Biz Lektin boya kuyruk damar enjeksiyonu ile gelişmiş damar görüntüleme deneyim paylaşımı için komut rivayetlerde, N. Bien-Ly katılım için, yazının eleştirel okuma B. Bingöl (Genentech) C. Höjer teşekkür, ve M Solloway (Genentech ) pankreas görüntülemede kullanılan fareler için. GFP-M hattı R. Littman (NYU) tarafından J. Sanes (St Louis Washington Üniversitesi) ve CX3CR1-GFP fareler tarafından oluşturuldu. Bu çalışma Genentech, Inc tarafından desteklenen

Tüm hayvan deneyleri ~ 3-5 aylık fareler üzerinde IACUC (Kurumsal Hayvan Bakım ve Kullanım Komitesi) yönetmeliklere uygun olarak yapıldı. Yazar, hiçbir rakip mali çıkarlarını bildirir. 1.. Hayvan Perfüzyon ve Doku Hazırlanması Zamanlama: fare + post-fiksasyon başına 30-60 dk (bir kaç saat için gece). <ol><li> Hayvan tartılır ve ketamin (80-200 mg / kg) ve ksilazin (7-20 mg / kg) ya da% 2.5 avertin (0.5 ml/25 g vücut ağırlığı IP) kullanılarak anestetize. </li><li> Tam etkiyi almak için anestezi için birkaç dakika bekleyin. </li><li> Hayvan tam anestezi olduğundan emin olmak için hayvanın ayak ve kuyruk çimdik. </li><li> Kan tamamen doku çıkarılır kadar 0.1 M fosfat tampon maddesi (PB) ya da 5-10 dakika boyunca 0.1 M fosfat tamponlu salin (PBS) ile oda sıcaklığında ilk önce hayvan serpmek. </li><li> Sabitleştirici çözeltiye perfüzyona geçiş: 0.1 M PB (veya 0.1 M PBS) içinde% 4 PFA ve perfüzyon devam/ dakika 3 ml &#39;lık bir hızda 30-40 dakika boyunca% 4 PFA ile. </li><li> Delme ve disseke ediliyor doku sıkma önlemek, zarar, örneğin olmadan dikkatlice ilgi organ / s teşrih. </li><li> PBS ile doldurulmuş bir petri kabına organları (bağ dokusu, beyin zarları ve dura madde) çevreleyen ilave doku çıkarın. </li><li> Birkaç saat veya gece boyunca 4 º C&#39;de için% 4 PFA organları Post-fix PFA sinyali gidermek veya özellikle GFP kanal için autofluorecense mesai 10 (kırmızı ve uzak kırmızı kanallarında daha az sorun olduğu) artabilir, çünkü sonrası uzun tespit kaçının. </li><li> Sadece takas işlemi başlamadan önce oda sıcaklığında PBS ile Organlar 2-3x yıkayın. </li></ol> 2.. Doku Takas Zamanlama: Büyük organların küçük organlarına ve 1-4 gün 2-3 saat. Notlar: Transgen ekspresyonu ile dokuların floresan etiketleme, viral transfeksiyon, boya izleme veya antivücut etiketleme temizlemeden önce tamamlanması gerekmektedir. Bütün doku temizleme adımları, oda sıcaklığında gerçekleştirilir. Takas çözümler THF, DBE, BABB (1 kısım benzil alkol ve 2 bölüm benzil benzoat) ve diklorometan (davranış düzgün havalandırılmış davlumbaz deneyler) ve deri ile doğrudan temas (kullanımlık nitril eldiven) kaçınılmalıdır zehirli ve inhalasyon. <ol><li> % 50 (hacim / hacim),% 70, ve aşağıdaki gibi ayrı bir cam şişe içinde, damıtılmış su içinde% 80 THF seyreltileri hazırlamak:% 50 THF için, örneğin, hacimli bir cam şişe içinde 25 ml THF ve damıtılmış su, 25 ml karıştırın 50 ml &#39;den daha büyüktür. </li><li> Nazikçe 1-2 dakika boyunca şişeyi sallayarak çözümler karıştırın. </li><li> Açıkça cam şişe etiketleyin. </li><li> Güvenli bir şişe kapatın ve karanlık bir kabine çalışan çözümler tutun. En iyi sonuç için, aynı çalışma çözümleri artık 1-2 hafta daha kullanmayın. Bu nedenle, mümkün kullanımı taze stok reaktifler olmak için mevcut en küçük birim olarak takas çözümler sipariş. </li><li>İlk temizleme çözeltisi,% 50 THF ile cam şişeler (örneğin, 2-3 mL) doldurun ve temizleme başlatmak için cam şişelere PBS arasındaki organları aktarın. </li><li> Güvenli bir şekilde kapaklı cam şişeleri kapatın ve karıştırma için bir rotator (örneğin, bir tekerlek karıştırıcı) kullanın. </li><li> Karanlıkta cam şişe kapağı ve korumak için alüminyum folyo kullanarak. Sabit bir hızda (~ 30 rpm) de belirtilen süre (Tablo 1) için cam şişelere örnekleri karışmaya rotator başlatın. </li><li> Temizleme çözeltisini çıkarın ve Tablo 1 &#39;de zaman tamamlandığında protokolde bir sonraki ekleyin. </li><li> Bir başlık tutulur cam atık konteynerlerinin içine takas toplayın. Sonuna kadar protokolde her takas çözüm için önceki adımı tekrarlayın. Yeni temizleme çözeltisi (DBE THF değişen, örneğin) ilave edilir, yeni bir pastör pipet kullanın. </li><li> Babb veya DBE ile son temizleme adımında, inkübasyon süresi uzatılabilir veya sh edilebilirnumuneleri (o beyin gibi çok büyük bir doku ise şeffaf / veya sarımsı) tamamen görünür ışıkta şeffaf hale gelene kadar ortened. </li><li> Görüntüleme adımları da dahil olmak üzere her zaman en son temizleme çözeltisi içindeki temizlenmiş organları tutun. </li></ol> 3. Görüntüleme Temizlendi Organları hazırlanıyor Zamanlama: 5-15 dk. Not: Görüntü temizledi organlar kısa sürede tam bir takas elde edilir gibi. Bu amaçla, ışık mikroskobu tabaka (örneğin, ultramicroscopy) veya konfokal / çoklu foton mikroskopi görüntüleme için örnekleri hazırlamak için aşağıdaki adımları uygulayın. Not: Temizlendi organlar zamanla floresan gücünü kaybedecektir (özellikle floresan proteinleri örneğin, GFP, antikor etiketleme daha dirençli olduğu