אנו מודים לג Højer לקריאה ביקורתית של כתב היד, ב &#39;ינגול (Genentech) להשתתפות בקריינות תסריט, נ&#39; ביין-Ly על שיתוף החוויה של הדמיה כלי דם משופרת עם הזרקה לוריד זנב של צבע לקטינים, ו-M Solloway (Genentech ) לעכברים משמשים בהדמיה לבלב. שורת ה-GFP-M נוצרה על ידי ג &#39;יי סאנס (אוניברסיטת וושינגטון בסנט לואיס) ועכברי CX3CR1-GFP על ידי ר&#39; ליטמן (NYU). העבודה נתמכת על ידי Genentech, Inc

כל הניסויים בבעלי החיים בוצעו בהתאם לתקנות IACUC (הוועדה מוסדית טיפול בבעלי חיים ושימוש) על עכברים ~ ישנים 3-5 חודשים. המחבר מצהיר שום אינטרסים כלכליים מתחרים. 1. בעלי החיים זלוף והכנת רקמה עיתוי: 30-60 דקות לכל עכבר + לפרסם קיבעון-(כמה שעות עד לילה). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשקול את בעלי החיים ולהרדים באמצעות קטמין (80-200 מ&quot;ג / קילוגרם) ו xylazine (7-20 מ&quot;ג / קילוגרם) או Avertin 2.5% (0.5 משקל גוף ml/25 g-IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן מספר דקות להרדמה ייכנס לתוקף מלא. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לצבוט את הבוהן והזנב של בעלי החיים על מנת לוודא כי בעל החיים הוא בהרדמה מלאה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Perfuse החיה הראשון ב RT עם 0.1 M פוספט חוצץ (PB) או 0.1 M פוספט הצפת מלוח (PBS) עבור 5-10 דקות עד הדם נמחק לחלוטין מהרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור זלוף לפתרון מקבע: PFA 4% ב 0.1 M PB (או 0.1 M PBS) ולהמשיך זלוףעם PFA 4% עבור 30-40 דק &#39;במהירות של 3 מיליליטר / דקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לנתח את האיבר / s של עניין בזהירות מבלי לפגוע, למשל, להימנע מניקוב ולסחוט את הרקמות שנמצא בגזורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הרקמה נוספת המקיפה את האיברים (רקמת חיבור, קרומי המוח או עניין הדורה) בצלחת פטרי מלאה PBS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוסט לתקן את האיברים PFA 4% במשך כמה שעות או הלילה ב 4 º C. הימנע הודעה קיבעון ארוך בגלל PFA עלול להרוות את האות או להגדיל את שעות נוספות autofluorecense 10 במיוחד עבור ערוץ ה-GFP (אשר מהווה בעיה פחותה בערוצים אדומים אדומים וכה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף את האיברים 2-3x עם PBS ב RT ממש לפני שמתחיל את הליך הסליקה. </li></ol> 2. סליקת רקמות עיתוי: 2-3 שעות לאיברים קטנים ו1-4 ימים לאיברים גדולים. הערות: ניאון התיוג של הרקמות על ידי ביטוי transgene, transfection הנגיפי, התחקות צבע או אנטיתיוג הגוף אמור להסתיים לפני ניקוי. כל צעדי סליקת הרקמה מבוצעים ב RT. פתרונות הסליקה THF, DBE, באב (בנזיל אלכוהול חלק 1 ותכשיר 2 חלק) וdichloromethane הם רעילים ושאיפה יש להימנע (ניסויי התנהגות במנדף מאוורר כראוי) ומגע ישיר עם עור (כפפות nitrile שימוש). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן 50% (כרך / כרך), 70%, ודילולי THF 80% במים מזוקקים בבקבוקי זכוכית נפרדים כדלקמן: לTHF 50%, למשל, לערבב 25 THF מיליליטר ו25 מיליליטר של מים מזוקקים בבקבוק זכוכית עם נפח של גדול מ50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים בעדינות על ידי פתרונות רועדים את הבקבוק לדקות 1-2. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תווית בקבוק הזכוכית בצורה ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לסגור את הבקבוקים ולשמור על פתרונות העבודה בארון חשוך. לקבלת התוצאות הטובות ביותר, אל תשתמשו בפתרוני עבודה באותו זמן רב יותר מאשר 1-2 שבועות. לכן, להורות על פתרונות הסליקה כמו הנפח הקטן ביותר העומד לרשות להיות ריאגנטים המניה טריים שימוש מסוגל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">למלא את צלוחיות זכוכית (למשל, מיליליטר 2-3) עם פתרון הסליקה הראשון, 50% THF, ולהעביר את האיברים מPBS לתוך צלוחיות זכוכית להתחיל סליקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מאובטח לסגור את צלוחיות זכוכית עם המכסים שלהם ולהשתמש מסובב (למשל, stirrer גלגל) לערבוב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בנייר אלומיניום כדי לכסות ולשמור על צלוחיות זכוכית בחושך. התחל המסובב לעורר דגימות בצלוחיות הזכוכית לזמן המצוין (טבלת 1) במהירות קבועה (~ 30V סל&quot;ד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את פתרון הסליקה ולהוסיף את הבאה בפרוטוקול כאשר הזמן בטבלה 1 הושלם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את פסולת הסליקה לתוך מכולות פסולת זכוכית שנשמרות במכסת מנוע. חזור על שלב קודם עבור כל פתרון סליקה בפרוטוקול ועד הסוף. השתמש פיפטה פסטר חדשה כאשר פתרון סליקה חדש נוסף (למשל, שינוי מTHF לDBE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בשלב הסליקה הסופי עם באב או DBE, ניתן להאריך פעמים הדגירה או shortened עד הדגימות להיות שקופות לחלוטין באור הנראה (או צהבהבים / שקופה אם זה הוא רקמה גדולה מאוד כמו מוח). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור את האיברים פינו בפתרון הסליקה הסופי בכל העת, כולל צעדי ההדמיה. </li></ol> 3. הכנת איברים הותרו להדמיה עיתוי: 5-15 דקות. הערה: תמונת האיברים פינו בהקדם סליקה מלאה מושגת. לשם כך, בצע את השלבים הבאים כדי להכין את הדגימות במיקרוסקופ אור גיליון (למשל, Ultramicroscopy) או הדמיה מיקרוסקופיה confocal / רב פוטון. הערה: איברים כחכחו יהיו רופפים כוח פלואורסצנטי שלהם לאורך זמן (במיוחד חלבוני ניאון למשל, GFP, תיוג נוגדן הוא עמיד יותר ואולי אפילו לתת תוצאות טובות יותר עם ​​incubations יותר). עבור הדמיה, ניתן להשתמש בם כל עוד טכניקות מיקרוסקופ פלואורסצנטי שונות כמו טיפול נאות של האיברים בקליאהפתרון טבעת מושגת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופ אור גיליון <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקום או הר המדגם כראוי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תקן את האיבר פונו על ידי סיבוב הבורג של בעל מדגם 4 באופן ידני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טובלים את הדגימה לחדר ההדמיה (רצוי מזכוכית) של מיקרוסקופ thelight גיליון כי הוא מלא באב או DBE, מה שיהיה בשימוש בצעד הסליקה הסופי. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למיקרוסקופיה פוטון / confocal הרב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הר את המדגם על שקופיות הדמיה (או חדר הדמיה) עם פתרון ההדמיה הסופי כדי להיות מסוגל תמונה עם פוטון רב או confocal, אשר משתמשים בשמן או מטרות מים שקועים בדרך כלל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בדבק דנטלי כדי להפוך את גבול מסביב לרקמות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למלא את הבריכה עם באב או DBE ממש לפני מלט שיניים מקבל נוקשה באופן מלא. הערה: מלט השיניים מתמצק במהירות; לתרגל כמה פעמים כדי להכיר אותו לפני שאתה מנסה את הדגימות בפועל. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מייד למקוםהמדגם פינה באמצע הבריכה ולכסות אותו עם כיסוי זכוכית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על מכסה הזכוכית עד שהוא אטום לחלוטין על ידי מלט שיניים ונוגע על פני השטח של האיבר מסומן, אשר יאפשר להגיע לעומק המרבי הדמיה על ידי מיקרוסקופית רב פוטון / confocal. הערות: הדבר מבטיח כי אין פתרון סליקה יישפך במהלך ההדמיה. הימנע מטבילת עדשת ההדמיה ישירות לתוך פתרון סליקה, אשר יכולה לפגוע בעדשה, אלא אם כן הוא עמיד בפני באב / DBE או שיש כיסוי מגן. </li></ol></li></ol> איברים 4. הדמיה כחכחו עיתוי: 15-45 דקות. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף Z-סריקה מכסה את הרקמה כולה פינתה (אם העדשה בשימוש מאפשרת) ברזולוציה הטובה ביותר שיכול לספק המיקרוסקופ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קרב על האזורים של עניין כדי לאסוף תמונות ברזולוציה גבוהות יותר. </li></ol> 5. בחינה של נתונים עם תוכנת עמירה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> טען את תמונת סרייהשל תוכנת עמירה עם מודול ResolveRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזן את גדלי voxel הנכונים בחלון &quot;תמונה קראו פרמטר&quot; ולחץ על אישור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר &quot;Multi פלנר תצוגה&quot; תת היישום. לאחר מכן השתמשתי במחוון &quot;עובי&quot; כדי לבחור את הסף האופטימלי לערכים האפורים, התאמת ערכי 2D and 3D. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין את המדגם על ידי גלישה בפרוסות באורינטציות 2D שונות ובאמצעות מודול יבול פינה בתצוגת 3D. הערה: ניתן למצוא מדריך לפתרון בעיות מפורט בפרוטוקול באל Ertürk et 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Tuchin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nat Med. 18, 166-171 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Erturk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+(3DISCO).">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ome+sweet+ome:+what+can+the+genome+tell+us+about+the+connectome.">Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).</li><li>Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+peripheral+corneal+clarity+after+surgical+trauma+in+patients+with+Avellino+corneal+dystrophy.">Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy.</a> Cornea. 25, 497-498 (2006).</li><li>Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bond+strength+and+debonding+characteristics+of+a+new+ceramic+bracket.">Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket.</a> American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).</li><li>Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegenerative+disease.">Microglia in neurodegenerative disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).</li><li>Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Disease:+astrocytes+in+neurodegenerative+disease.+Nature+clinical+practice.">Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice.</a> Neurology. 2, 679-689 (2006).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy.">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pr&#228;paraten. , (1903).</li><li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroinflammatory+response+in+humans+after+traumatic+brain+injury.">The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).</li><li>Zotova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+alterations+in+human+Alzheimer's+disease+following+Abeta42+immunization.">Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).</li><li>Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+cochlear+implantation+in+Friedreich's+ataxia:+A+case+study.">Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study.</a> Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury.">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li><li>Soderblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+fibroblasts+form+the+fibrotic+scar+after+contusive+spinal+cord+injury.">Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury.</a> J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6, 131-133 (2009).</li></ol>

