Agradecemos C. Hojer para a leitura crítica do manuscrito, B. Bingol (Genentech) para a participação em narrações roteiro, N. Bien-Ly para compartilhar a experiência de uma melhor imagem vasculatura com injeção veia da cauda de corante Lectin e M Solloway (Genentech ) para os ratinhos utilizados em imagiologia pâncreas. Linha GFP-M foi criado por J. Sanes (Universidade de Washington em St. Louis) e camundongos CX3CR1-GFP por R. Littman (NYU). O trabalho é apoiado pela Genentech, Inc.

Todos os experimentos com animais foram realizados de acordo com IACUC (Comitê Animal Care Institucional e utilização) regulamentos em ratos ~ 3-5 meses de idade. O autor declara não interesses financeiros concorrentes. 1. Perfusão Animal e preparação do tecido Timing: 30-60 min por mouse + pós-fixação (de algumas horas a noite). <ol><li> Pesa-se o animal e anestesiar usando cetamina (80-200 mg / kg) e xilazina (7-20 mg / kg) ou 2,5% de avertina (0,5 ml/25 g de peso corporal de IP). </li><li> Aguarde alguns minutos para anestesia fazer efeito completo. </li><li> Aperte o dedo do pé e cauda do animal para se certificar de que o animal está totalmente anestesiado. </li><li> Perfundir o primeiro animal à RT, com 0,1 M de tampão fosfato (PB) ou 0,1 M de tampão fosfato salino (PBS) durante 5-10 min, até que o sangue é completamente removido do tecido. </li><li> Alterne a perfusão de solução fixadora: PFA 4% em 0,1 M PB (ou 0,1 M PBS) e continuar a perfusãocom PFA a 4% durante 30-40 minutos a uma velocidade de 3 ml / min. </li><li> Dissecar a órgãos / s de interesse cuidadosamente sem danificar, por exemplo, evitar a perfuração e apertando o tecido que está a ser dissecado. </li><li> Remover o tecido extra em torno dos órgãos (tecido conjuntivo, meninges ou dura-máter) numa placa de Petri com PBS. </li><li> Pós-corrigir os órgãos em PFA 4% por algumas horas ou durante a noite a 4 º C. Evite longa pós-fixação porque PFA pode saciar o sinal ou aumentar as horas extras autofluorecense 10 especialmente para o canal GFP (que é um problema menor nos canais vermelho e vermelho agora). </li><li> Lave os órgãos 2-3x com PBS a RT imediatamente antes de iniciar o procedimento de limpeza. </li></ol> 2. Clearing Tissue Timing: 2-3 hr para pequenos órgãos e 1-4 dias para os grandes órgãos. Notas: A rotulagem fluorescente dos tecidos pela expressão do transgene, transfecção viral, traçando corante ou antirotulagem corpo deve ser concluída antes de limpar. Todos os passos de compensação do tecido são realizados à temperatura ambiente. As soluções de compensação de THF, DBE, Babb (1 parte de álcool benzílico e 2 parte benzoato de benzila) e diclorometano são tóxicos e inalação (conduzir experimentos em coifa bem ventilado) e contato direto com a pele deve ser evitado (luvas de borracha nitrílica uso). <ol><li> Prepare a 50% (vol / vol), 70%, 80% e diluições em THF em água destilada em frascos de vidro separados como se segue: Para 50% de THF, por exemplo, misturar 25 mL de THF e 25 ml de água destilada em um frasco de vidro com volume de de maior de 50 ml. </li><li> Misture soluções agitando a garrafa para um 1-2 min. </li><li> Identifique claramente a garrafa de vidro. </li><li> Feche bem as garrafas e manter as soluções de trabalho em um armário escuro. Para obter os melhores resultados, não use as mesmas soluções de trabalho com mais de 1-2 semanas. Portanto, pedir as soluções de compensação como o menor volume disponível para poder utilizar os novos reagentes de ações. </li><li>Encher os frascos de vidro (por exemplo, 2-3 ml) com a primeira solução de compensação, 50% de THF, e transferir os órgãos de PBS em frascos de vidro para iniciar a limpeza. </li><li> Feche bem os frascos de vidro com suas tampas e usar um rotador (por exemplo, um agitador roda) para agitar. </li><li> Use a folha de alumínio para cobrir e manter os frascos de vidro em escuro. Inicie o rotador para agitar as amostras em frascos de vidro durante o tempo indicado (Tabela 1), a uma velocidade constante (aproximadamente 30 rpm). </li><li> Remover a