ve hatta uzun inkubasyon ile daha iyi sonuçlar verebilir). Görüntüleme için, çeşitli floresan mikroskopi teknikleri Clea organların doğru kullanımı sürece kullanılabilirhalka çözüm elde edilir. <ol><li> Işık sayfalık mikroskop için <ol><li> Yerleştirin veya uygun numuneyi monte edin. </li><li> El ile numune tutucu 4 vidasını çevirerek temizlenir organı düzeltildi. </li><li> Son temizleme adımında kullanıldı hangisi BABB veya DBE, ile doldurulur TheLight-tabaka mikroskobu (tercihen cam) görüntüleme odasına örnek batırın. </li></ol></li><li> Çoklu foton / konfokal mikroskopi için <ol><li> Tipik olarak yağ veya su batırma kullanım amacı, çok fotonun veya konfokal mikroskopi, görüntü ile edebilmek için son görüntüleme çözeltisi ile bir görüntüleme slayt (ya da bir görüntüleme odası) hakkında örnek monte edin. </li><li> Doku etrafında bir sınır yapmak için diş çimento kullanın. </li><li> Diş çimento tamamen rijit alır hemen önce Babb veya DBE ile havuz doldurun. Not: Diş çimento hızla katılaşır; gerçek örnekleri denemeden önce aşina almak için birkaç kez uygulama. </li><li> Hemen yerhavuz ortasında ve bir kapak camı ile örtün temizlenir örneği. </li><li> Tamamen dental çimento ile kapatılmış ve konfokal / çoklu foton mikroskobu ile maksimum derinliği görüntüleme ulaşmasını sağlayacak temizlenir organ yüzeyine temas kadar cam kapak basın. Notlar: Bu hiçbir takas çözüm görüntüleme sırasında dökülen olmasını sağlar. Bu BABB / DBE dirençli veya koruyucu kapağı olmadığı sürece lens zarar, hangi temizleme solüsyonu doğrudan görüntüleme lens daldırma kaçının. </li></ol></li></ol> 4. Görüntüleme Temizlendi Organları Zamanlama: 15-45 dk. <ol><li> Mikroskop sunabilirsiniz iyi çözünürlükte (kullanılan lens izin verirse) tüm temizledi dokuyu kapsayan bir z-tarama toplayın. </li><li> Daha yüksek çözünürlüklü görüntüler toplamak için ilgi bölgelerinde yakınlaştırmak. </li></ol> Yazılım Amira ile 5 veri. Incelenmesi <ol><li> Görüntü serie yükleyinResolveRT modül, yazılım Amira s. </li><li> &quot;Resim Oku Parametre&quot; penceresi ve ok tuşuna basınız doğru voksel boyutlarını girin. </li><li> &quot;Multi Planer Görünüm&quot; alt uygulamasını seçin. Sonra 2D ve 3D değerlerini ayarlayarak, gri değerleri için optimum eşik seçmek için &quot;Kalınlık&quot; kaydırma çubuğunu kullanın. </li><li> Farklı 2D yönlerde dilimleri tarama ve 3D görünümünde mahsul-köşe modülü kullanarak örnek gözünüzde canlandırın. Not: protokolünün detaylı sorun giderme kılavuzu Ertürk ve ark 4 bulunabilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Tuchin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nat Med. 18, 166-171 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Erturk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+(3DISCO).">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ome+sweet+ome:+what+can+the+genome+tell+us+about+the+connectome.">Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).</li><li>Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+peripheral+corneal+clarity+after+surgical+trauma+in+patients+with+Avellino+corneal+dystrophy.">Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy.</a> Cornea. 25, 497-498 (2006).</li><li>Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bond+strength+and+debonding+characteristics+of+a+new+ceramic+bracket.">Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket.</a> American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).</li><li>Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegenerative+disease.">Microglia in neurodegenerative disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).</li><li>Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Disease:+astrocytes+in+neurodegenerative+disease.+Nature+clinical+practice.">Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice.</a> Neurology. 2, 679-689 (2006).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy.">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pr&#228;paraten. , (1903).</li><li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroinflammatory+response+in+humans+after+traumatic+brain+injury.">The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).</li><li>Zotova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+alterations+in+human+Alzheimer's+disease+following+Abeta42+immunization.">Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).</li><li>Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+cochlear+implantation+in+Friedreich's+ataxia:+A+case+study.">Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study.</a> Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury.">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li><li>Soderblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+fibroblasts+form+the+fibrotic+scar+after+contusive+spinal+cord+injury.">Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury.</a> J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6, 131-133 (2009).</li></ol>

