Damos las gracias a C. de Hojer para la lectura crítica del manuscrito, B. Bingol (Genentech) para participar en las narraciones de script, N. Bien-Ly para compartir la experiencia de mejora de imagen vascular con inyección en la vena de la cola de tinte lectina, y M Solloway (Genentech ) para los ratones utilizados en formación de imágenes páncreas. Línea de las buenas prácticas agrarias-M fue creado por J. Sanes (Universidad de Washington en St. Louis) y los ratones CX3CR1 GFP por R. Littman (NYU). El trabajo es apoyado por Genentech, Inc.

Todos los experimentos con animales se realizaron de conformidad con IACUC (Comité de Cuidado de Animales institucional y Uso) regulaciones sobre los ratones ~ 3-5 meses de edad. El autor declara no los intereses financieros de la competencia. 1. Animal de perfusión y preparación de tejido Tiempo: 30-60 min por ratón + posterior a la fijación (unas pocas horas a la noche). <ol><li> Pesar el animal y anestesiar utilizando ketamina (80-200 mg / kg) y xilazina (7-20 mg / kg) o 2,5% Avertin (0,5 ml/25 g de peso corporal IP). </li><li> Espere unos minutos para que la anestesia surta efecto completo. </li><li> Pellizcar la punta y la cola del animal para asegurarse de que el animal está totalmente anestesiado. </li><li> Perfundir el animal primero a TA con tampón fosfato 0,1 M (PB) o 0,1 M tampón fosfato salino (PBS) durante 5-10 minutos hasta que la sangre se elimina por completo del tejido. </li><li> Cambie la perfusión de solución de fijación: 4% PFA en 0,1 M PB (o 0,1 M PBS) y continuar la perfusióncon 4% PFA durante 30-40 min a una velocidad de 3 ml / min. </li><li> Diseccionar el órgano / s de interés cuidadosamente sin dañar, por ejemplo, evitar perforar y apretando el tejido que está siendo diseccionado. </li><li> Retire el tejido adicional que rodea los órganos (tejido conjuntivo, las meninges o duramadre) en una placa de Petri llena de PBS. </li><li> Post-fijar los órganos en PFA al 4% para algunas horas o durante la noche a 4 º C. Evitar largo post-fijación porque PFA podría apagar la señal o aumentar el tiempo extra autofluorecense 10 especialmente para el canal de GFP (que es un problema menor en los canales rojo y rojo lejano). </li><li> Lavar los órganos 2-3x con PBS a temperatura ambiente justo antes de comenzar el procedimiento de compensación. </li></ol> 2. Compensación de Tejidos Tiempo: 2-3 horas para los pequeños órganos y 1-4 días para los grandes órganos. Notas: El etiquetado de fluorescencia de los tejidos mediante la expresión de los transgenes, transfección viral, trazado con tintas o anti-etiquetado cuerpo debe ser completado antes de borrar. Todos los pasos de limpieza y eliminación de tejido se llevan a cabo a temperatura ambiente. Las soluciones de compensación de THF, DBE, Babb (1 parte de alcohol bencílico y benzoato de bencilo parte 2) y diclorometano son tóxicos y por inhalación (llevar a cabo experimentos en campana de humos con ventilación adecuada) y el contacto directo con la piel debe ser evitado (use guantes de nitrilo). <ol><li> Preparar 50% (vol / vol), 70%, y 80% de THF diluciones en agua destilada en frascos de vidrio separados de la siguiente manera: Para 50% de THF, por ejemplo, mezclar 25 ml de THF y 25 ml de agua destilada en una botella de vidrio con un volumen de mayores de 50 ml. </li><li> Mezcle las soluciones agitando suavemente la botella para un 1-2 min. </li><li> Etiquete la botella de vidrio claro. </li><li> Cierre bien las botellas y mantener las soluciones de trabajo en un armario oscuro. Para obtener los mejores resultados, no utilice las mismas soluciones de trabajo de más de 1-2 semanas. Por lo tanto, ordenar las soluciones de compensación como el menor volumen disponible para poder utilizar los reactivos de acciones nuevas. </li><li>Llene los frascos de vidrio (por ejemplo, 2-3 ml) con la primera solución de limpieza, 50% de THF, y la transferencia de los órganos de PBS en viales de vidrio para empezar claro. </li><li> Cierre bien los frascos de cristal con sus tapas y utilizar un rotador (por ejemplo, un agitador de rueda) para agitar. </li><li> Use papel de aluminio para cubrir y mantener los viales de vidrio en la oscuridad. Iniciar el rotador para agitar las muestras en los viales de vidrio durante el tiempo indicado (Tabla 1) a una velocidad constante (~ 30 rpm). </li><li> Eliminar la solución de limpieza