PLP는 샌포드 어린이 건강 연구 센터의 부교수 탐정이다. R01AR056712, R01AR052779 및 관절염 및 근골격계의 건강 / 국립 연구소의 국립 연구소 및 피부 질환 (NIAMS), MDA와 샌포드 어린이 건강 연구 포상에서 P30의 AR061303 :이 작품은 PLP에 다음 교부금에 의해 지원되었다. 이 작품은 부분적으로 프로젝트에서 유럽 연합의 일곱 번째 프레임 워크 프로그램에서 연구 자금 조달에서 도움이되고 FP7 - 건강 - 2009 년 ENDOSTEM 241440 (수리 및 근육 조직의 유지를 위해 혈관 관련 줄기 세포와 근육 줄기 세포의 활성화) SA에 의해 지원되었다. CIRM의 교제.

인간 배아 줄기 세포의 1. 감염 이 프로토콜은 높은 역가 lentiviruses 인코딩 BAF60C 및 MyoD (13)를 필요로한다. 이러한 구조 요청에 따라 사용할 수 있습니다. <ol><li> 시작하기 전에 추천 <ol><li> 공급이없는 상태에서 감염 바이러스 흡수하는 동안 휴대 경쟁을 제거하기 (그림 2A)에 대한 감염, 플레이트 인간 배아 줄기 세포의 고효율을 보장하기 위해. 사실, MEFs는 인간 배아 줄기 세포에 비해 MyoD 매개 전환 능력이로 감염 악명 쉽다. 따라서, hESC의 문화에서 MEFs을 제거하면 감염 속도를 증가시킨다. </li><li> 그것은 감​​염의 높은 효율을 보장하기 위해 높은 역가 lentiviruses을하는 것이 좋습니다. 감염의 효율성을 개선 할 수있는 옵션은 &quot;감염 확인&quot;절에서 설명합니다. </li><li> 물론 각 1 ㎎ / ㎖ 리겔 1 ㎖를 추가하여 리겔 코팅 된 플레이트를 준비하고 최소 1 실온에서 시간 (또는 O를 남겨 / N 4 ° C에서 밀봉전날 준비하는 경우). </li></ol></li><li> 감염 절차 <ol><li> 감염 전날 <ol><li> 1000 X 희석 (2 mM의 최종 농도)에 매체에 HES 세포 복제 및 복구 보충을 추가합니다. </li></ol></li><li> 0 일 - BAF60C와 감염 참고 : 첫 번째 MyoD 감염 다음 BAF60C와 인간 배아 줄기 세포의 감염을 수행합니다. <ol><li> 37 ℃에서 5 분 동안 TrypLE 1 ㎖와 배양하여 단일 세포 현탁액의 식민지 14로 성장 인간 배아 줄기 세포의 6 잘 플레이트의 우물을 떼어 놓다 </li><li> 15 ML 튜브로 전송 서스펜션, 1,200 rpm에서 5 분 동안의 hESC 매체와 원심 분리기 15 ML을 추가합니다. </li><li> 원심 분리하는 동안, 1 mTeSR1의 ML, 폴리 브렌 (6 ㎎ / ㎖) 및 건강의 세포 복제 및 복구 보조 식품 (2 ㎜)에 추가하여 깨끗한 튜브에 감염 믹스를 준비합니다. </li><li> 하나의 C에서 다시 정지 세포 펠렛 (약 5 × 5 -1 X 10 6 세포onfluent 아니라 인간 배아 줄기 세포의) 플라스틱에 부착 세포를 방지하는 6 자 낮은 부착 판, 상 감염 믹스 플레이트 1 ㎖와. </li><li> 10 8 MOI에 BAF60C-IRES-GFP 바이러스를 추가하고 배양기에서 3 시간을 품다 </li><li> 바이러스를 함유하는 세포 현탁액을 수집하고이 마트 리겔 - 코팅 된 웰에 동등하게 나눈다. 그런 다음 각 웰 mTeSR1 + HES 세포 복제 및 복구 부록 2 ㎖를 추가하고 인큐베이터에서 O / N 두십시오. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 조심스럽게 바이러스를 포함하는 매체를 제거하고 mTeSR1and HES 세포 복제 및 복구 보충 2 ㎖로 대체합니다. 그림 (b)에 나타낸 바와 같이, 세포 응집이 시작됩니다. </li></ol></li><li> 둘째 날 - MyoD와 감염 <ol><li> 계속 진행하기 전에 감염의 높은 효율을 가지고 있는지 확인하기 위해 형광 현미경으로 세포의 형광 상태를 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 감염 확인 &quot;섹션을 참조하십시오이온 &quot;. </li><li> 세포가 합류점의 적어도 80 %에 도달 한 경우, 다음과 같이 진행; 그렇지 않으면 이전 절차로 추가 날을 기다립니다. </li><li> 매체를 제거하고 세포를 떼어 놓다 TrypLE 시약 1 ㎖를 추가합니다. 37 ℃에서 5 분 알을 품다 </li><li> 설명 from1.2.2.2으로 반복 - 1.2.2.6 10 8 MOI에서 MyoD 바이러스를 추가. </li></ol></li><li> 3 일 <ol><li> 조심스럽게 바이러스를 포함하는 매체를 제거하고 mTeSR1and HES 세포 복제 및 복구 보충 2 ㎖로 대체합니다. </li><li> 리겔에 플레이트 MEFs는 감염된 세포의 증식을 허용 다음날 2.5 × 10 10 / cm 2에서 판을 입혔다. </li></ol></li><li> 4 일 <ol><li> 매체를 제거하고 세포를 떼어 놓다 TrypLE 시약 1 ㎖를 추가합니다. 37 ℃에서 5 분 알을 품다 </li><li> 15 ML 팔콘 튜브에 세포를 전송, 1,200 rpm에서 5 분 동안의 hESC 매체와 원심 분리기 15 ML을 추가합니다. </li><li> Remove 뜨는 hESC의 매체의 6 ㎖에 다시 일시 중지합니다. </li><li> 각 웰 MEFs가 함유에 3 ㎖를 분배 1:2 분할의 비율로 MEFs 함유 6 - 웰 플레이트와 플레이트의 인간 배아 줄기 세포에서 매체를 제거합니다. 식민지 합류에 도달 할 때 팁, MyoD/BAF60C-infected 세포의 우물 중 일부는 예비 주식으로 액체 질소에 냉동 할 수 있습니다. 냉동 매체는 90 KOSR의 %와 10 %의 DMSO 플러스 2 ㎜ HES 세포 복제 및 복구 보충을 포함한다. 나머지 우물은 분화 프로토콜에 노출 될 수 있습니다 - 자세한 내용은 아래를 참조하십시오. 