Ifşa hiçbir şey yok.

Doku temizleme yöntemleri temizlenir organlarda çeşitli doku katmanlarının kırılma indisleri ile görüntüleme ışık saçılımını azaltmaktır. Sonuç olarak, görüntü ışık derin dokulara nüfuz ve etiketlenmiş hücre / molekülleri uyarabilir. 17 takas doku Bu eski bir kavram Dodt ve arkadaşları 2 bozulmamış fare beyinleri üzerinde tekniğin ilk sofistike uygulamadan sonra artan ilgi görmüştür. O zamandan beri, 3DISCO, SCA / e, ClearT2, berraklık ve SeeDB 3,4,7,18-20 dahil olmak üzere yeni takas yöntemleri hızla büyüyen bir liste var. Özünde, hepsi floresan etiketi koruyarak derin doku görüntüleme için şeffaf organlarını vermeyi hedefliyoruz. Bunlar arasında, 3DISCO en basit ve tekrarlanabilir yöntemlerden biri olarak öne çıkıyor. Nispeten hızlı bir diğer takas yukarıda bahsedilen yöntemlerle (1-5 gün vs yetişkin beyinlerinde için 2-3 hafta, sırasıyla) 21 karşılaştırılır. Zaten başarı olmuşturtam olarak, beyin, omurilik, lenf düğümleri, dalak, akciğer, katı tümörler, pankreas, meme bezleri ve 3,4,9 farklı organlara tatbik. Buna ek olarak, bağımsız araştırma grupları tarafından çeşitli yayınlar zaten görüntüleme 22,23 sonuçları elde etmek için bu yöntem kullanılır. Bununla birlikte, farklı doku temizleme işlemleri farklı koşullar için avantajlı olabilir. Sca / e ve SeeDB embriyonik dokular 6,7 en iyi uygulanabilir iken Örneğin, onlar görüntüleme sırasında işlemek için daha kolay olabilir, su bazlı temizleme yöntemleri vardır. Buna karşılık, BERRAKLIK karmaşık ve pahalı bir takas yöntemidir. Ama özellikle beyin 8 gibi büyük dokularda, antikor etiketleme bağlamında avantajlı olabilir. 3DISCO en iyi görüntüleme sonuçları elde etmek için en kritik adım, doku temizleme önce gerçekleştirilir doku etiketleme vardır. Bu mümkün olan en güçlü flüoresan sinyali ile başlamak için gereklidir. Bu be sentetik boyalar, transfeksiyon ya da viral antikor etiketleme izlemeyi, floresan proteinleri transgenik ekspresyonu dahil olmak üzere, çeşitli yollarla elde etti. Herhangi bir temizleme prosedürü dokuların floresan sinyalini azaltacaktır akılda tutulmalıdır. Flüoresan sinyal başında yeterince güçlü değilse Dolayısıyla, - bu temizlenir dokuların takas görüntüleme önce kolayca saptanabilir değildir, yani kötü sonuçlar verecektir. Iyileştirmeler için bekleyen yöntemleri temizleyerek bazı sınırlamalar vardır. Kritik bir sınırlama temizleyerek reaktifler temizlenir organların yapısını değiştirmesi nedeniyle, onlar canlı dokuya kullanılamaz olmasıdır. Bu nedenle, bu gibi foto-aktifleştirilebilen mEos2 24 gibi deneyler sabitleme ve temizleme önce yapılmalıdır. Açıklıkta üzerine, parlak ve ışığa proteinlerden floresan sinyal süper çözünürlüklü görüntüleme mümkün olur. İlave olarak, temizleme protokol