solução de limpeza e de adicionar o próximo no protocolo, quando o tempo na Tabela 1 é concluída. </li><li> Recolher o lixo clareira em contentores de lixo de vidro que são mantidos em uma capa. Repita o passo anterior para cada solução de limpeza no protocolo até o fim. Use uma nova pipeta pasteur quando uma nova solução de limpeza é adicionado (por exemplo, mudar de THF para DBE). </li><li> Na etapa final clareira com BABB ou DBE, os tempos de incubação pode ser prorrogado ou shortened até que as amostras se tornar totalmente transparente à luz visível (ou amarelada / transparente, se é um grande tecido como o cérebro). </li><li> Manter os órgãos compensados ​​na solução final de compensação em todos os momentos, incluindo as etapas de imagem. </li></ol> 3. Preparando Órgãos Cancelado for Imaging Timing: 5-15 min. Nota: A imagem dos órgãos apuradas assim que uma compensação completa seja alcançada. Para isso, siga os seguintes passos para preparar as amostras para microscopia de luz folhas (por exemplo, ultramicroscopia) ou confocal / multi-fotão microscopia de imagem. Nota: órgãos Cancelado vai perder sua força de fluorescência ao longo do tempo (particularmente proteínas fluorescentes, por exemplo, GFP; rotulagem anticorpo é mais resistente e pode até dar melhores resultados com incubações mais longas). Para imagiologia, várias técnicas de microscopia de fluorescência pode ser utilizado, desde que a manipulação adequada dos órgãos na cleasolução anel é conseguida. <ol><li> Para a microscopia de luz folhas <ol><li> Coloque ou montar a amostra de forma adequada. </li><li> Corrigir o órgão cancelou girando manualmente o parafuso do suporte da amostra 4. </li><li> Mergulhar a amostra para a câmara de imagem (de preferência feito de vidro) de microscópio thelight-folha que é cheio com o BABB ou DBE, o que foi utilizado no passo final de limpeza. </li></ol></li><li> Para a microscopia de multi fotões / confocal <ol><li> Montagem da amostra sobre uma corrediça de imagem (ou uma câmara de imagem) com a solução final de imagem para ser capaz de imagem com um multi fotões ou microscopia confocal, que tipicamente utilizam óleo ou água objectivos imerso. </li><li> Use cimento dental para fazer uma borda ao redor do tecido. </li><li> Encher a piscina com BABB ou DBE pouco antes de cimento dental fica totalmente rígida. Nota: O cimento dental solidifica rapidamente; praticar algumas vezes para se familiarizar com ele antes de tentar as amostras reais. </li><li> Colocar imediatamentea amostra apuradas no meio da piscina e cubra com uma tampa de vidro. </li><li> Pressionar a tampa de vidro até que seja completamente selada com cimento dentário e toca na superfície do órgão limpa, o que permitirá atingir a profundidade máxima de imagiologia por microscopia confocal / multi-fotão. Notas: Isso garante que nenhuma solução compensação será derramado durante a imagem. Evitar mergulhando a lente de imagem directamente na solução de compensação, o que pode prejudicar a lente menos que seja resistente à BABB / DBE, ou tem uma capa protectora. </li></ol></li></ol> Órgãos 4. Imagem Cancelado Timing: 15-45 min. <ol><li> Coletar uma varredura z cobrindo todo o tecido limpo (se a lente utilizada permite) com o melhor resolução que o microscópio pode entregar. </li><li> Amplie as regiões de interesse para coletar imagens de alta resolução. </li></ol> 5. Exame dos dados com o software Amira <ol><li> Carregue a série imagems de software Amira com módulo ResolveRT. </li><li> Digite os tamanhos de voxel corretos na janela &quot;Imagem Read Parameter&quot; e pressione ok. </li><li> Selecione o &quot;Multi Planer View&quot; sub-aplicação. Em seguida, use o controle deslizante &quot;espessura&quot; para escolher o limite ideal para os valores de cinza, ajustando os valores 2D e 3D. </li><li> Visualize a amostra, navegando as fatias em diferentes orientações 2D e usando o módulo de integração lavoura-canto em vista 3D. Nota: Um guia de resolução detalhada do protocolo pode ser encontrada em Ertürk et al 4. </li></ol>

