نشكر C. Hojer لقراءة نقدية للمخطوطة، B. بينغول (جينينتيك) للمشاركة في السرد النصي، N. بيان، لي لتقاسم تجربة محسنة التصوير الأوعية الدموية مع حقن الوريد الذيل من كتين صباغة، وM Solloway (جينينتيك ) لالفئران المستخدمة في التصوير البنكرياس. تم إنشاء خط GFP-M من قبل J. سانس (جامعة واشنطن في سانت لويس) والفئران CX3CR1-GFP بواسطة R. يتمان (جامعة نيويورك). ويدعم هذا العمل من قبل جينينتيك، وشركة

أجريت جميع التجارب على الحيوانات وفقا للIACUC (اللجنة المؤسسية رعاية الحيوان واستخدام) اللوائح على الفئران القديمة ~ 3-5 أشهر. يعلن المؤلف لا المصالح المالية المتنافسة. 1. الإرواء الحيوانية وإعداد الأنسجة توقيت: 30-60 دقيقة لكل الماوس + تثبيت آخر (بضع ساعات ليلة وضحاها). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وزن الحيوان وتخدير باستخدام الكيتامين (80-200 ملغ / كلغ) وزيلازين (7-20 ملغ / كلغ) أو 2.5٪ AVERTIN (0.5 غرام من وزن الجسم ml/25 IP). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> انتظر بضع دقائق للتخدير نافذة المفعول كاملة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> قرصة أخمص القدمين، وذيل الحيوان للتأكد من أن الحيوان هو تخدير كامل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> يروي أول حيوان في RT مع 0.1 M الفوسفات العازلة (PB) أو 0.1 M الفوسفات العازلة المالحة (PBS) لمدة 5-10 دقيقة حتى تتم إزالة الدم تماما من الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تبديل نضح إلى حل تثبيتي: PFA 4٪ في 0.1 م PB (أو 0.1 M PBS) ومواصلة الترويةمع PFA 4٪ لمدة 30-40 دقيقة بسرعة 3 مل / دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تشريح الجهاز / ث الاهتمام بعناية دون الإضرار، على سبيل المثال، وتجنب ثقب والضغط على الأنسجة التي يتم تشريح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الأنسجة المحيطة اضافية الأجهزة (النسيج الضام، السحايا أو المسألة الجافية) في طبق بتري مليئة برنامج تلفزيوني. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> بعد إصلاح الأجهزة في PFA 4٪ لبضع ساعة أو بين عشية وضحاها في 4 درجة مئوية. تجنب طويلة آخر التثبيت بسبب PFA قد يطفئ إشارة أو زيادة الوقت بدل الضائع autofluorecense 10 وخاصة بالنسبة للقناة GFP (التي هي مشكلة أقل في القنوات أحمر أحمر والأبعد). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> غسل الأجهزة 2-3X مع برنامج تلفزيوني في RT فقط قبل البدء في إجراء المقاصة. </li></ol> 2. المقاصة الأنسجة توقيت: 2-3 ساعة للأجهزة الصغيرة و1-4 أيام للأجهزة الكبيرة. ملاحظات: وضع العلامات الفلورية للأنسجة عن طريق التحوير التعبير، ترنسفكأيشن الفيروسية، وتتبع صبغ أو المضادةينبغي أن يستكمل وضع العلامات الجسم قبل التطهير. يتم تنفيذ جميع الخطوات المقاصة الأنسجة في RT. الحلول المقاصة THF، قسم تعزيز الحدود، BABB (1 جزء البنزيل الكحول و 2 جزء بنزوات البنزيل) وثنائي كلورو ميثان سامة وينبغي تجنب استنشاق (إجراء التجارب في التهوية بشكل صحيح غطاء الدخان) والاتصال المباشر مع الجلد (قفازات استخدام النتريل). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إعداد 50٪ (المجلد / المجلد)، 70٪، و 80٪ التخفيفات THF في الماء المقطر في عبوات زجاجية منفصلة على النحو التالي: 50٪ لTHF، على سبيل المثال، مزج 25 مل THF و25 مل من الماء المقطر في زجاجة مع حجم من أكبر من 50 مل. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> مزيج الحلول عن طريق هز بلطف الزجاجة ل1-2 دقيقة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تسمية زجاجة بوضوح. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آمن إغلاق الزجاجات والحفاظ على حلول العمل في خزانة مظلمة. للحصول على أفضل النتائج، لا تستخدم حلول العمل نفسه أطول من 1-2 أسابيع. لذلك، من أجل الحلول المقاصة باعتبارها أصغر حجم المتاحة لتكون قادرة استخدام الكواشف الأسهم الطازجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ملء قوارير زجاجية (على سبيل المثال، 2-3 مل) مع الحل المقاصة الأولى، و 50٪ THF، ونقل الأجهزة من برنامج تلفزيوني في قارورة زجاجية لبدء المقاصة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> آمن إغلاق قارورة من الزجاج مع الأغطية واستخدام المدورة (على سبيل المثال، وهو النمام عجلة) لاثارة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام رقائق الألومنيوم لتغطية والحفاظ على قارورة زجاجية في الظلام. بدء المدورة لتحريك العينات في قوارير الزجاج للمرة المشار إليه (الجدول 1) بسرعة ثابتة (~ 30 دورة في الدقيقة). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إزالة الحل المقاصة وإضافة واحد القادم في البروتوكول عند اكتمال الوقت في الجدول 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع النفايات في حاويات النفايات المقاصة الزجاج التي يتم الاحتفاظ بها في غطاء محرك السيارة. كرر الخطوة السابقة لكل حل المقاصة في البروتوكول حتى النهاية. استخدام باستور ماصة جديدة عند إضافة محلول المقاصة جديدة (على سبيل المثال، تغيير من THF إلى DBE). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> في خطوة المقاصة النهائي مع BABB أو DBE، ومرات الحضانة يمكن تمديدها او ركلات الترجيحortened حتى تصبح العينات شفافة تماما في الضوء المرئي (أو مصفر / شفاف إذا كانت الأنسجة كبيرة جدا مثل الدماغ). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> الحفاظ على أجهزة مسح في الحل النهائي المقاصة في جميع الأوقات بما في ذلك الخطوات التصوير. </li></ol> 3. إعداد أجهزة مسح للتصوير توقيت: 5-15 دقيقة. ملاحظة: صورة أجهزة مسح في أقرب وقت يتم التوصل إلى المقاصة كاملة. تحقيقا لهذه الغاية، اتبع الخطوات التالية لإعداد العينات للفحص المجهري ورقة خفيفة (على سبيل المثال، فحص بالمجهر الفائق) أو متحد البؤر / متعددة الفوتون التصوير المجهري. ملاحظة: سوف تفقد قوة أجهزة مسح مضان على مر الزمن (البروتينات الفلورية وخصوصا على سبيل المثال، GFP؛ وضع العلامات الأجسام المضادة هي أكثر مقاومة، وربما حتى تعطي نتائج أفضل مع حضانات أطول). للتصوير، ومختلف تقنيات المجهر الفلورسنت يمكن استخدامها طالما التعامل السليم مع الأجهزة في الحريهويتحقق الحل الحلبة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> لورقة ضوء المجهر <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع أو تركيب العينة بشكل مناسب. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> إصلاح الجهاز تطهيرها من خلال تحويل المسمار من صاحب العينة 4 يدويا. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تراجع العينة إلى غرفة التصوير (ويفضل المصنوعة من الزجاج) المجهر ورقة thelight مليء BABB أو DBE، أيهما كان يستخدم في خطوة المقاصة النهائي. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> متعددة الفوتون / متحد البؤر المجهري <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جبل العينة على الشريحة التصوير (أو غرفة التصوير) مع الحل النهائي التصوير لتكون قادرة على الصورة مع الفوتون متعددة أو المجهري متحد البؤر، والتي تستخدم عادة النفط أو الأهداف المياه مغمورة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> استخدام الاسمنت الأسنان لجعل الحدود في جميع أنحاء الأنسجة. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ملء حوض السباحة مع BABB أو DBE قبل يحصل الاسمنت الأسنان جامدة تماما. ملاحظة: يتصلب الاسمنت الأسنان بسرعة؛ ممارسة عدة مرات للحصول على دراية به قبل محاولة عينات الفعلية. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> وضع على الفورمسح العينة في منتصف حمام السباحة وتغطية ذلك مع غطاء زجاجي. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> اضغط على غطاء زجاجي حتى يتم مختومة تماما من الاسمنت الأسنان واللمسات على سطح الجهاز مسح، الأمر الذي سيتيح الوصول إلى عمق التصوير القصوى التي كتبها متحد البؤر / متعدد الفوتون المجهري. ملاحظات: هذا يضمن أنه لا يوجد حل المقاصة سيسفك أثناء التصوير. تجنب غمس عدسة التصوير مباشرة في حل المقاصة، والتي يمكن أن تضر العدسة ما لم تكن مقاومة للBABB / قسم تعزيز الحدود أو لديه الغطاء الواقي. </li></ol></li></ol> أجهزة 4. التصوير مسح توقيت: 15-45 دقيقة. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> جمع المسح ض تغطي الأنسجة تطهيرها بالكامل (إذا كان يسمح للعدسة المستخدمة) بأفضل القرار الذي يمكن أن يحقق المجهر. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> التكبير في المناطق ذات الاهتمام لجمع الصور دقة أعلى. </li></ol> 5. فحص البيانات مع برمجيات أميرة <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تحميل الصورة السلسلهق لبرنامج أميرة مع وحدة ResolveRT. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> أدخل أحجام فوكسل الصحيح في &quot;صورة مقروءة معلمة&quot; نافذة واضغط موافق. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> حدد &quot;متعدد إستواء عرض&quot; التطبيق الفرعي. ثم استخدم &quot;سمك&quot; شريط التمرير لاختيار عتبة المثلى للقيم الرمادية، وتعديل 2D و 3D القيم. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> تصور عينة من تصفح شرائح مختلفة في التوجهات 2D وباستخدام وحدة المحاصيل الزاوية في عرض 3D. ملاحظة: دليل استكشاف الأخطاء وإصلاحها مفصلة للبروتوكول يمكن العثور عليها في إرتورك وآخرون 4. </li></ol>

