我々はmicrojettingパラメータに関するアドバイスを、カリフォルニア大学バークレー校のフレッチャー研究室からマイクVaheyに感謝します。この作品は、NIHの助成金DP2 HL117748-01が主催した。

1。無限チャンバー製作<ol><li>コンピュータ支援設計（CAD）ソフトウェアを使用して（その形状にちなんで命名）​​無限室を設計し、それがレーザーカッターと互換性があるように、ファイルを保存します。レーザーカッターで透明なアクリルで1/8- 3月16日からチャンバをカット0.15インチの中心間距離でこの形​​状、直径0.183の別々の二つの円を作成します。無限の形状は、液滴界面二重層形成および安定性を促進する。 </li><li>無限型のウェルにアクリルチャンバーの縁を通じて1月16日に穴を開けます。反対側に繰り返します。はさみで0.2ミリメートルのアクリルシートまたは井戸底として機能するように、レーザーカッターから小さな長方形をカットします。 </li><li> 0.2ミリメートルのアクリルの片面に速乾性接着剤の薄いが完全な層を適用し、チャンバーの底に接着します。室の底にしっかりと所定の位置に0.2ミリメートルのアクリルを保持し、分配する接着剤は、シールを作成しても表示領域を覆う回避することを可能にする界面での接着剤。その縁がチャンバ壁の端と同一平面であり、それは完全に無限室カットアウトを覆うようにアクリルを合わせてください。これは、十分なジェットの浸透を可能にし、ウェルの漏洩を防ぐことができます。 </li><li>開けた穴をカバーするために天然ゴムの2小片をカット。穴の周囲速乾性の接着剤を適用します。確保にピンセットですべての領域に穴を押し上でゴムを配置します。両方開けた穴について、この手順を繰り返します。漏れを防ぐために、すべての接着の接続が完了したシールであることを確認してください。 </li><li>針23 G、1を用いて、圧電方式のインクジェット先端部の挿入を容易にするために、チャンバの両側に天然ゴムに穴を突く。 </li></ol> 2。実験の準備 -20℃の冷凍庫でクロロホルムに店頭在庫の脂質溶液。この研究では、1,2 - diphytanoどちらかイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DPhPC）または1,2 -ジオレオイル-sn-グリセロ-3 -ホスホコリン（DOPC）を用いた。 25 mg / mlの脂質溶液は、一般的に、このプロトコル中で調製し、-20℃で保存した場合、2ヶ月間続くの2ミリリットル<ol><li> n-デカン中の脂質を再懸濁するためには、最初の小さなガラスジャーにストックバイアルからそれを転送し、アルゴンまたは窒素下で乾いた。脂質がより速く乾燥させ、ガスにより多くの表面積を露出するように乾燥しながら角度でjarファイルを保持します。 </li><li>わずかにねじ込まジャーのキャップを、乾燥した溶液は、1〜2時間デシケーター内で真空下に座ることができます。その後、25 mg / mlので脂質を再溶解するためにn-デカンを追加します。渦簡単に脂質溶液で15分間にわたり浴超音波処理器中でそれを超音波処理。 -20℃でn-デカン中に再構成する脂質を保存する</li><li>株式ショ糖溶液を調製します。 1.5 mlのマイクロチューブに、300 mMスクロースの900μLと100μLを追加1％のメチルセルロース（MC）。メチルセルロースは、吐出するのに役立つ溶液の粘度を増加させるために添加される。オプションのステップ：それぞれ、撮像において、よりコントラストや蛍光を貸して暗い色の食用色素や蛍光ビーズのオプションの1を添加する。この溶液は、細胞の浸透圧を一致させ、microjettingの間にコントラストを提供するように設計300ミリオスモルスクロース溶液である。 </li><li>使い捨て1ミリリットルのプラスチックシリンジに溶液を描く。先端が上を向いて注射器を保持した状態で、先端に向かって気泡を追い出すために繰り返しシャフトをフリックして、閉じ込められた空気を排出するためにプランジャーを押してください。それが噴出する責任の適切な圧電収縮を妨害するように、先に進む前に、注射器からすべての空気を抜くようにしてください。 </li><li>注射器の端部に0.22μmのフィルターを取り付けます。フィルターに捕捉されるから空気を防ぐために、垂直方向に注射器を保持し、液滴がチップ上に形成されるまで、プランジャーを押してください。注：A33ミリメートル直径のシリンジフィルターユニットが最適に機能することが見出されたが、直径3mmのシリンジフィルターなどのような別の小さなフィルターはデッドボリュームを低減するために使用することができる。 </li><li>インクジェットの雌ルアーアダプターを外し、しっかりとフィルターの端の上に所定の位置に押し込みます。ここでも、空気を閉じ込める防ぐために流体を噴射。インクジェットの上でねじ込みます。それが完全に取り付けられた後、流体は、インクジェットの先端に移動する必要があります。 </li></ol> 3。機器を準備を進め<ol><li> V-クランプを使用して、顕微鏡ステージ上で注射器アセンブリをマウントします。インクジェットコントローラ、インクジェットからのワイヤを接続します。注：カスタム·ステージは、このプロトコルのために構築した;ステージデザインは、ユーザによって決定することができるが、それは注射器及び試料ホルダのxy制御xyzの独立した制御を有することが重要である。 </li><li>所望の撮影を実現するために拡大し、必要なレンズの組み合わせを決定します。ここで、10×対物レンズおよび10倍の接眼レンズを使用する。 </li&gt; <li>噴射と小胞の生成を可視化するために高速度カメラ（≥千FPS）を使用します。イメージングに先立ち、必要に応じて、カメラのキャリブレーションを行う。画像キャプチャを開始するために、カメラのソフトウェア内の画像ベースの自動トリガーを使用しています。 </li><li>顕微鏡ステージ上に無限チャンバーをマウントします。ステージ上で所定の位置にテープでチャンバーを固定します。 </li><li> （ 図1bを参照）、天然ゴムに穴をあけ穴にインクジェット先端を慎重に位置を合わせます。これを行うには、室内に近いインクジェットを持参し、目で位置を調整し、顕微鏡レンズを通してより正確な調整を行う。粗い動きがインクジェット先端に損傷を与えることができるよう、慎重に進んでください。 </li><li>インクジェットが整列されると、ウェルのロード中に、インクジェットへの損傷を防止するために、離れてチャンバからシリンジ組立部品を再生する。それは、膜の穴に合うままであるように、インクジェットの運動が単方向であることを確認してください。 </li><li> PLUNを軽く押して、インクジェットノズルでの小滴が形成されるまで注射器アセンブリのGER。これは、いくつかの初期背圧を提供する。 </li><li>入力噴射パラメータ。台形バイポーラ波については、以下のパラメータを使用：20kHzのパルス周波数、3マイクロ秒の立上り時間、35秒のパルス持続時間、3秒立ち下がり時間、65 Vの印加電圧（パルス振幅）、及びトリガ100ジェットパルス（パルス数） 。しかし、印加電圧（パルス振幅）およびパルス数（トリガ当たりのジェットパルス）小胞のサイズを制御するために変えることができる。 </li></ol> 4。小胞の生成<ol><li>両方の井戸の全表面をカバーする、無限室にn-デカンに懸濁し25〜30μlの脂質溶液を追加します。 </li><li>ピペッティングゆっくりとスムーズに、よく1の最も外側のエッジに（ショ糖溶液と同じ浸透圧モル濃度の）25μlのグルコースを追加します。グルコースおよび脂質溶液が混合しないので、堆積の際、グルコースの低下は、形成すべきである。別の25を追加1、別のドロップを作り、5〜10分以内に室内の中央にある脂質二重膜を形成することに反対でなく、グルコースのL。 </li><li>天然ゴムを介してインクジェットを挿入し、慎重に液滴界面二重層に向けて案内する。導入されたインクジェットボリュームを置換し、二重層を破壊することができるように、ゆっくりと二重層にアプローチ。 </li><li>インクジェットは〜200μmの範囲内にある場合は、ステップ3.8で説明した設定で噴射を適用します。二重層からの距離が他のパラメータの中で、電圧およびパルス数に応じて、主に変化し得る。このプロトコルは、徐々に設定（電圧やパルス数）を増加し、二層の変形を観察することをお勧めします。 </li></ol> 5。洗浄装置<ol><li>顕微鏡ステージから注射器を切り離し、1ミリリットルのプラスチックシリンジとフィルターを処分。 </li><li>インクジェットをきれいにする、solutioに先端を浸漬することによって順番に次の解決策を吸引nは7〜10倍各々 ：70％エタノール、温水中の2％Neutrad溶液、70％エタノール、および蒸留H 2 Oをインクジェットは、吸引ピペットに安全に収まらない場合は、アダプターを形成するために、ピペットチップをカット。 </li><li>ティッシュでチャンバーを乾かします。 5〜10分間、2％（v / v）の温水にNeutrad、超音波処理して250ミリリットルのビーカーに無限室を配置します。超音波処理の後、完全に圧縮された空気の下に井戸を乾燥。ウェル中の水分は、脂質二重膜の安定性を損なうことができるので、それはまた、チャンバ15分間60℃のオーブン内に配置されることが推奨される。 </li></ol>

