בחרו z-מטוס בודד כדי להשיג קצב מסגרות גבוה.</li>
	<li>התאם את עוצמת הלייזר כדי לתת את האות האפשרי הטוב ביותר אבל רוויה קטנה. עם זאת, עוצמת הלייזר גבוהה מדי עלולה לגרום נזק הגולם לאורך זמן.</li>
	<li>להתחיל הדמיה ולחזור מפעם לפעם לבדוק את הסרט, להתאים מחדש את מיקום z-מחסנית במידת הצורך.</li>
</ol><img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig1.jpg"> איור 1: זרימת עבודה עבור הדמיה חיה של גיד השריר מורפוגנזה ב הגלמים דרוזופילה . ראה פרוטוקול לקבלת פרטים. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

<ol>
	<li>Brand, A. H., Perrimon, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Targeted+gene+expression+as+a+means+of+altering+cell+fates+and+generating+dominant+phenotypes.">Targeted gene expression as a means of altering cell fates and generating dominant phenotypes.</a> Development. 118 (2), 401-415 (1993).</li><li>Morin, X., Daneman, R., Zavortink, M., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+protein+trap+strategy+to+detect+GFP-tagged+proteins+expressed+from+their+endogenous+loci+in+Drosophila.">A protein trap strategy to detect GFP-tagged proteins expressed from their endogenous loci in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 98 (26), 15050-15055 (2001).</li><li>Venken, K. J. T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MiMIC:+a+highly+versatile+transposon+insertion+resource+for+engineering+Drosophila+melanogaster+genes.">MiMIC: a highly versatile transposon insertion resource for engineering Drosophila melanogaster genes.</a> Nat. Meth. 8 (9), 737-743 (2011).</li><li>Sarov, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+genome-wide+resource+for+the+analysis+of+protein+localisation+in+Drosophila.">A genome-wide resource for the analysis of protein localisation in Drosophila.</a> eLife. 5, e12068 (2016).</li><li>Ranganayakulu, G., Schulz, R. A., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Wingless+signaling+induces+nautilus+expression+in+the+ventral+mesoderm+of+the+Drosophila+embryo.">Wingless signaling induces nautilus expression in the ventral mesoderm of the Drosophila embryo.</a> Dev. Biol. 176 (1), 143-148 (1996).</li><li>Roy, S., Raghavan, K. V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Homeotic+genes+and+the+regulation+of+myoblast+migration,+fusion,+and+fibre-specific+gene+expression+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Homeotic genes and the regulation of myoblast migration, fusion, and fibre-specific gene expression during adult myogenesis in Drosophila.</a> Development. 124 (17), 3333-3341 (1997).</li><li>Bryantsev, A. L., Baker, P. W., Lovato, T. L., Jaramillo, M. S., Cripps, R. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+requirements+for+Myocyte+Enhancer+Factor-2+during+adult+myogenesis+in+Drosophila.">Differential requirements for Myocyte Enhancer Factor-2 during adult myogenesis in Drosophila.</a> Dev. Biol. 361 (2), 191-207 (2012).</li><li>Gordon, S., Dickinson, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+calcium+in+the+regulation+of+mechanical+power+in+insect+flight.">Role of calcium in the regulation of mechanical power in insect flight.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 103 (11), 4311-4315 (2006).</li><li>Jin, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome-Wide+Screens+for+In+Vivo+Tinman+Binding+Sites+Identify+Cardiac+Enhancers+with+Diverse+Functional+Architectures.">Genome-Wide Screens for In Vivo Tinman Binding Sites Identify Cardiac Enhancers with Diverse Functional Architectures.</a> PLoS Genet. 9 (1), e1003195 (2013).</li><li>Chen, E. H., Olson, E. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antisocial,+an+intracellular+adaptor+protein,+is+required+for+myoblast+fusion+in+Drosophila.">Antisocial, an intracellular adaptor protein, is required for myoblast fusion in Drosophila.</a> Dev. Cell. 1 (5), 705-715 (2001).</li><li>Clyne, P. J., Brotman, J. S., Sweeney, S. T., Davis, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Green+Fluorescent+Protein+Tagging+Drosophila+Proteins+at+Their+Native+Genomic+Loci+With+Small+P+Elements.">Green Fluorescent Protein Tagging Drosophila Proteins at Their Native Genomic Loci With Small P Elements.</a> Genetics. 165 (3), 1433-1441 (2003).</li><li>Katzemich, A., Liao, K. A., Czerniecki, S., Sch&#246;ck, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alp/Enigma+Family+Proteins+Cooperate+in+Z-Disc+Formation+and+Myofibril+Assembly.">Alp/Enigma Family Proteins Cooperate in Z-Disc Formation and Myofibril Assembly.</a> PLoS Genet. 9 (3), e1003342 (2013).</li><li>Klapholz, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Alternative+mechanisms+for+talin+to+mediate+integrin+function.">Alternative mechanisms for talin to mediate integrin function.</a> Curr. Biol. 25 (7), 847-857 (2015).</li><li>Schnorrer, F., Kalchhauser, I., Dickson, B. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+transmembrane+protein+Kon-tiki+couples+to+Dgrip+to+mediate+myotube+targeting+in+Drosophila.">The transmembrane protein Kon-tiki couples to Dgrip to mediate myotube targeting in Drosophila.</a> Dev. Cell. 12 (5), 751-766 (2007).</li><li>Menon, S. D., Chia, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Drosophila+rolling+pebbles:+a+multidomain+protein+required+for+myoblast+fusion+that+recruits+D-Titin+in+response+to+the+myoblast+attractant+Dumbfounded.">Drosophila rolling pebbles: a multidomain protein required for myoblast fusion that recruits D-Titin in response to the myoblast attractant Dumbfounded.</a> Dev. Cell. 1 (5), 691-703 (2001).</li><li>Bloor, J. W., Kiehart, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=zipper+Nonmuscle+myosin-II+functions+downstream+of+PS2+integrin+in+Drosophila+myogenesis+and+is+necessary+for+myofibril+formation.">zipper Nonmuscle myosin-II functions downstream of PS2 integrin in Drosophila myogenesis and is necessary for myofibril formation.</a> Dev. Biol. 239 (2), 215-228 (2001).</li><li>Millard, T. H., Martin, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamic+analysis+of+filopodial+interactions+during+the+zippering+phase+of+Drosophila+dorsal+closure.">Dynamic analysis of filopodial interactions during the zippering phase of Drosophila dorsal closure.</a> Development. 135 (4), 621-626 (2008).</li><li>Hatan, M., Shinder, V., Israeli, D., Schnorrer, F., Volk, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Drosophila+blood+brain+barrier+is+maintained+by+GPCR-dependent+dynamic+actin+structures.">The Drosophila blood brain barrier is maintained by GPCR-dependent dynamic actin structures.</a> J. Cell Biol. 192 (2), 307-319 (2011).</li><li>Lee, T., Luo, L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mosaic+Analysis+with+a+Repressible+Cell+Marker+for+Studies+of+Gene+Function+in+Neuronal+Morphogenesis.">Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker for Studies of Gene Function in Neuronal Morphogenesis.</a> Neuron. 22 (3), 451-461 (1999).</li><li>Roy, S., Huang, H., Liu, S., Kornberg, T. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cytoneme-mediated+contact-dependent+transport+of+the+Drosophila+decapentaplegic+signaling+protein.">Cytoneme-mediated contact-dependent transport of the Drosophila decapentaplegic signaling protein.</a> Science. 343 (6173), 1244624 (2014).</li><li>F&#246;rster, D., Luschnig, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Src42A-dependent+polarized+cell+shape+changes+mediate+epithelial+tube+elongation+in+Drosophila.">Src42A-dependent polarized cell shape changes mediate epithelial tube elongation in Drosophila.</a> Nat. Cell Biol. 14 (5), 526-534 (2012).</li><li>Weitkunat, M., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+guide+to+study+Drosophila+muscle+biology.">A guide to study Drosophila muscle biology.</a> Methods. 68 (1), 2-14 (2014).</li><li>Weitkunat, M., Kaya-&#199;opur, A., Grill, S. W., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tension+and+force-resistant+attachment+are+essential+for+myofibrillogenesis+in+Drosophila+flight+muscle.">Tension and force-resistant attachment are essential for myofibrillogenesis in Drosophila flight muscle.</a> Curr. Biol. 24 (7), 705-716 (2014).</li><li>Guirao, B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unified+quantitative+characterization+of+epithelial+tissue+development.">Unified quantitative characterization of epithelial tissue development.</a> eLife. 4, e08519 (2015).</li><li>Etournay, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Interplay+of+cell+dynamics+and+epithelial+tension+during+morphogenesis+of+the+Drosophila+pupal+wing.">Interplay of cell dynamics and epithelial tension during morphogenesis of the Drosophila pupal wing.</a> eLife. 4, e07090 (2015).</li><li>Weitkunat, M., Brasse, M., Bausch, A. R., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+tension+and+spontaneous+muscle+twitching+precede+the+formation+of+cross-striated+muscle+in+vivo.">Mechanical tension and spontaneous muscle twitching precede the formation of cross-striated muscle in vivo.</a> Development. 144 (7), 1261-1272 (2017).</li><li>Sellin, J., Albrecht, S., K&#246;lsch, V., Paululat, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dynamics+of+heart+differentiation,+visualized+utilizing+heart+enhancer+elements+of+the+Drosophila+melanogaster+bHLH+transcription+factor+Hand.">Dynamics of heart differentiation, visualized utilizing heart enhancer elements of the Drosophila melanogaster bHLH transcription factor Hand.</a> Gene Expr. Patterns. 6 (4), 360-375 (2006).</li><li>Lemke, S. B., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanical+forces+during+muscle+development.">Mechanical forces during muscle development.</a> Mech. Develop. 144 (Pt A), 92-101 (2017).</li><li>Classen, A. -. K., Aigouy, B., Giangrande, A., Eaton, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Imaging+Drosophila+pupal+wing+morphogenesis.">Imaging Drosophila pupal wing morphogenesis.</a> Methods Mol. Biol. 420, 265-275 (2008).</li><li>Gratz, S. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Genome+engineering+of+Drosophila+with+the+CRISPR+RNA-guided+Cas9+nuclease.">Genome engineering of Drosophila with the CRISPR RNA-guided Cas9 nuclease.</a> Genetics. 194 (4), 1029-1035 (2013).</li><li>Zhang, X., Koolhaas, W. H., Schnorrer, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+versatile+two-step+CRISPR-+and+RMCE-based+strategy+for+efficient+genome+engineering+in+Drosophila.">A versatile two-step CRISPR- and RMCE-based strategy for efficient genome engineering in Drosophila.</a> G3. 4 (12), 2409-2418 (2014).</li><li>Port, F., Chen, H. -. M., Lee, T., Bullock, S. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimized+CRISPR/Cas+tools+for+efficient+germline+and+somatic+genome+engineering+in+Drosophila.">Optimized CRISPR/Cas tools for efficient germline and somatic genome engineering in Drosophila.</a> P. Natl. Acad. Sci. USA. 111 (29), E2967-E2976 (2014).</li></ol>