<ol>
	<li>Tuchin, V. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Tissue optics: light scattering methods and instruments for medical diagnosis. , (2007).</li><li>Dodt, H. U., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ultramicroscopy:+three-dimensional+visualization+of+neuronal+networks+in+the+whole+mouse+brain.">Ultramicroscopy: three-dimensional visualization of neuronal networks in the whole mouse brain.</a> Nat Methods. 4, 331-336 (2007).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+the+unsectioned+adult+spinal+cord+to+assess+axon+regeneration+and+glial+responses+after+injury.">Three-dimensional imaging of the unsectioned adult spinal cord to assess axon regeneration and glial responses after injury.</a> Nat Med. 18, 166-171 (2012).</li><li>Erturk, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+imaging+of+solvent-cleared+organs+using+3DISCO.">Three-dimensional imaging of solvent-cleared organs using 3DISCO.</a> Nat Protoc. 7, 1983-1995 (2012).</li><li>Becker, K., Jahrling, N., Saghafi, S., Weiler, R., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemical+clearing+and+dehydration+of+GFP+expressing+mouse+brains.">Chemical clearing and dehydration of GFP expressing mouse brains.</a> PLoS One. 7, (2012).</li><li>Hama, H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Scale:+a+chemical+approach+for+fluorescence+imaging+and+reconstruction+of+transparent+mouse+brain.">Scale: a chemical approach for fluorescence imaging and reconstruction of transparent mouse brain.</a> Nat Neurosci. 14, 1481-1488 (2011).</li><li>Ke, M. T., Fujimoto, S., Imai, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SeeDB:+a+simple+and+morphology-preserving+optical+clearing+agent+for+neuronal+circuit+reconstruction.">SeeDB: a simple and morphology-preserving optical clearing agent for neuronal circuit reconstruction.</a> Nat Neurosci. 16, 1154-1161 (2013).</li><li>Chung, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Structural+and+molecular+interrogation+of+intact+biological+systems.">Structural and molecular interrogation of intact biological systems.</a> Nature. 497, 332-337 (2013).</li><li>Erturk, A., Bradke, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-resolution+imaging+of+entire+organs+by+3-dimensional+imaging+of+solvent+cleared+organs+(3DISCO).">High-resolution imaging of entire organs by 3-dimensional imaging of solvent cleared organs (3DISCO).</a> Exp Neurol. 242, 57-64 (2013).</li><li>Stewart, J. C., Villasmil, M. L., Frampton, M. W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Changes+in+fluorescence+intensity+of+selected+leukocyte+surface+markers+following+fixation.">Changes in fluorescence intensity of selected leukocyte surface markers following fixation.</a> Cytometry Part A : the journal of the International Society for Analytical Cytology. 71, 379-385 (2007).</li><li>Lichtman, J. W., Sanes, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ome+sweet+ome:+what+can+the+genome+tell+us+about+the+connectome.">Ome sweet ome: what can the genome tell us about the connectome.</a> Curr Opin Neurobiol. 18, 346-353 (2008).</li><li>Roh, M. I., Chung, S. H., Stulting, R. D., Kim, W. C., Kim, E. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Preserved+peripheral+corneal+clarity+after+surgical+trauma+in+patients+with+Avellino+corneal+dystrophy.">Preserved peripheral corneal clarity after surgical trauma in patients with Avellino corneal dystrophy.</a> Cornea. 25, 497-498 (2006).</li><li>Liu, J. K., Chung, C. H., Chang, C. Y., Bond Shieh, D. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bond+strength+and+debonding+characteristics+of+a+new+ceramic+bracket.">Bond strength and debonding characteristics of a new ceramic bracket.</a> American journal of orthodontics and dentofacial orthopedics : official publication of the American Association of Orthodontists, its constituent societies, and the American Board of Orthodontics. 128, 761-765 (2005).</li><li>Perry, V. H., Nicoll, J. A., Holmes, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglia+in+neurodegenerative+disease.">Microglia in neurodegenerative disease.</a> Nature reviews. Neurology. 6, 193-201 (2010).</li><li>Maragakis, N. J., Rothstein, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mechanisms+of+Disease:+astrocytes+in+neurodegenerative+disease.+Nature+clinical+practice.">Mechanisms of Disease: astrocytes in neurodegenerative disease. Nature clinical practice.</a> Neurology. 2, 679-689 (2006).</li><li>Jahrling, N., Becker, K., Dodt, H. U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D-reconstruction+of+blood+vessels+by+ultramicroscopy.">3D-reconstruction of blood vessels by ultramicroscopy.</a> Organogenesis. 5, 145-148 (2009).</li><li>Spalteholz, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> &#220;ber das Durchsichtigmachen von menschlichen und tierischen Pr&#228;paraten. , (1903).</li><li>Smith, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+neuroinflammatory+response+in+humans+after+traumatic+brain+injury.">The neuroinflammatory response in humans after traumatic brain injury.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 39, 654-666 (2012).</li><li>Zotova, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microglial+alterations+in+human+Alzheimer's+disease+following+Abeta42+immunization.">Microglial alterations in human Alzheimer's disease following Abeta42 immunization.</a> Neuropathology and applied neurobiology. 37, 513-524 (2011).</li><li>Frewin, B., Chung, M., Donnelly, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bilateral+cochlear+implantation+in+Friedreich's+ataxia:+A+case+study.">Bilateral cochlear implantation in Friedreich's ataxia: A case study.</a> Cochlear implants international. 14, 287-290 (2013).</li><li>Kim, S. Y., Chung, K., Deisseroth, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Light+microscopy+mapping+of+connections+in+the+intact+brain.">Light microscopy mapping of connections in the intact brain.</a> Trends in cognitive sciences. 17, 596-599 (2013).</li><li>Luo, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Three-dimensional+evaluation+of+retinal+ganglion+cell+axon+regeneration+and+pathfinding+in+whole+mouse+tissue+after+injury.">Three-dimensional evaluation of retinal ganglion cell axon regeneration and pathfinding in whole mouse tissue after injury.</a> Exp Neurol. 247, 653-662 (2013).</li><li>Soderblom, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Perivascular+fibroblasts+form+the+fibrotic+scar+after+contusive+spinal+cord+injury.">Perivascular fibroblasts form the fibrotic scar after contusive spinal cord injury.</a> J Neurosci. 33, 13882-13887 (2013).</li><li>McKinney, S. A., Murphy, C. S., Hazelwood, K. L., Davidson, M. W., Looger, L. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+bright+and+photostable+photoconvertible+fluorescent+protein.">A bright and photostable photoconvertible fluorescent protein.</a> Nat Methods. 6, 131-133 (2009).</li></ol>