azalırfloresan protein yoğunluğu, temizlenmiş organlar uzun süre depolanamaz. Bazı organların Silinecek zor olduğunu not etmek önemlidir. Kesilen organlarda kan hücrelerinin (örneğin, dalak, karaciğer) yüksek miktarda elde ederse, özellikle, bu açık ve görüntü nispeten zordur. Bu tür yetişkin kemirgen beyin gibi büyük dokular için tam bir temizleme elde etmek için de nispeten daha zordur. Bu dokular, diğer taraftan, floresan sinyali azaltmak olabilecek, uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. Buna ek olarak, mikroskobi yöntemlerinin geliştirilmesi görüntü büyük şeffaf organlar kerede yüksek çözünürlükte ele alınması gereken bir bekleyen ihtiyaç olabilir. Tekniğin diğer önemli kısıtlılığı doku etiketleme. Genetik ya da virüs ifade ile, güçlü bir flüoresan sinyal doğru olmakla birlikte, her bir hücre veya molekül genetik veya viral yönden etiketli olabilir. Diğer taraftan, kalın dokuların antikor etiketleme basit bir işlem değildir ya da po değilçoğu durumda ssible. Bu 3 (birkaç hafta birkaç gün) özel permeabilizasyon protokolleri ve uzun inkübasyon süreleri gerekebilir. Bu dokular nedeniyle dehidratasyon ve delipidasyon esas temizledikten sonra (omurilik dokusu için ölçülen) her boyutta ~% 20 küçültmek akılda tutmak için de önemlidir. Bu çekme ratiometrically meydana gelir ve miktar adımda düzeltilmelidir. Sunulan sonuçlarında görüldüğü gibi, floresan etiketli yapılar temizlenmiş dokularda protein bütünlüğünün göstergesi olan, sağlam kalır. Örneğin, Focusclear-ki berraklık veya% 80 gliserol içinde kullanıldığı için, nihai temizlenir doku hidrofobik doğası, ayrıca antikor ile boyandı edilemez ya da su ihtiva eden çözeltiler içinde gömülü. Son olarak, görüntüleme verileri ezici boyutlarını analiz etmek için bir meydan okumadır. Bütün bir kemirgen beyin hücresel çözünürlükte taranır Örneğin, istenilen str izlemek ve ölçmek çok zor olurduuctures (örneğin, nöronal veya glia şebekeleri) ve otomatik bir şekilde farklı örnekleri üzerinde karşılaştırın. Araştırmacılar, yeni takas yöntemleri bulmak amacı ise özetle, (çeşitli dokuları temizleyerek zorluk, daha geniş alanlara yüksek çözünürlükte görüntüleme ve karmaşık veri analizi) Yukarıda çeşitli zorluklar paralel olarak geliştirilmelidir. Sonuç olarak, 3DISCO dahil son zamanlarda geliştirilen doku temizleme teknikleri, zarif sağlam organların yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme artık mümkün olduğunu göstermektedir. Bu yöntemler kullanarak, bilim adamları, sağlam organın hücre ve moleküllerin anatomik bilgi edinebilirsiniz. Şeffaf organlar üzerinde bu öncü 3D görüntüleme çalışmaları karmaşık anatomik ve sağlığı ve hastalığı dokuların / organların moleküler örgütlerini deşifre araştırmacılar giderek artan sayıda ilham.