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	<li>Liu, A. P., Fletcher, D. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Biology+under+construction:+in+vitro+reconstitution+of+cellular+function.">Biology under construction: in vitro reconstitution of cellular function.</a> Nature reviews. Mol. Cell Biol. 10, 644-650 (2009).</li><li>Yeh, B. J., Lim, W. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Synthetic+biology:+lessons+from+the+history+of+synthetic+organic+chemistry.">Synthetic biology: lessons from the history of synthetic organic chemistry.</a> Nat. Chem. Biol. 3, 521-525 (2007).</li><li>Richmond, D. 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P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Droplet+Microfluidics.">Droplet Microfluidics.</a> Lab Chip. 8, 198-220 (2008).</li><li>Stachowiak, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Unilamellar+vesicle+formation+and+encapsulation+by+microfluidic+jetting.">Unilamellar vesicle formation and encapsulation by microfluidic jetting.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A. 105, 4697-4702 (2008).</li><li>Osaki, T., Yoshizawa, S., Kawano, R., Sasaki, H., Takeuchi, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lipid-coated+microdroplet+array+for+in+vitro+protein+synthesis.">Lipid-coated microdroplet array for in vitro protein synthesis.</a> Anal. Chem. 83, 3186-3191 (2011).</li><li>Liu, A. 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利害の対立が宣言されていません。

多くの技術が電鋳、エマルション、液滴発生14-16を含む、小胞の生成のために開発されている。ただし、新しい実験技術は、生体系に成長して類似性を有する生物学的システムの設計を可能にするために必要です。特にマイクロ流体の方法は近い生物学にベシクルモデルをもたらし、膜unilamellarity、サイズの単分散性、および内部のコンテンツ17,18を管理するコントロールのレ...