<ol>
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Não há nada a divulgar.

Métodos de compensação Tissue visam reduzir a dispersão da luz de imagem, combinando os índices de refração de diferentes camadas de tecido nos órgãos desmatadas. Como um resultado, a luz de imagem podem penetrar profundamente nos tecidos e estimular as células marcadas / moléculas. Este velho conceito de tecido limpando 17 ganhou crescente atenção após a primeira aplicação sofisticada da técnica em cérebros intactos rato por Dodt e colegas 2. Desde então, há uma lista crescente de novos métodos de compensação, incluindo 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLAREZA e SeeDB 3,4,7,18-20. Em essência, todos eles visam tornar os órgãos transparentes para imagens de tecidos profundos, preservando a etiqueta fluorescente. Entre eles, 3DISCO destaca-se como um dos métodos mais simples e reprodutível. É relativamente rápido em comparação com outros métodos de compensação mencionados acima (1-5 dias vs 2-3 semanas para cérebros adultos, respectivamente) 21. Ele já foi sucessototalmente aplicado a diferentes órgãos, como o cérebro, medula espinhal, gânglios linfáticos, baço, pulmão, tumores sólidos, pâncreas e glândulas mamárias 3,4,9. Além disso, várias publicações de grupos de pesquisa independentes já usou esse método para obter imagens resulta 22,23. No entanto, diferentes procedimentos de limpeza de tecido pode ser vantajoso para as diferentes condições. Por exemplo, enquanto Sca / e e SeeDB são mais aplicáveis ​​em tecidos embrionários 6,7, são métodos de compensação à base de água, que poderia ser mais fácil de manusear durante o exame. Em contraste, a clareza é um método de compensação complicada e dispendiosa. Mas, pode ser vantajoso no contexto da marcação com anticorpos, especialmente em grandes tecidos, tais como tumores do cérebro 8. O passo mais importante para obter os melhores resultados de imagem de 3DISCO é a rotulagem dos tecidos, que é realizado antes da compensação de tecidos. É essencial para começar com o sinal de fluorescência mais forte possível. Isto pode bE conseguida de várias maneiras, incluindo a expressão transgénica de proteínas fluorescentes, detecção por corantes sintéticos, transfecção viral ou marcação de anticorpos. Deve ser mantido em mente que qualquer procedimento de compensação irá reduzir o sinal fluorescente dos tecidos. Assim, se o sinal fluorescente não é forte o suficiente no início - ou seja, não é facilmente detectável antes da compensação por imagem dos tecidos desmatadas vai entregar resultados pobres. Existem algumas limitações de limpar os métodos que estão à espera de melhorias. Uma limitação fundamental é que uma vez que os reagentes de compensação alteram a estrutura dos órgãos compensados, eles não podem ser utilizados em tecido vivo. Assim, experiências como com mEos2 fotoactivável 24 deve ser realizada antes da fixação e de compensação. Após a limpeza, de super-resolução de imagem do sinal de fluorescência a partir de proteínas brilhantes e fotoestáveis ​​torna-se possível. Além disso, porque o protocolo de compensação diminui ointensidade das proteínas fluorescentes, os órgãos não apuradas pode ser armazenado por períodos prolongados. É importante notar que alguns órgãos são mais difíceis de ser apagadas. Especialmente, se os órgãos dissecados reter grandes quantidades de células de sangue (por exemplo, o baço, o fígado), que são relativamente difíceis de limpar e de imagem. Também é relativamente difícil de conseguir uma eliminação completa de grandes tecidos, tais como cérebro adulto roedor. Tais tecidos podem precisar de tempos de incubação mais longos, o que poderia, por outro lado, reduzir o sinal fluorescente. Além disso, o desenvolvimento de métodos de microscopia que pode imagem de grandes órgãos transparentes de uma só vez em uma alta resolução de uma necessidade aguardando para ser abordado. Outra importante limitação da técnica é a rotulagem tecido. Enquanto um forte sinal de fluorescência através de expressão genética ou vírus é ideal, nem todas as células ou a molécula pode ser etiquetado de forma viral ou geneticamente. Por outro lado, a marcação de anticorpos de tecidos espessos não é um procedimento simples, ou mesmo não possible na maioria dos casos. Ele pode precisar de protocolos especiais permeabilização e longos tempos de incubação (vários dias a algumas semanas) 3. Também é importante ter em mente que os tecidos encolher cerca de 20% em cada dimensão (medida de tecido da medula espinhal) depois de limpar, principalmente devido à desidratação e delipidação. Este encolhimento ocorre ratiometrically e deve ser corrigida em passos de quantificação. Como pode ser observado nos resultados apresentados, estruturas marcadas com fluorescência permanece intacta, o que é a indicação de integridade de proteínas nos tecidos compensados. Devido à natureza hidrofóbica do final de tecido limpa, ela não pode mais ser coradas com os anticorpos ou incorporados em soluções aquosas contendo, por exemplo, Focusclear-que é usado em clareza e 80% de glicerol. Finalmente, é um desafio para analisar tamanhos enormes de dados de imagem. Por exemplo, quando todo um cérebro murino é digitalizado com uma resolução de celular, que seria muito difícil de rastrear e quantificar str desejadouctures (por exemplo, redes neuronais ou glia) e comparar em diferentes amostras de forma automatizada. Em resumo, enquanto pesquisadores pretendem descobrir novos métodos de compensação, os vários desafios acima (dificuldade de limpar diversos tecidos, imagens em alta resolução de áreas maiores, e análise de dados complicado) deve ser melhorado em paralelo. Em conclusão, técnicas de limpeza de tecidos recentemente desenvolvidos, incluindo 3DISCO, elegantemente demonstram que imagens de alta resolução 3D de órgãos intactos agora é possível. Usando esses métodos, os cientistas podem obter informações anatômicas das células e moléculas no órgão intacto. Estes estudos de imagem 3D pioneiras em órgãos transparentes inspirar um número crescente de pesquisadores de decifrar anatômica complexa e organizações moleculares de tecidos / órgãos de saúde e doença.