ليس هناك شيء في الكشف عنها.

تهدف أساليب المقاصة الأنسجة للحد من تشتت الضوء التصوير عن طريق مطابقة معاملات الانكسار من طبقات الأنسجة المختلفة في أجهزة مسح. ونتيجة لذلك، لا يمكن للضوء التصوير التوغل عميقا في الأنسجة وتحفيز الخلايا المسمى / الجزيئات. وقد اكتسب هذا المفهوم القديم للأنسجة تطهير 17 الاهتمام المتزايد بعد أول تطبيق لهذه التقنية المتطورة على أدمغة فئران سليمة من قبل Dodt والزملاء 2. منذ ذلك الحين، هناك قائمة متزايدة بسرعة أساليب جديدة بما في ذلك تبادل المعلومات 3DISCO، هيئة السلع التموينية / ه، ClearT2 والوضوح وSeeDB 3،4،7،18-20. في جوهرها، وأنهم جميعا تهدف إلى جعل أجهزة شفافة للتصوير الأنسجة العميقة من خلال الحفاظ على التسمية الفلورسنت. من بينها، 3DISCO تبرز باعتبارها واحدة من الطرق الأكثر مباشرة وقابلة للتكرار. فهو سريع نسبيا بالمقارنة مع الطرق الأخرى المذكورة أعلاه المقاصة (1-5 أيام مقابل 2-3 أسابيع لأدمغة البالغين، على التوالي) 21. وقد تم بالفعل النجاحيطبق بالكامل إلى الأجهزة المختلفة مثل المخ والحبل الشوكي، والعقد اللمفاوية والطحال والرئة، والأورام الصلبة، والبنكرياس، والغدد الثديية 3،4،9. بالإضافة إلى ذلك، العديد من المنشورات من قبل مجموعات بحثية مستقلة استخدمت بالفعل هذه الطريقة للحصول على النتائج التصوير 22،23. ومع ذلك، يمكن أن تختلف إجراءات المقاصة الأنسجة يكون من المفيد لظروف مختلفة. على سبيل المثال، في حين أن هيئة السلع التموينية / ه وSeeDB قابلة للتطبيق أفضل على الأنسجة الجنينية 6،7، فهي طرق تبادل المعلومات تعتمد على الماء، والتي يمكن أن يكون أسهل في التعامل معها أثناء التصوير. في المقابل، والوضوح هو أسلوب المقاصة معقدة ومكلفة. ولكن يمكن أن يكون من المفيد في سياق وضع العلامات الضد، وخاصة في الأنسجة الكبيرة مثل الدماغ 8. الخطوة الأكثر أهمية للحصول على أفضل النتائج من التصوير 3DISCO هو وضع العلامات الأنسجة، والذي تحقق قبل المقاصة الأنسجة. فمن الضروري أن تبدأ مع أقوى إشارة الفلورسنت ممكن. هذا يمكن به تحقيقها بطرق مختلفة بما في ذلك التعبير المعدلة وراثيا من البروتينات الفلورية والبحث عن المفقودين من قبل الأصباغ الاصطناعية، ترنسفكأيشن الفيروسية أو وضع العلامات الأجسام المضادة. ينبغي أن يوضع في الاعتبار أن أي إجراء المقاصة سوف يقلل من إشارة الفلورسنت من الأنسجة. وبالتالي، إذا كانت إشارة الفلورسنت ليست قوية بما فيه الكفاية في بداية - أي أنه لا يمكن كشفها بسهولة أمام المقاصة التصوير من الأنسجة مسح سيلقي النتائج السيئة. هناك بعض القيود المفروضة على تطهير الطرق التي تنتظر التحسينات. وجود قيود أهمية هو أنه منذ الكواشف تطهير تغيير هيكل أجهزة مسح، فإنها لا يمكن أن تستخدم على الأنسجة الحية. وبالتالي، والتجارب مع مثل mEos2 photoactivatable 24 يجب أن يتم تنفيذ قبل تحديد والمقاصة. على المقاصة، فائقة التصوير القرار من إشارة الفلورسنت من البروتينات مشرق وصامد يصبح ذلك ممكنا. بالإضافة إلى ذلك، لأن البروتوكول المقاصة يقلل منكثافة البروتينات الفلورية وأجهزة مسح لا يمكن تخزينها لفترات طويلة. من المهم أن نلاحظ أن بعض الأجهزة من الصعب أن يتم مسح. خصوصا، إذا كانت أجهزة تشريح الاحتفاظ كميات عالية من خلايا الدم (على سبيل المثال، الطحال، الكبد)، فهي صعبة نسبيا لمسح والصورة. بل هو أيضا أكثر صعوبة نسبيا لتحقيق المقاصة كاملة للأنسجة كبيرة، مثل القوارض الكبار الدماغ. مثل هذه الأنسجة قد تحتاج مرات الحضانة لفترة أطول، والتي يمكن، من ناحية أخرى، والحد من إشارة الفلورسنت. بالإضافة إلى ذلك، تطوير أساليب الفحص المجهري يمكن أن صورة أجهزة شفافة كبيرة في آن واحد بدرجة وضوح عالية هو ضرورة انتظار لمعالجتها. آخر قيود هامة لهذه التقنية هي وضع العلامات الأنسجة. في حين أن إشارة قوية الفلورسنت عبر التعبير الجيني أو فيروس مثالية، وليس كل خلية أو جزيء يمكن أن توصف وراثيا أو فيروسي. من ناحية أخرى، ووضع العلامات الضد من الأنسجة سميكة ليس إجراءات واضحة أو حتى لا بوssible في معظم الحالات. قد تحتاج إلى بروتوكولات permeabilization الخاصة ومرات حضانة طويلة (عدة أيام إلى بضعة أسابيع) 3. من المهم أيضا أن نأخذ في الاعتبار أن الأنسجة يتقلص ~ 20٪ في كل البعد (قياس للأنسجة الحبل الشوكي) بعد تطهير ويرجع ذلك أساسا إلى الجفاف وإزالة الشحميات. يحدث هذا الانكماش ratiometrically وينبغي تصحيحه في الخطوات الكمي. كما لوحظ في النتائج المقدمة، لا تزال هياكل fluorescently المسمى سليمة، وهو مؤشر على سلامة البروتين في أنسجة تطهيرها. بسبب طبيعة مسعور من الأنسجة تطهيرها النهائي، فإنه لا يمكن زيادة ملطخة الأجسام المضادة أو جزءا لا يتجزأ من الحلول التي تحتوي على الماء على سبيل المثال، Focusclear-والذي يستخدم في وضوح أو 80٪ الجلسرين. أخيرا، فإنه يشكل تحديا لتحليل أحجام الساحقة من بيانات التصوير. على سبيل المثال، عندما يتم فحص دماغ الفئران كامل في قرار الخلوية، فإنه سيكون من الصعب جدا تتبع وقياس شارع المطلوبuctures (على سبيل المثال، أو الشبكات العصبية الدبقية) وقارن بين أكثر من عينات مختلفة بطريقة آلية. باختصار، في حين تهدف الباحثين لمعرفة أساليب جديدة المقاصة، ينبغي تحسين مختلف التحديات أعلاه (صعوبة تطهير الأنسجة المختلفة، والتصوير بدقة عالية من مناطق أوسع، وتحليل البيانات المعقدة) في نفس الوقت. في الختام، الأنسجة وضعت مؤخرا تقنيات المعلومات بما في ذلك 3DISCO، تثبت أن بأناقة التصوير ذات الدقة العالية 3D الأجهزة سليمة هو ممكن الآن. باستخدام هذه الطرق، يمكن للعلماء الحصول على معلومات تشريحية من الخلايا والجزيئات في الجهاز سليمة. هذه الدراسات التصوير 3D الرائدة على أجهزة شفافة مصدر إلهام لعدد متزايد من الباحثين فك التشريحية المعقدة والمنظمات الجزيئي للأنسجة / أجهزة في هيث والمرض.

