私たちは、原稿の重要な読書のためでHojer、B.ビンギョル（ジェネンテック）スクリプトナレーションに参加するため、N.ビエン-LYレクチン色素の尾静脈注射で改善された血管系のイメージングの経験を共有するための、そしてM Solloway（ジェネンテックに感謝）膵臓イメージングで使用したマウスについて。 GFP-Mのラインは、J. Sanes（セントルイスのワシントン大学）とR·リットマン（NYU）によるCX3CR1-GFPマウスによって作成されました。仕事はジェネンテック社によってサポートされている

すべての動物実験は〜3-5ヶ月齢のマウスでの動物実験委員会（機関動物実験委員会）の規制に従って行われた。著者は、競合する経済的利益を宣言していません。 1。動物灌流および組織標本タイミング：マウス+後固定あたり30〜60分（数時間から一晩）。 <ol><li>動物を計量し、ケタミン（80〜200ミリグラム/ kg）およびキシラジン（7-20 mg / kg）を2.5％のアベルチン（0.5 ml/25 g体重IP）を用いて麻酔。 </li><li>完全有効にするには麻酔のための数分待ちます。 </li><li>動物が完全に麻酔されていることを確認するために、動物のつま先と尾をつまん。 </li><li>血液が完全に組織から除去されるまで5〜10分間0.1 Mリン酸緩衝液（PB）または0.1 Mリン酸緩衝生理食塩水（PBS）で室温で最初の動物を灌流。 </li><li>固定液を灌流切り替える：0.1 M PB（または0.1 M PBS）中の4％PFAを灌流を継続/分3ミリリットルの速度で30〜40分間、4％PFAで。 </li><li>解剖されている組織を穿刺し、圧迫しないよう、 例えば 、損傷を与えることなく、慎重に関心のある器官/ Sを解剖。 </li><li> PBSで満たしたペトリ皿に臓器（結合組織、髄膜または硬膜）の周囲の余分な組織を除去する。 </li><li>数時間または一晩、4℃で4％PFA中で臓器をポスト修正PFAは、信号を消光又は特に（赤と遠赤色チャネルにおいてより少ない問題である）、GFPチャネルに対してautofluorecense残業10を増やす可能性があるため、長い後固定は避けてください。 </li><li>ただ清算手続きを開始する前に臓器を室温でPBSで2〜3倍を洗ってください。 </li></ol> 2。組織のクリアタイミング：大規模な臓器の小器官や1〜4日2-3時間。 注：導入遺伝子発現による組織の蛍光標識、ウイルストランスフェクション、染料のトレースや抗ボディラベリングはクリアする前に完了する必要があります。全ての組織のクリアステップはRTで行う。 （ニトリル手袋を使用）クリアソリューションTHF、DBE、BABB（1部のベンジルアルコールおよび2パート安息香酸ベンジル）およびジクロロメタンは毒性吸入（換気ドラフト内行動実験）であり、皮膚との直接接触は避けるべきである。 <ol><li>次のように別個のガラス瓶中で蒸留水中に50％（体積/体積）、70％、および80％THF希釈液を調製する：50％THFについては、 例えば 、容積を25ml THF及びガラス瓶中の蒸留水25mlを混合50mlのより大きい。 </li><li>静かに1〜2分間ボトルを振ることにより溶液を混合。 </li><li>はっきりガラス瓶にラベルを付けます。 </li><li>しっかり瓶を閉じ、暗いキャビネットに使用液を保持します。最良の結果を得るには、長い1〜2週間以上同じ作業のソリューションを使用しないでください。したがって、新鮮なストック試薬を使用できるようにするために、最小のボリュームとして清算ソリューションを注文。 </li><li>第一の透明溶液でガラスバイアル（ 例えば、2〜3 ml）を充填、50％THF、およびクリアを開始するためにガラスバイアル中にPBSから臓器を転送する。 </li><li>安全に蓋をガラスバイアルを閉じ、攪拌するための回転体（ 例えば 、ホイール攪拌機）を使用します。 </li><li>暗闇の中でガラスバイアルをカバーし、維持するためにアルミ箔を使用してください。一定速度（〜30 rpm）で示された時間（ 表1）のためのガラスバイアル内のサンプルを攪拌する回転装置を起動します。 </li><li>決済ソリューションを削除し、 表1の時間が終了したとき、プロトコルの次の1を追加します。 </li><li>フード内に保持されたガラスの廃棄物容器にクリア廃棄物を収集します。 最後まで、プロトコルの各決済ソリューションの前の手順を繰り返します。新しい決済ソリューションが追加されたとき（ 例えば 、DBEをTHFからの変更）新しいパスツールピペットを使用してください。 </li><li> BABBまたはDBEとの最終決済ステップでは、インキュベーション時間を延長またはSHことができますサンプルは、可視光（またはそれが脳のような非常に大規模な組織であれば、黄色がかった/透明）で完全に透明になるまでortened。 </li><li>イメージング手順など、常に最終的な決済ソリューションでクリア臓器を保管してください。 </li></ol> 3。イメージングのためにクリア臓器の準備タイミング：5月15日分。 注意：画像をクリア臓器とすぐに完全な清算が達成されるように。そのためには、光シート顕微鏡（ 例えば 、超顕微法）または共焦点/多光子顕微鏡イメージングのためのサンプルを準備するため、次の手順に従います。 注：クリア臓器は、時間の経過とともにその蛍光強度を失うことになる（特に、蛍光タンパク質GFP 等 、抗体の標識は、より耐性があり、さらに長いインキュベーションとのより良い結果を与える場合があります）。イメージングのために、種々の蛍光顕微鏡技術は、クレア臓器を適切に処理する限り使用することができるリング溶液が達成される。 <ol><li>光シート顕微鏡用<ol><li>適切にサンプルを配置したり、マウントします。 </li><li>手動で試料ホルダー4のネジを回してクリア臓器を固定します。 </li><li>最終の決済段階で使用した方BABBまたはDBE、充填されているthelightシート顕微鏡（好ましくはガラス製の）撮像チャンバー内に試料を浸し。 </li></ol></li><li>多光子/共焦点顕微鏡用<ol><li>一般的に、油や水に浸漬目標を使用したマルチフォトンや共焦点顕微鏡と画像を可能にするには、最終的なイメージングソリューションとイメージングスライド（またはイメージング室）にサンプルをマウントします。 </li><li>組織の周囲に境界線を作るために歯科用セメントを使用しています。 </li><li>歯科用セメントが完全に剛体を取得する直前にBABBまたはDBEとプールを埋める。 注意：歯科用セメントはすぐに凝固する。実際のサンプルを試す前に、それに慣れるために数回の練習。 </li><li>すぐに場所プールの中央にクリアサンプルカバーガラスでそれをカバーしています。 </li><li>プレスカバーガラスが完全に共焦点/多光子顕微鏡により最大撮像深度に到達できるようになりクリア器官の表面に歯科用セメントおよびタッチによって密封されるまで。 注：これはクリアリングソリューションは、撮影中にこぼれないことを保証します。それはBABB / DBEに耐性があるか、保護カバーを持っていない限り、レンズに害を与えることができるソリューションを、クリアに直接結像レンズを浸漬することは避けてください。 </li></ol></li></ol> 4。イメージングは​​、臓器をクリアタイミング：15〜45分。 <ol><li>顕微鏡が提供できる最高の解像度で（使用しているレンズは許可されている場合）全体をクリアした組織をカバーするZ-スキャンを収集します。 </li><li>高解像度の画像を収集するために関心領域を拡大します。 </li></ol>ソフトウェアアミラとのデータの5検討<ol><li>画像セリエをロードResolveRTモジュールとソフトウェアアミラ秒。 </li><li> 「画像読取パラメータ」ウィンドウ、[OK]を押して、正しいボクセルサイズを入力してください。 </li><li> 「マルチプレーナービュー」サブアプリケーションを選択します。そして、2次元および3次元の値を調整し、グレー値のための最適なしきい値を選択する「厚さ」スライダを使用します。 </li><li>異なる2D向きでスライスを閲覧し、3Dビューで作物コーナーモジュールを用いて試料を可視化。 注：プロトコルの詳細なトラブルシューティングガイドはErtürk ら 4に記載されています。 </li></ol>