O exame histológico dos tecidos biológicos é uma abordagem fundamental para a compreensão da natureza das moléculas / células em seu contexto natural. Idealmente, imagens de alta resolução de todo o órgão é mais informativo e desejado. Dado que a luz tem uma profundidade de penetração limitada, devido ao espalhamento 1, órgãos fixos têm de ser seccionados de forma a realizar de alta resolução de imagem microscópica. Assim, a maioria dos estudos histológicos são realizadas em algumas secções de tecido que representam apenas uma pequena porção do órgão. Em alguns estudos, por exemplo, aqueles com o objetivo de traçar conexões neuronais no cérebro ou na medula espinhal, todos os cortes de tecidos dos órgãos-alvo são coletados e fotografada para uma reconstrução 3D. No entanto, o corte de tecido e de imagem posterior de seções individuais tem várias limitações. Estes incluem a ser demorada e que conduz a uma reconstrução 3D incompleta do tecido, devido às distorções mecânicas e difícils no alinhamento das imagens resultantes. Recentemente, a compensação de imagem e transparentes órgãos intactos tem sido desenvolvido como uma solução para este inconveniente significativo 2,3. Após a limpeza, todo o órgão é processado transparente permitindo que a luz de imagens de viajar end-to-end (Figura 1) para produzir imagens de alta resolução do órgão unsectioned usando um microscópio de varredura a laser, como um multi fótons de luz ou folhas microscópio ( Figura 2). Vários grupos de pesquisa têm desenvolvido novos protocolos de limpeza do tecido a ser capaz de imagem seu tecido de interesse para fins diferentes. Estes incluem solvente orgânico 2-5, 6,7 água e eletroforese baseado 8 protocolos de compensação. Entre eles, a imagiologia 3-dimensional do solvente afastada órgãos ou 3DISCO é um protocolo facilmente aplicável numa variedade de amostras biológicas, incluindo o sistema nervoso central (SNC) de órgãos, órgãos imunes e tumores sólidos. Em additião, pode ser combinada com diferentes técnicas de microscopia, tais como a microscopia de luz de fluorescência folha (LSFM), multi fotão e por microscopia confocal de varrimento laser. 3DISCO baseia-se na compensação de reagentes prontamente disponíveis e baratos, tais como tetrahidrofurano (THF) e o éter dibenzílico (DBE) 4. O protocolo inteiro pode levar tão curto quanto 3-4 horas. Assim, 3DISCO é uma técnica robusta e rápida em comparação com os métodos histológicos tradicionais que pode levar semanas ou meses a completar 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:201px;">Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:291px;">can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CX3CR1 GFP mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Littman lab at NYU</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td>(Mallinckrodt, 7892-04)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-2-2 Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">152463</td>
			<td>used to prepare Avertin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>186562-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270997-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dibenzyl ether&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma, 108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin FITC&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0401-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CC10</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9772</td>
			<td align="right">0.388888889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;</td>
			<td>APP pharmaceuticals&#160;</td>
			<td align="right">504001</td>
			<td>used in perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Rotator&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100498-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mL Media Storage Bottles</td>
			<td>Kimax Media Bottles</td>
			<td>EW-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Minipuls evolution perfusion pump&#160; with MF4* medium flow pump head&#160;</td>
			<td>Gilson, Inc</td>
			<td>F110701 and F117606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastWell</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>FW20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2940-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish&#160;</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dental cement&#160;</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1223PNK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Quantofix Peroxide Test Strips</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">37206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:201px;">Amira with RT resolve microscopy module 
			&#160;</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:201px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH</td>