אין מה לחשוף.

שיטות ניקוי רקמות מטרתם להפחית את הפיזור של ההדמיה אור על ידי מדדי השבירה של שכבות רקמה שונות המתאימות באיברים מסומן. כתוצאה מכך, אור ההדמיה יכול לחדור עמוק לתוך רקמות ולגרות את התאים / מולקולות שכותרתו. הרעיון הישן הזה של רקמת ניקוי 17 זכה לתשומת לב הולך וגדל לאחר היישום הראשון המתוחכם של הטכניקה על מוח עכבר בשלמות על ידי Dodt ועמיתים 2. מאז, יש רשימה הולכת וגדלה במהירות של שיטות סליקה חדשות כולל 3DISCO, SCA / דואר, ClearT2, בהירות וSeeDB 3,4,7,18-20. בעיקרו של הדבר, כל מה שהם שואפים להפוך את האיברים שקופים להדמית רקמות עמוקה על ידי שמירה על תווית הניאון. ביניהם, 3DISCO בולט כאחת השיטות פשוטות ולשעתק ביותר. זה לעומת מהיר יחסית לשיטות אחרות סליקה שהוזכרו לעיל (1-5 ימים לעומת 2-3 שבועות למוחות בוגרים, בהתאמה) 21. זה כבר היה הצלחהמיושם באופן מלא לאיברים שונים כגון המוח, חוט השדרה, בלוטות לימפה, טחול, ריאות, גידולים מוצקים, לבלב, ובלוטות החלב 3,4,9. בנוסף, מספר פרסומים על ידי קבוצות מחקר עצמאיות שכבר השתמשו בשיטה זו כדי להשיג תוצאות ההדמיה 22,23. עם זאת, נהלי סליקת רקמות שונים יכולים להיות יתרון עבור תנאים שונים. לדוגמא, בעוד SCA / דואר וSeeDB חלים הטובים ביותר על רקמות עוברי 6,7, הם שיטות סליקה על בסיס מים, שיכול להיות קל יותר לטפל במהלך הדמיה. לעומת זאת, בהירות היא שיטת סליקה מסובכת ויקרה. אבל זה יכול להיות יתרון בהקשר של תיוג נוגדן, בעיקר ברקמות גדולות כגון מוח 8. השלב הקריטי ביותר כדי להשיג את התוצאות הטובות ביותר מהדמית 3DISCO הוא תיוג רקמות, שנעשה לפני סליקת הרקמות. זה חיוני כדי להתחיל עם אות הניאון החזקה ביותר האפשרית. זה יכול bדואר שהושג בדרכים שונות, כולל ביטוי מהונדס של חלבוני ניאון, התחקות על ידי צבעים סינטטיים, transfection הנגיפי או תיוג נוגדן. יש לזכור כי כל הליך סליקה יפחית את אות הניאון של הרקמות. לפיכך, אם אות הניאון היא לא מספיק חזקה בהתחלה - כלומר הוא לא ניתן לגילוי בקלות לפני הסליקה ההדמיה של הרקמות פינו יספק תוצאות עניות. ישנן מספר מגבלות סליקת שיטות שמחכות לשיפורים. מגבלה קריטית היא שמאז ריאגנטים סליקה לשנות את המבנה של האיברים התפזרו, הם לא יכולים לשמש ברקמה חי. לפיכך, יש לבצע ניסויים כגון עם mEos2 photoactivatable 24 לפני תיקון והסליקה. על הסליקה, הדמיה ברזולוציה סופר של אות הניאון מחלבונים בהירים וphotostable הופכת לאפשרית. בנוסף, בגלל פרוטוקול