<html>これは、細胞生物学の分子から細胞への我々の理解を統合することが含まマルチスケール問題であることがますます明らかになってきた。その結果、分子が個別に動作し、正確にどのように知ることは複雑な細胞の挙動を理解するには十分ではない。これは、5を抽出するアフリカツメガエルにおける脂質二重層小胞4、紡錘体とアクチンネットワーク相互作用の再構成によって例示されるように、部分的には多成分系の射出挙動の存在であり、細菌の細胞分裂機械6の空間的なダイナミックス。生体系の分子プロセスを解剖の還元主義のアプローチを補完する一つの方法は、生物学的要素の最小セットを使用して細胞挙動を再構成する逆のアプローチを取ることです。このアプローチの重要な部分は、限られた量の生体分子の信頼性の高いカプセル化、細胞の重要な機能が含まれます。 e_contentは&quot;&gt;いくつかの戦略は、バイオミメティックシステムを研究するための生体分子をカプセル化するために存在する。最も生物学的に関連システムは、細胞の細胞質膜によって課される生化学的および物理的な制約を模倣する脂質二重膜、である。電鋳7による巨大単層小胞（GUVs）の形成、精製タンパク質を操作するための問題である可能性がありGUV世代14のために最も広く使用される技術の一つは、通常、高塩緩衝液8との互換性がないため不十分な封入収率を持っています。電鋳でも大量の試料を必要とする（&gt; 100μL）、 、および非効率的に近接した脂質層の間の拡散の困難さに起因する大きな分子を組み込んでいる脂質小胞を生成するためのいくつかのマイクロ流体アプローチが開発されている。層を水 - 油 - 水との間の2つのインターフェイスを介して構成要素を通過するダブルエマルション法を、（W / O / W）、Voの蒸発に依存しています脂質二重層の形成9を駆動するlatile溶媒。他のものは脂質二重層小胞10または二つの独立したステップ11での連続的なストリームを生成するマイクロ流体組立ラインを使用している。我々は、急速に制御されたサイズ、組成、およびカプセル化のGUVsを生成するために液滴界面二重層12に流体パルスを印加することに基づいて、代替技術を開発した。マイクロ流体噴射として知られている我々のアプローチは、生物学的な様々な問題を調査するための機能的な生体分子システムを作成するためのアプローチを提供し、いくつかの既存の小胞生成技術の組み合わせの利点があります。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:633px;" width="633">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Name</td>
			<td style="width:163px;">Company</td>
			<td style="width:157px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:160px;">Comments</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Piezoelectric Inkjet</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">MJ-AL-01-xxx</td>
			<td style="width:160px;">xxx denotes orifice diameter in microns</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Jet Drive III Controller</td>
			<td style="width:163px;">MicroFab Technologies</td>
			<td style="width:157px;">CT-M3-02</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">High-speed camera</td>
			<td style="width:163px;">Vision Research</td>
			<td style="width:157px;">MiroEX2</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">DPhPC lipid in chloroform</td>
			<td style="width:163px;">Avanti</td>
			<td style="width:157px;">850356C</td>
			<td style="width:160px;">Ordered in small aliquots in vials</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">33mm PVDF filters, 0.2 &#181;m</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">SLGV033RS</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">1ml syringes</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">14823434</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">n-Decane</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">111871000</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Glucose</td>
			<td style="width:163px;">Acros Organics</td>
			<td style="width:157px;">410950010</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Sucrose</td>
			<td style="width:163px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:157px;">S7903-1KG</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Methylcellulose</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9084958</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="84">
			<td height="84" style="height:84px;width:153px;">1/8&#34; Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">8560K239</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs for the infinity-shaped chamber are available upon request</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">0.2 mm Acrylic</td>
			<td style="width:163px;">Astra Products</td>
			<td style="width:157px;">Clarex clear 001</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Acrylic Cement</td>
			<td style="width:163px;">TAP Plastics</td>
			<td style="width:157px;">10693</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Loctite 495 Superglue</td>
			<td style="width:163px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:157px;">NC9011323</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:153px;">Loctite 3494 UV Strengthening Adhesive</td>
			<td style="width:163px;">Strobels Supply</td>
			<td style="width:157px;">30765</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:153px;">Natural rubber</td>
			<td style="width:163px;">McMaster Carr</td>
			<td style="width:157px;">85995K14</td>
			<td style="width:160px;"></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:153px;">Custom stage</td>
			<td style="width:163px;">Home made</td>
			<td style="width:157px;">N/A</td>
			<td style="width:160px;">CAD designs are available upon request</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

lipid bilayer vesicle generation using microfluidic jetting

ボトムアップ合成生物学は、潜在的に生化学系と、最小限の生物を調査し、再構成するための新しいアプローチを提示します。この新興分野は、下から上に複雑な、機能してシステムへの基本的な生物学的なコンポーネントを設計し、組み立てる技術者、化学者、生物学者、物理学者を行っています。このようなボトムアップのシステムは、基本的な生物学的問い合わせや、革新的な治療法1,2人工細胞の開発につながる可能性があります。巨大単層小胞（GUVs）は、それらの細胞様膜構造とサイズに合成生物学のためのモデルのプラットフォームとして機能することができます。マイクロ流体吐出、又はmicrojettingは、制御された大きさ、膜組成、膜貫通タンパク質の取り込み、およびカプセル3を有するGUVsの生成を可能にする技術である。この方法の基本原理は、懸濁リットル変形するピエゾ作動式インクジェット装置によって生成された複数の高周波流体パルスの使用であるGUVに重層をIPID。プロセスは、石鹸膜でシャボン玉を吹くに似ています。噴出液、包含する溶液の組成、および/または成分の組成を変化させることによって二重層に含まれる、研究者は、カスタマイズされた小胞を作成するためにこの技術を適用することができる。本稿ではmicrojettingにより液滴界面二重層から簡単な小胞を生成するための手順について説明します。

私たちは、機械加工部品や手動マイクロメートルから組み立てたカスタムステージ（ 図1）と、従来の倒立蛍光顕微鏡でミクロ流体噴射セットアップを組み立てています。インクジェットの特性評価は、小胞の生成プロセスへの洞察を提供します。インクジェットノズルと脂質二重層との間の距離を変化させることにより、力が膜の変形を生じさせるために適用影響を及ぼす。二...