			<td>freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Os neurônios são células altamente polarizado com extremamente longa morfologia. Sua função depende das ligações que se formam entre si e com outros tecidos. Assim, o mapeamento da organização estrutural dos neurônios é extremamente importante para entender como eles funcionam na saúde e na doença. No entanto, seguindo essas enormes conexões neuronais em todo o nervoso conectonomia sistema recentemente nomeados 11 - continua a ser um dos desafios mais difíceis na neurociência. Para este fim, tanto da UE 12 e EUA 13 iniciaram grandes projetos para mapear o cérebro humano. Enquanto 3DISCO podem ser empregues em vários órgãos, tem sido particularmente útil para rastrear ligações neuronais longo da medula espinal e do cérebro. Por exemplo, por meio de varreduras ultramicroscopia segmentos de medula espinal compensados ​​grandes, as ligações axonais pode ser seguida ao longo centímetros na espinal-medula do roedor (Figura 2). De um modo semelhante, a totalidade do cérebro do rato afastada (Figura 3a) e hipocampo (Figura 3b) pode ser trabalhada para seguir as ligações neuronais no cérebro. Quando microscopia confocal fóton ou múltipla é utilizada em órgãos desmatadas, a resolução de imagem pode ser significativamente melhorada, especialmente na dimensão z. Por exemplo, várias imagens de fotões de medulas espinhais apuradas a partir de ratos da linha de GFP-M (Figura 4a) atinge uma imagem uniforme, ao longo de toda a profundidade (~ 1,5-2 mm) da medula espinal. Microscopia confocal sobre a medula espinal afastada proporciona melhor resolução de uma forma semelhante (Figuras 4b e c). Multi imagens de microscopia de fótons de cérebros desmatadas proporciona imagens muito de alta resolução para visualizar detalhes de estruturas neuronais incluindo espinhas dendríticas (Figura 5). As amostras para 3DISCO pode ser marcado de várias maneiras, incluindo a expressão do transgene, viral transfecção, traçado corante e rotulagem de anticorpos. Por exemplo, é possível marcar toda a vasculatura do cérebro (Figuras 6a e b), e na medula espinhal (Figuras 6c e d) utilizando lectina conjugada marcadores fluorescentes 4, o qual pode ser utilizado para estudar a-barreira hematoencefálica (BHE ) na saúde e na doença. Ambas as microglia e astrócitos são altamente implicados na patologia da neurodegeneração, incluindo doenças de Alzheimer e lesões traumáticas 14,15. Usando 3DISCO, a sua densidade e distribuição na medula espinal (Figura 7) ou do cérebro pode ser estudada. Tecidos não-neuronais, também pode ser trabalhada. Por exemplo, células Clara em todo os pulmões de roedores pode ser immunolabeled com anticorpos e representado sem o corte em um único nível celular (Figura 8). Da mesma forma, é possível limpar e células de imagem, por exemplo,células alfa no tecido do pâncreas unsectioned (Figura 9). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. Compensação tecido 3DISCO torna tecidos unsectioned transparentes para imagens de tecidos profundos. Uncleared (a) e compensados ​​(b) os tecidos da medula espinhal como pode ser visto pela luz visível. Após a compensação, microscopia de varredura a laser-tecido profundo se torna possível. (C) os tecidos da medula espinhal Uncleared e desmatadas foram fotografadas por microscopia de dois fótons. As barras de escala em a, b = 0,5 mm e em c = 100 pm. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. 3DISCO imagiologia de medula espinal a seguir extensões axonais. A medula dissecada de Thy-1 de linha de ratinhos transgénicos GFP (GFP-M) é dividida em pedaços mais pequenos (~4 mm). Depois de seguir o protocolo de compensação para pequenos tecidos (Tabela 1) as medulas espinhais transparentes foram visualizados utilizando ultramicroscopia. Reconstruções em 3D de um ~ 4 milímetros segmento da medula espinhal em horizontal (a), coronal (b) e sagital (c). (D) Representante rastreada axônios (vermelho) são mostrados na visão transparente em tons de cinza. (E) Alto ampliação da região indicada em (d). As barras de escala em a, b, c, d = 0,5 mm, e em e = 20 um. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> 3DISCO imagem do cérebro apagado e hipocampo Figura 3.. Exemplos de cérebros e hipocampo de camundongos GFP-M desmatadas foram fotografadas com um ultramicroscópio. Visualizações 3D de todo o cérebro (a) e hipocampo (b) demonstrar o netwo neuronalrks nos tecidos transparentes com imagens. As barras de escala em um = 2 mm, e em b = 20 ^ m. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Compensação de tecido aumenta a resolução obtida por vários fotões e microscopia confocal. Segmentos da medula espinhal de ratos transparentes GFP-M fotografada por vários fotões (a) ou microscopia confocal (b, c). Note-se que a limpeza substancialmente melhora a resolução e profundidade de imagem revelando a estrutura fina de axônios e dendritos. Barras de escala = 100 um em um e em b, c = 20 um. <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. 