הסליקה פוחתאינטנסיביות של חלבוני הניאון, לא ניתן לאחסן האיברים פינו לתקופות ממושכות. חשוב לציין כי חלק מהאיברים הם יותר קשים להיות מסומנות. במיוחד, אם האיברים גזורים לשמור על כמויות גבוהות של תאי דם (למשל, טחול, כבד), שהם קשים יחסית כדי לנקות ותמונה. זה גם יחסית קשה יותר להשגת סליקה מלאה לרקמות גדולות, כגון מוח מכרסם מבוגר. רקמות כגון ייתכן שתצטרכנה פעמים דגירה ארוכות יותר, אשר יכולה, מצד שני, להפחית את אות הניאון. בנוסף, פיתוח של שיטות מיקרוסקופית שיכול איברים גדולים ושקופים תמונה בבת אחת ברזולוציה גבוהה הוא צורך מחכה שיפנו אליו. מגבלה נוספת חשובה של הטכניקה היא תיוג רקמות. בעוד אות ניאון חזקה באמצעות ביטוי גנטי או וירוס היא אידיאלית, לא בכל תא או מולקולה יכול להיות מתויג גנטי או באופן ויראלי. מצד השני, תיוג נוגדן של רקמות עבות הוא לא הליך פשוט או אפילו לא פוssible ברוב המקרים. זה אולי צריך פרוטוקולי permeabilization מיוחדים וזמני דגירה ארוכה (מספר ימים עד מספר שבועות) 3. כמו כן, חשוב לזכור כי הרקמות להתכווץ ~ 20% בכל ממד (נמדד לרקמת חוט השדרה) לאחר ניקוי בעיקר עקב התייבשות וdelipidation. הצטמקות זו מתרחשת ratiometrically וצריכה להיות מתוקנת בצעדי כימות. כפי שנצפה בתוצאות שהוצגו, המבנים שכותרתו fluorescently נותרו על כנן, המהווה את אינדיקציה לתקינות חלבון ברקמות מסומנות. בגלל האופי ההידרופובי של הרקמה פינתה הסופית, זה לא יכול להיות מוכתם נוסף עם נוגדנים או מוטבע בפתרונות מים המכילים למשל, Focusclear-המשמש בגליצרול CLARITY-או 80%. לבסוף, זה אתגר לנתח גדלים מכריעות של נתוני הדמיה. לדוגמא, כאשר המוח עכברי כולו נסרק ברזולוציה סלולרית, זה יהיה קשה מאוד להתחקות אחר ולכמת str הרצויuctures (למשל, עצבי או רשתות גליה) ולהשוות על מדגמים שונים באופן אוטומטי. לסיכום, בעוד שחוקרים שואפים לגלות שיטות סליקה חדשות, האתגרים השונים לעיל (קושי בניקוי רקמות מגוונות, הדמיה ברזולוציה גבוהה של אזורים גדולים יותר, וניתוח נתונים מסובך) יש לשפר במקביל. לסיכום, טכניקות ניקוי רקמות שפותחו לאחרונה, כולל 3DISCO, אלגנטיות להוכיח כי 3D הדמיה ברזולוציה גבוהה של איברים שלמים עכשיו זה אפשרי. שימוש בשיטות אלה, מדענים יכולים להשיג מידע האנטומי של תאים ומולקולות באיבר שלם. מחקרי אלה חלוצי 3D הדמיה על איברים שקופים לעורר מספר גדל והולך של חוקרים לפענח אנטומי מורכבות וארגונים מולקולריים של רקמות / איברים בהית ומחלות.