<ol>
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開示することは何もありません。

組織決済方法はクリア器官において異なる組織層の屈折率を一致させることにより、撮像光の散乱を低減することを目指し。これにより、撮像光が深部組織に浸透し、標識された細胞/分子を刺激することができる。 17をクリアする組織のこの古い概念はDodtと同僚2による完全なマウスの脳での技術の最初の高度なアプリケーションの後に成長して注目を集めている。それ以来、3DISCO、のSca / E、ClearT2、明快さとSeeDB 3,4,7,18-20など、新しい決済方式の急速に成長しているリストがあります。基本的に、彼らはすべての蛍光標識を保存することによって深部組織イメージングのための透過的な臓器をレンダリングすることを目指しています。その中でも、3DISCOは最も簡単で再現性のある方法の一つとして際立っている。これは、比較的速い他の清算上記の方法（1-5日対成人の脳のための2〜3週間のそれぞれ）21と比較される。それは、すでに成功を収めている完全に脳、脊髄、リンパ節、脾臓、肺、固形腫瘍、膵臓、及び乳腺3,4,9などの異なる器官に適用される。また、独立した研究グループによっていくつかの出版物は、既に撮像結果22,23を取得するには、このメソッドを使用していました。それにもかかわらず、異なる組織のクリア手順は、さまざまな条件のために有利である可能性があります。のSca / EとSeeDBは胚組織6,7で最高適用可能である例えば、彼らは、撮影時の取り扱いが容易になる可能性があり、水ベースのクリア方法、である。対照的に、CLARITYは、複雑で高価な決済方法である。しかし、それは、特に、脳8などの大きな組織において、抗体標識の状況において有利で ​​あり得る。 3DISCOから最高の撮像結果を得るために最も重要なステップは、組織のクリアの前に実施される組織のラベルです。これは、可能な最も強い蛍光シグナルで開始することが必須である。これができるBeは、合成染料、ウイルストランスフェクションまたは抗体標識によってトレースを、蛍光タンパク質の遺伝子組換え発現を含む様々な方法で達成した。これは、任意の決済手続きが組織の蛍光シグナルが減少していることに留意すべきである。蛍光シグナルは、先頭部分に充分な強度がないため、 -それはクリアされた組織のクリアイメージングの前に容易に検出可能ではない、つまり悪い結果をお届けします。 改善を待っている方法をクリアするいくつかの制限があります。重要な制限は、クリアな試薬がクリア臓器の構造を変化させるので、それらは生きている組織上で使用することができないことである。したがって、このような光活性化mEos2 24と同様の実験を固定し、クリアする前に行われるべきです。クリア時には、明るく光安定タンパク質からの蛍光シグナルの超解像が可能となる。また、クリアリングプロトコルが減少するので、蛍光タンパク質の強度、クリア臓器を長期間保存することができません。これは、いくつかの臓器をクリアするのが困難であることに留意することが重要である。解剖器官は血液細胞（ 例えば 、脾臓、肝臓）を多量に保持する場合は特に、それらがクリアされ、画像が比較的困難である。このような成人の齧歯類の脳の大きさの組織のための完全な消去を達成することも比較的困難である。このような組織は、他の一方で、蛍光シグナルを減少させる可能性がある、より長いインキュベーション時間を必要とすることができる。また、高解像度で一度にすることができる画像大きい透明な器官顕微鏡検査法の開発は、対処すべき待機中の必要があることである。技術の他の重要な制限は、組織の標識である。遺伝やウイルス発現により強い蛍光シグナルが理想的ですが、必ずしもすべての細胞または分子は、遺伝子またはウイルス標識することができる。一方、厚い組織の抗体の標識は、直接的な手順またはさらにPOはありませんほとんどの場合、ssible。それは、（数週間に数日）の特別透過化プロトコルと長いインキュベーション時間が必要になる場合があります3。それは、組織による脱水、脱脂主にクリアした後に（脊髄組織を測定）、各次元で約20％に縮小していることを心に留めておくことも重要です。この収縮は、レシオメトリック発生し、定量化ステップで修正する必要があります。提示された結果で観察されたように、蛍光標識した構造がクリアされた組織中のタンパク質の完全性の指標である、そのまま残ります。 例えば 、Focusclear-するCLARITY-80％グリセロールで使用されるため、最終的にクリア組織の疎水性の性質のために、さらに抗体で染色することができない、または水を含有する溶液に包埋した。最後に、撮像データの圧倒的な大きさを分析することが課題である。全体マウス脳細胞の解像度で走査した場合、例えば、それが所望の列strをトレースし、定量化することは非常に困難であろうuctures（ 例えば 、神経細胞やグリアネットワーク）および自動化された方法で、異なる試料の上に比較する。研究者は、新しい決済方法を見つけることを目的としながら、要約すると、（多様な組織をクリアすることの難しさ、広い面積を高解像度で画像化し、複雑なデータ分析）上記の様々な課題を並行して改善されるべきである。 結論として、3DISCO含む最近開発された組織のクリア技術は、エレガントに無傷の器官の高解像度の3D画像が現在可能であることを実証している。これらの方法を使用して、科学者たちは、無傷の器官において細胞および分子の解剖学的情報を得ることができます。透明な器官でこれらの先駆的な3Dイメージング研究は、複雑な解剖学的およびヒースおよび疾患における組織/器官の分子組織を解読する研究者が増えて鼓舞。