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Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。

マイクロ流体ジェッティングを使用して、脂質二重層小胞の生成

Bottom-up synthetic biology presents a novel approach for investigating and reconstituting biochemical systems and, potentially, minimal organisms. This ...

lipid-bilayer-vesicle-generation-using-microfluidic-jetting

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JoVE Journal

Bioengineering

14.7K ビュー.  University of Michigan. 液滴界面の脂質二重層に対するマイクロ流体噴射は、膜の非対称性、膜貫通タンパク質の取り込み、および材料のカプセル化を制御して小胞を生成するための信頼できる方法を提供します。この技術は、区画化された生体分子が所望される生体系の様々な研究に適用することができる。 

ビデオ: Lipid Bilayer Vesicle Generation Using Microfluidic Jetting

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer (SALB) Method

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related processes while conferring biocompatibility and biofunctionality to solid substrates. The spontaneous adsorption and rupture of phospholipid vesicles is the most commonly used method to form SLBs. However, under physiological conditions, vesicle fusion (VF) is limited to only a subset of lipid compositions and solid supports. Here, we describe a one-step general procedure called the solvent-assisted lipid bilayer (SALB) formation method in order to form SLBs which does not require vesicles. The SALB method involves the deposition of lipid molecules onto a solid surface in the presence of water-miscible organic solvents (e.g., isopropanol) and subsequent solvent-exchange with aqueous buffer solution in order to trigger SLB formation. The continuous solvent exchange step enables application of the method in a flow-through configuration suitable for monitoring bilayer formation and subsequent alterations using a wide range of surface-sensitive biosensors. The SALB method can be used to fabricate SLBs on a wide range of hydrophilic solid surfaces, including those which are intractable to vesicle fusion. In addition, it enables fabrication of SLBs composed of lipid compositions which cannot be prepared using the vesicle fusion method. Herein, we compare results obtained with the SALB and conventional vesicle fusion methods on two illustrative hydrophilic surfaces, silicon dioxide and gold. To optimize the experimental conditions for preparation of high quality bilayers prepared via the SALB method, the effect of various parameters, including the type of organic solvent in the deposition step, the rate of solvent exchange, and the lipid concentration is discussed along with troubleshooting tips. Formation of supported membranes containing high fractions of cholesterol is also demonstrated with the SALB method, highlighting the technical capabilities of the SALB technique for a wide range of membrane configurations.

Biomembrane Fabrication by the Solvent-assisted Lipid Bilayer SALB Method

We present an experimental protocol to form a supported lipid bilayer on solid substrates without using lipid vesicles. We demonstrate a one-step method to form a lipid bilayer on silicon dioxide and gold as well as supported membranes with cholesterol-enriched domain for various biological applications.

溶剤アシスト脂質二重（SALB）法による生体膜の作製

In order to mimic cell membranes, the supported lipid bilayer (SLB) is an attractive platform which enables in vitro investigation of membrane-related ...

生物工学

Automated Lipid Bilayer Membrane Formation Using a Polydimethylsiloxane Thin Film

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for biosensor applications. However, conventional BLM formation techniques have several drawbacks and they often require specific expertise and laborious processes. In particular, conventional BLMs suffer from low formation success rates and inconsistent membrane formation time. Here, we demonstrate a storable and transportable BLM formation system with controlled thinning-out time and enhanced BLM formation rate by replacing conventionally used films (polytetrafluoroethylene, polyoxymethylene, polystyrene) to polydimethylsiloxane (PDMS). In this experiment, a porous-structured polymer such as PDMS thin film is used. In addition, as opposed to conventionally used solvents with low viscosity, the use of squalene permitted a controlled thinning-out time via slow solvent absorption by PDMS, prolonging membrane lifetime. In addition, by using a mixture of squalene and hexadecane, the freezing point of the lipid solution was increased (~16 &#176;C), in addition, membrane precursors were produced that can be indefinitely stored and readily transported. These membrane precursors have reduced BLM formation time of &#60; 1 hr and achieved a BLM formation rate of ~80%. Moreover, ion channel experiments with gramicidin A demonstrated the feasibility of the membrane system.

We demonstrate a storable, transportable lipid bilayer formation system. A lipid bilayer membrane can be formed within 1 hr with over 80% success rate when a frozen membrane precursor is brought to ambient temperature. This system will reduce laborious processes and expertise associated with ion channels.