הבדיקה היסטולוגית של רקמות ביולוגיות היא גישה בסיסית בהבנת טבעו של מולקולות / תאים בהקשר הטבעי שלהם. באופן אידיאלי, הדמיה ברזולוציה גבוהה של כל האיבר היא אינפורמטיבי ורצוי ביותר. מכיוון שהאור יש לו עומק חדירה מוגבל, בשל פיזור 1, איברים קבועים צריכים להיות מחולקים על מנת לבצע הדמיה מיקרוסקופית ברזולוציה גבוהה. לפיכך, רוב מחקרי היסטולוגיה מבוצעים על סעיפי רקמות כמה שמייצגים רק חלק קטן מהאיבר. בחלק מהמחקרים, למשל, אלה במטרה לאתר את קשרים עצביים במוח או בחוט השדרה, כל חלקי הרקמות מאברי המטרה נאספים וצלמו לשחזור 3D. עם זאת, יש חתך רקמות וההדמיה הבאה של קטעים בודדים מגבלות שונות. אלה כוללים זמן להיות רב ומובילים לשחזור 3D לא מושלם של הרקמה, עקב עיוותים מכאניות וקשהies ביישור של התמונות שהתקבלו. לאחרונה, איברים שקופים ללא פגע סליקה וההדמיה פותחו כפתרון משמעותי לזה חסרון 2,3. עם הקרחת, כל האיבר הוא שניתנו שקוף המאפשרים את אור ההדמיה לנסוע מקצה לקצה (איור 1) כדי להפיק תמונות ברזולוציה גבוהה של איבר unsectioned באמצעות מיקרוסקופ סריקת לייזר כגון מיקרוסקופ או פוטון אור גיליון רב ( איור 2). קבוצות מחקר שונות פיתחו פרוטוקולי סליקת רקמה חדשים כדי להיות מסוגל תמונת רקמת עניין שלהם למטרות שונות. אלה כוללים ממס אורגני 2-5, 6,7 המים ואלקטרופורזה 8 פרוטוקולי סליקה מבוסס. ביניהם, הדמיה 3 ממדים של ממס פינתה איברים או 3DISCO הוא פרוטוקול ישים בקלות על מגוון רחב של דגימות ביולוגיות, כולל מערכת עצבים מרכזית איברים (CNS), איברים חיסוניים וגידולים מוצקים. בadditיון, ניתן לשלב אותו עם שיטות מיקרוסקופיה שונות כגון מיקרוסקופ אור גיליון הקרינה (LSFM), פוטון רב ומיקרוסקופי סריקת לייזר confocal. 3DISCO מבוסס על ניקוי עם חומרים כימיים זמינים ולא יקרים כגון tetrahydrofuran (THF) ואתר dibenzyl (DBE) 4. כל הפרוטוקול יכול לקחת קצר ככל 3-4 שעות. לפיכך, 3DISCO היא טכניקה חזקה ומהירה בהשוואה לשיטות מסורתיות היסטולוגית שעשויים להימשך שבועות עד חודשים כדי להשלים 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:201px;">Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:291px;">can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CX3CR1 GFP mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Littman lab at NYU</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td>(Mallinckrodt, 7892-04)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-2-2 Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">152463</td>
			<td>used to prepare Avertin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>186562-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270997-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dibenzyl ether&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma, 108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin FITC&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0401-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CC10</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9772</td>
			<td align="right">0.388888889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;</td>
			<td>APP pharmaceuticals&#160;</td>
			<td align="right">504001</td>
			<td>used in perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Rotator&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100498-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mL Media Storage Bottles</td>
			<td>Kimax Media Bottles</td>
			<td>EW-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Minipuls evolution perfusion pump&#160; with MF4* medium flow pump head&#160;</td>
			<td>Gilson, Inc</td>
			<td>F110701 and F117606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastWell</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>FW20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2940-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish&#160;</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dental cement&#160;</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1223PNK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Quantofix Peroxide Test Strips</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">37206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:201px;">Amira with RT resolve microscopy module 
			&#160;</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:201px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH</td>
			<td>freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