الفحص النسيجي من الأنسجة البيولوجية هو نهج أساسي في فهم طبيعة الجزيئات / الخلايا في سياقها الطبيعي. من الناحية المثالية، التصوير ذات الدقة العالية للجهاز بأكمله هو أكبر قدر من المعلومات والمطلوب. لأن الضوء لديه عمق الاختراق محدودة، وذلك بسبب تناثر 1، الأجهزة الثابتة يجب أن تكون مقطوع من أجل أداء عالية الدقة التصوير المجهري. وبالتالي، فإن معظم الدراسات التي أجريت على الأنسجة وقليل من أقسام الأنسجة تمثل سوى جزء صغير من الجهاز. في بعض الدراسات، على سبيل المثال، تلك التي تهدف إلى تعقب من الوصلات العصبية في الدماغ أو الحبل الشوكي، يتم جمع جميع أقسام الأنسجة من الأعضاء المستهدفة وتصويرها لإعادة الإعمار 3D. ومع ذلك، باجتزاء الأنسجة والتصوير لاحقة من المقاطع الفردية والقيود المختلفة. وتشمل هذه كونها مضيعة للوقت ويؤدي إلى إعادة الإعمار 3D غير مكتملة من الأنسجة، وذلك بسبب التشوهات الميكانيكية وصعبةالمنشأ في محاذاة الصور الناتجة. في الآونة الأخيرة، وقد تم تطوير أجهزة التصوير المقاصة وشفافة سليمة كحل كبيرة لهذا القصور 2،3. على تبادل المعلومات، يتم تقديم الجهاز بأكمله شفافة تسمح للضوء التصوير في السفر نهاية إلى نهاية (الشكل 1) لإنتاج صور عالية الدقة من الجهاز unsectioned باستخدام مجهر المسح الضوئي ليزر مثل الفوتون أو ورقة خفيفة متعددة المجهر ( الشكل 2). وقد وضعت مجموعات بحثية مختلفة بروتوكولات تبادل المعلومات أنسجة جديدة لتكون قادرة على الصورة أنسجتهم من الفائدة لأغراض مختلفة. وتشمل هذه المذيبات العضوية 2-5، 6،7 المياه ومقرها الكهربائي 8 بروتوكولات تبادل المعلومات. فيما بينها، والتصوير 3 الأبعاد للمسح المذيبات أو أجهزة 3DISCO هو بروتوكول للتطبيق بسهولة على مجموعة متنوعة من العينات البيولوجية بما في ذلك الجهاز العصبي المركزي (CNS) أجهزة وأجهزة المناعة والأورام الصلبة. في additأيون، فإنه يمكن الجمع بين تقنيات الفحص المجهري مختلفة مثل المجهر الضوئي ورقة مضان (LSFM)، متعددة الفوتون ومتحد البؤر المسح الضوئي ليزر المجهري. ويستند 3DISCO تنقية مع الكواشف متوفرة وغير مكلفة مثل رباعي هيدرو الفوران (THF) والأثير dibenzyl (DBE) 4. بروتوكول كامل يمكن أن يستغرق قصيرة قدر 3-4 ساعة. وبالتالي، 3DISCO هي تقنية قوية وسريعة بالمقارنة مع الطرق التقليدية النسيجية التي قد تستغرق أسابيع أو شهور لإكمال 9.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="913">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:201px;">Thy-1 GFP (GFP-M) mouse</td>
			<td style="width:248px;"></td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:291px;">can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">CX3CR1 GFP mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Littman lab at NYU</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">TgN(hGFAP-ECFP) mouse</td>
			<td></td>
			<td></td>
			<td>can be obtained from Jackson&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Paraformaldehyde&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>P6148</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">Na2HPO4&#160;</td>
			<td>Mallinckrodt</td>
			<td>7917-16</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="26">
			<td height="26" style="height:26px;">NaH2PO4&#160;</td>
			<td>(Mallinckrodt, 7892-04)</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-2-2 Tribromoethanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>T48402</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">2-Methyl-2-butanol</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">152463</td>
			<td>used to prepare Avertin solution</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Saline&#160;</td>
			<td>Braun</td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Tetrahydrofuran&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>186562-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dichloromethane&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>270997-12X100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dibenzyl ether&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>Sigma, 108014-1KG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl alcohol&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>305197-100ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Benzyl benzoate&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>B6630-250ML</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Lectin FITC&#160;</td>
			<td>Sigma</td>
			<td>L0401-1MG</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">anti-CC10</td>
			<td>Santa Cruz</td>
			<td>SC-9772</td>
			<td align="right">0.388888889</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Heparin&#160;</td>
			<td>APP pharmaceuticals&#160;</td>
			<td align="right">504001</td>
			<td>used in perfusion&#160;</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass vials&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>548-0554</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Forceps&#160;</td>
			<td>FST</td>
			<td>11251-10</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Mini Rotator&#160;</td>
			<td>VWR</td>
			<td>100498-878</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Aluminum Foil&#160;</td>
			<td>Fisherbrand</td>
			<td>01-213-104</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">100mL Media Storage Bottles</td>
			<td>Kimax Media Bottles</td>
			<td>EW-34523-00</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="60">
			<td height="60" style="height:60px;">Minipuls evolution perfusion pump&#160; with MF4* medium flow pump head&#160;</td>
			<td>Gilson, Inc</td>
			<td>F110701 and F117606</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microscopy slide</td>
			<td>VWR</td>
			<td>48311-703</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">FastWell</td>
			<td>Grace Bio-Labs</td>
			<td>FW20</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Cover slip</td>
			<td>Corning</td>
			<td>2940-245</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Glass petri dish&#160;</td>
			<td>Corning Pyrex</td>
			<td>3160-101</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Dental cement&#160;</td>
			<td>Lang Dental</td>
			<td>1223PNK</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="40">
			<td height="40" style="height:40px;">Quantofix Peroxide Test Strips</td>
			<td>Sigma</td>
			<td align="right">37206</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="81">
			<td height="81" style="height:81px;width:201px;">Amira with RT resolve microscopy module 
			&#160;</td>
			<td>Visage Imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="41">
			<td height="41" style="height:41px;width:201px;">Imaris</td>
			<td>Bitplane imaging</td>
			<td>image analysis software</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ImageJ&#160;</td>
			<td>NIH</td>
			<td>freeware</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

imaging cleared intact biological systems at a cellular level by 3disco

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact organs. Unlike traditional histological methods, where the tissue of interest is sectioned for fluorescent imaging, 3D imaging of cleared tissue allows examination of labeled cells and molecules in the entire specimen. To this end, optically opaque tissues should be rendered transparent by matching the refractory indices throughout the tissue. Subsequently, the tissue can be imaged at once using laser-scanning microscopes to obtain a complete high-resolution 3D image of the specimen. A growing list of tissue clearing protocols including 3DISCO, CLARITY, Sca/e, ClearT2, and SeeDB provide new ways for researchers to image their tissue of interest as a whole. Among them, 3DISCO is a highly reproducible and straightforward method, which can clear different types of tissues and can be utilized with various microscopy techniques. This protocol describes this straightforward procedure and presents its various applications. It also discusses the limitations and possible difficulties and how to overcome them.