더 많은 세포가 더 myospheres을 생산하는 데 필요한 경우에는 다음과 같이 감염된 인간 배아 줄기 세포가 추가로 전파 할 수 있습니다 : </li><li> 매체를 제거하고 37 ℃에서 5 분 동안 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV의 1 ㎖로 배양 </li><li> 콜라게나 제 IV를 제거하고 hESC의 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 해부 현미경에서 10 ㎖의 팁 식민지 다 쳤어요. </li><li> coloni의 덩어리를 수집15 ML 튜브에 3 분 동안 침전 할 수 말이지. 그런 비율 1:4를 사용 MEFs 플레이트에 hESC의 매체와 플레이트에 뜨는,에 resuspend를 제거합니다. </li></ol></li></ol></li><li> 감염 확인 <ol><li> 세포를 전파하는 동안,이 RNA 분석을 위해 수확 (주제 결과 참조), 각 단계에서 올바른 생체 상태를 반영 바이오 마커를 확인하기 위해 면역 형광에 의해 단백질 발현 분석을 수행 할 더 작은 규모로 감염된 세포를 플레이트에 추천. 고역가 lentiviruses 예상 감염된 세포의 백분율은 80 % 이상이어야한다. </li><li> 고성능을 보장하기 위해, 렌티 바이러스 벡터는 형광 선별 마커 및 / 또는 항생제 내성을 도입, 변형 될 수있다. BAF60C을 표현하는 우리의 렌티 바이러스 플라스미드는 GFP의 형광을 수행한다. </li><li> 형광 마커를위한 인간 배아 줄기 세포를 정렬. 감염의 낮은 효율의 경우 형광을 사용하는 것이 좋습니다BAF60C 바이러스를 발현하는 세포에 풍부하고 높은 역가 MyoD 바이러스 세포를 감염 (FACS - 정렬을) 정렬 ctivated 세포. <ol><li> 중간에있는 HES 세포 복제 및 복구 보충 정렬 전날를 추가합니다. </li><li> 정렬의 날 (0 일에서 설명합니다) TrypLE하여 세포를 떼어 놓다 및 FACS 튜브에 KO 교체 혈청 플러스 HES 세포 복제 및 복구 보조 식품의 세포를 재현 탁. </li><li> 정렬의 끝에서, 건강의 세포 복제 및 복구 보충을 추가 MEFs 플레이트에 KO 교체 혈청과 접시에있는 세포를 수집합니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 2. EB와 같은 유도 및 분화 <ol><li> 유도 및 분화 과정 <ol><li> 0 일 - EB 유도 <ol><li> 잘 (그림 2C)에서 식민지의 높은 숫자를 가지고, BAF60C/Myod-infected 인간 배아 줄기 세포에서 분화를 시작하기 전에, 확인하십시오. </li><li> 각 웰의 연구에 대한emove 매체를, PBS로 세척하고 1 ㎎ / ㎖ 콜라게나 제 IV의 1 ML을 추가합니다. 37 ℃에서 5 분 동안 품어 </li><li> 콜라게나 제를 제거하고 EB 매체의 1 ML을 추가합니다. </li><li> 해부 현미경으로 신속하게 기계적으로 10 ㎖의 끝으로 긁어 400 ~ 800 세포 집합체에 식민지를 떼어 놓다. </li><li> 15 ML 튜브에 식민지의 덩어리를 수집하고 3 분 동안 침전 할 수 있습니다. 뜨는을 제거, EB 매체의 3 ㎖에 다시 일시 중단하고 6 자 낮은 부착 판 잘 하나에 세포 현탁액을 전송합니다. </li></ol></li><li> 1 일 <ol><li> 진행하기 전에 콜로니 크기 및 세포 죽음을 확인한다. 큰 덩어리가있는 경우, 5 ML 피펫, 3 ~ 4 회 가볍게 피펫 팅에 의해 아래를 휴식. 세포의 죽음이 매우 높은 경우 (많은 부동 세포와 파편)는 중력에 의해 15 ML 튜브에 집계를 수집하여 매체를 대체하고 신선한 EB 매체의 3 ㎖로 격판 덮개를, 그렇지 않은 경우에는 다음과 같이 진행합니다. </li><li> 추가 1.5우물에 신선한 EB 매체의 ML </li></ol></li><li> 2 일 <ol><li> 15 ML 튜브에있는 우물에서 집계를 수집하여 매체를 변경합니다. 그 2 분 동안 정착하자. </li><li> , 뜨는을 제거 신선한 EB 매체의 3 ㎖로 교체하고 같은 우물에 재배포. </li></ol></li><li> 3 일 <ol><li> 우물에 신선한 EB 매체의 1.5 ML을 추가합니다. </li></ol></li><li> 4 일 <ol><li> &quot;주 2&quot;의 설명에 따라 진행합니다. </li></ol></li><li> 5 일 - EB 같은 클러스터 (그림 2D)의 근원 성 차별. <ol><li> 2.1.3.1에 ​​설명 된대로 집계를 수집하고 PBS의 2 ㎖로 한 번 세척; 집계가 침전 할 수 있습니다. </li><li> PBS를 제거하고 DM 매체의 3 ㎖를 추가; 같은 우물에 접시. </li></ol></li><li> 6 일 - 20 일 <ol><li> D6에서 D20에 3 일마다 신선한 매체와 매체를 교체하십시오. 대표 myospheres는 F에 표시됩니다igure 2E. </li></ol></li></ol></li><li> 확인 myosphere 차별화 <ol><li> 더 진행하기 전에, 이전 조브 프로토콜 (12)에서 설명한 바와 같이, 10의 화합물에 포함 myospheres의 섹션을 만들어 myospheres 이내에 근육 조직 분화의 효율을 확인하기 위해 추천된다. 같은 myognenin으로 근육 조직 마커 (복제 F5D, DSHB)과 마이 오신 중쇄 (복제 MF20, DSHB) (대표 결과를 참조)에 대한 면역 형광 염색을 수행합니다. 이 5 분 동안 도데 실 황산나트륨 (SDS) 0.5 %로 처리하여 항원 검색을 수행하는 것이 중요하다 EB 섹션 오게 닌에 대한 염색으로 성공하기! 팁. 또한 그것은 F5D 및 MF20 항체를 이용한 이중 염색이 프로토콜을 사용하는 것이 가능하다. </li></ol></li></ol> 3. 미디어 조리법 <ol><li> ESC 매체 DMEM-F12 1 mM의 L-글루타민 20 % 녹아웃 빼앗아음 교체 매체 (KOSR) 0.1 mM의 비 필수 아미노산 (NEAA) 50 U / ㎖ 페니실린 / 스트렙토 마이신 (펜 / Strep의) 0.1 ㎜ 베타 - 머 캅토 에탄올 8 NG / ㎖ 염기성 섬유 아세포 성장 인자 (bFGF) </li><li> EB 매체 DMEM F12 1 mM의 L-글루타민 15 % FBS 5 % 말 혈청 </li><li> DM 매체 DMEF F12 1X 리퀴드 미디어 보충 1X N-2 (부록) </li></ol>