3DISCO imagem das espinhas dendríticas. Tecido cerebral de camundongos Transparente GFP-M fotografada pelo multi fótons. Visualizações 3D da região do córtex digitalizada apresentados em versãoperspectivas Tical (a) e horizontais (b). (C) ~ 50 um de projecção a partir dos níveis indicados em (a, b). (D) alta ampliação da região indicada em (c) demonstrar os detalhes das estruturas neuronais incluindo espinhas dendríticas (setas). As barras de escala em um = 50 mm, em b, c = 25 um, no d = 5 mm. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. 3DISCO da vasculatura. Para identificar os vasos sanguíneos em todo os órgãos, corante de lectina-FITC foi utilizada durante a perfusão (antes da compensação) como descrito 16. É importante mencionar que achamos que a injeção na veia da cauda do traçador dá melhor sinal sobre perfusão cardíaca do marcador. Após a coleta dos cérebros fixos e medula espinhal, eles foram apuradas e imaged por ultramicroscopia. Visualização 3D de toda a vasculatura cerebral do rato em heatmap (a) e em escala de cinza (a). (B) a visualização 3D da vasculatura de um rato segmento da medula espinhal em heatmap (c) e em escala de cinza (d). Os heatmaps foram gerados com base na intensidade de coloração da lectina; azul: baixa intensidade (background) e vermelho: alta intensidade (vascularização). As barras de escala em um = 2 mm, b = 1 mm, e em c, d = 250 um. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. 3DISCO de células da glia no tecido CNS apagada. Medula espinhal de camundongos transgênicos expressando GFP em microglia Tgh (CX3CR1-EGFP) ou astrócitos TgN (hGFAP-ECFP) foram apuradas e fotografada por microscopia de multi fótons. Rendição 3D de microglia é mostrado como a visualização do volume de superfície (a) e vista transparente ( <strong&gt; b). (C) Uma projecção óptica (~ 50 mM) é apresentado para mostrar os detalhes da microglia na medula espinal. Rendição 3D de astrócitos é mostrado como a visualização do volume de superfície (a) e vista transparente (b). (F) Uma projecção óptica (~ 50 mM) é apresentado para mostrar os detalhes dos astrócitos na medula espinhal. As barras de escala em a, b, d, e = 100 mm e em c, f = 50 mm. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. 3DISCO de um lobo pulmonar inteiro de montagem com coloração de anticorpos de células Clara. Para o anticorpo coloração dos lobos pulmonares todo-mount, 10 semanas de idade camundongos BALB / C fêmeas foram perfundidos através do ventrículo direito com PBS, a fim de remover o sangue dos pulmões. Os pulmões foram subsequentemente inflado com PFA a 4% e fixa S / N a RT em fixador, pelo menos, três vezes o volume de poe tecidos. No dia seguinte, os pulmões foram rapidamente lavadas em PBS e o lóbulo direito foi colocado em 5 ml de 1% de Triton X-100 em PBS, durante a permeabilização durante 48 horas ou até o tecido se afundou. Todas as colorações foram realizadas em 0,2% de Triton X-100 em PBS contendo 5% de FBS e 2% de BSA e lavagens foram em 0,2% de Triton X-100 em PBS. Coloração com anticorpos anti-CC10 foi de 72 horas a 4 ° C, seguido por extensa lavagem de cerca de 6 horas. A microscopia por fluorescência de o anticorpo primário foi realizada com o anticorpo secundário anti-cabra-Alexa Fluor-594 durante a noite a 4 ° C, seguido por lavagens extensas em 6 horas durante a noite. No dia seguinte, os lóbulos coradas foram apuradas através de 50%, 70%, e 80% de THF, durante 30 min cada, seguido por três lavagens de 30 min em 100% de THF, seguidos por 20 min em DCM, seguido de 30 min em DBE. As barras de escala em a e b = 1 mm e em c = 100 pm. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Figura<html> 9. 3DISCO de pâncreas. Após a perfusão de ratos, como descrito acima no protocolo, o pâncreas foi dissecado e liberado com o protocolo curto. A fluorescência é derivado Rosa26 LSL tdTomato recombinação induzida por tratamento com tamoxifeno de ratos portadores de um transgene de BAC de 200 kb abrangendo o rato glucagon locus endógeno com CreERT2 inseridos no ATG do glucagon. As setas marcam algumas das células alfa fluorescentes marcado na ilhota. As barras de escala em a, b e c = 1 mm e em d = 500 mm. <img alt="Tabela 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tabela 1. Protocolos de limpeza de tecidos para vários tecidos. Exemplos de protocolos de limpeza de tecidos para tecidos diferentes. Note-se que o tempo de compensação para cada etapa pode ser encurtado ou estendido conforme a necessidade de melhorar o desempenho de compensação. O peso aproximado de pequenos tecidos é de aproximadamente 20-100 mg e do cérebro é de aproximadamente 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Clique aqui para ver uma versão maior desta tabela.