הנוירונים מקוטבים מאוד תאים עם מורפולוגיה ארוכה מאוד. הפונקציה שלהם תלויה בקשרים שהם יוצרים בין אחד לשני ועם רקמות אחרות. לפיכך, מיפוי המבנה הארגוני של נוירונים הוא מאוד חשוב על מנת להבין איך הם מתפקדים בבריאות ובחוליים. עם זאת, התחקות קשרים עצביים עצומים כאלה ברחבי connectomics כל העצבים בשם מערכת לאחרונה 11 - עדיין נשארת אחד האתגרים הקשים ביותר במדעי המוח. לשם כך, גם באיחוד האירופי 12 ו13 ארה&quot;ב יזמו פרויקטים גדולים למפה המוח האנושי. בעוד 3DISCO יכול להיות מועסק על איברים שונים, זה כבר שימושי במיוחד כדי לעקוב אחר קשרים עצביים ארוכים בחוט השדרה והמוח. לדוגמא, באמצעות סריקות Ultramicroscopy של מגזרי חוט השדרה פינו גדולים, ניתן בעקבות קשרי אקסון מעל סנטימטרים בחוט השדרה של המכרסמים (איור 2). באופן דומה, המוח כולו פינה העכבר (איור 3 א) וההיפוקמפוס (3 ב איור) ניתן הדמיה לעקוב קשרים עצביים במוח. כאשר פוטון מיקרוסקופיה confocal או רב משמשת באיברים מסומן, ההדמיה ברזולוציה ניתן לשפר באופן משמעותי, במיוחד בZ-ממד. לדוגמא, הדמיה פוטון רב של מיתרי השדרה פינו מעכברי ה-GFP-M קו (איור 4 א) משיגה תמונה חלקה לאורך כל העומק (~ 1.5-2 מ&quot;מ) של חוט השדרה. microcopy confocal על חוט השדרה פינה מספק רזולוציה משופרת באופן דומה (4 ב דמויות וג). הדמיה מיקרוסקופית פוטונים רב של מוח פינה מספקת תמונות ברזולוציה גבוהה מאוד כדי להמחיש פרטים קטנים של מבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (איור 5). הדגימות ל3DISCO יכולות להיות מתויגות בדרכים שונות, כולל ביטוי transgene, virtransfection אל, התחקות צבע וסימון נוגדן. לדוגמא, ניתן לתייג את כל כלי הדם במוח (6 א דמויות וב) וחוט השדרה (6 ג דמויות וד) באמצעות קליעים נותבים ניאון קטינים מצומדת 4, אשר יכול לשמש כדי לחקור דם למוח, המחסום (BBB ) בבריאות ובחוליים. מיקרוגליה והאסטרוציטים שניהם מעורבים מאוד בפתולוגיה של ניוון מוחיים כולל המחלות אלצהיימר ופציעות טראומטיות 14,15. שימוש 3DISCO, ניתן ללמוד בצפיפות וההפצה בחוט השדרה (איור 7) או במוח שלהם. יכולות גם להיות צילמו רקמות שאינן עצביות. לדוגמא, תאי קלרה הריאות מכרסמים כל ניתן immunolabeled עם נוגדנים וצלמו ללא חתך ברמת תא בודדת (איור 8). באופן דומה, אפשר לנקות ותאי תמונה למשלתאי אלפא ברקמת לבלב unsectioned (איור 9). <img alt="איור 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> איור 1. סליקת רקמת 3DISCO הופכת רקמות unsectioned שקופות להדמית רקמות עמוקה. (ב) רקמות חוט השדרה בערפול (א) ופינו כפי שניתן לראות באור הנראה. על הסליקה, מיקרוסקופית סריקת לייזר רקמות עמוקות הופך לאפשרי. (ג) רקמות חוט השדרה בערפול ופינו היו הדמיה על ידי מיקרוסקופ 2 פוטונים. סולם ברים ב, b = 0.5 מ&quot;מ ובc = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> איור 2. ההדמיה 3DISCO של חוט השדרה לעקוב סיומות אקסון. חוט השדרה גזור מן השורה Thy-1 מהונדס GFP עכבר (GFP-M) מחולק לחתיכות קטנות יותר (~4 מ&quot;מ). לאחר ביצוע פרוטוקול סליקה לרקמות קטנות (טבלה 1) מיתרי השדרה השקופים היו דמיינו באמצעות Ultramicroscopy. שחזורי 3D של קטע עמוד השדרה ~ 4 מ&quot;מ אופקי (א), העטרה (ב) והשקפת sagittal (ג). (ד) נציג לייחס אקסונים (אדום) מוצגים בתצוגה שקופה בגווני אפור. (ה) צפה בהגדלה גבוהה של האזור שצוין ב( ד). סולם ברים בA, B, C, D = 0.5 מ&quot;מ ובדואר = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> איור 3. ההדמיה 3DISCO של מוח וההיפוקמפוס פינה. דוגמאות של מוח והיפוקמפוס של עכברי ה-GFP-M פינה הם צילמו עם אולטרה. פריטים חזותיים 3D של המוח כולו () וההיפוקמפוס (ב) הוכחת netwo העצביRKS ברקמות שקופות הדמיה. סולם ברים ב= 2 מ&quot;מ ובb = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> איור 4. סליקת רקמות משפרת את הרזולוציה המתקבלת על ידי פוטונים רב ומיקרוסקופיה confocal. מגזרי חוט השדרה שקופים מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב (א) או confocal (ב, ג). שים לב שהניקוי באופן משמעותי משפר את הרזולוציה ועומק הדמיה חושף את המבנה העדין של אקסונים ודנדריטים. סולם ברים ב= 100 מיקרומטר ובb, c = 20 מיקרומטר. <img alt="איור 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> איור 5. ההדמיה 3DISCO של קוצים הדנדריטים. רקמת מוח שקופה מעכברי ה-GFP-M צילמו ידי פוטונים רב. פריטים חזותיים 3D של אזור קליפת המוח הסרוקים מוצגים בverפרספקטיבות tical (א) ואופקיות (ב). (ג) ~ 50 מיקרומטר הקרנה מהרמות שצוינו ב( a, b). הגדלה (ד) גבוהה באזור מצויינים ב( ג) הממחיש את הפרטים הקטנים של המבנים עצביים כוללים קוצים הדנדריטים (ראשי חץ). סולם ברים ב= 50 מיקרומטר, בb, c = 25 מיקרומטר, בד = 5 מיקרומטר. <img alt="איור 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> איור 6. 3DISCO של כלי דם. כדי לתייג את כלי דם בכל האיברים, צבע לקטינים-FITC שימש במהלך זלוף (לפני הסליקה) כמתואר 16. ראוי לציין להזכיר כי מצאנו כי הזרקה לוריד זנב של נותב נותנת אות טובה יותר זלוף לב של נותב. לאחר איסוף המוח הקבוע וחוט שדרה, הם פונו ואנימאגד ידי Ultramicroscopy. 3D להדמיה של כלי הדם במוח עכבר כולו בHeatmap (א) ואפורה בקנה מידה (א). (ב) להדמיה 3D של כלי הדם של קטע עכבר חוט השדרה בHeatmap (ג) ואפורה בקנה מידה (ד). Heatmaps נוצרו בהתבסס על עוצמת צביעה לקטינים; כחול: בעצימות נמוכות (ברקע) ואדום: בעוצמה גבוהה (כלי דם). סולם ברים ב= 2 מ&quot;מ, מ&quot;מ b = 1, וג, ד = 250 מיקרומטר. <img alt="איור 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> איור 7. 3DISCO של תאי גליה ברקמת מערכת העצבים המרכזית מסומנת. מיתרי השדרה של עכברים הטרנסגניים להביע GFP במיקרוגליה TgH (CX3CR1-EGFP) או האסטרוציטים TGN (hGFAP-ECFP) פונו וצלמו על ידי מיקרוסקופ פוטון רב. 3D טיוח של מיקרוגליה מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה ( <sטרונג&gt; ב). (ג) היטל אופטי (~ 50 מיקרומטר) מוצג כדי להראות את הפרטים של מיקרוגליה בחוט השדרה. 3D טיוח של האסטרוציטים מוצג כהדמית משטח נפח (א) ותצוגה שקופה (ב). (ו) השלכה אופטית (~ 50 מיקרומטר) מוצגת כדי להראות את הפרטים של האסטרוציטים בחוט השדרה. סולם ברים בA, B, D, E = 100 מיקרומטר ובC, F = 50 מיקרומטר. <img alt="איור 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> איור 8. 