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우리는 공개 아무것도 없어.

여기에서 제안 된 프로토콜은 직접 인간 배아 줄기 세포에서 수축 근섬유 (myospheres)의 3 차원 클러스터를 생성하는 방법에 대해 설명합니다. 제안 된 전략은 심사 분석 및 개발 연구 모두를위한 모델 &quot;접시에있는 질병&quot;으로 적합 할 수있다 서스펜션 미니 근육을 생성하는 전례가없는 뛰어난 잠재력을 가지고 있습니다. 게다가 인간 배아 줄기 세포로부터 myospheres를 생성하는 방법은 간단하고 일반적으로 복구 세포의 수율에 부정적인 영향을 감별 도중 어떤 FACS 소팅 공정을 필요로하지 않는다. 이 단일 세포로 EB의 해리를 의미 이후 게다가, 분화 동안에 정렬 절차는 응집을 방해한다. 제안 된 방법은 다 능성 배아 줄기 세포에서 발현되지 않는 특정 요인, MyoD 및 BaAF60C와 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 reprograming을 기반으로합니다. MyoD 및 BAF60C는 &quot;핵심&quot;단백질 복잡한 일에게 제공자국에서 전사가 골격 근육 조직 프로그램을 활성화하기 위해 진행되는 게놈 유전자 좌. 두 요소는 렌티 바이러스 감염에 의해 세포에 전달하고 모든 세포에서 두 요인의 감염의 고효율을 얻을 수 있으므로 중요된다. 이것은 높은 역가의 바이러스 또는 선택 마커 부여 바이러스를 사용하여 달성 될 수있다. 배양 조건은 근육 조직의 분화의 정도를 최적화하는 중요한 역할을한다. 골격 myotubes에 근육 조직 전구체의 변환을 달성하기 위해 - 우리는 혈청 정의 된 배지에서 배양 (ITS 인슐린 트랜스페린을 포함) 다음에, 근원 전구체의 클러스터로 인간 배아 줄기 세포를 표현 MyoD/BAF60C의 분화에 대한 혈청 기반의 차별화 프로토콜을 제안한다. 그러나, 정의 된 다른 매체와 동일하거나 더 나은 근원 성 분화를 달성 할 수있는 것이 가능하다. 프로토콜의 하나의 전류 제한은, 게다가 함유 태아 혈청의 사용에 의존한다는 것이다많은 동물성 단백질과 물질을 보내고, 로트의 변화를 보여줍니다. 이 myospheres 내 근육 조직 전환의 낮은 효율성 또는 이질의 원인이 될 수 있습니다. 참고로, BAF60/MyoD-expressing 인간 배아 줄기 세포에서 파생 된 모든 EB 같은 구조는 myospheres 것은 아닙니다; 즉, 일부는 완전히 근섬유로 구성 EB 같은 집계입니다. (결과 참조) 프로토콜의 끝에서 수행 EB 섹션에 의해 추정 된 면역 염색으로 정상적으로 BAF60C 및 MyoD 발현을 인간 배아 줄기 세포 유래의 myospheres 수가 30-60% 변할 수있다. 만 myospheres의 배양 접시를 풍부하게하는 잠재적 인 방법은 근육 조직 기자를 사용하는 것입니다. 이는 부분적으로 또는 분화하지 EB 같은 클러스터를 폐기하고 오직 myospheres를 선택하는 것이 용이. 마지막으로, 도입 된 요소의 시간적 요건을 기본 메커니즘을 더 잘 이해가 전달 방법을 개선하는 것이 유용 할 것이다. 예를 들어, BAF60C 및 MyoD는 SH 필요오트 시간은 올바른 방향 &quot;킥&quot;세포에, 수정 된 mRNA의 납품에 근거를 둔 방법을 적용 할 수 있습니다. 인자가 세포가 내인성 단백질을 이용하기 전에 장시간이 필요한 경우에 대조적으로, 에피 솜 접근법은 가변성 및 게놈 통합 때문에 제어되지 않은 효과를 제거하기 위해 추천된다. 마지막으로, 우리는 이전 골격근에 hESC의 전환을 달성하기 위해에 또는 MyoD (결코 이후)과 동시에 BAF60C을 표현하는 필수되어 있습니다. BAF60C의 사전 식에 대한 요구 사항은 아마도 게놈 6,15 통해 적절한 MyoD 염색질 배포를위한 성적인 풍경을 미리 설정하는 역할에 의존합니다. 따라서, 미래의 프로토콜은 화합물 또는 인간 배아 줄기 세포에서 BAF60C 발현을 촉진 다른 조작에 의해 개선 될 수 있습니다.