y agregue la siguiente en el protocolo cuando se termina el tiempo en la Tabla 1. </li><li> Recoger los residuos de compensación en los contenedores de residuos de vidrio que se mantienen en una capucha. Repita el paso anterior para cada solución de limpieza en el protocolo hasta el final. Utilice una nueva pipeta pasteur cuando se añade una nueva solución de limpieza (por ejemplo, el cambio de THF a DBE). </li><li> En la etapa de compensación final con BABB o DBE, los tiempos de incubación pueden ser extendidos o shortened hasta que las muestras se vuelven completamente transparentes a la luz visible (o amarillento / transparente si se trata de un tejido muy grande, como el cerebro). </li><li> Mantenga despejados los órganos en la solución de limpieza final, en todo momento, incluyendo los pasos de formación de imágenes. </li></ol> 3. Preparación Órganos aclarados for Imaging Tiempo: 5-15 min. Nota: La imagen de los órganos despejadas tan pronto como se logre una compensación completa. Para ello, siga los siguientes pasos para preparar las muestras para microscopía de lámina de luz (por ejemplo, ultramicroscopía) o imágenes de microscopía confocal / multi-fotón. Nota: Los órganos borrado, pierden su fuerza de fluorescencia con el tiempo (particularmente las proteínas fluorescentes por ejemplo, las buenas prácticas agrarias, el etiquetado de anticuerpos es más resistente e incluso puede dar mejores resultados con incubaciones más largas). Para formación de imágenes, diversas técnicas de microscopía de fluorescencia se pueden utilizar, siempre y cuando el manejo adecuado de los órganos en el CLEAse logra una solución anillo. <ol><li> Para microscopía hojas luz <ol><li> Coloque o monte la muestra adecuada. </li><li> Fijar el órgano autorizado girando manualmente el tornillo del soporte de la muestra 4. </li><li> Sumergir la muestra en la cámara de formación de imágenes (preferentemente de vidrio) de microscopio TheLight hojas que se llena con BABB o DBE, lo que se utilizó en el paso de compensación final. </li></ol></li><li> Para múltiples microscopía fotónica / confocal <ol><li> Montar la muestra en una diapositiva de formación de imágenes (o una cámara de imágenes) con la solución de imagen final para ser capaz de imagen con un fotón múltiples o microscopía confocal, que suelen utilizar aceite o objetivos sumergidas en agua. </li><li> Utilice cemento dental para hacer un borde alrededor del tejido. </li><li> Llenar la piscina con BABB o DBE justo antes de cemento dental se pone totalmente rígido. Nota: El cemento dental se solidifica rápidamente; practicar un par de veces para familiarizarse con él antes de tratar las muestras reales. </li><li> Coloque inmediatamentela muestra despejado en el centro de la piscina y se cubre con una cubierta de vidrio. </li><li> Pulse el vidrio de cubierta hasta que esté completamente sellado por cemento dental y toca a la superficie del órgano despejado, lo que permitirá alcanzar la profundidad máxima de formación de imágenes por microscopía confocal / multi-fotón. Notas: Esto asegura que no hay solución de compensación será derramada durante la proyección de imagen. Evite la inmersión de la lente de imagen directamente en la solución de compensación, que puede dañar la lente a menos que sea resistente a la BABB / DBE o tiene una cubierta protectora. </li></ol></li></ol> Órganos 4. Imaging aclarados Tiempo: 15-45 min. <ol><li> Se recoge una z-scan que cubre todo el tejido borrado (si la lente utilizada permite) a la mejor resolución que el microscopio puede ofrecer. </li><li> Zoom en las regiones de interés para recoger imágenes de mayor resolución. </li></ol> 5. Examen de los datos con el software Amira <ol><li> Cargue la serie de imagens de software Amira con módulo ResolveRT. </li><li> Introduzca el tamaño de voxel correctas en la ventana y pulse ok &quot;Imagen Read Parameter&quot;. </li><li> Seleccione el &quot;Multi Planer View&quot; sub-aplicación. A continuación, utilice el control deslizante &quot;Grueso&quot; para elegir el umbral óptimo para los valores de gris, el ajuste de los valores de 2D y 3D. </li><li> Visualice la muestra, navegando por las rebanadas en diferentes orientaciones 2D y utilizando el módulo de cultivos-corner en la vista 3D. Nota: Una guía detallada del protocolo de resolución de problemas se puede encontrar en Ertürk et al 4. </li></ol>