המחברים אין לחשוף.

פרוטוקול הציג מתאר כיצד תמונת גיד השריר מורפוגנזה חי הגלמים דרוזופילה באמצעות מגוון של חלבונים fluorescently מתויגות. זה ויוו הדמיה אסטרטגיה יכול לשמש כדי לחקור תהליכים פיתוחיים בסביבתם הטבעית של האורגניזם כולו.
זה הכרחי עבור ניסוי יירוט מוצלח לאתר את הנקודה הנכונה זמן התפתחותית לנתח. לדוגמה, שרירי תעופה עקיף dorsolongitudinal ליזום מצורף אל המטרות שלהם גיד-≈16 h APF23 בזמן שרירי הבטן לפתח מאוחר יותר ולצרף משני הכיוונים רק בין 30 ל-40 h APF26. כתוצאה מכך, ספרות שפורסמו קודם לכן יש להשתמש כדי למצוא את הנקודות בזמן הנכון של פיתוח לנתח או, אם רקמות או מבנה עניין לא נחקרה בהרחבה בעבר, ההתפתחות הכללית חייב להיות מאופיין קודם.
על הגלמים הרכבה בהצלחה בשקופיות פלסטיק לפי הזמנה, חשוב החריצים שיש מידות מתאים: חריצים צורך להיות 1.0-1.5 מ מ רחב ו- 0.3 - 0.4 מ מ עמוק. לעומק הזה מאפשרת כוונון המרחק המדויק coverslip העליון עם מרווח coverslips כנדרש. עם זאת, coverslip מרווח אחד לפחות אמור לשמש כדי למנוע ייבוש של גליצרול 50% מן המדגם על-ידי כוחות נימי. למקם נכון את הגלמים ב- groove דורש קצת ניסיון צריך להיות מותאם כזה כי המבנה של עניין הוא הכי קרוב ככל האפשר כדי coverslip.
אם מספר גדול של הגלמים אמור לדימות בהפעלה מיקרוסקופ אחד, הם יכולים כל להיות מותקן מראש, ולאחר מכן מאוחסנים בתוך אינקובטור עד הדמיה כדי להבטיח תזמון התפתחותי תקין. הגלמים עליו לשרוד את כל ההליך, גם לפחות לנסות eclose אם שמר על השקופית לאחר דימות. שיעור ההישרדות יכול לשמש את הבדיקה כדי לבדוק אם התנאים הדמיה לפגוע הגלמים.
ההגדרות הדימות צריך להיבחר בקפידה בהתאם לדרישות ניסיוני. סרטים לטווח קצר, קצב גבוה לעומת יחס אות לרעש גבוה צריך להיות מאוזן, בעוד צריכת חשמל גבוהה יחסית לייזר יכול לשמש מבלי להזיק הגלמים מדי. עם זאת, סרטים לטווח ארוך, עוצמת הלייזר יש להישמר ברמה מתונה, הגלמים צריך לא לדימות באופן רציף אלא בנקודות מסוימות הזמן, לדוגמה, כל 20 דקות. כדי להבטיח כי המבנה של עניין לא זזה מתוך בתחום התצוגה, ייתכן צורך להתאים מחדש את מיקום z-המחסנית בין נקודות זמן. לידע שלנו, פתיחת התיק הגולמי כשלעצמה אינה משפיעה על תזמון התפתחותית. עם זאת, שלב מבוקרי טמפרטורה אמור לשמש לסרטים לטווח ארוך כדי להבטיח תזמון התפתחותי תקין. שמירה על שיקולים אלה בחשבון, סרטים מאוד אינפורמטיבי ניתן לרכוש.
פרוטוקול שהוצגו ניתן להמחיש לא רק מורפוגנזה גיד השריר, אלא גם רקמות מתפתחות אחרות, לדוגמה, האגף אפיתל29. רק שלושה שינויים בפרוטוקול זה נדרשים: (1) פתיחה של המקרה הגולמי מעל הכנף במקום בית החזה או בבטן, (2) מיקום של הגלמים עם האגף לכיוון של coverslip העליון ו- (3) שימוש שונה פלורסנט סמן חלבונים. עם ההתקדמות של CRISPR/Cas9-הטכנולוגיה, חלבונים פלורסנט מתויג יותר endogenously יהיו זמינים, כי זה הפך להיות יותר ישירה למטרה לוקוסים אנדוגני ב דרוזופילה30,31 , 32. בעתיד, זה יאפשר שחקרתי את הדינמיקה של מספר חלבונים, תאים ורקמות כולו בסביבה הפיזיולוגית שלהם בפירוט.