능성을 유지하면서 때문에 그들의 독특한 능력의 자기 갱신, 인간 배아 줄기 세포 (hESCs)는 재생 의학의 귀중한 자원으로 간주됩니다. 체외 질병 모델링을위한 골격 근육의 병에 걸린 근육과 hESC의 또는 유도 만능 줄기 세포의 세포 매개 다시 채우기 줄기 (IPSC)에서 파생 된 세대는 치료를 식별하고 많은 신경 근육 질환의 발병 기전을 해명하기위한 연구의 주요 목표입니다. 그러나 이러한 연구는 골격근 세포로 변환하는 인간 배아 줄기 세포의 저항과 골격 근육 생성을 향해 hESC의 - 약속의 분자 규제에 관한 정보의 소수에 의해 도전을 받고있다. 사실, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 전구 세포를 생성하는 이전의 시도는 배아 바디 (EB)에서 유래 된 자손 또는 중간 엽 세포는 전사 활성제의 자궁외 식 (다음 골격 근육 생성을 활성화 할 능력이 있다는 것을 밝혀 예PAX3 또는 Myf5) 1-3 또는 특정 배양 조건 4-5에 노출. 우리는 이전에 (SMARCD3에 의해 암호화) SWI / SNF 구성 요소, BAF60C는, 근육의 특정 유전자좌 6 MyoD 매개 활성화를 허용하는 전사 기계의 필수 구성 요소입니다 것으로 나타났습니다. 우리는 최근에 BAF60C의 선택 부재는 인간 배아 줄기 세포에, 그렇지 않으면 체세포 8-10을 표현 BAF60C에서 관찰 골격 근육 생성 7 MyoD 매개 활성화에 대한 저항성을 부여하는 것을 발견했다, 과정은 일반적으로 근육 조직 전환 함. BAF60C의 강제 식 직접 BAF60C 및 근육 조직 계보 7으로 인간 배아 줄기 세포를 저지른 성적인 서명을 부과 MyoD으로, 특정 배양 조건에 따라, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 생성을 활성화 MyoD 수 있습니다. 참고로, 이전의 단백체 분석 BAF6의 선택이 없음을 밝혀0C는 SWI / SNF의 구성 요소 중, 줄이고 ESCs 11. 우리는 3 차원 수축을 형성하기 위해 통합 할 수있는 골격 근육 아세포의 균질 인구의 세대로 이어지는, 근육 조직 계보에 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 노력을 부과하는이 기술을 사용 구조 (myospheres) 그 기능을 모방 소형 골격 근육 7. 사실, 인간 배아 줄기 세포에서 골격 근육 전구 세포를 생성하는 우리의 방법은 휴대 등의 세포 분화 신호에 노출 될 때까지 표현형 잠재적 인 근육 조직 혈통에 인간 배아 줄기 세포의 후 성적인 노력에 의존 차별화 매체의 집계와 문화 (특정 프로토콜 참조). 이 전략은 성적으로 골격 근육 계통에 최선을 다하고 조직 학적과 골격의 기능적 특성을 요점을 되풀이 입체 수축 myospheres의 형성에 적합한 인간 배아 줄기 세포의 균일 한 인구의 확장을 허용근육. myospheres 근육 질환의 모델 &quot;접시에있는 질병&quot;에 대한 악용 소형화 근육의 첫 번째 증거를 제공합니다. 환자 유래 유도 만능에서 발생하는 경우,이 myospheres은 치료 화합물의 높은 처리량 검사를위한 도구로 엄청난 잠재력을 제공 할뿐 아니라, 오랜 개발 질문을 명료하게 할 수있는 잠재력 및 희귀 질환의 발병 기전이있다. 우리는 또한 고메스 등. (12)에 의해 조브 프로토콜에 설명 된대로 myosphere 분석 한 즉시 판독이 부분에 대한 면역 조직 화학 염색에 의해 제공 될 수 있습니다