Biyolojik dokuların histolojik inceleme doğal bağlamda moleküller / hücrelerinin doğasını anlamada temel bir yaklaşımdır. İdeal olarak, tüm organ, yüksek çözünürlüklü görüntüleme en bilgilendirici ve arzu edilir. Işık saçılması 1 nedeniyle sınırlı bir nüfuz etme derinliği, sahip olduğu için, sabit organ yüksek çözünürlüklü mikroskopik görüntüleme gerçekleştirmek için kesitli olması gerekir. Bu nedenle, histoloji çalışmaların çoğu organın sadece küçük bir bölümünü temsil eden birkaç doku bölümleri üzerinde gerçekleştirilmiştir. Bazı çalışmalarda, örneğin, beyin veya omurilik nöron bağlantıları dışarı iz amaçlayan bu, hedef organlar tüm doku bölümleri toplanır ve 3D rekonstrüksiyon için görüntülenmiş. Ancak, doku kesit ve bireysel bölümlerin sonraki görüntüleme çeşitli sınırlamalar vardır. Bunlar olması nedeniyle mekanik bozulmalara zaman alıcı ve doku eksik 3D rekonstrüksiyon yol ve zor bulunurelde edilen görüntülerin hizada ler. Son zamanlarda, takas ve görüntüleme sağlam şeffaf organlar bu eksiklik 2,3 önemli bir çözüm olarak geliştirilmiştir. Açıklığın üzerine, tüm organı işlenir şeffaf görüntüleme hafif seyahat için izin uçtan uca böyle bir çoklu foton veya hafif sayfalık mikroskop gibi bir lazer tarama mikroskobu kullanılarak unsectioned organın yüksek çözünürlüklü görüntüler üretmek için (Şekil 1) ( Şekil 2). Çeşitli araştırma grupları farklı amaçlar için kendi ilgi doku görüntü edebilmek için yeni doku takas protokolleri geliştirmiştir. Bu organik çözücünün 2-5, 8 temizleme protokolleri su bazlı 6,7 ve elektroforez içerir. Bunlar arasında, bir çözücü 3-boyutlu görüntüleme organları temizlenmiş ya da 3DISCO merkezi sinir sistemi (CNS) organlar, immün organlar ve katı tümörler dahil olmak üzere biyolojik numune bir çeşitliliği üzerinde kolayca uygulanabilir bir protokoldür. Addit içindeiyon, bu tür ışık tabaka floresan mikroskobu (LSFM), çoklu foton ve konfokal lazer tarama mikroskobu gibi farklı mikroskopi teknikleri ile birleştirilebilir. 3DISCO örneğin 4, tetrahidrofuran (THF) ve dibenzil eter (DBE) olarak kolaylıkla temin edilebilen ve pahalı reaktifler ile takas dayanmaktadır. Tüm protokol 3-4 saat gibi kısa sürebilir. Böylece, 3DISCO 9 tamamlamak için ay hafta sürebilir geleneksel histolojik yöntemlere göre sağlam ve hızlı bir tekniktir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:201px;">Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:291px;">can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CX3CR1 GFP mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Littman lab at NYU</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td>(Mallinckrodt, 7892-04)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-2-2 Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">152463</td>
			<td>used to prepare Avertin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>186562-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270997-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dibenzyl ether&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma, 108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin FITC&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0401-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CC10</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9772</td>
			<td align="right">0.388888889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;</td>
			<td>APP pharmaceuticals&#160;</td>
			<td align="right">504001</td>
			<td>used in perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Rotator&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100498-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mL Media Storage Bottles</td>
			<td>Kimax Media Bottles</td>
			<td>EW-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Minipuls evolution perfusion pump&#160; with MF4* medium flow pump head&#160;</td>
			<td>Gilson, Inc</td>
			<td>F110701 and F117606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastWell</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>FW20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2940-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish&#160;</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dental cement&#160;</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1223PNK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Quantofix Peroxide Test Strips</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">37206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:201px;">Amira with RT resolve microscopy module 