<ol>
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No hay nada que revelar.

Métodos de limpieza y eliminación de tejido tienen como objetivo reducir la dispersión de la luz de imagen, haciendo coincidir los índices de refracción de las diferentes capas de tejido en los órganos de inmediata disposición. Como resultado, la luz de formación de imágenes puede penetrar profundamente en los tejidos y estimular las células marcadas / moléculas. Este viejo concepto de tejido de compensación 17 se ha ganado cada vez más atención después de la primera aplicación sofisticada de la técnica en los cerebros de ratón intactas por Dodt y colegas 2. Desde entonces, hay una creciente lista de nuevos métodos de compensación incluyendo 3DISCO, Sca / e, ClearT2, CLARITY y SeeDB 3,4,7,18-20. En esencia, todos ellos tienen como objetivo hacer que los órganos transparentes para imágenes de tejidos profundos mediante la preservación de la etiqueta fluorescente. Entre ellos, 3DISCO se destaca como uno de los métodos más sencillos y reproducibles. Se compara con relativa rapidez a otros métodos de compensación mencionados anteriormente (1-5 días vs 2-3 semanas para los cerebros adultos, respectivamente) 21. Ya ha sido el éxitoplenamente aplicado a diferentes órganos, como el cerebro, la médula espinal, los ganglios linfáticos, el bazo, el pulmón, los tumores sólidos, el páncreas y las glándulas mamarias 3,4,9. Además, varias publicaciones de grupos de investigación independientes que ya utilizan este método para obtener imágenes como resultado 22,23. Sin embargo, diferentes procedimientos de compensación de tejido podrían ser ventajoso para diferentes condiciones. Por ejemplo, mientras Sca / ey SeeDB se aplican mejor en tejidos embrionarios 6,7, son los métodos de compensación a base de agua, que podrían ser más fáciles de manejar durante la exploración. En contraste, la claridad es un método de compensación complicado y costoso. Sin embargo, puede ser ventajoso en el contexto del etiquetado de anticuerpos, especialmente en las grandes tejidos tales como cerebro 8. El paso más crítico para obtener los mejores resultados de las imágenes de 3DISCO es etiquetado tejido, que se realiza antes de la limpieza del tejido. Es fundamental comenzar con la señal fluorescente fuerte posible. Esto puede be conseguirse de varias formas que incluyen la expresión transgénica de las proteínas fluorescentes, la localización por colorantes sintéticos, transfección viral o etiquetado de anticuerpos. Se debe tener en cuenta que cualquier procedimiento de compensación se reducirá la señal fluorescente de los tejidos. Por lo tanto, si la señal fluorescente no es lo suficientemente fuerte como al principio - es decir, que no es fácilmente detectable antes de que el intercambio de información de imágenes de los tejidos aclarados dará resultados pobres. Hay algunas limitaciones de los métodos que están a la espera de mejoras despejar. Una limitación importante es que, puesto que los reactivos de compensación alteran la estructura de los órganos despejadas, no pueden ser utilizados en el tejido vivo. Por lo tanto, los experimentos tales como con mEos2 fotoactivable 24 se deben realizar antes de la fijación y la limpieza. Tras la limpieza, super-resolución de imagen de la señal fluorescente de proteínas brillantes y fotoestable