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="841">
	<colgroup>
		<col span="3" />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3506</td>
			<td style="width:64px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">6 well low attachment plate</td>
			<td style="width:259px;">Corning</td>
			<td style="width:259px;">3471</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">GFR Matrigel</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciencies</td>
			<td style="width:259px;">356231</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="25">
			<td height="25" style="height:25px;width:259px;">MEFs (growth arrested)14</td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td style="width:259px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Collagenase IV</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17104-019</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">DMEM-F12</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15-090-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">KOSR</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">10828-028</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">1mM L-glutamine (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">35050-61</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Pen/Strep (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">15070-063</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">2-Mercaptoethanol</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">21985-023</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">NEAA (100X)</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">11140-050</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Polybrene</td>
			<td style="width:259px;">Millipore</td>
			<td style="width:259px;">TR-1003-G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">ITS Liquid Media Supplement</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">I3146</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">N2-supplement&#160;</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">17502-048</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">TrypLE express</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">12605-010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">FBS</td>
			<td style="width:259px;">HyClone</td>
			<td style="width:259px;">SH30396.03</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">HS</td>
			<td style="width:259px;">Invitrogen</td>
			<td style="width:259px;">16050114</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:259px;"><a href="https://www.stemgent.com/products/193">hES Cell Cloning &#38; Recovery Supplement</a></td>
			<td style="width:259px;">Stemgent</td>
			<td style="width:259px;">01-0014-100</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">bfgf</td>
			<td style="width:259px;">Sigma</td>
			<td style="width:259px;">4114-TC</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">mTeSR1</td>
			<td style="width:259px;">Stemcell Technologies</td>
			<td style="width:259px;">5850</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyoD</td>
			<td style="width:259px;">BD Biosciences</td>
			<td style="width:259px;">554130</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-MyHC</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">MF20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:259px;">Anti-myogenin</td>
			<td style="width:259px;">DSHB</td>
			<td style="width:259px;">F5D</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

generation of myospheres from hescs by epigenetic reprogramming

인간 배아 줄기 세포 (hESCs)에서 골격 근육 세포의 균일하고 풍부한 인구의 생성은 세포 기반 치료를위한 인간 신경 근육 질환의 모델 &quot;접시에있는 질병&quot;에 대한 요구 사항입니다. 이러한 낮은 풍부하고 또한 인구뿐만 아니라, 입체적인 수축성 구조체의 형성을위한 프로토콜의 부족의 불균일 등 주요 장애물은, 신경 근육 질환에 대한 줄기 세포의 응용을 제한했다. 우리는 인간 배아 줄기 세포에 정의 된 요소의 자궁외 도입하여 이러한 한계를 극복하는 프로토콜을 디자인 한 - 근육의 결정 인자 MyoD 및 SWI / SNF 염색질 복잡한 구성 요소 BAF60C 리모델링 - 골격 근육 세포로 인간 배아 줄기 세포를 재 프로그램 할 수있다. 여기서 우리는 프로토콜의 hESC 파생 된 근원 세포를 생성하고 삼차원 적 소형화 구조 (myospheres)에 자신의 클러스터링을 촉진하기 위해 설립 설명하는 기능적 모방 소형 골격 근육 7 </sup&gt;.

도 1a는 프로토콜의 개략이 인간 배아 줄기 세포로부터 myospheres를 생성하는 것이 제안 나타낸다. (화살표로 표시)을 제어하는​​ 중요한 단계는 인간 배아 줄기 세포의 감염 효율 및 myospheres 내의 근육 조직의 변환이다. 우리의 실험에서 우리는 GFP의 형광을 전달하는 렌티 바이러스 벡터 인코딩 BAF60C 활용합니다. 우리는 일반적으로 BAF60C을 표현 인구 풍부하게 감염 후 BAF60C 및 FACS - 정렬 72 시간에 세포를 감염. 세포가 합류의 70 ~ 80 %에 도달 할 때, 우리는 MyoD의 렌티 바이러스에 감염. 처음 감염 후 일반적으로 그 합류에 도달하는 셀에 대한 2,​​ 3 일이 소요된다. 그림 1B는 감염되지 않은 인간 배아 줄기 세포에 배 유도 상대적으로 외래 유전자의 발현 수준을 보여줍니다. 그림 1C 도입 요인의 단백질 수준에서의 발현 및 분포를 보여줍니다. BAF60C<html> MyoD식이 MyoD 항체와 면역에 의해 감지되는 동안 식, GFP의 형광으로 표시됩니다. 우리는 우리가 EB 같은 집계에 감염된 인간 배아 줄기 세포의 분화를 시작하고 하루 일 0을 고려하십시오. DM 매체의 15 일 후, myospheres의 일부 (보통 전체가 아니라이)의 OCT 화합물 (12)에 내장과 근육 조직 변환 효율을 확인하기 위해 근육 조직 마커에 대한 면역을 수행하는 단면된다. 그림 1D는 오게 닌과 마이 오신 중쇄에 대한 대표적인 염색을 보여줍니다 최적의 근원 성 차별. Myospheres 아마도 작은 myospheres 함께 융합의 결과로, 또는 다른 특이한 형상을 가질 수있다. 10 일부터 시작, 그것은 (동영상 1, 2 참조) myospheres에 산발적 수축을 관찰 할 수있다. 43/51243fig1.jpg &quot;/&gt; 그림 1.) 인간 배아 줄기 세포. B에서 myospheres) BAF60C 및 MyoD (H9-BM) QRT-PCR에 의해 모니터링 및 배 유도로 표현에 감염된 인간 배아 줄기 세포에 외래 유전자의 mRNA 수준의 생성에 사용되는 프로토콜의 회로도 등 감염된 인간 배아 줄기 세포를 조롱에 비해 때문. D) 면역 형광이 오게 닌 스테인드 myosphere 섹션에서 수행 된 벡터의 IRES-GFP 요소 (MYOG에 MyoD 염색 (빨강) 및 BAF60C 형광 (녹색)를 표시 (H9-CTR). C) 면역 형광 이미지 ), 마이 오신 헤비 체인 (My​​HC) 및 DAPI에 대한 대조 (면역 형광 세부 정보를 볼 수 있습니다). 스케일 바는 100 μm의입니다. <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51243/51243fig2.jpg" /> 그림 2.의 다른 단계에서 세포 모양의 대표 사진분화 (2 부)에 감염 (파트 I)에서 프로토콜. 스케일 바는 100 μm의입니다. EB와 같은 구조 반면, D1에서 D5로 모양 (D)에 주로 원형이며, 그림 1A의 계획이 예상치 못한 형태를 제시하고 문화에 이질적인 따라 15 일 이상 성장 myospheres; E와 F의 두 가지 예를 참조하십시오.