המנגנון גיד השריר מאפשר בעלי חיים, כולל האדם כדי להעביר חלקי גופם. אבני הבניין מולקולרית של מערכת השריר-גיד מאוד נשמרים. לכן, המושגים של גיד השריר פיתוח שרלוונטית הכוח האנושי ביולוגיה, לדוגמה מורפוגנזה שריר, גיד השריר המצורף, ארגון עצמי myofibril, ניתן יהיה ללמוד באמצעות דרוזופילה melanogaster כמו נגישה בקלות מערכת מודל. מערכת הגולמי דרוזופילה יש מספר יתרונות ניסיוני. ראשית, על השלב הגולמי – כאשר השרירים למבוגרים נוצרות – האורגניזם הוא sessile וקל לכן תמונה על מיקרוסקופ על פני תקופה של שעות או אפילו ימים. שנית, רבים טופס השרירים קרוב מספיק מתחת לפני השטח הגולמי כך הם יכולים לדימות בתוך האורגניזם ללא פגע, שקוף חלקית. שלישית, השרירים יכול ייחקרו בתוך הסביבה הטבעית שלהם, הם מחוברים ויוצרים שלד חיצוני באמצעות גיד תאים בהם המתח רקמות נבנית. . זה לא אפשרי במערכות תרבות תא השריר. לבסוף, שפע של כלים גנטיים זמינה בדרוזופילה. בין אלה הם סמנים מתויגות fluorescently רבות המאפשרות תיוג של סוגי תאים מסוים או מבני subcellular עבור דימות in vivo.
טבלה 1 מסכמת את סמני החשוב ביותר עבור מורפוגנזה גיד השריר. זה כולל סמני overexpressed באמצעות ה GAL4-UAS-מערכת1 ו מתויג endogenously חלבון סמני2,3,4. היתרון של GAL4-UAS-המערכת הוא כי סמני מתבטאים בדרך כלל ברמה גבוהה, וכתוצאה מכך אות חזק זה יכול בקלות לדימות בכולה-הר הגלמים. בנוסף, ירידה לפרטים רקמות יכולה להיות מושגת על-ידי בחירה GAL4 נהגי בזהירות. היתרון של חלבונים פיוז'ן לידי ביטוי בשליטה אנדוגני הוא כי הדינמיקה של החלבונים המתאימים ניתן למדה ויוו, בעוד הם יכולים לשמש גם סמנים לסוגי תאים שונים או מבנים subcellular ספציפיים, לדוגמה, ΒPS-אינטגרין-GFP לאתרים המצורפים שריר. . יחד, סמנים אלה מספקות גמישות גבוהה עיצוב ניסיוני, הבחירה של מחקר בעיות יכולות להיפתר עכשיו ובעתיד.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody><tr><td colspan="2">מבנה עם תוויות</td>
			<td colspan="2">סמן</td>
			<td colspan="2">הביטוי ולוקליזציה</td>
			<td colspan="2">מחלקה</td>
			<td colspan="2">מספר מניות</td>
			<td colspan="2">תגובה</td>
			<td>Ref.</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="15">שריר</td>
			<td colspan="2">
Mef2-GAL4</td>
			<td colspan="2">כל myoblasts ואת כל השרירים בכל שלבי</td>
			<td colspan="2">GAL4 קו</td>
			<td colspan="2">BL 27390</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>5</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
1151-GAL4</td>
			<td colspan="2">מבשרי שריר למבוגרים, myotubes מוקדמת עד ≈24 h APF</td>
			<td colspan="2">GAL4 קו, משפר מלכודת</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>6</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act79B-GAL4</td>
			<td colspan="2">לקפוץ שריר על בידול</td>
			<td colspan="2">GAL4 קו</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F-GAL4</td>
			<td colspan="2">שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">GAL4 קו</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>7</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Act88F- Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">Act88F משפר יזם נהיגה Cameleon 3.1</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Ca2 + מחוון</td>
			<td>8</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Act88F-GFP</td>
			<td colspan="2">שרירי תעופה עקיף החל ≈14 h APF</td>
			<td colspan="2">GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף)</td>
			<td colspan="2">fTRG78, fTRG10028</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
GFP - nls אותו</td>
			<td colspan="2">מבשרי שריר למבוגרים, גרעיני, עד ≈24 h APF בשרירי טיסה עקיף</td>
			<td colspan="2">משפר/יזם עם הכתב nls-GFP</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">פרגמנט משפר 1.5 kb</td>
			<td>9</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
Mhc-טאו-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubules DLM תבניות, המבדילים השרירים</td>
			<td colspan="2">משפר/יזם עם טאו-GFP כתב</td>
			<td colspan="2">BL 53739</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>10</td>
		</tr><tr><td colspan="2">ΒTub60D-GFP</td>
			<td colspan="2">microtubules ב- myotubes (למשל, שרירי תעופה עקיף של ≈14 h AFP, הפחתת בחריפות לאחר ≈48 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף)</td>
			<td colspan="2">fTRG958</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Mhc-GFP (weeP26)</td>
			<td colspan="2">sarcomeres (עבה פילמנט) של כל השרירים בגוף (למשל, שרירי תעופה עקיף החל מ≈30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-השמנה</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">השתמש משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים, תוויות תת-קבוצה של isoform</td>
			<td>11</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Sls-GFP</td>
			<td colspan="2">sarcomeres (Z-דיסק) של כל השרירים בגוף (למשל, שרירי תעופה עקיף החל מ≈30 h APF)</td>
			<td colspan="2">GFP-השמנה (לגלי קו)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">G53, שימוש משפחתית ולא משפחתית הטרוזיגוטיים</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp66-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-דיסק של כל השרירים בגוף</td>
			<td colspan="2">GFP-השמנה (לגלי קו)</td>
			<td colspan="2">BL 6824</td>
			<td colspan="2">ZCL0663</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Zasp52-GFP</td>
			<td colspan="2">Z-דיסק של כל השרירים בגוף</td>
			<td colspan="2">GFP-השמנה (לגלי קו)</td>
			<td colspan="2">BL 6838</td>
			<td colspan="2">G00189</td>
			<td>
2 , 12
</td>
		</tr><tr><td colspan="2">. השודדים-GFP</td>
			<td colspan="2">אקטין מחייב; לידי ביטוי אפיתל, myoblasts, myotubes</td>
			<td colspan="2">GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף)</td>
			<td colspan="2">fTRG585</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Dlg1-GFP</td>
			<td colspan="2">צמתי תא אפיתל, myoblasts וממברנות שרירים בכל שלבי</td>
			<td colspan="2">GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף)</td>
			<td colspan="2">fTRG502</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="5">האתר המצורף שריר</td>
			<td colspan="2">ΒPS-אינטגרין-GFP</td>
			<td colspan="2" fo:page-break-inside="avoid">שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף)</td>
			<td colspan="2">GFP-טוק-ב</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP ו- mCherry</td>
			<td colspan="2">שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף)</td>
			<td colspan="2">GFP-השמנה (לחקות קו)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>3</td>
		</tr><tr><td colspan="2">Talin-GFP</td>
			<td colspan="2">שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף)</td>
			<td colspan="2">GFP-פיוז'ן (קו TransgeneOme לעוף)</td>
			<td colspan="2">fTRG587</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>4</td>
		</tr><tr><td colspan="2">אפשריים-GFP</td>
			<td colspan="2">שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף)</td>
			<td colspan="2">GFP-השמנה (לגלי קו)</td>
			<td colspan="2">קיוטו 110951 (ZCL3111)</td>
			<td colspan="2">ZCL3111, ZCL3192</td>
			<td>2</td>
		</tr><tr><td colspan="2">יקבלו-GFP ו- RFP</td>
			<td colspan="2">שריר מצורף אתרים (למשל, החל ≈18 h AFP בשרירי טיסה עקיף)</td>
			<td colspan="2">GFP-פיוז'ן (transgene)</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>13</td>
		</tr><tr><td colspan="2">גיד</td>
			<td colspan="2">
sr-GAL4</td>
			<td colspan="2">תאי גיד החזה, לאורך כל השלב הגולמי</td>
			<td colspan="2">GAL4 קו, משפר מלכודת</td>
			<td colspan="2">BL 26663</td>
			<td colspan="2">homozygous קטלני</td>
			<td>14</td>
		</tr><tr><td colspan="2">שריר וגיד</td>
			<td colspan="2">
Duf-GAL4</td>
			<td colspan="2">השרירים ואת epithelia, התפרצות מוקדמת.</td>
			<td colspan="2">GAL4 קו</td>
			<td colspan="2">BL 66682</td>
			<td colspan="2">kirre-rP298, מייסד תא סמן</td>
			<td>15</td>
		</tr><tr><td colspan="2" rowspan="7">UAS-כתבים</td>
			<td colspan="2">
UAS- GFP-Gma</td>
			<td colspan="2">איגוד אקטין</td>
			<td colspan="2">קו UAS</td>
			<td colspan="2">BL 31776</td>
			<td colspan="2">תחום הכריכה אקטין Moesin דבוקה GFP</td>
			<td>16</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- mCherry-Gma</td>
			<td colspan="2">איגוד אקטין</td>
			<td colspan="2">קו UAS</td>
			<td colspan="2">-</td>
			<td colspan="2">Gma דבוקה mCherry</td>
			<td>17</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-GFP</td>
			<td colspan="2">איגוד אקטין</td>
			<td colspan="2">קו UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35544</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS- Lifeact-רובי</td>
			<td colspan="2">איגוד אקטין</td>
			<td colspan="2">קו UAS</td>
			<td colspan="2">BL 35545</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>18</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-GFP</td>
			<td colspan="2">איגוד ממברנה</td>
			<td colspan="2">קו UAS</td>
			<td colspan="2">מניות שונות, למשל: BL 32184</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>19</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-CD8-mCherry</td>
			<td colspan="2">איגוד ממברנה</td>
			<td colspan="2">קו UAS</td>
			<td colspan="2">BL 27391 ו 27392</td>
			<td colspan="2"></td>
			<td>20</td>
		</tr><tr><td colspan="2">
UAS-דקל-mCherry</td>
			<td colspan="2">ממברנה מחייב דרך palmitoylation</td>
			<td colspan="2">קו UAS</td>
			<td colspan="2">BL 34514</td>
			<td colspan="2">
UAS- brainbow</td>
			<td>21</td>
		</tr></tbody></table>טבלה 1: מתויגות Fluorescently סמני חלבונים מתאימים ללמוד גיד השריר מורפוגנזה ויוו.
כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך ניתן לבצע הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב חי הגלמים ומוצלחת (איור 1). לחלופין, ניתן לתקן הגלמים, גזור, immunostained, אשר מאפשר באמצעות נוגדנים לתייג גם חלבונים אשר לא גרה סמני הינם זמינים22. במקרה זה, איכות הדמיה היא בדרך כלל גבוה יותר כי יש תנועה, ניתן למקם את המבנה של עניין בסמיכות coverslip. אולם, ניתוח של קיבוע יכול להוביל לנזק ומולקולרית או דינמיקה רקמות, לדוגמה, עוויתות שרירים, יכול להילמד רק בתוך האורגניזם החי.