ポリジメチルシロキサン薄膜を用いた自動化された脂質二重膜の形成

An artificial lipid bilayer, or black lipid membrane (BLM), is a powerful tool for studying ion channels and protein interactions, as well as for ...

Ligand Nano-cluster Arrays in a Supported Lipid Bilayer

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological studies. In the past years, it has become increasingly clear that living cells respond, not only to the biochemical nature of the molecules presented to them but also to the way these molecules are presented. Creating protein micro-patterns is therefore now standard in many biology laboratories; nano-patterns are also more accessible. However, in the context of cell-cell interactions, there is a need to pattern not only proteins but also lipid bilayers. Such dual proteo-lipidic patterning has so far not been easily accessible. We offer a facile technique to create protein nano-dots supported on glass and propose a method to backfill the inter-dot space with a supported lipid bilayer (SLB). From photo-bleaching of tracer fluorescent lipids included in the SLB, we demonstrate that the bilayer exhibits considerable in-plane fluidity. Functionalizing the protein dots with fluorescent groups allows us to image them and to show that they are ordered in a regular hexagonal lattice. The typical dot size is about 800 nm and the spacing demonstrated here is 2 microns. These substrates are expected to serve as useful platforms for cell adhesion, migration and mechano-sensing studies.

We present a protocol to functionalize glass with nanometric protein patches surrounded by a fluid lipid bilayer. These substrates are compatible with advanced optical microscopy and are expected to serve as platform for cell adhesion and migration studies.

サポートされている脂質二重層中のリガンドナノクラスター配列

Currently there is considerable interest in creating ordered arrays of adhesive protein islands in a sea of passivated surface for cell biological ...

Multi-step Variable Height Photolithography for Valved Multilayer Microfluidic Devices

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to entry for non-specialists who would benefit greatly from the ability to develop their own microfluidic devices to address research questions. Particularly lacking has been the open dissemination of protocols related to photolithography, a key step in the development of a replica mold for the manufacture of polydimethylsiloxane (PDMS) devices. While the fabrication of single height silicon masters has been explored extensively in literature, fabrication steps for more complicated photolithography features necessary for many interesting device functionalities (such as feature rounding to make valve structures, multi-height single-mold patterning, or high aspect ratio definition) are often not explicitly outlined. 
Here, we provide a complete protocol for making multilayer microfluidic devices with valves and complex multi-height geometries, tunable for any application. These fabrication procedures are presented in the context of a microfluidic hydrogel bead synthesizer and demonstrate the production of droplets containing polyethylene glycol (PEG diacrylate) and a photoinitiator that can be polymerized into solid beads. This protocol and accompanying discussion provide a foundation of design principles and fabrication methods that enables development of a wide variety of microfluidic devices. The details included here should allow non-specialists to design and fabricate novel devices, thereby bringing a host of recently developed technologies to their most exciting applications in biological laboratories.

Multilayer microfluidic devices often involve the fabrication of master molds with complex geometries for functionality. This article presents a complete protocol for multi-step photolithography with valves and variable height features tunable to any application. As a demonstration, we fabricate a microfluidic droplet generator capable of producing hydrogel beads.

バルブ付き多層マイクロ流体デバイスのための多段階可変高さのフォトリソグラフィ

Microfluidic systems have enabled powerful new approaches to high-throughput biochemical and biological analysis. However, there remains a barrier to ...

Generation of Dynamical Environmental Conditions using a High-Throughput Microfluidic Device

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and organs are either highly expensive, like robotics, or lack nanoliter volume and millisecond time accuracy in liquid manipulation. We herein present the design and fabrication of a microfluidic system, which consists of 1,500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. To demonstrate the capacities of the microfluidic device, neural stem cell (NSC) spheres are maintained in the proposed system. We observed that when the NSC sphere is exposed to CXCL in day 1 and EGF in day 2, the round-shaped conformation is well maintained. Variation in the input order of 6 drugs causes morphological changes to the NSC sphere and the expression level representative marker for NSC stemness (i.e., Hes5 and Dcx). These results indicate that dynamic and complex environmental conditions have great effects on NSC differentiation and self-renewal, and the proposed microfluidic device is a suitable platform for high throughput studies on the complex life machinery.

We present a microfluidic system for high throughput studies on complex life machinery, which consists of 1500 culture units, an array of enhanced peristaltic pumps and an on-site mixing modulus. The microfluidic chip allows for the analysis of the highly complex and dynamic micro-environmental conditions in vivo.