生体組織の組織学的検査は、彼らの自然な文脈で分子/細胞の性質を理解する上での基本的なアプローチです。理想的には、臓器全体の高分解能イメージングが最も有益で所望である。光は1散乱に起因する限定された浸透深さを有しているので、固定された器官は、高解像度の顕微鏡イメージングを実行するために切断されなければならない。したがって、組織学的研究のほとんどは、器官のごく一部を表す少数の組織切片上で行われる。いくつかの研究では、 例えば、脳または脊髄におけるニューロンの接続をトレースすることを目指したものが、標的臓器からのすべての組織切片を回収し、3次元再構成のために画像化した。しかし、個々のセクションの組織切片およびその後の画像は、さまざまな制限があります。これらは機械的な歪みに起因する時間がかかり、組織の不完全な3次元再構成につながる、という困難が含まれる得られる画像の位置合わせIES。 最近では、クリアとイメージングそのまま透明器官はこの欠点2,3への重要なソリューションとして開発されました。クリア時には、器官全体がレンダリングされ、透明な撮像光が移動することを可能にエンド·ツー·エンドのような多光子または光シート顕微鏡などの走査型レーザ顕微鏡を用いunsectioned器官の高解像度画像を生成する（ 図1）（図2）。種々の研究グループは、異なる目的のために、目的の画像それらの組織にできるようにする新たな組織のクリアプロトコルを開発した。これらは、有機溶媒に2-5、8クリアプロトコルをベース水6,7および電気泳動を含む。これらの中でも、溶媒の3次元イメージングは​​、臓器をクリアまたは3DISCOは、中枢神経系（CNS）の器官、免疫器官および固形腫瘍を含む種々の生物学的サンプルに容易に適用するプロトコルである。 ADDIT中イオンは、このような光学シート蛍光顕微鏡（LSFM）、多光子共焦点レーザー走査顕微鏡などの異なる顕微鏡技術と組み合わせることができる。 3DISCOは、テトラヒドロフラン（THF）及びジベンジルエーテル（DBE）4として容易に入手可能で安価な試薬を用いてクリアすることに基づいています。プロトコル全体で3〜4時間程度の短い取ることができます。このように、3DISCOは9を完了するのに数週間から数ヶ月かかる場合があり、伝統的な組織学的方法に比べて、堅牢で高速な手法である。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:201px;">Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:291px;">can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CX3CR1 GFP mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Littman lab at NYU</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td>(Mallinckrodt, 7892-04)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-2-2 Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">152463</td>
			<td>used to prepare Avertin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>186562-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270997-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dibenzyl ether&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma, 108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin FITC&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0401-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CC10</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9772</td>
			<td align="right">0.388888889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;</td>
			<td>APP pharmaceuticals&#160;</td>
			<td align="right">504001</td>
			<td>used in perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Rotator&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100498-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mL Media Storage Bottles</td>
			<td>Kimax Media Bottles</td>
			<td>EW-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Minipuls evolution perfusion pump&#160; with MF4* medium flow pump head&#160;</td>
			<td>Gilson, Inc</td>
			<td>F110701 and F117606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastWell</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>FW20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2940-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish&#160;</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dental cement&#160;</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1223PNK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Quantofix Peroxide Test Strips</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">37206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:201px;">Amira with RT resolve microscopy module 
			&#160;</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:201px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH</td>
			<td>freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