3DISCO של אונת ריאה כל הר עם מכתים נוגדן של תאי קלרה. למכתים נוגדן כל ההר של אונות ריאה, היו perfused נקבות עכברי BALB / C 10 בן השבוע דרך החדר ממני עם PBS כדי להסיר דם מהריאות. ריאות היו מנופחות לאחר מכן עם PFA 4% וקבועים O / N ב RT במקבע לפחות שלוש פעמים את היקף הדואר רקמות. למחרת, הריאות היו שטופה בקצרה בPBS והאונה הימנית הייתה לשים 5 מיליליטר של 1% טריטון X-100 בPBS עבור permeabilization ל48 שעות או עד שהרקמה צנחה. כל stainings בוצעו ב0.2% טריטון X-100 בPBS המכיל 5% FBS ו BSA 2% ושטיפות היו ב0.2% טריטון X-100 ב-PBS. צביעה עם אנטי CC10 הייתה ל72 שעות ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב למשך כ 6 שעות. ניאון תיוג של הנוגדן הראשוני הושג עם נוגדנים משני נגד עיזים-Alexa פלואוריד-594 לילה ב 4 ° C ואחריו שוטף נרחב עבור שעות 6 עד הלילה. למחרת, פונו אונות מוכתמות דרך 50%, 70%, וTHF 80% ל30 דקות כל אחד ואחריו שלושה שוטף 30 דקות בTHF 100%, ואחריו 20 דקות בDCM, ואחריו 30 דקות בDBE. סולם ברים ובb = 1 מ&quot;מ ובc = 100 מיקרומטר. <img alt="איור 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> דמות<html> 9. 3DISCO של לבלב. לאחר טפטוף של עכברים כפי שתואר לעיל בפרוטוקול, הלבלב היה גזור ופינה עם הפרוטוקול הקצר. הקרינה נובעת מרקומבינציה ROSA26 LSL tdTomato הנגרמת על ידי טיפול בטמוקסיפן של עכברים שנשאו transgene BAC 200 kb פורש לוקוס גלוקגון עכבר אנדוגני עם CreERT2 מוכנס לתוך ATG של גלוקגון. ראשי החץ לסמן חלק מתאי אלפא כותרת הניאון באיון. סולם ברים ב= מ&quot;מ, B ו-C 1 ובד = 500 מיקרומטר. <img alt="טבלת 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> טבלת 1. פרוטוקולי סליקת רקמות לרקמות שונות. דוגמאות לפרוטוקולי סליקת רקמה לרקמות שונות. שים לב כי זמן הסליקה לכל שלב ניתן לקצר או להאריך לפי צורך כדי לשפר את ביצועי הסליקה. המשקל המשוער של רקמות קטנות הוא ~ 20-100 מ&quot;ג והמוח הוא ~ 300-500 מ&quot;ג.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של השולחן הזה.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO at JoVE.com

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

הדמיה כחכחה מערכות ביולוגיות שלמות ברמה תאית על ידי 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K Views.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

Video: Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

המדינה תלות השפעות על TMS: מבט על התנהגות Phosphene מניע

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissection העין עכבר על הר שלם של האפיתל פיגמנט רשתית

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

ברזולוציה גבוהה תהודה מגנטית פונקציונלית שיטות המוח התיכון האדם

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton מיקרוסקופי של מוח העכבר הותר הבעת YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdialysis של אתנול במהלך אתנול נחישות ממשל עצמי ואתנול אופרנטית על ידי גז כרומטוגרפיה

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

אפיון היסטולוגית שלם של Microdevices מוח מושתלים-ורקמה סובבת

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

הקלטת אלקטרו במוח של דג הזברה למבוגר שלמה

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

הערכה תפקודית של ביולוגי עצבי בתרבויות ברשת של תאי גזע שמקורם בנוירונים במערכת עצבים מרכזי

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

שימוש בהתקן מיקרופלואידיקה גירוי מכני, רזולוציה גבוהה הדמיה של C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

ברזולוציה גבוהה 3D הדמיה של זיהום וירוס כלבת ברקמת המוח נקי ממס

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...