se hace posible. Además, debido a que el protocolo de intercambio de información disminuye elintensidad de las proteínas fluorescentes, los órganos despejadas no se pueden almacenar durante períodos prolongados. Es importante señalar que algunos órganos son más difíciles de ser limpiado. Sobre todo, si los órganos diseccionados retienen grandes cantidades de células de la sangre (por ejemplo, el bazo, el hígado), son relativamente difíciles de borrar y la imagen. También es relativamente más difícil de lograr una compensación completa para grandes tejidos, tales como roedores cerebro adulto. Tales tejidos pueden necesitar tiempos de incubación más largos, lo que podría, por otra parte, reducir la señal fluorescente. Además, el desarrollo de métodos de microscopía que puede imagen grandes órganos transparentes a la vez en una de alta resolución es una necesidad a la espera de ser tratados. Otra limitación importante de la técnica es etiquetado tejido. Mientras que una señal fluorescente fuerte a través de la expresión genética o el virus es ideal, no cada célula o molécula pueden ser etiquetados genéticamente o de forma viral. Por otro lado, el etiquetado de anticuerpos de tejidos gruesos no es un procedimiento directo o incluso no POssible en la mayoría de los casos. Se puede necesitarse protocolos permeabilización especiales y tiempos de incubación largos (varios días a unas pocas semanas) 3. También es importante tener en cuenta que los tejidos se encogen ~ 20% en cada dimensión (medida para el tejido de la médula espinal) después de limpiar debido principalmente a la deshidratación y de eliminación de lípidos. Esta contracción se produce ratiometrically y debe corregirse en los pasos de cuantificación. Como se observa en los resultados presentados, estructuras marcadas fluorescentemente permanecen intactas, que es la indicación de la integridad de la proteína en los tejidos aclarados. Debido a la naturaleza hidrófoba del tejido aclarado final, no se puede teñir con más anticuerpos o incrustado en soluciones de agua contiene, por ejemplo, Focusclear-que se utiliza en glicerol CLARITY-o 80%. Finalmente, es un desafío para analizar abrumadoras tamaños de datos de imágenes. Por ejemplo, cuando toda una cerebro murino se escanea a una resolución celular, que sería muy difícil de localizar y cuantificar str deseadauctures (por ejemplo, redes neuronales o gliales) y comparar más de diferentes muestras de una manera automatizada. En resumen, mientras que los investigadores tratan de descubrir nuevos métodos de compensación, los diversos problemas mencionados (dificultad de limpieza de diversos tejidos, imágenes en alta resolución de las zonas más grandes, y el análisis de datos complicados) deberían mejorarse en paralelo. En conclusión, las técnicas de limpieza y eliminación de tejido recientemente desarrollados, incluyendo 3DISCO, elegantemente demuestran que la alta resolución de imágenes en 3D de los órganos intactos, ahora es posible. El uso de estos métodos, los científicos pueden obtener información anatómica de las células y moléculas en el órgano intacto. Estos estudios de imagen en 3D pioneros sobre órganos transparentes inspiran un creciente número de investigadores a descifrar anatómica compleja y organizaciones moleculares de los tejidos / órganos en la salud y la enfermedad.