神経細胞は、高度に非常に長い形態を有する細胞を分極されている。それらの機能は、互いに間および他の組織との形成の接続に依存します。このため、神経細胞の構造組織をマッピングすることは、彼らが健康と病気にどのように機能するか理解するために極めて重要である。しかし、全体の神経系-最近名前connectomics 11を通じてこのような巨大な神経結合をトレースする-まだ神経科学の最も困難な課題の一つである。そのためには、EUの12、米国13の両方が人間の脳をマッピングするために大規模なプロジェクトを開始した。 3DISCOは様々な臓器に用いることができるが、それは脊髄および脳内の長い神経結合をトレースするために特に有用であった。例えば、大きなクリア脊髄セグメントの超顕微法スキャンを用いて、軸索の接続が齧歯類脊髄（センチメートルにわたって追跡することができる図2）。同様に、全体のクリアマウス脳（ 図3a）および海馬（ 図3b）は、脳におけるニューロン接続を追跡する画像化することができる。 共焦点又は多光子顕微鏡をクリア器官で使用される場合、撮像分解能が著しく、特に、z次元において、向上させることができる。例えば、GFP-M線マウス（ 図4a）からクリア脊髄の多光子イメージングは、脊髄の全体の深さ（〜1.5〜2ミリメートル）の全体にわたってシームレスな画像を達成する。クリア脊髄上の共焦点縮小コピーは、同様の方法（ 図4BおよびC）に改良された解像度を提供します。クリア脳の多光子顕微鏡イメージングは、樹状突起棘（ 図5）を含むニューロンの構造の細部を視覚化するために、非常に高い解像度の画像を提供します。 3DISCOのための試料は、VIR、導入遺伝子の発現を含む様々な方法で標識することができるアルトランスフェクション、染料トレースおよび抗体標識。例えば、血液脳関門（BBBを研究するために使用することができるレクチン結合蛍光トレーサー4を用いて、脳（ 図6aおよびb）および脊髄（ 図6c及びd）の全体の血管系を標識することが可能である）健康と病気における。 ミクログリアおよびアストロサイトの両方が非常にアルツハイマー病や外傷14,15を含む神経変性の病態に関与している。 3DISCOを用いて、脊髄（ 図7）または脳におけるそれらの濃度および分布を研究することができる。 非神経組織はまた、画像化することができる。例えば、全体のげっ歯類肺におけるクララ細胞が抗体で免疫標識することができ、単一細胞レベル（ 図8）で切片化することなく、画像化した。同様に、オフにすることができ、画像セルは、例えばunsectioned膵臓組織中のα細胞（ 図9）。 <img alt="図1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> 図1。3DISCO組織クリアは深部組織イメージングのための透明unsectioned組織をレンダリングします。可視光で見られるように、（a）は、未確認とクリア（b）は、脊髄組織。クリア時には、深部組織レーザ走査顕微鏡法が可能となる。 （c）は未確認クリア脊髄組織を、2光子顕微鏡で画像化した。 、B = 0.5ミリメートルおよびC =100μmの中のスケールバーは。 <img alt="図2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> 図2。軸索の拡張に追随する脊髄の3DISCOイメージング。のThy-1 GFPトランスジェニックマウス系統（GFP-M）から解剖脊髄を小さな断片に分割して（〜4ミリメートル）。小さ ​​な組織について以下の決済プロトコル（ 表1）の後に透明な脊髄コードが超顕微法を用いて可視化した。 （b）は 、水平（a）は 、冠状および矢状ビュー（c）における〜4ミリメートル脊髄セグメントの3D再構成。 （d）は代表的には、軸索（赤色）はグレースケール透視図に示されている追跡した。 （d）の中で示された領域の（e）の高倍率図である。 、B、C、D = 0.5mmから電子内=20μmのスケールバー。 <img alt="図3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> 図3。クリア脳および海馬の3DISCOイメージング。GFP-mマウスの脳をクリアし、海馬の例は限外顕微鏡で画像化した。脳全体の（a）及び海馬の3次元視覚化（b）は、ニューロンのネットワークや通信システムを実証画像化され、透明な組織におけるRKS。 = 2ミリメートル中とB中のスケールバー=20μmである。 <img alt="図4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> 図4。組織クリアが多光子共焦点顕微鏡により得られた解像度を向上させる。マルチフォトン（a）または共焦点顕微鏡によって画像化GFP-Mマウスからの透過脊髄セグメント（B、C）。大幅にクリアしても、軸索と樹状突起の微細構造を明らかに解像度と撮像深度を向上させることに注意してください。 = 100μm単位とB中のスケールバーは、C =20μmである。 <img alt="図5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> 図5。樹状突起棘の3DISCOイメージング。多光子によって撮像されたGFP-Mマウスからの透過的な脳組織。スキャンした皮質領域の3次元視覚化バージョンで提供（a）は ticalと水平視点（b）に示す 。 （C）（a、b）の中で示された水準から〜50μmの投影。 （D）（C）において示された領域の高倍率樹状突起棘（矢頭）を含む神経細胞の構造の細部を示す。 B中=50μmの中のスケールバーは、C = 25ミクロン、D IN = 5程度である。 <img alt="図6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> 16を説明するように、図6。血管系の3DISCO。全体の臓器の血管にラベルを付けるには、レクチン-FITC色素は（クリア前）灌流時に使用された。それは我々がトレーサーの尾静脈注射はトレーサーの心臓灌流にわたって良好な信号が得られることがわかっていることを言及することは注目に値する。固定脳と脊髄を収集した後、彼らはクリアされ、私た超顕微法によってmaged。ヒートマップにおける全マウス脳の脈管構造（a）およびグレースケールの三次元視覚化の（a）。マウス脊髄ヒートマップにおけるセグメント（c）およびグレースケールの（d）の脈管構造の（b）は、3次元可視化。ヒートマップは、レクチン染色の強度に基づいて生成した;青：低強度（バックグラウンド）と赤：高強度（血管系）。 = 2ミリメートル、B = 1ミリメートル、およびC、D = 250μm単位のスケールバー。 <img alt="図7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> クリアCNS組織内のグリア細胞の図7。3DISCO。ミクログリアTGH（CX3CR1-EGFP）またはアストロサイトTGN（hGFAP-ECFP）に、GFPを発現するトランスジェニックマウスの脊髄はクリアされ、多光子顕微鏡で画像化した。ミクログリアの3Dレンダリングは、（表面ボリューム可視化（a）および透視図として示されている<strong&gt; B）。 （c）は光学投影（〜50μm）を脊髄におけるミクログリアの詳細を示すために提示される。星状細胞の3Dレンダリングは、表面ボリューム可視化（a）および透視図（b）のように示されている。 （f）は、光学投影（〜50μm）は、脊髄におけるアストロサイトの詳細を示すために提示される。 =50μmでfは、B、D、E = 100ミクロンであり、c中のスケールバーは、。 <img alt="図8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> 図8。クララ細胞の抗体染色したホールマウント肺葉の3DISCOが。肺葉のホールマウント抗体染色のために、10週齢のBALB / c雌マウスにするために、PBSで右心室を通して灌流した肺から血液を除去。肺は、その後、少なくとも3回目の量を4％PFAで膨張し、固定液中で、室温でO / N固定したE組織。翌日、肺を簡単にPBSでリンスし、右葉は、48時間透過化または組織が沈むまでPBS中の1％トリトンX-100 5mlに入れた。すべての染色を、5％FBS及び2％BSAを含有するPBS中の0.2％トリトンX-100で行い、リンスは、PBS中の0.2％トリトンX-100であった。抗CC10による染色は、約6時間にわたって徹底的な洗浄に続いて4℃で72時間加熱した。一次抗体の蛍光標識は、一晩、4℃で6時間から一晩のために十分に洗浄に続いて抗ヤギ - アレクサフルーア-594二次抗体を用いて達成された。翌日、染色された葉は50％、70％、およびDBE中で30分間、続いて、DCM中で20分間、続いて100％THF三30分間の洗浄、続いて30分ごとに、80％のTHFを介してクリアされた。およびb = 1ミリメートルとC = 100μm単位でのスケールバー。 <img alt="図9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> 図<html> 9。膵臓の3DISCOは。プロトコルで上記のようにマウスの灌流後、膵臓を解剖し、短いプロトコルでクリア。蛍光は、グルカゴンのATGに挿入CreERT2と内因性マウスグルカゴン遺伝子座にまたがる200キロバイトのBAC導入遺伝子を有するマウスのタモキシフェン治療によって誘発されるROSA26 LSL tdTomato再結合に由来している。矢頭は、島での蛍光標識α細胞の一部をマーク。 a、b、cの= 1ミリメートルおよびD = 500μm単位のスケールバー。 <img alt="表1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> 様々な組織のためのプロトコルをクリア表1。ティッシュ。異なる組織のための組織クリアリングプロトコルの例。クリアリング性能を向上させるために必要な各ステップのクリア時間を短縮または延長することができることに留意されたい。小さな組織のおよその重量は、約20〜100 mgおよび脳は〜300〜500ミリグラムである。のTTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;ターゲット=&quot; _blank &quot;&gt;この表の拡大版を表示するには、こちらをクリックしてください。

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Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

イメージングは​​3DISCOにより、細胞レベルで無傷生物系をクリア

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

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Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K ビュー.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

イメージングは​​3DISCOにより、細胞レベルで無傷生物系をクリア

イメージングは3DISCOにより、細胞レベルで無傷生物系をクリア