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Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육.

성적인 프로그램을 다시 만들에 의해 인간 배아 줄기 세포에서 Myospheres의 생성

Generation of a homogeneous and abundant population of skeletal muscle cells from human embryonic stem cells (hESCs) is a requirement for cell-based ...

generation-of-myospheres-from-hescs-by-epigenetic-reprogramming

Research

JoVE Journal

Biology

7.7K 조회수.  Sanford-Burnham Institute for Medical Research.  여기서, 우리는 인간의 생물학적 기능을 다시 요약 관대 배양 조건 하에서 수축성 근섬유 (myospheres)의 입체 클러스터를 형성하는 골격 근육 원종의 균질 한 집단을 생성 향해 인간 배아 줄기 세포 (인간 배아 줄기 세포)의 후생 유전 학적 리 프로그래밍을 기반 프로토콜을 설명 골격 근육. 

비디오: Generation of Myospheres From hESCs by Epigenetic Reprogramming

From MEFs to Matrigel I: Passaging hESCs in the Presence of MEFs

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.


This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells. Part 1 of 3.

MEFs부터를 Matrigel하기 : MEFs의 면전에서 Passaging hESCs를

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells.
...

연구

생물학

From MEFs to Matrigel 2: Splitting hESCs from MEFs onto Matrigel

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF plates to feeder cell-free Matrigel plates.


This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 2 of 3.

Matrigel에 MEFs에서 분리 hESCs : MEFs에서 Matrigel 2

This video demonstrates how to grow human embryonic stem cells (hESCs) on mouse embryonic fibroblast (MEF) feeder cells, how to passage hESCs from MEF ...

From MEFs to Matrigel 3: Passaging hESCs from Matrigel onto Matrigel

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated.

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage hESCs in feeder cell-free conditions. Confirmation of hESC pluripotency grown in feeder cell-free conditions by immunofluorescence microscopy is also demonstrated. Part 3 of 3.

MEFs에서 Matrigel 3 : Matrigel에 Matrigel에서 Passaging hESCs

This video demonstrates how to maintain the growth of human embryonic stem cells (hESCs) in feeder cell-free conditions and how to continuously passage ...

Generation of Single-Cell Suspensions from Mouse Neural Tissue

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a repertoire of cell surface molecules, or molecular determinants, through which it can be identified and characterized. Currently, robust cell identification and separation technologies require single-cell preparations to be generated while simultaneously limiting cell death and destruction of characteristic surface protein. The gentleMACS Dissociator, when used in combination with trypsin or papain-based dissociation kits, can effectively and gently dissociate brain tissue while preserving antigen epitopes and limiting cell loss. Standardized preparation of single-cell suspensions is achieved using C Tubes and optimized, preset gentleMACS Programs. Once generated, single-cell suspensions can be treated with monoclonal conjugates like Anti-Prominin-1 MicroBeads, which identify neural progenitors, or purified further using Myelin Removal Beads.

Dissociating cells from specific tissue types requires specific parameters for tissue aggitation to obtain a high volume of viable, culturable cells. The Miltenyi gentleMACS Dissociator optimizes this task with a simple, practical protocol. In this publication the use of this apparatus on nerual tissue is explained.

마우스 신경 조직에서 단일 셀 Suspensions의 생성

Within the nervous system, hundreds of neuronal and glial cell types have been described. Each specific cell type in the brain or spinal cord has a ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Mouse Embryonic Fibroblasts with a Four Transcription Factor, Doxycycline Inducible Lentiviral Transduction System

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc, and Klf4 is capable of inducing pluripotency in mouse fibroblasts.1 Subsequent reports have demonstrated the utility of the doxycycline (DOX) inducible lentiviral delivery system for the generation of both primary and secondary iPS cells from a variety of other adult mouse somatic cell types.2,3
Induced pluripotent stem (iPS) cells are similar to embryonic stem (ES) cells in morphology, proliferation and ability to induce teratoma formation. Both types of cell can be used as the pluripotent starting material for the generation of differentiated cells or tissues in regenerative medicine.4-6 iPS cells also have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming mouse embryonic fibroblast (MEF) cells with the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set. We also demonstrate that the Stemgent DOX Inducible Mouse TF Lentivirus Set is capable of expressing each of the four transcription factors upon transduction into MEFs thereby inducing a pluripotent stem cell state that displays the pluripotency markers characteristic of ES cells.