			&#160;</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:201px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH</td>
			<td>freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Nöronlar derece derece uzun morfolojisi ile hücreler polarize edilir. Bunların işlevi birbirlerini arasında ve diğer dokular ile meydana bağlantıları bağlıdır. Bu nedenle, nöronların yapısal organizasyon haritalama, sağlık ve hastalıkta nasıl işlediğini anlamak için son derece önemlidir. Ancak, tüm sinir sistemi-son zamanlarda adında connectomics 11 boyunca böyle muazzam nöronal bağlantıları izleme - hala nörobilim alanında en zor sorunlardan biri olmaya devam etmektedir. Bu amaçla, AB 12 ve ABD 13 hem de insan beynini haritasına büyük projeler başlatmış bulunuyoruz. 3DISCO çeşitli organlar üzerinde istihdam edilebilir olsa da, omurilik ve beyindeki nöronal uzun bağlantılarını izlemek için özellikle yararlı olmuştur. Örneğin, büyük temizlenir omurilik bölümlerinin ultramicroscopy taramalar kullanılarak, aksonal bağlantıları kemirgen omurilik (santimetre üzerinde takip edilebilirŞekil 2). Benzer bir şekilde, tüm temizlenir fare beyni (Şekil 3a) ve hipokamp (Şekil 3b), beyindeki nöronal bağlantıları takip görüntülenebilir. Konfokal mikroskopi ya da çoklu foton temizlenir organlar üzerinde kullanıldığı zaman, görüntüleme çözünürlüğü önemli ölçüde, özellikle z-boyutunda, geliştirilebilir. Örneğin, GFP-M hattı fareler (Şekil 4a) temizlenir omurilik çoklu foton görüntüleme omurilik bütün derinliği (~ 1.5-2 mm) boyunca kesintisiz bir görüntü elde eder. Temizlenir omurilik konfokal mikroskopisine benzer bir şekilde (Şekil 4b ve c) gelişmiş çözünürlük sunuyor. Temizlenir beyinleri çok foton mikroskobu görüntüleme dendritik dikenler (Şekil 5) içeren sinirsel yapıların ince ayrıntıları görselleştirmek için çok yüksek çözünürlüklü görüntüler sunar. 3DISCO için örnekler vir transgen ekspresyonu dahil olmak üzere, çeşitli yollarla etiketlenebiliral transfeksiyon, boya izleme ve antikor etiketleme. Örneğin, kan-beyin-bariyerini incelemek için kullanılabilir lektin konjüge floresan izleyiciler 4 ile beyin (Şekil 6a ve b) ve omurilik (Şekil 6c ve d), (BBB tüm damar etiket mümkündür ) sağlık ve hastalık. Mikroglia ve astrositler Hem yüksek Alzheimer hastalıkları ve travmatik yaralanmalar 14,15 nörodejenerasyon dahil olmak üzere patolojisinde de işaret edilir. 3DISCO kullanarak, bunların yoğunluğu ve omurilikte dağılımı (Şekil 7) veya beyin incelenebilir. Olmayan nöronal dokular da görüntülenebilir. Örneğin, tüm kemirgen akciğerlerde Clara hücre antikorları ile imüno edilebilir ve tek hücre düzeyinde (Şekil 8) en kesit olmadan görüntülenmiş. Benzer şekilde, temizlemek mümkündür ve görüntü hücreleri örneğinunsectioned pankreas dokusu (Şekil 9) alfa hücreleri. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1.. 3DISCO doku temizleme derin doku görüntüleme için şeffaf unsectioned dokuları oluşturur. Görünür ışığın görüldüğü gibi (a) Temizlenmemiş ve temizlenmiş (b) omurilik dokuları. Açıklıkta üzerine, derin doku lazer tarayıcı mikroskop mümkün olur. (C) Temizlenmemiş ve temizlenir omurilik dokuları 2-foton mikroskobu ile görüntülenmiştir. A, b = 0.5 mm ve 100 um c = Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 2," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Şekil 2.. Aksonal uzantıları takip omurilik 3DISCO görüntüleme. Thy-1 GFP transgenik fare hattı (GFP-M) gelen disseke omurilik ~ (küçük parçalara ayrılır4 mm). Küçük dokularda (Tablo 1) için temizleme protokolü takip sonra, saydam omurilik ultramicroscopy kullanılarak görselleştirilmiştir. Yatay bir ~ 4 mm omurilik segmentinin 3D rekonstrüksiyon (a), koronal (b) ve sagital görünümü (c). (D) Temsilcisi aksonlarını (kırmızı) takip gri tonlama şeffaf görünümde gösterilir. (D) &#39;de gösterilen bölge (e) yüksek büyütme görünüşüdür. A, b, c, d = 0.5 mm ve = 20 um e Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> Temizlenir beynin hipokampus ve Şekil 3. 