الخلايا العصبية وخلايا الاستقطاب للغاية مع التشكل طويلة للغاية. وظيفتها يعتمد على الاتصالات التي كانت تشكل بين بعضها البعض ومع الأنسجة الأخرى. وبالتالي، ورسم خرائط التنظيم الهيكلي من الخلايا العصبية مهم للغاية من أجل فهم كيفية عملها في الصحة والمرض. ومع ذلك، تتبع مثل هذه الاتصالات العصبية هائلة في جميع أنحاء بأكمله العصبي connectomics اسمه نظام في الآونة الأخيرة 11 - لا تزال واحدة من أصعب التحديات في علم الأعصاب. تحقيقا لهذه الغاية، وقد بدأت كل من الولايات المتحدة والاتحاد الأوروبي 12 13 المشاريع الكبيرة إلى خريطة الدماغ البشري. بينما 3DISCO يمكن استخدامها على الأجهزة المختلفة، فقد كان مفيدا بشكل خاص لتتبع الوصلات العصبية طويلة في الحبل الشوكي والدماغ. على سبيل المثال، وذلك باستخدام بالاشعة فحص بالمجهر الفائق من شرائح الحبل الشوكي تطهيرها كبيرة، ويمكن أن يتبع اتصالات محور عصبي أكثر من سم في النخاع الشوكي القوارض (الشكل 2). بطريقة مماثلة، كامل الدماغ تطهيرها الماوس (الشكل 3A) وقرن آمون (الشكل 3B) ولا يمكن تصوير لمتابعة الوصلات العصبية في الدماغ. عند استخدام متحد البؤر أو متعدد الفوتون المجهري على أجهزة مسح والتصوير القرار يمكن تحسينها بشكل كبير، خصوصا في ض البعد. على سبيل المثال، متعددة الفوتون التصوير من النخاع الشوكي تطهيرها من الفئران خط GFP-M (الشكل 4A) يحقق صورة سلس في جميع أنحاء عمق بأكمله (~ 1.5-2 ملم) من الحبل الشوكي. microcopy متحد البؤر على الحبل الشوكي مسح يسلم تحسين القرار بطريقة مماثلة (أرقام 4B و ج). متعددة التصوير الفوتون المجهري من العقول مسح صورا عالية الدقة جدا لتصور التفاصيل الدقيقة من الهياكل العصبية بما في ذلك العمود الفقري شجيري (الشكل 5). العينات ل3DISCO يمكن أن توصف بطرق مختلفة بما في ذلك التحوير التعبير، فيرآل ترنسفكأيشن، تتبع صبغ ووضع العلامات الأجسام المضادة. على سبيل المثال، فمن الممكن لتسمية الأوعية الدموية بأكملها من الدماغ (أرقام 6A وب) والحبل الشوكي (أرقام 6C ود) باستخدام كتين مترافق استشفاف الفلورسنت 4، والتي يمكن استخدامها لدراسة الدماغ من العوائق الدم (BBB ) في الصحة والمرض. كلا الخلايا الدبقية الصغيرة والخلايا النجمية وتورط للغاية في علم الأمراض من تنكس عصبي بما في ذلك الأمراض الزهايمر والإصابات 14،15. باستخدام 3DISCO، يمكن دراستها كثافتها وتوزيعها في الحبل الشوكي (الشكل 7) أو الدماغ. كما يمكن تصوير الأنسجة غير العصبية. على سبيل المثال، خلايا كلارا في الرئتين القوارض بأكمله يمكن immunolabeled مع الأجسام المضادة وتصويرها دون باجتزاء على مستوى خلية واحدة (الشكل 8). وبالمثل، فمن الممكن لمسح الصورة والخلايا مثلاخلايا ألفا في البنكرياس الأنسجة unsectioned (الشكل 9). <img alt="الشكل 1" fo:content-width="4in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig1highres.jpg" width="500" /> الشكل 1. يجعل 3DISCO المقاصة الأنسجة الأنسجة unsectioned شفافة للتصوير الأنسجة العميقة. غير مطهرة (أ) وتطهيرها (ب) أنسجة الحبل الشوكي كما يراها الضوء المرئي. على تبادل المعلومات، ويصبح العميق الأنسجة المسح المجهري بالليزر ممكن. (ج) تم تصوير أنسجة الحبل الشوكي غير مطهرة وتطهيرها بنسبة 2 الفوتون المجهري. أشرطة النطاق في أ، ب = 0.5 مم وج = 100 ميكرون. <img alt="الرقم 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig2highres.jpg" width="500" /> الشكل 2. ينقسم 3DISCO تصوير النخاع الشوكي لمتابعة التمديدات محور عصبي الحبل الشوكي تشريح من لدنك-1 GFP المعدلة وراثيا خط الماوس (GFP-M) إلى أجزاء أصغر (~4 ملم). بعد اتباع بروتوكول المقاصة لأنسجة صغيرة (الجدول 1) كانت تصور النخاع الشوكي شفافة باستخدام فحص بالمجهر الفائق. اعادة البناء 3D من 4 مم شريحة الحبل الشوكي ~ في الأفقي (أ)، الاكليلية (ب) وعرض السهمي (ج). (د) تتبع الممثل محاور عصبية (الحمراء) وترد في عرض شفافة الرمادي. (ه) بترف التكبير من المنطقة المشار إليها في الفقرة (د). أشرطة النطاق في أ، ب، ج، د = 0.5 مم وه = 20 ميكرون. <img alt="الرقم 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig3highres.jpg" width="500" /> الشكل 3. التصوير 3DISCO من الدماغ والحصين تطهيرها. تم تصوير أمثلة على العقول وتطهيرها الحصين من الفئران GFP-M مع مجهر فائق. تصورات 3D من الدماغ بأكمله (أ) وقرن آمون (ب) مما يدل على الشبكات العصبيةRKS في الأنسجة شفافة تصويرها. أشرطة النطاق في = 2 مم وب = 20 ميكرون. <img alt="الرقم 4" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig4highres.jpg" width="500" /> الشكل 4. المقاصة الأنسجة يعزز القرار التي حصلت عليها ومتعددة الفوتون المجهري متحد البؤر. شفاف شرائح من الحبل الشوكي الفئران GFP-M التقط بواسطة متعدد الفوتون (أ) أو المجهري متحد البؤر (ب، ج). نلاحظ أن يحسن إلى حد كبير بمسح القرار وعمق التصوير الكشف عن هيكل غرامة من المحاور والتشعبات. أشرطة النطاق في = 100 ميكرون وفي ب، ج = 20 ميكرون. <img alt="الرقم 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig5highres.jpg" width="500" /> الرقم 5. 3DISCO التصوير من العمود الفقري شجيري. أنسجة المخ شفاف من الفئران GFP-M التقط بواسطة متعدد الفوتون. تصورات 3D من المنطقة الممسوحة ضوئيا القشرة المقدمة في النسخةوجهات نظر تلك الواقعة على الدولة (أ) والأفقي (ب). (ج) ~ 50 ميكرون الإسقاط من المستويات المشار إليها في (أ، ب). (د) التكبير العالية من المنطقة المشار إليها في (ج) مما يدل على التفاصيل الدقيقة من الهياكل العصبية بما في ذلك العمود الفقري شجيري (السهام). أشرطة النطاق في = 50 ميكرون، في ب، ج = 25 ميكرون، في د = 5 ميكرون. <img alt="الرقم 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig6highres.jpg" width="500" /> الرقم 6. 3DISCO من الأوعية الدموية. لتسمية الأوعية الدموية في الأجهزة بأكمله، وكان يستخدم كتين-FITC صبغ خلال نضح (قبل المقاصة) كما هو موضح 16. من الجدير بالذكر الإشارة إلى أن وجدنا أن حقن الوريد الذيل من التتبع يعطي إشارة أفضل على نضح القلب من التتبع. بعد جمع العقول الثابتة والنخاع الشوكي، وأنها أزيلت وطماجد عن طريق فحص بالمجهر الفائق. 3D تصور كامل الأوعية الدموية في الدماغ في الماوس heatmap (أ) ومقياس الرمادية (أ). (ب) 3D التصور من الأوعية الدموية من شريحة الماوس الحبل الشوكي في heatmap (ج) والرمادي النطاق (د). تم إنشاء heatmaps استنادا إلى شدة كتين تلطيخ؛ الزرقاء: كثافة منخفضة (الخلفية) والحمراء: كثافة عالية (الأوعية الدموية). أشرطة النطاق في = 2 مم، ب = 1 مم، وفي ج، د = 250 ميكرون. <img alt="الرقم 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig7highres.jpg" width="500" /> الرقم 7. الخلايا الدبقية 3DISCO في أنسجة الجهاز العصبي المركزي تطهيرها. تم تطهير والنخاع الشوكي من الفئران المعدلة وراثيا معربا عن GFP في الخلايا الدبقية الصغيرة TGH (CX3CR1-EGFP) أو الخلايا النجمية تيراغرام نتروز (hGFAP-ECFP) والتقط بواسطة متعدد الفوتون المجهري. ويرد 3D جعل من الخلايا الدبقية الصغيرة كما سطح حجم التصور (أ) وعرض شفافة ( <sترونج&gt; ب). (ج) يتم تقديم أحد الإسقاط الضوئية (~ 50 ميكرون) لإظهار تفاصيل الخلايا الدبقية الصغيرة في النخاع الشوكي. ويرد 3D جعل من الخلايا النجمية كما حجم سطح التصور (أ) و شفافة الرأي (ب). (و) يرد أحد الإسقاط الضوئية (~ 50 ميكرون) لإظهار تفاصيل عن الخلايا النجمية في الحبل الشوكي. أشرطة النطاق في أ، ب، د، ه = 100 ميكرون وج، و = 50 ميكرون. <img alt="الرقم 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig8highres.jpg" width="500" /> الرقم 8. 3DISCO من كل جبل الفص الرئة مع تلوين الأجسام المضادة للخلايا كلارا. لكامل جبل تلوين الأجسام المضادة من فصوص الرئة، وperfused عمره 10 أسابيع الفئران BALB / C الإناث من خلال البطين الأيمن مع برنامج تلفزيوني من أجل إزالة الدم من الرئتين. وتضخم الرئتين في وقت لاحق مع PFA 4٪ وثابتة O / N في RT في تثبيتي على الأقل ثلاثة أضعاف حجم اله الأنسجة. اليوم التالي، تم تشطف الرئتين لفترة وجيزة في برنامج تلفزيوني، وكان وضع الفص الأيمن في 5 مل من 1٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني عن permeabilization لمدة 48 ساعة أو حتى غرقت الأنسجة. أجريت جميع stainings في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني تحتوي على 5٪ FBS و 2٪ BSA وكانت يشطف في 0.2٪ تريتون X-100 في برنامج تلفزيوني. تلطيخ مع المضادة للCC10 كان لمدة 72 ساعة في 4 درجات مئوية تليها يغسل واسعة لحوالي 6 ساعة. وقد تحقق وضع العلامات الفلورية من الأجسام المضادة الأولية مع مكافحة الماعز اليكسا فلور-594 الضد الثانوية بين عشية وضحاها في 4 درجات مئوية تليها يغسل واسعة لمدة 6 ساعة ليلة وضحاها. في اليوم التالي، تم تطهير فصوص الملون من خلال 50٪، 70٪، و 80٪ THF لمدة 30 دقيقة كل تليها ثلاث غسلات 30 دقيقة في 100٪ THF، تليها 20 دقيقة في DCM، تليها 30 دقيقة في قسم تعزيز الحدود. أشرطة النطاق في أ و ب = 1 مم وج = 100 ميكرون. <img alt="الرقم 9" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51382/51382fig9highres.jpg" width="500" /> شخصية<html> 9. 3DISCO من البنكرياس. بعد نضح من الفئران كما هو موضح أعلاه في البروتوكول، تم تشريح البنكرياس وتطهيرها مع بروتوكول قصيرة. مشتق من مضان ROSA26 LSL tdTomato إعادة التركيب الناجمة عن العلاج تاموكسيفين من الفئران يحمل 200 كيلو بايت BAC التحوير تمتد الماوس الذاتية الجلوكاجون مكان مع CreERT2 إدراجها في ATG من الجلوكاجون. والنصال احتفال بعض الخلايا ألفا الفلورسنت المسمى في جزيرة. أشرطة النطاق في أ، ب، ج = 1 مم ود = 500 ميكرون. <img alt="الجدول 1" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg" width="600" /> الجدول 1. بروتوكولات تبادل المعلومات الأنسجة لالأنسجة المختلفة. أمثلة من الأنسجة بروتوكولات تبادل المعلومات عن الأنسجة المختلفة. لاحظ أن الوقت المقاصة لكل خطوة يمكن اختصارها أو تمديدها حسب الحاجة لتحسين أداء المقاصة. وزن تقريبي من الأنسجة الصغيرة ~ 20-100 ملغ والدماغ هو ~ 300-500 ملغ.ال تي تي بي :/ / www.jove.com/files/ftp_upload/51382/51382table1.jpg &quot;الهدف =&quot; _blank &quot;&gt; الرجاء انقر هنا لمشاهدة نسخة أكبر من هذا الجدول.