El examen histológico de los tejidos biológicos es un enfoque fundamental en la comprensión de la naturaleza de las moléculas / células en su contexto natural. Idealmente, imágenes de alta resolución de todo el órgano es más informativo y deseada. Debido a que la luz tiene una profundidad de penetración limitada, debido a la dispersión 1, los órganos fijos tienen que ser seccionado para realizar imágenes microscópicas de alta resolución. Por lo tanto, la mayor parte de los estudios histológicos se realizan en pocas secciones de tejido que representan sólo una pequeña parte del órgano. En algunos estudios, por ejemplo, las destinadas a trazar las conexiones neuronales en el cerebro o la médula espinal, todas las secciones de tejido de los órganos diana se recogen y se va a examinar para una reconstrucción 3D. Sin embargo, seccionar los tejidos y la posterior obtención de imágenes de secciones individuales tiene varias limitaciones. Estos incluyen ser mucho tiempo y que conduce a una reconstrucción 3D incompleta del tejido, debido a las distorsiones mecánicas y difícilIES en la alineación de las imágenes resultantes. Recientemente, de compensación y de imágenes transparentes órganos intactos se ha desarrollado como una solución importante a este defecto de 2,3. Tras la limpieza, todo el órgano se vuelve transparente permitiendo a la luz imágenes de viajar de extremo a extremo (Figura 1) para producir imágenes de alta resolución del órgano unsectioned usando un microscopio de barrido láser como un fotón o hojas luz multi microscopio ( la Figura 2). Varios grupos de investigación han desarrollado nuevos protocolos de limpieza y eliminación de tejido para ser capaz de imagen de su tejido de interés para diferentes propósitos. Estos incluyen disolvente orgánico 2-5, 6,7 agua y electroforesis basada 8 protocolos de compensación. Entre ellos, de formación de imágenes 3-dimensional de disolvente se aclaró órganos o 3DISCO es un protocolo fácilmente aplicable en una variedad de muestras biológicas incluyendo el sistema nervioso central (SNC) órganos, órganos inmunes y tumores sólidos. En adicde iones, que se puede combinar con diferentes técnicas de microscopía tales como microscopía de luz hoja de fluorescencia (LSFM), múltiples fotones y microscopía confocal de barrido láser. 3DISCO se basa en la limpieza con reactivos fácilmente disponibles y baratos tales como tetrahidrofurano (THF) y éter de dibencilo (DBE) 4. El protocolo completo puede tomar tan corto como 3-4 hr. Por lo tanto, 3DISCO es una técnica robusta y rápida en comparación con los métodos histológicos tradicionales que pueden tardar semanas o meses para completar 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:201px;">Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:291px;">can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CX3CR1 GFP mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Littman lab at NYU</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td>(Mallinckrodt, 7892-04)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-2-2 Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">152463</td>
			<td>used to prepare Avertin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>186562-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270997-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dibenzyl ether&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma, 108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin FITC&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0401-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CC10</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9772</td>
			<td align="right">0.388888889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;</td>
			<td>APP pharmaceuticals&#160;</td>
			<td align="right">504001</td>
			<td>used in perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Rotator&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100498-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mL Media Storage Bottles</td>
			<td>Kimax Media Bottles</td>
			<td>EW-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Minipuls evolution perfusion pump&#160; with MF4* medium flow pump head&#160;</td>
			<td>Gilson, Inc</td>
			<td>F110701 and F117606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastWell</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>FW20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2940-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish&#160;</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dental cement&#160;</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1223PNK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Quantofix Peroxide Test Strips</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">37206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:201px;">Amira with RT resolve microscopy module 
			&#160;</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:201px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH</td>
			<td>freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