The Stemgent Dox Inducible Mouse TF Lentivirus Set can reprogram mouse embryonic fibroblasts (MEFs) to induced pluripotent stem (iPS) cells. Here we demonstrate the protocol for DOX-inducible expression of mouse reprogramming transcription factors Oct4, Sox2, Klf4 and c-Myc to generate iPS colonies that express common mES pluripotency markers.

4 전사 인자와 마우스 배아 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성, Doxycycline는 Lentiviral 전달 시스템 Inducible

Using a defined set of transcription factors and cell culture conditions, Yamanaka and colleagues demonstrated that retrovirus-mediated delivery and ...

Generation of Induced Pluripotent Stem Cells by Reprogramming Human Fibroblasts with the Stemgent Human TF Lentivirus Set

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing the pluripotent state in mouse fibroblasts.1 The same group also reported the successful reprogramming of human somatic cells into induced pluripotent stem (iPS) cells using human versions of the same transcription factors delivered by retroviral vectors.2 Additionally, James Thomson et al. reported that the lentivirus-mediated co-expression of another set of factors (Oct4, Sox2, Nanog and Lin28) was capable of reprogramming human somatic cells into iPS cells.3
iPS cells are similar to ES cells in morphology, proliferation and the ability to differentiate into all tissue types of the body. Human iPS cells have a distinct advantage over ES cells as they exhibit key properties of ES cells without the ethical dilemma of embryo destruction. The generation of patient-specific iPS cells circumvents an important roadblock to personalized regenerative medicine therapies by eliminating the potential for immune rejection of non-autologous transplanted cells.
Here we demonstrate the protocol for reprogramming human fibroblast cells using the Stemgent Human TF Lentivirus Set. We also show that cells reprogrammed with this set begin to show iPS morphology four days post-transduction. Using the Stemolecule Y27632, we selected for iPS cells and observed correct morphology after three sequential rounds of colony picking and passaging. We also demonstrate that after reprogramming cells displayed the pluripotency marker AP, surface markers TRA-1-81, TRA-1-60, SSEA-4, and SSEA-3, and nuclear markers Oct4, Sox2 and Nanog.

We demonstrate the protocol for the generation of induced pluripotent stem cells from human somatic cells using lentivirus-mediated delivery of the human factors Oct4, Sox2, Nanog, and Lin28. Pluripotency was confirmed by morphology and the presence of embryonic stem (ES) cell-specific markers.

Stemgent 인간 TF의 Lentivirus와 인간의 섬유아 세포를 프로그래밍하여 유도 Pluripotent 줄기 세포의 생성 세트

In 2006, Yamanaka and colleagues first demonstrated that retrovirus-mediated delivery and expression of Oct4, Sox2, c-Myc and Klf4 is capable of inducing ...

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid generation time and short life span, easy and inexpensive maintenance, fully sequenced genome, and array of RNAi resources and mutant animals. Additionally, analysis of the C. elegans genome revealed a great similarity between worms and higher vertebrates, which suggests that research in worms could be an important adjunct to studies performed in whole mice or cultured cells. A powerful and important part of worm research is the ability to use transgenic animals to study gene localization and function. Transgenic animals can be created either via microinjection of the worm germline or through the use of biolistic bombardment. Bombardment is a newer technique and is less familiar to a number of labs. Here we describe a simple protocol to generate transgenic worms by biolistic bombardment with gold particles using the Bio-Rad PDS-1000 system. Compared with DNA microinjection into hermaphrodite germline, this protocol has the advantage of not requiring special skills from the operator with regards to identifying worm anatomy or performing microinjection. Further multiple transgenic lines are usually obtained from a single bombardment. Also in contrast to microinjection, biolistic bombardment produces transgenic animals with both extrachromosomal arrays and integrated transgenes. The ability to obtain integrated transgenic lines can avoid the use of mutagenic protocols to integrate foreign DNA. In conclusion, biolistic bombardment can be an attractive method for the generation of transgenic animals, especially for investigators not interested in investing the time and effort needed to become skilled at microinjection.

Generation of Transgenic C. elegans by Biolistic Transformation

Transgenic worms are commonly used in C. elegans research. Described is a simple, yet effective, protocol to introduce transgenes into worms using biolistic bombardment with DNA-coated gold particles. The effort involved and results of bombardment compare favorably with microinjection for the generation of transgenic animals.

트렌스 제닉의 생성 C. 엘레간스 Biolistic 변환에 의해

The number of laboratories using the free living nematode C. elegans is rapidly growing. The popularity of this biological model is attributed to a rapid ...