ハイスループットマイクロ流体装置を用いた動的環境条件の生成

Mimicking in vivo environmental conditions is crucial for in vitro studies on complex life machinery. However, current techniques targeting live cells and ...

Formulating and Characterizing Lipid Nanoparticles for Gene Delivery using a Microfluidic Mixing Platform

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high encapsulation efficiency. Use of lipid nanoparticles (LNPs) to encapsulate nucleic acids is advantageous to protect the RNA or DNA from degradation, while also promoting cellular uptake. LNPs often contain multiple lipid components including an ionizable lipid, helper lipid, cholesterol, and polyethylene glycol (PEG) conjugated lipid. LNPs can readily encapsulate nucleic acids due to the ionizable lipid presence, which at low pH is cationic and allows for complexation with negatively charged RNA or DNA. Here LNPs are formed by encapsulating messenger RNA (mRNA) or plasmid DNA (pDNA) using rapid mixing of the lipid components in an organic phase and the nucleic acid component in an aqueous phase. This mixing is performed using a precise microfluidic mixing platform, allowing for nanoparticle self-assembly while maintaining laminar flow. The hydrodynamic size and polydispersity are measured using dynamic light scattering (DLS). The effective surface charge on the LNP is determined by measuring the zeta potential. The encapsulation efficiency is characterized using a fluorescent dye to quantify entrapped nucleic acid. Representative results demonstrate the reproducibility of this method and the influence that different formulation and process parameters have on the developed LNPs.

Lipid nanoparticles are developed using a microfluidic mixing platform approach for mRNA and DNA encapsulation.

マイクロ流体混合プラットフォームを用いた遺伝子導入のための脂質ナノ粒子の作製と特性化

Lipid-based drug carriers have been used for clinically and commercially available delivery systems due to their small size, biocompatibility, and high ...

Generation of a Simplified Three-Dimensional Skin-on-a-chip Model in a Micromachined Microfluidic Platform

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of concept, a simplified and undifferentiated human skin containing a dermal (stromal) and an epidermal (epithelial) compartment has been modelled. To accomplish this, a versatile and robust, vinyl-based device divided into two chambers has been developed, overcoming some of the drawbacks present in microfluidic devices based on polydimethylsiloxane (PDMS) for biomedical applications, such as the use of expensive and specialized equipment or the absorption of small, hydrophobic molecules and proteins. Moreover, a new method based on parallel flow was developed, enabling the in situ deposition of both the dermal and epidermal compartments. The skin construct consists of a fibrin matrix containing human primary fibroblasts and a monolayer of immortalized keratinocytes seeded on top, which is subsequently maintained under dynamic culture conditions. This new microfluidic platform opens the possibility to model human skin diseases and extrapolate the method to generate other complex tissues.

Here, we present a protocol to generate a three-dimensional simplified and undifferentiated skin model using a micromachined microfluidic platform. A parallel flow approach allows the in situ deposition of a dermal compartment for the seeding of epithelial cells on top, all controlled by syringe pumps.

マイクロマシンマイクロ流体プラットフォームにおける簡単な3次元スキンオンチップモデルの生成

This work presents a new, cost-effective, and reliable microfluidic platform with the potential to generate complex multilayered tissues. As a proof of ...

Assembly of Cell Mimicking Supported and Suspended Lipid Bilayer Models for the Study of Molecular Interactions

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial protective barrier for all cell types, separating the internal cellular components from the extracellular environment. These membranes are composed largely of a lipid bilayer, which contains outer hydrophilic head groups and inner hydrophobic tail groups, along with various proteins and cholesterol. The composition and structure of the lipids themselves play a crucial role in regulating biological function, including interactions between cells and the cellular microenvironment, which may contain pharmaceuticals, biological toxins, and environmental toxicants. In this study, methods to formulate uni-lipid and multi-lipid supported and suspended cell mimicking lipid bilayers are described. Previously, uni-lipid phosphatidylcholine (PC) lipid bilayers as well as multi-lipid placental trophoblast-inspired lipid bilayers were developed for use in understanding molecular interactions. Here, methods for achieving both types of bilayer models will be presented. For cell mimicking multi-lipid bilayers, the desired lipid composition is first determined via lipid extraction from primary cells or cell lines followed by liquid chromatography-mass spectrometry (LC-MS). Using this composition, lipid vesicles are fabricated using a thin-film hydration and extrusion method and their hydrodynamic diameter and zeta potential are characterized. Supported and suspended lipid bilayers can then be formed using quartz crystal microbalance with dissipation monitoring (QCM-D) and on a porous membrane for use in a parallel artificial membrane permeability assay (PAMPA), respectively. The representative results highlight the reproducibility and versatility of in vitro cell membrane lipid bilayer models. The methods presented can aid in rapid, facile assessment of the interaction mechanisms, such as permeation, adsorption, and embedment, of various molecules and macromolecules with a cell membrane, helping in the screening of drug candidates and prediction of potential cellular toxicity.