<table>
	<tbody>
		<tr>
			<td>Stereomicroscope</td>
			<td>Leica</td>
			<td>MZ6</td>
			<td>product has been replaced by Leica M60</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>fly food in bottles (or vials)</td>
			<td>-</td>
			<td>-</td>
			<td>standard culture medium</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paint brush</td>
			<td>da Vinci</td>
			<td>1526Y</td>
			<td>size 1</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>microscope slides</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>VWR: 631-1303</td>
			<td>76 x 26 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>double-sided tape (optional)</td>
			<td>Scotch</td>
			<td>6651263</td>
			<td>12 mm x 6.3 m</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>petri dishes</td>
			<td>Greiner Bio-One</td>
			<td>632102</td>
			<td>94 x 16 mm</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>paper tissues</td>
			<td>Th.Geyer</td>
			<td>7695251</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, standard)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11251-20</td>
			<td>0.1 mm x 0.06 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>forceps #5 (Dumont, inox, biology grade)</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>11252-20</td>
			<td>0.05 mm x 0.02 mm tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Cohan-Vannas spring scissors</td>
			<td>Fine Science Tools</td>
			<td>15000-02</td>
			<td>straight tip</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>plastic slides with a groove (reusable)</td>
			<td>custom-built</td>
			<td>-</td>
			<td>75 x 26 x 4 mm plexi glass slide with 1.0-1.5 mm wide and 0.3-0.4 mm deep groove</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>coverslips</td>
			<td>Marienfeld</td>
			<td>107032</td>
			<td>18 x 18 mm, No. 1.5H</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>glycerol</td>
			<td>Sigma-Aldrich</td>
			<td>49781</td>
			<td>dilute to 50 % in water</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>adhesive tape</td>
			<td>Tesa</td>
			<td>57370-02</td>
			<td>1.5 mm x 10 m</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vivo imaging of muscle-tendon morphogenesis in drosophila pupae

השרירים יחד עם הגידים, השלד מאפשרים בעלי חיים, כולל האדם כדי להעביר חלקי גופם. מורפוגנזה שריר מאוד כולו מבעלי חיים לבני אדם. לכן, שיטת מודל דרוזופילה ניתן ללמוד מושגים של פיתוח שרירים-הגיד כי ניתן להחיל גם הכוח האנושי לביולוגיה. כאן, אנו מתארים בפרוטרוט איך מורפוגנזה של מערכת השריר למבוגרים-הגיד יכול בקלות לדימות חיי, פיתוח הגלמים דרוזופילה . לפיכך, השיטה מאפשרת לחקור חלבונים, תאים ורקמות בסביבה הפיזיולוגית שלהם. בנוסף פרוטוקול צעד אחר צעד עם עצות מועילות, אנו מספקים סקירה מקיפה של חלבונים סמן מתויגות fluorescently המתאימים הלומדים מערכת השריר-גיד. כדי להבליט את היישומים תכליתי של הפרוטוקול, אנחנו מקרינים סרט דוגמה החל ויזואליזציה של אירועים morphogenetic לטווח ארוך – המתרחשים על ציר הזמן של שעות וימים – כדי ויזואליזציה של תהליכים דינאמיים לטווח קצר כמו רעד שרירי המתרחשים סרגל זמן של שניות. יחדיו, פרוטוקול זה צריך לאפשר לקורא לעצב ולבצע הדמיה לחיות ניסויים על חקירת גיד השריר מורפוגנזה באורגניזם ללא פגע.