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Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Imagem Limpa Sistemas Biológicos intactas em um nível celular por 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K visualizações.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

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Scalable Fluidic Injector Arrays for Viral Targeting of Intact 3-D Brain Circuits

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted in neurological and psychiatric disorders--would be greatly facilitated by a technology for rapidly targeting genes to complex 3-dimensional neural circuits, enabling fast creation of "circuit-level transgenics." We have recently developed methods in which viruses encoding for light-sensitive proteins can sensitize specific cell types to millisecond-timescale activation and silencing in the intact brain. We here present the design and implementation of an injector array capable of delivering viruses (or other fluids) to dozens of defined points within the 3-dimensional structure of the brain (Figure. 1A, 1B). The injector array comprises one or more displacement pumps that each drive a set of syringes, each of which feeds into a polyimide/fused-silica capillary via a high-pressure-tolerant connector. The capillaries are sized, and then inserted into, desired locations specified by custom-milling a stereotactic positioning board, thus allowing viruses or other reagents to be delivered to the desired set of brain regions. To use the device, the surgeon first fills the fluidic subsystem entirely with oil, backfills the capillaries with the virus, inserts the device into the brain, and infuses reagents slowly (&lt;0.1 microliters/min). The parallel nature of the injector array facilitates rapid, accurate, and robust labeling of entire neural circuits with viral payloads such as optical sensitizers to enable light-activation and silencing of defined brain circuits. Along with other technologies, such as optical fiber arrays for light delivery to desired sets of brain regions, we hope to create a toolbox that enables the systematic probing of causal neural functions in the intact brain. This technology may not only open up such systematic approaches to circuit-focused neuroscience in mammals, and facilitate labeling of brain regions in large animals such as non-human primates, but may also open up a clinical translational path for cell-specific optical control prosthetics, whose precision may enable improved treatment of intractable brain disorders. Finally, such devices as described here may facilitate precisely-timed fluidic delivery of other payloads, such as stem cells and pharmacological agents, to 3-dimensional structures, in an easily user-customizable fashion.