3DISCO görüntüleme. Temizlenir beyinleri ve GFP-M farelerin Hipokampuslardan örnekleri bir ultramicroscope ile görüntülendi. Nöronal netwo gösteren bütün beyin (a) ve hipokampus (b) 3D görselgörüntülenmiş saydam dokularda rks. A = 2 mm ve b Ölçek bar = 20 mikron. <img alt="Şekil 4," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Şekil 4,. Doku temizleme çoklu foton ve konfokal mikroskobu ile elde çözünürlüğü geliştirir. Çoklu foton (a) ya da eş odaklı mikroskopi ile görüntülenmiştir GFP-M farelerden Şeffaf omurilik kesimleri (b, c). Esasen takas akson ve dendritler ince yapısını ortaya çözünürlük ve görüntüleme derinliğini artırır unutmayın. A = 100 um ve b Ölçek çubukları, c = 20 um. <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Şekil 5. Dendritik dikenler 3DISCO görüntüleme. Çoklu foton tarafından görüntülendi GFP-M farelerin Şeffaf beyin dokusu. Ver sunulan taranmış korteks bölgesi 3D görselleştirme(a) tical ve yatay perspektifler (b). (C) &#39;de belirtilen ~ seviyelerinden 50 mikron çıkıntı (a, b). (C) dendritik dikenler (ok başları) de dahil olmak üzere nöronal yapıların ince detayları göstermek de belirtilen bölgenin (d) yüksek büyütme. B a = 50 mikron Ölçek çubukları, c = 25 mikron, d = 5 um. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> 16, anlatıldığı gibi Şekil 6,. Damar 3DISCO. Tüm organlarda kan damarları etiketlemek için, lektin-FITC boya (Açıklığın öncesi) perfüzyon sırasında kullanıldı. Biz izleyici kuyruk ven enjeksiyon izleyicinin kardiyak perfüzyon üzerinde daha iyi sinyal verir bulduğunu söz dikkat çekicidir. Sabit beyin ve omurilik toplandıktan sonra temizlenir ve i edildiultramicroscopy tarafından maged. İlgi haritası, tüm fare beyin damar 3 boyutlu görüntüleme (a) ve gri-ölçeği (a). Bir fare omurilik İlgi haritası segmenti (c) ve gri-ölçekli (d) &#39;nin damar (b) 3D görselleştirme. HeatMap lektin boyama yoğunluğuna göre oluşturulan; mavi: düşük yoğunluklu (arka plan) ve kırmızı: yüksek yoğunluklu (damarsal). A = 2 mm, b = 1 mm, ve c, d = 250 mikron Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Temizlenir CNS doku glia hücreleri Şekil 7.. 3DISCO. Mikroglia Tg (CX3CR1-EGFP) veya astrosit TGN (hGFAP-eCFP) GFP ifade eden transjenik farelerin omurilik temizlenir ve çok foton mikroskopi ile görüntülenmiştir. Mikrogliya 3D render yüzey hacim görselleştirme (a) ve şeffaf görünümde (olarak gösterilen <strong&gt; b). (C) Optik çıkıntı (~ 50 um), omurilikte mikroglia ayrıntıları göstermek için sunulmuştur. Astrositlerde 3D ​​render yüzey hacim görselleştirme (a) ve şeffaf görüntüsü (b) olarak gösterilmiştir. (F) Optik çıkıntı (~ 50 um), omurilikte astrositlerin ayrıntıları göstermek için sunulmuştur. = 50 um f a, b, d, e = 100 um ve c Ölçek çubukları. <img alt="Şekil 8," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Amacıyla clara hücrelerin antikor boyama ile bir bütün montaj lobun Şekil 8.. 3DISCO. Akciğer lobu tüm montaj antikor boyama için, 10 haftalık BABL / C dişi fareler PBS ile sağ ventrikül ile perfüze edildi akciğerlerden kan kaldırmak. Akciğerler, daha sonra, en az üç kez th hacminin% 4 PFA ile şişirilmiş ve sabitleyici olarak oda sıcaklığında O / N sabitlendie doku. Bir sonraki gün, akciğerler kısaca PBS içinde durulandı ve sağ lob 48 saat boyunca nüfuziyet veya doku batan kadar PBS içinde% 1 Triton X-100, 5 ml konulmuştur. Tüm boyamalar,% 5 FBS ve% 2 BSA içeren PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde yapılır ve durulama PBS içinde% 0.2 Triton X-100 içinde idi. Anti-CC10 ile boyama, yaklaşık olarak 6 saat için geniş yıkama, ardından 4 ° C&#39;de 72 saat idi. Birincil antikor floresan etiketleme gece boyunca 4 ° C&#39;de 6 saat için gece boyunca yaygın yıkamalar ve ardından anti-keçi-Alexa Fluor 594-ikincil antikor ile elde edilmiştir. Ertesi gün, lekeli loblar 30 dakika boyunca% 50,% 70 ve% 80 THF ile silinmesinden DBE olarak 30 dakika süre ile, DCM, ardından 20 dakika% 100 THF içinde üç yıkama 30 dakika, ardından her biri. A ve b = 1 mm ve c = 100 mikron Ölçek bar. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Rakam<html> 9. Pankreas 3DISCO. Protokol, yukarıda tarif edildiği gibi farelerde perfüzyon sonra, pankreas kesitlere ayrılmıştır ve kısa bir protokol ile temizlenir. Floresan glukagon ATG eklenen CreERT2 ile endojen fare glukagon lokusu kapsayan bir 200 kb BAC transgeni taşıyan farelerin tamoksifen tarafından uyarılan ROSA26 LSL tdTomato rekombinasyon türetilmiştir. Ok uçları adacığmdaki floresan-etiketli a hücrelerin bazı işaretleyin. A, b ve c = 1 mm ve d = 500 mikron Ölçek çubukları. <img alt="Tablo 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tablo 1. Çeşitli dokularda için Doku takas protokolleri. Farklı dokular için doku takas protokol örnekleri. Her adım için takas süresi kısaltılabilir veya takas performansını artırmak için gerektiğinde uzatılabilir unutmayın. Küçük dokuların yaklaşık ağırlığı 20-100 mg ve beyin ~ 300-500 mg dır ~ olduğunu.ttps :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; bu tablonun daha büyük bir versiyonunu görmek için buraya tıklayınız.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO at JoVE.com