רקמות שונות יכולים להיות שבעורך ויוו בפיתוח הגלמים לעוף, הפיכתם מערכת מודל אידיאלי ללמוד מורפוגנזה איברים למבוגרים. בין אלה הם השרירים טיסה עקיף, האפיתל החזה כולל תאי גיד, האפיתל כנף, שרירי הבטן, הלב22,23,24,25,26 , 27. כאן, אנו מתמקדים הדמיה חיה של שריר וגיד מורפוגנזה. לקבלת תיאור מפורט של טיסה עקיף שריר, שריר הבטן מורפוגנזה ושיטות נוספים ללמוד ביולוגיה השריר ב דרוזופילה, אנו מכנים את הקורא Weitkunat ו- Schnorrer 201422.
חיים הדמיה של שרירי תעופה עקיף
לימוד פיתוח ארוכת טווח של השרירים טיסה עקיף המורכב של השרירים dorsolongitudinal (DLMs) ואת השרירים dorsoventral (DVMs), Moesin הכדוריים אקטין מחייב תחום מתויג עם GFP (UAS -GFP-Gma) בא לידי ביטוי בכל השרירים באמצעות Myocyte משפר פקטור 2 (Mef2)-הנהג GAL4 (איור 2 א-D, הסרט S1). לפני הדמיה, חלון במקרה הגולמי נפתח מעל בית החזה, כפי שמוצג באיור 1F. במיקרוסקופ שני הפוטונים, z-במחסן נרכשו בכל 20 דקות עבור h 21 החל מ- ≈11 h לאחר היווצרות puparium (11 h APF). במסגרת זמן זו, DLMs (ירוק כיסויי איור2 א'-D') קודם ליזום מצורף אל תאי גיד (איור 2 א) ולאחר מכן תפצל בזמן הקבצים המצורפים שריר בוגר (איור 2B). בשלב הבא, myotubes לקצר (איור 2C) עד שיגיעו לבסוף הבמה מקסימאלית הדחוס ב 30 אבני APF (איור דו-ממדי). יחדיו, הסרט הזה מדגיש כי השינויים הדרמטיים של שריר מורפולוגיה המתרחשות על ציר הזמן של שעות.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig2.jpg"> איור 2: לחיות הדמיה של טיסה עקיף שריר וגיד מורפוגנזה. (י-ם) נקודות מתוך סרט שני הפוטונים (סרט S1) באמצעות Mef2זמן-GAL4, UAS- GFP-Gma כסמן של אקטין בשרירי טיסה עקיף המורכב של השרירים dorsolongitudinal (DLMs, מודגשים בירוק א' '-D'), (את השרירים dorsoventral DVMs, מוארים בכחול א' '-ד' '). גודל ברים הם 100 מיקרומטר. (E-H) זמן נקודות סרט שני הפוטונים (סרט S2) באמצעות Duf-GAL4UAS-CD8-GFP כסמן שרירי תעופה עקיף, לרבות גיד תאי האפיתל החזה. פנלים E'-H' הצג כיסוי עם מודל של מערכת השריר-גיד בכל נקודה בזמן, הדגשת בהרחבות זמן רב תאית הנוצרת על-ידי האפיתל גיד (מגנטה) בקשר עם השרירים (ירוק). גודל ברים הם 100 מיקרומטר (משוער לפי גודל מבני הדמיה). (אני-L) זמן נקודות מסרט שני צבעים, ספינינג דיסק קונאפוקלית (סרט S3) התמקדות גיד השריר מצורף חניכה. תאי גיד מסומנים בכיתוב sr-GAL4UAS-דקל-mCherry (מגנטה), את dorsolongitudinal עקיף טיסה שרירי עם Mhc -טאו-GFP (ירוק). גודל ברים הם 10 מיקרומטר. הזמן מסומן בתור hh: mm לאחר היווצרות puparium (APF). שים לב כי לא כל הסרטים נרכשו על הבמה מבוקרי טמפרטורה, לכן, תזמון התפתחותי עלול לסטות. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
לימוד מורפוגנזה בגיד ו שרירים בו זמנית, ממברנה מכורך GFP (UAS -CD8-GFP) בא לידי ביטוי באמצעות Dumbfounded (Duf)-GAL4 כנהג, הבאה לידי ביטוי הן ב התאים הגיד והשרירים טיסה עקיף (איור 2E -H, הסרט S2). Z-מחסנית צולמה במיקרוסקופ שני הפוטונים כל 20 דקות החל מ- 16 ה APF עבור 20 h. ואילו myotubes קומפקטי (כיסוי ירוק באיור 2E'-H'), הגיד תאים הרחבות זמן הסלולר טופס להאריך עם הזמן (כיסוי מגנטה ב 2E איור'-H'). יחדיו, הסרט הזה מדגיש הגומלין קרוב בין ה גיד ושרירים תאים ויוו.
לחקור אותו גיד השריר אינטראקציה בפירוט רב יותר, בוצעה הדמיה שני צבעים, ההגדלה גבוהה. הגלמים עם שרשרת כבדה צולבות הקישור חוטים שרירן (Mhc)-טאו-GFP ב DLMs ו UAS -palmitoylated-mCherry (UAS -דקל-mCherry) מונעים על ידי פס (sr)-GAL4 ב הגידים היו עם תמונה כל 5 דקות החל מ- 12 שעות APF במשך 4.5 h בדיסק מסתובב מיקרוסקופ קונפוקלי (איור 2I-L, הסרט S3). ב 12 שעות APF, myotubes נודדים לכיוון תאי היעד שלהם גיד תוך יצירת filopodia ארוך-הטיפים (איור 2I). לאחר מכן, שריר וגיד הרקמות interdigitate (דמות 2J, K) כדי ליצור קובץ מצורף יציב. כפי המצורף מתבגר, פחות filopodia טופס וממשק גיד השריר smoothens (איור 2 L). לפיכך, הדמיה שני צבעים, ההגדלה גבוהה יכול לשמש כדי לחשוף דינמיקה סלולר בפירוט האורגניזם החי.
חיים הדמיה של שרירי הבטן
עבור הדמיה חיה של שרירי הבטן (איור 3הסרט S4), Mef2-GAL4> UAS-CD8-GFP שימש כסמן ונפתח חלון מעל הבטן במקרה הגולמי כמו מפורט ב איור 1 ג'י. בדומה לסרט שריר טיסה עקיף מיוצג באיור 2A-D, ההיווצרות והגידול של שרירי הבטן ניתן בעקבות במשך שעות רבות של פיתוח (h 55 ב S4 הסרט). במהלך תקופה זו, myoblasts הפתיל טופס גדל myotubes (איור 3 א). העצות myotube להגר ממטרותיהם גיד, לאחר צירוף אל תאי גיד, נוצרות היחידות כויץ של השרירים, sarcomeres, (איור 3B-D).
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig3.jpg"> איור 3: לחיות הדמיה של שריר הבטן מורפוגנזה. (י-ם) נקודות מתוך סרט (סרט S4) באמצעות Mef2זמן-GAL4UAS-CD8-GFP כסמן לעקוב מורפוגנזה שריר הבטן. לוחות א '-ה ' הצג שכבות-על של מודלים של ערכה שריר הבטן (ירוק) המהווה de novo במהלך השלב הגולמי. גודל ברים הם 100 מיקרומטר. הזמן מסומן בתור hh: mm APF. הסרט נרכשה בטמפרטורת החדר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
חיים הדמיה של בפקעת השרירים
בניגוד איור 2 ו- 3 איור, איור 4 מראה dynamics שרירים המתרחשים על ציר הזמן של שניות: הקלטה חיה של התכווצות שרירים. הגלמים לבטא βPS-אינטגרין-GFP תחת שליטה אנדוגני היו עם תמונה עם רזולוציה זמן של 0.65 s ב- z-מטוס בודד במיקרוסקופ קונפוקלי (S5 הסרט). בדוגמה המוצגת באיור4, האתרים מצורף של שלוש DVMs (איור 4A) היו עם תמונה 10 דקות החל מ- 42 h APF. בתקופה זו העיוות חמישה אירועים נצפו (איור 4B-F), מראה כי sarcomeres הם כבר התאספו מספיק טוב כדי לתמוך התכווצויות מתואמת בשלב זה הזמן בפיתוח. לפיכך, הדמיה של רעד שרירי יכול לשמש read-out תפקודית sarcomerogenesis כבר במהלך הטיסה עקיף שרירים פיתוח28, בניגוד למשל טיסה בדיקות, אשר יכול להתבצע רק לאחר וגיחתו.
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig4.jpg"> איור 4: חיים הדמיה של בפקעת השרירים. (א) קודם הזמן-נקודת מסרט (סרט S5) מציג בפקעת של שרירי תעופה עקיף dorsoventral ב 42 h APF באמצעות βPS-אינטגרין-GFP כסמן. בתוך שדה הראייה הם השריר מצורף אתרים של DVM II 2, DVM III 1 ו 2 השלישי (אנגלית). (B-נ) צבע שכבות-על חמישה אירועים עווית בודדים, כל אחד מציג את המסגרת לפני העווית (מגנטה) ואת המסגרת הראשונה של האירוע עווית (ירוק). שימו לב כי סיבי השריר בודדים עווית בנפרד אחד מהשני. חצים להדגיש את התנועה עוויתות. הפתרון הזמן של הסרט הוא הם 0.65 סרגלי קנה מידה ס' 25 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig4large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
חיים הדמיה של חלבונים מתויגות endogenously
דומה βPS-אינטגרין-GFP, אוסף גדול של חלבונים פיוז'ן לידי ביטוי דרוזופילה תחת שליטה אנדוגני היה שנוצר2,3,4. קווים אלה לעוף ניתן ללמוד לדוגמה subcellular לוקליזציה או את פרופילי ביטוי של חלבונים עניין. האוסף שימושי במיוחד אם נוגדנים ספציפיים אינם זמינים או דינמיקה חלבון צריך ובדוקים ויוו בלי קיבוע. איור 5 מציג שלוש דוגמאות של פיוז'ן endogenously ביטוי חלבונים מספריית TransgeneOme (fTRG) לעוף, Hu li shao טאי (Hts)-GFP (איור 5 א, ב'), Talin-GFP (איור 5C, D) וβtubulin60d-GFP ( איור 5E, F). הביטוי של חלבונים אלה ניתן יהיה ללמוד ברקמות כל לבטא אותם באופן טבעי. . הנה, אנחנו מראים האפיתל בית החזה (איור 5AC, E) ואת השרירים טיסה עקיף או האתרים שלהם מצורף (איור 5BD, F) כדוגמאות.
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/57312/57312fig5.jpg"> איור 5: הדמיה חיה של endogenously מתויג חלבונים. (A, B) השלכות המרבי של z-במחסן של הגלמים לבטא Hts-GFP. (C, D) השלכות המרבי של z-במחסן של הגלמים לבטא Talin-GFP. (E, F) השלכות המרבי של z-במחסן של הגלמים לבטא βTubulin60D-GFP. לוחות A, C ו- E במופע האפיתל החזה 18, 24, 18 h APF, בהתאמה, לוחות B, D ו- F להראות את השרירים טיסה עקיף או האתרים שלהם מצורף ב 30 אבני APF. גודל ברים הם 25 מיקרומטר. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/57312/57312fig5large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae at JoVE.com