This protocol describes the formation of cell mimicking uni-lipid and multi-lipid vesicles, supported lipid bilayers, and suspended lipid bilayers. These in vitro models can be adapted to incorporate a variety of lipid types and can be used to investigate various molecule and macromolecule interactions.

分子相互作用研究のための細胞模倣支援及び懸濁脂質二重層モデルの組み立て

Model cell membranes are a useful screening tool with applications ranging from early drug discovery to toxicity studies. The cell membrane is a crucial ...

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and Pfizer/BioNTech. These vaccines have demonstrated the efficacy of mRNA-LNP therapeutics and opened the door for future clinical applications. In mRNA-LNP systems, the LNPs serve as delivery platforms that protect the mRNA cargo from degradation by nucleases and mediate their intracellular delivery. The LNPs are typically composed of four components: an ionizable lipid, a phospholipid, cholesterol, and a lipid-anchored polyethylene glycol (PEG) conjugate (lipid-PEG). Here, LNPs encapsulating mRNA encoding firefly luciferase are formulated by microfluidic mixing of the organic phase containing LNP lipid components and the aqueous phase containing mRNA. These mRNA-LNPs are then tested in vitro to evaluate their transfection efficiency in HepG2 cells using a bioluminescent plate-based assay. Additionally, mRNA-LNPs are evaluated in vivo in C57BL/6 mice following an intravenous injection via the lateral tail vein. Whole-body bioluminescence imaging is performed by using an in vivo imaging system. Representative results are shown for the mRNA-LNP characteristics, their transfection efficiency in HepG2 cells, and the total luminescent flux in C57BL/6 mice.

Testing the In Vitro and In Vivo Efficiency of mRNA-Lipid Nanoparticles Formulated by Microfluidic Mixing

Here, a protocol for formulating lipid nanoparticles (LNPs) that encapsulate mRNA encoding firefly luciferase is presented. These LNPs were tested for their potency in vitro in HepG2 cells and in vivo in C57BL/6 mice.

マイクロ流体混合で調製したmRNA-脂質ナノ粒子のin vitro および in vivo 効率の試験

Lipid nanoparticles (LNPs) have attracted widespread attention recently with the successful development of the COVID-19 mRNA vaccines by Moderna and ...

コンビナトリアルプラグ製造のためのマイクロ流体デバイスの構築

Bilayer Microfluidic Device for Combinatorial Plug Production

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such systems have been used to encapsulate a variety of biochemical reactions - from incubation of single cells to implementation of PCR reactions, from genomics to chemical synthesis. Coupling the microfluidic channels with regulatory valves allows control over their opening and closing, thereby enabling the rapid production of large-scale combinatorial libraries consisting of a population of droplets with unique compositions. In this paper, protocols for the fabrication and operation of a pressure-driven, PDMS-based bilayer microfluidic device that can be utilized to generate combinatorial libraries of water-in-oil emulsions called plugs are presented. By incorporating software programs and microfluidic hardware, the flow of desired fluids in the device can be controlled and manipulated to generate combinatorial plug libraries and to control the composition and quantity of constituent plug populations. These protocols will expedite the process of generating combinatorial screens, particularly to study drug response in cells from cancer patient biopsies.

著者スポットライト:Precision Oncologyにおける計算アプローチと実験的アプローチの統合

The fabrication of a polydimethylsiloxane (PDMS)-based bilayer device for the production of combinatorial libraries in water-in-oil emulsions (plugs) is presented here. The necessary hardware and software required to automate plug production are detailed in the protocol, and the production of a quantitative library of fluorescent plugs is also demonstrated.

コンビナトリアルプラグ製造のための二層マイクロ流体デバイス

Droplet microfluidics is a versatile tool that allows the execution of a large number of reactions in chemically distinct nanoliter compartments. Such ...