Watch this Scientific Journal Video about Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO at JoVE.com

Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen.

التصوير مسح النظم البيولوجية السليمة على المستوى الخلوي عن طريق 3DISCO

Tissue clearing and subsequent imaging of transparent organs is a powerful method to analyze fluorescently labeled cells and molecules in 3D, in intact ...

imaging-cleared-intact-biological-systems-at-cellular-level

Research

JoVE Journal

Neuroscience

26.4K Views.  Genentech, Inc.. To obtain high-resolution images of fluorescently labeled cells within large tissues, ideally, the biological samples should be imaged without sectioning. 3DISCO is a straightforward tissue clearing procedure based on sequential incubation with organic solvents. Upon clearing, the organs become transparent allowing an end-to-end laser scan of the specimen. 

Video: Imaging Cleared Intact Biological Systems at a Cellular Level by 3DISCO

State-Dependency Effects on TMS:  A Look at Motive Phosphene Behavior

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate cortical excitability (either increasing or decreasing it) via the application of localized magnetic field pulses.1,2 Within the field of TMS, the term state dependency refers to the initial, baseline condition of the particular neural region targeted for stimulation. As can be inferred, the effects of TMS can (and do) vary according to this primary susceptibility and responsiveness of the targeted cortical area.3,4,5

In this experiment, we will examine this concept of state dependency through the elicitation and subjective experience of motive phosphenes. Phosphenes are visually perceived flashes of small lights triggered by electromagnetic pulses to the visual cortex. These small lights can assume varied characteristics depending upon which type of visual cortex is being stimulated. In this particular study, we will be targeting motive phosphenes as elicited through the stimulation of V1/V2 and the V5/MT+ complex visual regions.6

In this article, we examine the effects of visually relevant state dependency on TMS induced motive phosphenic presentations.