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש, רב-תכליתי לביצוע חי הדמיה של תהליכים התפתחותיים מורפוגנזה הכללי של גיד השריר בפרט חי הגלמים דרוזופילה .

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Muscles together with tendons and the skeleton enable animals including humans to move their body parts. Muscle morphogenesis is highly conserved from ...

in-vivo-imaging-of-muscle-tendon-morphogenesis-in-drosophila-pupae

Research

JoVE Journal

Developmental Biology

In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

11.3K Views.  Max Planck Institute of Biochemistry. כאן, אנו מציגים שיטה קלה לשימוש, רב-תכליתי לביצוע חי הדמיה של תהליכים התפתחותיים מורפוגנזה הכללי של גיד השריר בפרט חי הגלמים דרוזופילה .

Video: In Vivo Imaging of Muscle-tendon Morphogenesis in Drosophila Pupae

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track during live cell imaging. These processes include: retinal rotation, cell growth and organismal movement. Additionally, irregularities in the topology of the epithelium, including subtle bumps and folds often introduced as the pupa is prepared for imaging, make it challenging to acquire in-focus images of more than a few ommatidia in a single focal plane. The workflow outlined here remedies these issues, allowing easy analysis of cellular processes during Drosophila pupal eye development. Appropriately-staged pupae are arranged in an imaging rig that can be easily assembled in most laboratories. Ubiquitin-DE-Cadherin:GFP and GMR-GAL4&#8211;driven UAS-&#945;-catenin:GFP are used to visualize cell boundaries in the eye epithelium 1-3. After deconvolution is applied to fluorescent images captured at multiple focal planes, maximum projection images are generated for each time point and enhanced using image editing software. Alignment algorithms are used to quickly stabilize superfluous motion, making individual cell behavior easier to track.

Live-imaging of the Drosophila Pupal Eye

This protocol presents an efficient method for imaging the live Drosophila pupal eye neuroepithelium. This method compensates for tissue movement and uneven topology, enhances visualization of cell boundaries through the use of multiple GFP-tagged junction proteins, and uses an easily-assembled imaging rig.

Live-הדמיה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; גלמי עין

Inherent processes of Drosophila pupal development can shift and distort the eye epithelium in ways that make individual cell behavior difficult to track ...

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in architecture, is well-characterized, and is amenable to genetic analysis. Each egg chamber consists of germ-line cells surrounded by a single epithelial layer of somatic follicle cells. Subsets of follicle cells undergo differentiation during specific stages to become several different cell types. Standard techniques primarily allow for a lateral view of egg chambers, and therefore a limited view of follicle cell organization and identity. The upright imaging protocol describes a mounting technique that enables a novel, vertical view of egg chambers with a standard confocal microscope. Samples are first mounted between two layers of glycerin jelly in a lateral (horizontal) position on a glass microscope slide. The jelly with encased egg chambers is then cut into blocks, transferred to a coverslip, and flipped to position egg chambers upright. Mounted egg chambers can be imaged on either an upright or an inverted confocal microscope. This technique enables the study of follicle cell specification, organization, molecular markers, and egg development with new detail and from a new perspective.