Controlling and analyzing neural circuits in vivo would be facilitated by a technology for delivery of viruses and other reagents to desired 3-dimensional sets of brain regions. We demonstrate customized fluidic injector array fabrication, and delivery of virally-encoded optical sensitizers, enabling optical manipulation of complex brain circuits.

Escalável Fluidic Arrays Injector para Viral Segmentação de Intact Circuitos 3-D do cérebro

Our understanding of neural circuits--how they mediate the computations that subserve sensation, thought, emotion, and action, and how they are corrupted ...

Neurociência

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

Estado de dependência-Efeitos sobre a TMS: Um olhar sobre Comportamento fosfeno Motive

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Dissecação de um olho do rato para um monte inteiro do epitélio pigmentar da retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

De alta resolução funcionais Métodos ressonância magnética para Midbrain Humanos

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopia multifotônica do cérebro do rato Cleared Expressando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdiálise de etanol durante a operante determinação auto-administração de etanol e etanol por cromatografia gasosa

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterização histológica intacta de Microdevices Brain-implantados e tecido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Gravação eletrofisiológica no cérebro de Intacta Zebrafish Adulto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Utilizando um dispositivo microfluídica para estimulação mecânica e alta resolução de imagem de c. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imagem latente 3D de alta resolução da infecção do vírus da raiva no tecido solvente-cancelado do cérebro

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...