التبعية للدولة التأثيرات على TMS : نظرة على سلوك الدافع وبصة

Transcranial magnetic stimulation (TMS) is a non-invasive neurostimulatory and neuromodulatory technique that can transiently or lastingly modulate ...

Dissection of a Mouse Eye for a Whole Mount of the Retinal Pigment Epithelium

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and cones). The RPE is a monolayer of pigmented cuboidal cells and associates closely with the neural retina just above it. This association makes the RPE of great interest to researchers studying retinal diseases. The RPE is also the site of an in vivo assay of homology-directed DNA repair, the pun assay. The mouse eye is particularly difficult to dissect due to its small size (about 3.5mm in diameter) and its spherical shape. This article demonstrates in detail a procedure for dissection of the eye resulting in a whole mount of the RPE. In this procedure, we show how to work with, rather than against, the spherical structure of the eye. Briefly, the connective tissue, muscle, and optic nerve are removed from the back of the eye. Then, the cornea and lens are removed. Next, strategic cuts are made that result in significant flattening of the remaining tissue. Finally, the neural retina is gently lifted off, revealing an intact RPE, which is still attached to the underlying choroid and sclera. This whole mount can be used to perform the pun assay or for immunohistochemistry or immunofluorescent assessment of the RPE tissue.

A formal demonstration of the dissection of a mouse eye, resulting in a whole mount of the retinal pigment epithelium.

تشريح العين ماوس لجبل الجامعة للصبغات الظهارة الشبكية

The retinal pigment epithelium (RPE) lies at the back of the mammalian eye, just under the neural retina, which contains the photoreceptors (rods and ...

High-resolution Functional Magnetic Resonance Imaging Methods for Human Midbrain

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon measuring activity on the surface of cerebral cortex rather than in subcortical regions such as midbrain and brainstem. Subcortical fMRI must overcome two challenges: spatial resolution and physiological noise. Here we describe an optimized set of techniques developed to perform high-resolution fMRI in human SC, a structure on the dorsal surface of the midbrain; the methods can also be used to image other brainstem and subcortical structures.
High-resolution (1.2 mm voxels) fMRI of the SC requires a non-conventional approach. The desired spatial sampling is obtained using a multi-shot (interleaved) spiral acquisition1. Since, T2* of SC tissue is longer than in cortex, a correspondingly longer echo time (TE ~ 40 msec) is used to maximize functional contrast. To cover the full extent of the SC, 8-10 slices are obtained. For each session a structural anatomy with the same slice prescription as the fMRI is also obtained, which is used to align the functional data to a high-resolution reference volume.
In a separate session, for each subject, we create a high-resolution (0.7 mm sampling) reference volume using a T1-weighted sequence that gives good tissue contrast. In the reference volume, the midbrain region is segmented using the ITK-SNAP software application2. This segmentation is used to create a 3D surface representation of the midbrain that is both smooth and accurate3. The surface vertices and normals are used to create a map of depth from the midbrain surface within the tissue4.
Functional data is transformed into the coordinate system of the segmented reference volume. Depth associations of the voxels enable the averaging of fMRI time series data within specified depth ranges to improve signal quality. Data is rendered on the 3D surface for visualization.
In our lab we use this technique for measuring topographic maps of visual stimulation and covert and overt visual attention within the SC1. As an example, we demonstrate the topographic representation of polar angle to visual stimulation in SC.

This article describes techniques to perform high-resolution functional magnetic resonance imaging with 1.2 mm sampling in human midbrain and subcortical structures using a 3T scanner. Use of these techniques to resolve topographic maps of visual stimulation in the human superior colliculus (SC) is given as an example.

عالية الدقة التصوير بالرنين المغناطيسي الوظيفي للطرق الدماغ المتوسط ​​الإنسان

Functional MRI (fMRI) is a widely used tool for non-invasively measuring correlates of human brain activity. However, its use has mostly been focused upon ...

Multiphoton Microscopy of Cleared Mouse Brain Expressing YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the organ before imaging.1,2 However, for organs that contain fluorescent proteins such as GFP and YFP, optical clearing protocols that use methanol dehydration and clear using benzyl alcohol:benzyl benzoate (BABB) while unprotected from light3 do not preserve the fluorescent signal. The protocol presented here is a novel way in which to perform whole organ optical clearing on mouse brain while preserving the fluorescence signal of YFP expressed in neurons. Altering the optical clearing protocol such that the organ is dehydrated using an ethanol graded series has been found to reduce the damage to the fluorescent proteins and preserve their fluorescent signal for multiphoton imaging.4 Using an optimized method of optical clearing with ethanol-based dehydration and clearing by BABB while shielded from light, we show high-resolution multiphoton images of yellow fluorescent protein (YFP) expression in the neurons of a mouse brain more than 2 mm beneath the tissue surface.

Multiphoton microscopy of whole mouse organs is possible by optically clearing the organ before imaging, but not all protocols preserve the fluorescent signal of fluorescent proteins. Using an optical clearing method with ethanol-based dehydration and benzyl alcohol:benzyl benzoate clearing, we show high-resolution multiphoton images of whole mouse brain expressing YFP.

Multiphoton المجهر من مخ الفأر مسح تعرب عن YFP

Multiphoton microscopy of intrinsic fluorescence and second harmonic generation (SHG) of whole mouse organs is made possible by optically clearing the ...

Microdialysis of Ethanol During Operant Ethanol Self-administration and Ethanol Determination by Gas Chromatography

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol. However, ethanol is typically self-administered orally, rather than intravenously like many other drugs of abuse. The pharmacokinetics of orally administered drugs are more complex than intravenously administered drugs. Because understanding the relationship between the pharmacological and behavioral effects of ethanol requires knowledge of the time course of ethanol reaching the brain during and after drinking, we use in vivo microdialysis and gas chromatography with flame ionization detection to monitor brain dialysate ethanol concentrations over time. 
Combined microdialysis-behavioral experiments involve the use of several techniques. In this article, stereotaxic surgery, behavioral training and microdialysis, which can be adapted to test a multitude of self-administration and neurochemical centered hypotheses, are included only to illustrate how they relate to the subsequent phases of sample collection and dialysate ethanol analysis. Dialysate ethanol concentration analysis via gas chromatography with flame-ionization detection, which is specific to ethanol studies, is described in detail. Data produced by these methods reveal the pattern of ethanol reaching the brain during the self-administration procedure, and when paired with neurochemical analysis of the same dialysate samples, allows conclusions to be made regarding the pharmacological and behavioral effects of ethanol.

A method to determine the time course of ethanol concentration in the brains of rats during operant ethanol self-administration is described. Gas chromatography with flame ionization detection is used to quantify ethanol in the dialysate samples, because it has the sensitivity required for the small volumes that are generated.

Microdialysis من الإيثانول خلال فعال الإيثانول الإدارة الذاتية والايثانول تقرير بواسطة جهاز الكروماتوجرافي الغازي

Operant self-administration methods are commonly used to study the behavioral and pharmacological effects of many drugs of abuse, including ethanol.  ...

Intact Histological Characterization of Brain-implanted Microdevices and Surrounding Tissue

Research into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices that interface chronically with surrounding brain tissue. Tissue surrounding these implants is thought to react to the presence of the devices over time, which includes the formation of an insulating "glial scar" around the devices. However, histological analysis of these tissue changes is typically performed after explanting the device, in a process that can disrupt the morphology of the tissue of interest.
Here we demonstrate a protocol in which cortical-implanted devices are collected intact in surrounding rodent brain tissue. We describe how, once perfused with fixative, brains are removed and sliced in such a way as to avoid explanting devices. We outline fluorescent antibody labeling and optical clearing methods useful for producing an informative, yet thick tissue section. Finally, we demonstrate the mounting and imaging of these tissue sections in order to investigate the biological interface around brain-implanted devices.