DNA Extraction from Paraffin Embedded Material for Genetic and Epigenetic Analyses

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number gains and losses and DNA methylation. Advances in high-throughput, genome-wide profiling technologies, such as microarrays, have significantly improved our ability to identify and detect these specific alterations. However as technology continues to improve, a limiting factor remains sample quality and availability. Furthermore, follow-up clinical information and disease outcome are often collected years after the initial specimen collection. Specimens, typically formalin-fixed and paraffin embedded (FFPE), are stored in hospital archives for years to decades. DNA can be efficiently and effectively recovered from paraffin-embedded specimens if the appropriate method of extraction is applied. High quality DNA extracted from properly preserved and stored specimens can support quantitative assays for comparisons of normal and diseased tissues and generation of genetic and epigenetic signatures 1. To extract DNA from paraffin-embedded samples, tissue cores or microdissected tissue are subjected to xylene treatment, which dissolves the paraffin from the tissue, and then rehydrated using a series of ethanol washes. Proteins and harmful enzymes such as nucleases are subsequently digested by proteinase K. The addition of lysis buffer, which contains denaturing agents such as sodium dodecyl sulfate (SDS), facilitates digestion 2. Nucleic acids are purified from the tissue lysate using buffer-saturated phenol and high speed centrifugation which generates a biphasic solution. DNA and RNA remain in the upper aqueous phase, while proteins, lipids and polysaccharides are sequestered in the inter- and organic-phases respectively. Retention of the aqueous phase and repeated phenol extractions generates a clean sample. Following phenol extractions, RNase A is added to eliminate contaminating RNA. Additional phenol extractions following incubation with RNase A are used to remove any remaining enzyme. The addition of sodium acetate and isopropanol precipitates DNA, and high speed centrifugation is used to pellet the DNA and facilitate isopropanol removal. Excess salts carried over from precipitation can interfere with subsequent enzymatic assays, but can be removed from the DNA by washing with 70% ethanol, followed by centrifugation to re-pellet the DNA 3. DNA is re-suspended in distilled water or the buffer of choice, quantified and stored at -20&deg;C. Purified DNA can subsequently be used in downstream applications which include, but are not limited to, PCR, array comparative genomic hybridization 4 (array CGH), methylated DNA Immunoprecipitation (MeDIP) and sequencing, allowing for an integrative analysis of tissue/tumor samples.

This video demonstrates the protocol for DNA extraction from formalin-fixed paraffin-embedded material. This is a multi-day procedure in which tissue sections are deparaffinized with xylene, rehydrated with ethanol and treated with proteinase K to purify and isolate DNA for subsequent gene-specific or genome-wide analysis.

유전과 Epigenetic 분석을위한 파라핀 임베디드 재료에서 DNA 추출

Disease development and progression are characterized by frequent genetic and epigenetic aberrations including chromosomal rearrangements, copy number ...

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors are offering new opportunities for regenerative medicine. Such clinical applications of iPS cells have been limited so far, mainly due to the poor efficiency of the existing reprogramming methodologies and the risk of the generated iPS cells to form tumors upon implantation.
We hypothesized that the reprogramming of somatic cells towards pluripotency could be achieved in vivo by gene transfer of reprogramming factors. In order to efficiently reprogram cells in vivo, high levels of the Yamanaka (OKSM) transcription factors need to be expressed at the target tissue. This can be achieved by using different viral or nonviral gene vectors depending on the target tissue. In this particular study, hydrodynamic tail-vein (HTV) injection of plasmid DNA was used to deliver the OKSM factors to mouse hepatocytes. This provided proof-of-evidence of in vivo reprogramming of adult, somatic cells towards a pluripotent state with high efficiency and fast kinetics. Furthermore no tumor or teratoma formation was observed in situ.
It can be concluded that reprogramming somatic cells in vivo may offer a potential approach to induce enhanced pluripotency rapidly, efficiently, and safely compared to in vitro performed protocols and can be applied to different tissue types in the future.

In vivo Reprogramming of Adult Somatic Cells to Pluripotency by Overexpression of Yamanaka Factors

This study demonstrates the reprogramming of somatic cells towards pluripotency in vivo without the generation of teratomas. We used hydrodynamic tail vein injection of plasmid DNA encoding the Yamanka factors to induce the in vivo reprogramming of adult hepatocytes into cells of enhanced pluripotency.

야마나카 인자의 과발현에 의해 능성에 성인 체세포 세포의 생체 내 재 프로그램

Induced pluripotent stem (iPS) cells that result from the reprogramming of somatic cells to a pluripotent state by forced expression of defined factors ...

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

As a member of the phylum Cnidaria, the sister group to all bilaterians, Hydra can shed light on fundamental biological processes shared among multicellular animals. Hydra is used as a model for the study of regeneration, pattern formation, and stem cells. However, research efforts have been hampered by lack of a reliable method for gene perturbations to study molecular function. The development of transgenic methods has revitalized the study of Hydra biology1. Transgenic Hydra allow for the tracking of live cells, sorting to yield pure cell populations for biochemical analysis, manipulation of gene function by knockdown and over-expression, and analysis of promoter function. Plasmid DNA injected into early stage embryos randomly integrates into the genome early in development. This results in hatchlings that express transgenes in patches of tissue in one or more of the three lineages (ectodermal epithelial, endodermal epithelial, or interstitial). The success rate of obtaining a hatchling with transgenic tissue is between 10% and 20%. Asexual propagation of the transgenic hatchling is used to establish a uniformly transgenic line in a particular lineage. Generating transgenic Hydra is surprisingly simple and robust, and here we describe a protocol that can be easily implemented at low cost.

Generation of Transgenic Hydra by Embryo Microinjection

Stably transgenic Hydra are made by microinjection of plasmid DNA into embryos followed by random genomic integration and asexual propagation to establish a uniform line. Transgenic Hydra are used to track cell movements, overexpress genes, study promoter function, or knock down gene expression using RNAi.