Upright Imaging of Drosophila Egg Chambers

The upright imaging method described in this protocol allows for the detailed visualization of the poles of a developing Drosophila melanogaster egg. This end-on view provides a new perspective into the arrangements and morphologies of multiple cell types in the follicular epithelium.

הדמיה זקופה של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; לשכות ביצה

Drosophila melanogaster oogenesis provides an ideal context for studying varied developmental processes since the ovary is relatively simple in ...

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration have been thoroughly analyzed in vitro. However, in vivo cell migration somehow differs from in vitro migration, and has proven more difficult to analyze, being less accessible to direct observation and manipulation. This protocol uses the migration of the prospective prechordal plate in the early zebrafish embryo as a model system to study the function of candidate genes in cell migration. Prechordal plate progenitors form a group of cells which, during gastrulation, undergoes a directed migration from the embryonic organizer to the animal pole of the embryo. The proposed protocol uses cell transplantation to create mosaic embryos. This offers the combined advantages of labeling isolated cells, which is key to good imaging, and of limiting gain/loss of function effects to the observed cells, hence ensuring cell-autonomous effects. We describe here how we assessed the function of the TORC2 component Sin1 in cell migration, but the protocol can be used to analyze the function of any candidate gene in controlling cell migration in vivo.

Analyzing In Vivo Cell Migration using Cell Transplantations and Time-lapse Imaging in Zebrafish Embryos

Combining cell transplantation, cytoskeletal labeling and loss/gain of function approaches, this protocol describes how the migrating zebrafish prospective prechordal plate can be used to analyze the function of a candidate gene in in vivo cell migration.

ניתוח<em&gt; In vivo</em&gt; נדידת תאים באמצעות השתלות תא והדמיה זמן לשגות עוברי דג הזברה

Cell migration is key to many physiological and pathological conditions, including cancer metastasis. The cellular and molecular bases of cell migration ...

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. One aspect of egg activation, conserved across all organisms examined, is a change in the intracellular concentration of calcium (Ca2+) often termed a 'Ca2+ wave'. While the speed and number of oscillations of the Ca2+ wave varies between species, the change in intracellular Ca2+ is key in bringing about essential events for embryonic development. These changes include resumption of the cell cycle, mRNA regulation, cortical granule exocytosis, and rearrangement of the cytoskeleton.
In the mature Drosophila egg, activation occurs in the female oviduct prior to fertilization, initiating a series of Ca2+-dependent events. Here we present a protocol for imaging the Ca2+ wave in Drosophila. This approach provides a manipulable model system to interrogate the mechanism of the Ca2+ wave and the downstream changes associated with it.

Imaging Calcium in Drosophila at Egg Activation

This article describes an adaptable ex vivo protocol for visualizing Ca2+ during egg activation in Drosophila.

סידן הדמיה ב<em&gt; תסיסנית</em&gt; ב ביצת הפעלה

Egg activation is a universal process that includes a series of events to allow the fertilized egg to complete meiosis and initiate embryonic development. ...

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have been used to study many biological processes, such as cell proliferation, differentiation, growth, migration, apoptosis, competition, cell-cell signaling, and compartmental boundary formation. However, methods for the long-term ex vivo culture and live imaging of the imaginal discs have not been satisfactory, despite many efforts. Recently, we developed a method for the long-term ex vivo culture and live imaging of imaginal discs for up to 18 h. In addition to using a high insulin concentration in the culture medium, a low-melting agarose was also used to embed the disc to prevent it from drifting during the imaging period. This report uses the eye-antennal discs as an example. Photoreceptor R3/4-specific m&#948;0.5-Ga4 expression was followed to demonstrate that photoreceptor differentiation and ommatidial rotation can be observed during a 10 h live imaging period. This is a detailed protocol describing this simple method.

Long-term Live Imaging of Drosophila Eye Disc

This protocol describes a detailed method for the long-term ex vivo culture and live imaging of a Drosophila imaginal disc. It demonstrates photoreceptor differentiation and ommatidial rotation within the 10 h period of live imaging of the eye disc. The protocol is simple and does not require expensive setup.

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של<em&gt; דרוזופילה</em&gt; דיסק העין

Live imaging provides the ability to continuously track dynamic cellular and developmental processes in real time. Drosophila larval imaginal discs have ...

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic lamellae and smooth muscle cells (SMCs), and an outer layer of fibroblasts and extracellular matrix. In contrast to the widespread study of pathological models (e.g., atherosclerosis) in the adult aorta, much less is known about the embryonic and perinatal aorta. Here, we focus on SMCs and provide protocols for the analysis of the morphogenesis and pathogenesis of embryonic and perinatal aortic SMCs in normal development and disease. Specifically, the four protocols included are: i) in vivo embryonic fate mapping and clonal analysis; ii) explant embryonic aorta culture; iii) SMC isolation from the perinatal aorta; and iv) subcutaneous osmotic mini-pump placement in pregnant (or non-pregnant) mice. Thus, these approaches facilitate the investigation of the origin(s), fate, and clonal architecture of SMCs in the aorta in vivo. They allow for modulating embryonic aorta morphogenesis in utero by continuous exposure to pharmacological agents. In addition, isolated aortic tissue explants or aortic SMCs can be used to gain insights into the role of specific gene targets during fundamental processes such as muscularization, proliferation, and migration. These hypothesis-generating experiments on isolated SMCs and the explanted aorta can then be assessed in the in vivo context through pharmacological and genetic approaches.

Using In Vivo and Tissue and Cell Explant Approaches to Study the Morphogenesis and Pathogenesis of the Embryonic and Perinatal Aorta

Protocols for studying the embryonic and perinatal murine aorta using in vivo clonal analysis and fate mapping, aortic explants, and isolated smooth muscle cells are detailed here. These diverse approaches facilitate the investigation of the morphogenesis of the embryonic and perinatal aorta in normal development and the pathogenesis in disease.

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

The aorta is the largest artery in the body. The aortic wall is composed of an inner layer of endothelial cells, a middle layer of alternating elastic ...

Live Imaging of Mouse Secondary Palate Fusion

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to cleft secondary palate, a common congenital anomaly in humans. Secondary palate fusion has been extensively studied leading to several proposed cellular mechanisms that may mediate this process. However, these studies have been mostly performed on fixed embryonic tissues at progressive timepoints during development or in fixed explant cultures analyzed at static timepoints. Static analysis is limited for the analysis of dynamic morphogenetic processes such a palate fusion and what types of dynamic cellular behaviors mediate palatal fusion is incompletely understood. Here we describe a protocol for live imaging of ex vivo secondary palate fusion in mouse embryos. To examine cellular behaviors of palate fusion, epithelial-specific Keratin14-cre was used to label palate epithelial cells in ROSA26-mTmGflox reporter embryos. To visualize filamentous actin, Lifeact-mRFPruby reporter mice were used. Live imaging of secondary palate fusion was performed by dissecting recently-adhered secondary palatal shelves of embryonic day (E) 14.5 stage embryos and culturing in agarose-containing media on a glass bottom dish to enable imaging with an inverted confocal microscope. Using this method, we have detected a variety of novel cellular behaviors during secondary palate fusion. An appreciation of how distinct cell behaviors are coordinated in space and time greatly contributes to our understanding of this dynamic morphogenetic process. This protocol can be applied to mutant mouse lines, or cultures treated with pharmacological inhibitors to further advance understanding of how secondary palate fusion is controlled.