Here we present a histological method for capturing, labeling, optically clearing, and imaging the intact brain tissue interface around chronically implanted microdevices in rodent brain tissue. Results from the techniques comprising this method are useful for understanding the impact of various penetrating brain-implants on their surrounding tissue.

توصيف نسيجية سليمة من الأجهزة بالغة الصغر زرع الدماغ والأنسجة المحيطة بها

Research  into the design and utilization of brain-implanted microdevices, such as  microelectrode arrays, aims to produce clinically relevant devices ...

Electrophysiological Recording in the Brain of Intact Adult Zebrafish

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram recordings. This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments, allowing recording of neural activity. Immobilization of the adult requires a mechanism to deliver dissolved oxygen to the gills in lieu of buccal and opercular movement. With our technique, animals are immobilized and perfused with habitat water to fulfill this requirement. A craniotomy is performed under tricaine methanesulfonate (MS-222; tricaine) anesthesia to provide access to the brain. The primary electrode is then positioned within the craniotomy window to record extracellular brain activity. Through the use of a multitube perfusion system, a variety of pharmacological compounds can be administered to the adult fish and any alterations in the neural activity can be observed. The methodology not only allows for observations to be made regarding changes in neurological activity, but it also allows for comparisons to be made between larval and adult zebrafish. This gives researchers the ability to identify the alterations in neurological activity due to the introduction of various compounds at different life stages.

This paper describes how an adult zebrafish can be immobilized, intubated, and used for in vivo electrophysiological experiments to allow recordings and manipulation of neural activity in an intact animal.

تسجيل الكهربية في الدماغ سليمة من اسماك الزرد الكبار

Previously, electrophysiological studies in adult zebrafish have been limited to slice preparations or to eye cup preparations and electrorentinogram ...

Functional Evaluation of Biological Neurotoxins in Networked Cultures of Stem Cell-derived Central Nervous System Neurons

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, cell-based model that produces functioning synapses and undergoes physiological responses to intoxication. Here we describe a simple and robust method to efficiently differentiate murine embryonic stem cells (ESCs) into defined lineages of synaptically active, networked neurons. Following an 8 day differentiation protocol, mouse embryonic stem cell-derived neurons (ESNs) rapidly express and compartmentalize neurotypic proteins, form neuronal morphologies and develop intrinsic electrical responses. By 18 days after differentiation (DIV 18), ESNs exhibit active glutamatergic and &#947;-aminobutyric acid (GABA)ergic synapses and emergent network behaviors characterized by an excitatory:inhibitory balance. To determine whether intoxication with CNTs functionally antagonizes synaptic neurotransmission, thereby replicating the in vivo pathophysiology that is responsible for clinical manifestations of botulism or tetanus, whole-cell patch clamp electrophysiology was used to quantify spontaneous miniature excitatory post-synaptic currents (mEPSCs) in ESNs exposed to tetanus neurotoxin (TeNT) or botulinum neurotoxin (BoNT) serotypes /A-/G. In all cases, ESNs exhibited near-complete loss of synaptic activity within 20 hr. Intoxicated neurons remained viable, as demonstrated by unchanged resting membrane potentials and intrinsic electrical responses. To further characterize the sensitivity of this approach, dose-dependent effects of intoxication on synaptic activity were measured 20 hr after addition of BoNT/A. Intoxication with 0.005 pM BoNT/A resulted in a significant decrement in mEPSCs, with a median inhibitory concentration (IC50) of 0.013 pM. Comparisons of median doses indicate that functional measurements of synaptic inhibition are faster, more specific and more sensitive than SNARE cleavage assays or the mouse lethality assay. These data validate the use of synaptically coupled, stem cell-derived neurons for the highly specific and sensitive detection of CNTs.

A custom protocol is described to differentiate mouse ES cells into defined populations of highly pure neurons exhibiting functioning synapses and emergent network behavior. Electrophysiological analysis demonstrates the loss of synaptic transmission following exposure to botulinum neurotoxin serotypes /A-/G and tetanus neurotoxin.

تقييم الوظيفي للأعصاب البيولوجية في الثقافات الشبكية من الخلايا الجذعية المستمدة من الجهاز العصبي المركزي الخلايا العصبية

Therapeutic and mechanistic studies of the presynaptically targeted clostridial neurotoxins (CNTs) have been limited by the need for a scalable, ...

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the influence of mechanical stress on cellular function is still poorly understood. In part, this knowledge gap exists because few tools enable simultaneous deformation of tissue and cells, imaging of cellular activity in live animals, and efficient restriction of motility in otherwise highly mobile model organisms, such as the nematode Caenorhabditis elegans. The small size of C. elegans makes them an excellent match to microfluidics-based research devices, and solutions for immobilization have been presented using microfluidic devices. Although these devices allow for high-resolution imaging, the animal is fully encased in polydimethylsiloxane (PDMS) and glass, limiting physical access for delivery of mechanical force or electrophysiological recordings. Recently, we created a device that integrates pneumatic actuators with a trapping design that is compatible with high-resolution fluorescence microscopy. The actuation channel is separated from the worm-trapping channel by a thin PDMS diaphragm. This diaphragm is deflected into the side of a worm by applying pressure from an external source. The device can target individual mechanosensitive neurons. The activation of these neurons is imaged at high-resolution with genetically-encoded calcium indicators. This article presents the general method using C. elegans strains expressing calcium-sensitive activity indicator (GCaMP6s) in their touch receptor neurons (TRNs). The method, however, is not limited to TRNs nor to calcium sensors as a probe, but can be expanded to other mechanically-sensitive cells or sensors.

Using a Microfluidics Device for Mechanical Stimulation and High Resolution Imaging of C. elegans

New tools for mechanobiology research are needed to understand how mechanical stress activates biochemical pathways and elicits biological responses. Here, we showcase a new method for selective mechanical stimulation of immobilized animals with a microfluidic trap allowing high-resolution imaging of cellular responses.

استخدام جهاز ميكروفلويديكس لتحفيز الميكانيكية وتصوير قرار عالية من C. ايليجانس

One central goal of mechanobiology is to understand the reciprocal effect of mechanical stress on proteins and cells. Despite its importance, the ...

High-Resolution 3D Imaging of Rabies Virus Infection in Solvent-Cleared Brain Tissue

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and study the distribution, tropism, and abundance of pathogens inside of organ tissues provides pivotal data on disease development and progression. Using conventional microscopy methods, immunolabeling is mostly restricted to thin sections obtained from paraffin-embedded or frozen samples. However, the limited 2D image plane of these thin sections may lead to the loss of crucial information on the complex structure of an infected organ and the cellular context of the infection. Modern multicolor, immunostaining-compatible tissue clearing techniques now provide a relatively fast and inexpensive way to study high-volume 3D image stacks of virus-infected organ tissue. By exposing the tissue to organic solvents, it becomes optically transparent. This matches the sample&#8217;s refractive indices and eventually leads to a significant reduction of light scattering. Thus, in combination with long free working distance objectives, large tissue sections up to 1 mm in size can be imaged by conventional confocal laser scanning microscopy (CLSM) at high resolution. Here, we describe a protocol to apply deep-tissue imaging after tissue clearing to visualize rabies virus distribution in infected brains in order to study topics like virus pathogenesis, spread, tropism, and neuroinvasion.

Novel, immunostaining-compatible tissue clearing techniques like the ultimate 3D imaging of solvent-cleared organs allow the 3D visualization of rabies virus brain infection and its complex cellular environment. Thick, antibody-labeled brain tissue slices are made optically transparent to increase imaging depth and to enable 3D analysis by confocal laser scanning microscopy.

التصوير ثلاثي الأبعاد عالي الدقة للعدوى بفيروس داء الكلب في أنسجة الدماغ التي تم تطهيرها من المذيبات

The visualization of infection processes in tissues and organs by immunolabeling is a key method in modern infection biology. The ability to observe and ...