Las neuronas están altamente polarizadas células con morfología extremadamente larga. Su función depende de las conexiones que se forman entre sí y con otros tejidos. Por lo tanto, la cartografía de la organización estructural de las neuronas es muy importante para entender cómo funcionan en la salud y la enfermedad. Sin embargo, el paradero de tales enormes conexiones neuronales a lo largo de todo el sistema nervioso conectómica-recientemente nombrados 11 - sigue siendo uno de los retos más difíciles de la neurociencia. Con este fin, tanto en la UE 12 y EE.UU. 13 han puesto en marcha grandes proyectos para mapear el cerebro humano. Mientras 3DISCO se puede emplear en diversos órganos, que ha sido particularmente útil para rastrear conexiones neuronales largos en la médula espinal y el cerebro. Por ejemplo, utilizando exploraciones ultramicroscopía de grandes segmentos de la médula espinal despejadas, las conexiones axonales pueden seguirse durante centímetros en el roedor de la médula espinal (La Figura 2). En forma similar, todo el cerebro aclarado de ratón (Figura 3a) y el hipocampo (Figura 3b) se pueden obtener imágenes a seguir conexiones neuronales en el cerebro. Cuando se utiliza la microscopía confocal de fotón o múltiples en órganos despejadas, la resolución de formación de imágenes se puede mejorar de manera significativa, especialmente en dimensión z. Por ejemplo, múltiples de formación de imágenes de fotones de las médulas espinales de ratones de línea despejadas GFP-M (Figura 4A) logra una imagen sin fisuras a través de toda la profundidad (~ 1,5-2 mm) de la médula espinal. Microscopia confocal en la médula espinal despejado ofrece una mejor resolución de una forma similar (Figuras 4b y c). Múltiples imágenes de microscopía de fotones de cerebros despejadas proporciona imágenes de muy alta resolución para visualizar los detalles finos de las estructuras neuronales, incluyendo las espinas dendríticas (Figura 5). Las muestras para 3DISCO pueden ser etiquetados de varias maneras, incluyendo la expresión del transgen, virAl transfección, el trazado de colorante y el etiquetado de anticuerpos. Por ejemplo, es posible marcar toda la vasculatura del cerebro (figuras 6a y b) y la médula espinal (Figuras 6c y d) el uso de lectina conjugada trazadores fluorescentes 4, que se puede utilizar para estudiar la barrera hematoencefálica (BBB ) en la salud y la enfermedad. Ambos astrocitos y microglia son altamente implicados en la patología de la neurodegeneración, incluyendo las enfermedades de Alzheimer y lesiones traumáticas 14,15. Uso de 3DISCO, su densidad y la distribución en la médula espinal (Figura 7) o el cerebro pueden ser estudiados. Tejidos no neuronales también se pueden obtener imágenes. Por ejemplo, células de Clara en la totalidad de los pulmones de roedores pueden ser immunolabeled con anticuerpos y la imagen sin seccionar en un solo nivel de célula (Figura 8). Del mismo modo, es posible borrar y celdas de imagen, por ejemplo,células alfa en el tejido pancreático unsectioned (Figura 9). <img alt="Figura 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1. 3DISCO compensación tejido hace que los tejidos unsectioned transparentes para obtener imágenes de tejidos profundos. Sin declarar (a) y borrado (b) los tejidos de la médula espinal, como se ve por la luz visible. Tras la limpieza, el tejido de la microscopia de escaneo láser de profundidad se hace posible. (C) los tejidos de la médula espinal no liquidados y compensados ​​fueron imágenes por microscopía de 2 fotones. Las barras de escala en a, b = 0,5 mm y en c = 100 m. <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2. 3DISCO de formación de imágenes de la médula espinal a seguir extensiones axonales. La médula espinal diseccionado de Thy-1 línea de ratón transgénico GFP (GFP-M) se divide en trozos más pequeños (~4 mm). Después de seguir el protocolo de compensación para pequeños tejidos (Tabla 1) las médulas espinales transparentes se visualizaron utilizando ultramicroscopía. Reconstrucciones en 3D de un segmento de 4 mm ~ médula espinal en horizontal (a), coronal (b) y vista sagital (c). (D) Representante trazó axones (rojo) se muestran en la vista transparente en escala de grises. (E) de visión de alta magnificación de la región indicada en (d). Las barras de escala en A, B, C, D = 0,5 mm y en e = 20 micras. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3. 3DISCO imágenes del cerebro y el hipocampo despejado. Ejemplos de cerebros y los hipocampos de ratones GFP-M despejadas fueron imágenes con una ultramicroscopio. Visualizaciones en 3D de todo el cerebro (a) y el hipocampo (b) que demuestran la netwo neuronalrks en los tejidos transparentes fotografiados. Las barras de escala en a = 2 mm y en b = 20 m. <img alt="Figura 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> Figura 4. Aclaración del tejido mejora la resolución obtenida por múltiples fotones y microscopía confocal. Segmentos de la médula espinal de ratones transparentes GFP-M fotografiada por las múltiples fotones (a) o microscopía confocal (b, c). Tenga en cuenta que la limpieza sustancialmente mejora la resolución y la profundidad de formación de imágenes revelando la estructura fina de los axones y dendritas. Las barras de escala en un = 100 micras y en b, c = 20 micras. <img alt="La figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5. 3DISCO imágenes de las espinas dendríticas. Tejido cerebral de ratones transparente GFP-M fotografiados por múltiples fotones. Visualizaciones 3D de región de la corteza escaneada presentados en el versículoperspectivas ticos (a) y horizontales (b). (C) ~ 50 micras de proyección de los niveles indicados en (a, b). (D) de alta magnificación de la región indicada en (c) la demostración de los detalles finos de las estructuras neuronales, incluyendo las espinas dendríticas (puntas de flecha). Las barras de escala en a = 50 m, en b, c = 25 micras, en d = 5 micras. <img alt="La figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. 3DISCO de la vasculatura. Para etiquetar los vasos sanguíneos en los órganos enteros, se usa un colorante de lectina-FITC durante la perfusión (antes de la compensación) como se describe 16. Vale la pena mencionar que se encontró que la inyección vena de la cola del trazador da una mejor señal sobre la perfusión cardiaca del trazador. Después de recoger los cerebros fijos y la médula espinal, se borran y imaged por ultramicroscopía. Visualización en 3D de toda la vasculatura del cerebro del ratón en el mapa de calor (a) y en escala de grises (a). (B) visualización en 3D de la vasculatura de un segmento de médula espinal de ratón en mapa de calor (C) y de escala de grises (D). Los mapas de calor se generan en función de la intensidad de la tinción de lectina; azul: baja intensidad (al fondo) y el rojo: alta intensidad (vasculatura). Las barras de escala en a = 2 mm, b = 1 mm, y en c, d = 250 m. <img alt="La figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. 3DISCO de células gliales en el tejido del SNC despejado. Las médulas espinales de ratones transgénicos que expresan GFP en microglia TGH (CX3CR1-EGFP) o astrocitos TgN (hGFAP-ECFP) fueron despejados y imágenes de microscopía de fotones múltiples. Representación 3D de microglia se muestra como el volumen de la visualización de la superficie (a) y la visión transparente ( <strong&gt; b). (C) Una proyección óptica (~ 50 m) se presenta para mostrar los detalles de la microglia en la médula espinal. Representación 3D de astrocitos se muestra como la visualización de volumen de superficie (a) y la visión transparente (b). (F) Una proyección óptica (~ 50 m) se presenta para mostrar los detalles de los astrocitos en la médula espinal. Las barras de escala en a, b, d, e = 100 micras y en C, F = 50 micras. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8. 