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Görüntüleme 3DISCO ile Hücresel Düzeyde Sağlam Biyolojik Sistemleri Temizlendi

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Universidad San Sebastian

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.5K Görüntüleme.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

Video: Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

TMS Devlet Bağımlılık Etkileri: Motive Phosphene Davranış Bir Bakış

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Nörobilim

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Retina pigment epiteli Tüm Mount Fare Göz Diseksiyon

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

İnsan orta beyin için yüksek çözünürlüklü Fonksiyonel Manyetik Rezonans Görüntüleme Yöntemleri

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

YFP ifade Temizlendi Fare Beyin Multiphoton Mikroskopi

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Gaz kromatografisi ile operant etanol kendi kendine uygulama ve etanol belirleme sırasında etanol mikrodivaliz

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Beyin-implante Microdevices ve Çevresi Doku Bozulmamış Histolojik Karakterizasyonu

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Sağlam Yetişkin Zebra balığı Beyin Elektrofizyolojik Kayıt

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Mekanik stimülasyon ve yüksek çözünürlük görüntüleme C. elegans bir havacilik aygıtı kullanma

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Solvent-temizlenmiş beyin dokusu kuduz virüs enfeksiyonu yüksek çözünürlüklü 3D görüntüleme

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...

In Vivo Imaging of Cerebrospinal Fluid Transport through the Intact Mouse Skull using Fluorescence Macroscopy

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and magnetic resonance imaging (MRI) have enabled in vivo quantification of CSF flow but they are limited by reduced imaging volumes and low spatial resolution, respectively. Recent work has found that CSF enters the brain parenchyma through a network of perivascular spaces surrounding the pial and penetrating arteries of the rodent cortex. This perivascular entry of CSF is a primary driver of the glymphatic system, a pathway implicated in the clearance of toxic metabolic solutes (e.g., amyloid-&#946;). Here, we illustrate a new macroscopic imaging technique that allows real-time, mesoscopic imaging of fluorescent CSF tracers through the intact skull of live mice. This minimally-invasive method facilitates a multitude of experimental designs and enables single or repeated testing of CSF dynamics. Macroscopes have high spatial and temporal resolution and their large gantry and working distance allow for imaging while performing tasks on behavioral devices. This imaging approach has been validated using two-photon imaging and fluorescence measurements obtained from this technique strongly correlate with ex vivo fluorescence and quantification of radio-labeled tracers. In this protocol, we describe how transcranial macroscopic imaging can be used to evaluate glymphatic transport in live mice, offering an accessible alternative to more costly imaging modalities.

Transcranial optical imaging allows wide-field imaging of cerebrospinal fluid transport in the cortex of live mice through an intact skull.

İçinde vivo beyin omurilik akışkan taşınması floresan Makroskopisi kullanarak bozulmamış fare kafatası aracılığıyla görüntüleme

Cerebrospinal fluid (CSF) flow in rodents has largely been studied using ex vivo quantification of tracers. Techniques such as two-photon microscopy and ...