Here, we present a protocol for live imaging of mouse secondary palate fusion using confocal microscopy. This protocol can be used in combination with a variety of fluorescent reporter mouse lines, and with pathway inhibitors for mechanistic insight. This protocol can be adapted for live imaging in other developmental systems.

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז &#39;ן

The fusion of the secondary palatal shelves to form the intact secondary palate is a key process in mammalian development and its disruption can lead to ...

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended intracellular endotubes that build and stabilize the lumen with a membrane and submembraneous cytoskeleton of apical character. The excretory cell expands its length approximately 2,000 times to generate these canals, making this model unique for the in vivo assessment of de novo polarized membrane biogenesis, intracellular lumen morphogenesis and unicellular tubulogenesis. The protocol presented here shows how to combine standard labeling, gain- and loss-of-function genetic or RNA interference (RNAi)-, and microscopic approaches to use this model to visually dissect and functionally analyze these processes on a molecular level. As an example of a labeling approach, the protocol outlines the generation of transgenic animals with fluorescent fusion proteins for live analysis of tubulogenesis. As an example of a genetic approach, it highlights key points of a visual RNAi-based interaction screen designed to modify a gain-of-function cystic canal phenotype. The specific methods described are how to: label and visualize the canals by expressing fluorescent proteins; construct a targeted RNAi library and strategize RNAi screening for the molecular analysis of canal morphogenesis; visually assess modifications of canal phenotypes; score them by dissecting fluorescence microscopy; characterize subcellular canal components at higher resolution by confocal microscopy; and quantify visual parameters. The approach is useful for the investigator who is interested in taking advantage of the C. elegans excretory canal for identifying and characterizing genes involved in the phylogenetically conserved processes of intracellular lumen and unicellular tube morphogenesis.

The C. elegans Excretory Canal as a Model for Intracellular Lumen Morphogenesis and In Vivo Polarized Membrane Biogenesis in a Single Cell: labeling by GFP-fusions, RNAi Interaction Screen and Imaging

The C. elegans excretory canal is a unique single-cell model for the visual in vivo analysis of de novo polarized membrane biogenesis. This protocol describes a combination of standard genetic/RNAi and imaging approaches, adaptable for the identification and characterization of molecules directing unicellular tubulogenesis, and apical membrane and lumen biogenesis.

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

The four C. elegans excretory canals are narrow tubes extended through the length of the animal from a single cell, with almost equally far extended ...

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the proteins involved in these pathways are evolutionarily conserved between mammals and other eukaryotes, such as the fruit fly Drosophila melanogaster, suggesting that similar organizing principles exist during the development of these organisms. Importantly, Drosophila has been used extensively to identify cellular and molecular mechanisms regulating processes that are required in mammals including neurogenesis, differentiation, axonal guidance, and synaptogenesis. Flies have also been used successfully to model a variety of human neurodevelopmental diseases. Here we describe a protocol for the step-by-step microdissection, fixation, and immunofluorescent localization of proteins within the adult Drosophila brain. This protocol focuses on two example neuronal populations, mushroom body neurons and retinal photoreceptors, and includes optional steps to trace individual mushroom body neurons using Mosaic Analysis with a Repressible Cell Marker (MARCM) technique. Example data from both wild-type and mutant brains are shown along with a brief description of a scoring criteria for axonal guidance defects. While this protocol highlights two well-established antibodies for investigating the morphology of mushroom body and photoreceptor neurons, other Drosophila brain regions and the localization of proteins within other brain regions can also be investigated using this protocol.

Dissection and Immunofluorescent Staining of Mushroom Body and Photoreceptor Neurons in Adult Drosophila melanogaster Brains

This protocol describes the dissection and immunostaining of adult Drosophila melanogaster brain tissues. Specifically, this protocol highlights the use of Drosophila mushroom body and photoreceptor neurons as example neuronal subsets that can be accurately used to uncover general principles underlying many aspects of neuronal development.

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

Nervous system development involves a sequential series of events that are coordinated by several signaling pathways and regulatory networks. Many of the ...

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the Notch receptor with ligands from neighboring cells induces activation of the signaling pathway (trans-activation), while interaction with ligands from the same cell inhibits signaling (cis-inhibition). Proper balance between trans-activation and cis-inhibition helps establish optimal levels of Notch signaling in some contexts during animal development. Because of the overlapping expression domains of Notch and its ligands in many cell types and the existence of feedback mechanisms, studying the effects of a given post-translational modification on trans- versus cis-interactions of Notch and its ligands in vivo is difficult. Here, we describe a protocol for using Drosophila S2 cells in cell-aggregation assays to assess the effects of knocking down a Notch pathway modifier on the binding of Notch to each ligand in trans and in cis. S2 cells stably or transiently transfected with a Notch-expressing vector are mixed with cells expressing each Notch ligand (S2-Delta or S2-Serrate). Trans-binding between the receptor and ligands results in the formation of heterotypic cell aggregates and is measured in terms of the number of aggregates per mL composed of &#62;6 cells. To examine the inhibitory effect of cis-ligands, S2 cells co-expressing Notch and each ligand are mixed with S2-Delta or S2-Serrate cells and the number of aggregates is quantified as described above. The relative decrease in the number of aggregates due to the presence of cis-ligands provides a measure of cis-ligand-mediated inhibition of trans-binding. These straightforward assays can provide semi-quantitative data on the effects of genetic or pharmacological manipulations on the binding of Notch to its ligands, and can help deciphering the molecular mechanisms underlying the in vivo effects of such manipulations on Notch signaling.

Cell Aggregation Assays to Evaluate the Binding of the Drosophila Notch with Trans-Ligands and its Inhibition by Cis-Ligands

Complexity of in vivo systems makes it difficult to distinguish between the activation and inhibition of Notch receptor by trans- and cis-ligands, respectively. Here, we present a protocol based on in vitro cell-aggregation assays for qualitative and semi-quantitative evaluation of the binding of Drosophila Notch to trans-ligands vs cis-ligands.

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים

Notch signaling is an evolutionarily conserved cell-cell communication system used broadly in animal development and adult maintenance. Interaction of the ...

אין ויוו הדמיה של גיד השריר מורפוגנזה ב דרוזופילה הגלמים

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

Live-הדמיה של

הדמיה זקופה של

ניתוח

סידן הדמיה ב

הדמיה לטווח ארוך בשידור חי של

באמצעות In Vivo , רקמות, תאים Explant גישות ללמוד מורפוגנזה ו פתוגנזה של הלידה של אבי העורקים

הדמיה חיה של עכבר משניים פיוז 'ן

התעלה Excretory C. elegans כמודל עבור מורפוגנזה לומן תאיים ו Vivo ב מקוטב ממברנה להן בתא יחיד: תיוג על ידי התכה GFP, RNAi אינטראקציה עם המסך הדמיה

ניתוח Immunofluorescent מכתים של פטריות הגוף והנפש ומה קולט אור נוירונים במוח למבוגרים דרוזופילה melanogaster

תא מבחני צבירה כדי להעריך את הכריכה של החריץ דרוזופילה עם טרנס-ליגנדים וניגוד שלה על ידי חבר העמים-ליגנדים