3DISCO de un lóbulo de todo el montaje de pulmón con la tinción de anticuerpos de las células Clara. Para la tinción de anticuerpos todo el montaje de los lóbulos pulmonares, 10 semanas de edad, los ratones Balb / c hembras fueron perfundidos a través del ventrículo derecho con PBS con el fin de eliminar la sangre de los pulmones. Los pulmones fueron posteriormente se inflaron con PFA al 4% y se fijaron O / N a temperatura ambiente en un fijador al menos tres veces el volumen de the tejido. Al día siguiente, los pulmones se enjuagaron brevemente en PBS y el lóbulo derecho fue puesto en 5 ml de 1% de Triton X-100 en PBS durante la permeabilización durante 48 horas o hasta que el tejido se hundió. Todas las tinciones se realizaron en 0,2% de Triton X-100 en PBS que contenía FBS al 5% y 2% de BSA y enjuagues estaban en 0,2% de Triton X-100 en PBS. La tinción con anti-CC10 fue durante 72 horas a 4 ° C, seguido de lavados extensivos para aproximadamente 6 horas. Etiquetado fluorescente del anticuerpo primario se logró con anti-cabra-Alexa Fluor-594 anticuerpo secundario durante la noche a 4 ° C, seguido de lavados extensivos durante 6 horas a durante la noche. El día siguiente, lóbulos teñidas se aclaró a través de 50%, 70%, y 80% de THF durante 30 min cada uno seguido por tres lavados de 30 min en 100% de THF, seguido por 20 min en DCM, seguido por 30 min en DBE. Las barras de escala en a y b = 1 mm y en c = 100 m. <img alt="Figura 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> Figura<html> 9. 3DISCO de páncreas. Después de la perfusión de los ratones como se describió anteriormente en el protocolo, el páncreas se disecó y se aclaró con el protocolo corto. La fluorescencia se deriva de ROSA26 LSL tdTomato recombinación inducida por el tratamiento con tamoxifeno de ratones que portan un transgén de BAC 200 kb que abarca el locus de ratón glucagón endógeno con CreERT2 insertados en el ATG de glucagón. Las puntas de flecha señalan algunas de las células alfa marcados con fluorescencia en el islote. Las barras de escala en a, b y c = 1 mm, y en d = 500 m. <img alt="Tabla 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> Tabla 1. Protocolos de limpieza y eliminación de tejido para diversos tejidos. Ejemplos de protocolos de limpieza y eliminación de tejido para diferentes tejidos. Tenga en cuenta que el tiempo de compensación para cada paso se puede reducir o ampliar, según sea necesario para mejorar el rendimiento de compensación. El peso aproximado de los tejidos pequeños es de ~ 20 a 100 mg y el cerebro es ~ 300-500 mg.TTP :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;target =&quot; _blank &quot;&gt; Haga clic aquí para ver una versión más grande de esta tabla.

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Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

Borrado de imágenes Sistemas Biológicos intactos a nivel celular por 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K vistas.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

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State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

La dependencia estatal Efectos sobre la EMT: Una mirada a la conducta motriz fosfeno

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Investigación

Neurociencias

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

Disección de un ojo del ratón de un monte entero del epitelio pigmentario de la retina

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

De alta resolución Magnética Funcional por imágenes de los métodos de resonancia cerebro medio humano

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Microscopía Multiphoton de cerebro de ratón Borrado Expresando YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdiálisis de etanol durante etanol operante determinación y la auto-administración de etanol por cromatografía de gases

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

Caracterización histológica de avería Microdevices Brain-implantado y el tejido circundante

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

Registro electrofisiológico en el cerebro del pez cebra adultos Intacto

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

Evaluación Funcional de neurotoxinas Biológica en Culturas en Red de Células Madre deriva-Sistema Nervioso Central Neuronas

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

Usando un dispositivo de microfluidos para la estimulación mecánica y alta resolución de imagen de C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

Imágenes 3D de alta resolución de la infección por el virus de la rabia en el tejido cerebral con disolventes

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...