המחברים מבקשים להאריך את הכרת התודה שלהם לתמיכה כספית מקרן פסטר של ניו יורק (לJD, CS, CS), האיחוד האירופי-FP7 תכנית &quot;האוטומציה&quot; (לSLS), Institut התכנית קרנו 11 (לJD, AH , AR, RT, SLS) והפרויקט IMNOS (לRT, SLS), קרן קוני-מייב הצדקה (SLS), התואר השני באירופה בהדמיה מולקולרית (אליה), תוכניות האזור איל דה פראנס MODEXA (SLS), שומשום (SLS) וDimMalInf (SLS, RT), ANR תכנית Grandes Investissement de l&#39;Avenir תשתיות Nationales en Biologie-סנטה: צרפת LifebioImaging (FLI) צרפת חיים הדמיה (RT, SLS), צרפת bioimaging (JD, SLS) ו מכון פסטר בפריז. יתר על כן, החוקרים רוצים להודות, José Bengoechea והרברט שוויצר לחומרים כימיים. יתר על כן, החוקרים רוצים להודות סינדי Fevre שנוצר הנוגדנים.

1. ריאגנטים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישה או לפתח חיידקים זורח ותרבות תקשורת המתאימה כגון חיידקי Escherichia שונה המבטאים את ABCDE סוויטה דה לוקס 21, fischeri Vibrio, sp Photobacterium. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן תמיסת מלח פיסיולוגי (0.9% NaCl) ופתרונות תקשורת ותרבות על פי מתכונים סטנדרטיים. E. coli ו ק דלקת ריאות גדלו לוריא Bertani (LB) על 37 מעלות צלזיוס, וV. fischeri וsp Photobacterium בLB בתוספת 0.5 M NaCl על 22 ° C. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רכישה או לרכוש בדיקות ניאון כגון Q-גשש 705 (40 קוטר ננומטר, המכונה QD705), 800 (בקוטר ננומטר 40, המכונה QD800) Q-גשש, ניאון (40 קוטר ננומטר) וזעירים מקלקר לא פלורסנט ( 48 קוטר ננומטר), וצבעי ניאון קונבנציונליים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את חומרים כימיים הנחוצים לתיוג בקטריאלי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להבטיח גישה לתרמי פליטת אור חיה מלא, כמו ספקטרום IVIS, שמסוגל לזהות אות במגוון רחב של אורכי גל פליטה וזמני חשיפה. קורא צלחת מסוגל מדידות פליטת אור יספיק לרוב הניסויים שתוארו כאן. </li></ol> 2. שחזור בסיסי של דלק <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> החל מ מושבות בודדות בתרבות צלחות סטנדרטיות, להתחיל תרבויות לילה של חיידקים זוהרים. הנה, V. fischeri היו בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> היום של ניסויים, ליזום תת טריים ולאפשר להם להתקדם עד 600 OD של 1-1.5 מושגת. על מנת לייצר תוצאות דומות עדיף להשתמש בחיידקים במדינות צמיחה דומות שבהם מייצרים אותות אינטנסיביים. זה יכול להיות סמוך ובטוח על ידי שמירה מתמדת 600 OD. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שלב aliquots של 100 μl מכל אחד עם או 5 μl של QD705 או תמיסת מלח פיסיולוגי (PS), ולאחר מכן להוסיף ל895 μl של PS לstandacuvettes ספקטרוסקופיות rd. הנח את cuvettes המלא לתוך ספקטרום IVIS ולקחת מדידות תחת מערכות הסינון המתאימות. הנה, היה בשימוש במסנן הפליטה 710-730 ננומטר. </li></ol> 3. דלק במהלך משתנים במרחקים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שני נפח מופחת (1 מיליליטר) cuvettes פוטומטריה פלסטיק עם או 50 μl של QD705 או 97.2 μl של זעירים מקלקר 48 ננומטר לא פלורסנט בנפח כולל של PS 1 מיליליטר. זה מבטיח שטח פנים מוצק דומה לנפח כולל בין שתי הישויות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן קובט מקור אור על ידי עוטף קובט שלישי עם סרט שחור סטנדרטי או חומר אטום אחר מסוגל לחסום אור. להכין שני חלונות אופטיים זהים בזהירות בצדדים מנוגדים של קובט. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח את cuvettes מילא בעבר ישירות על גבי כל צד של קובט מקור האור. הוספת aliquot 1 מיליליטר של V. fischeri או אחרת תרבות (כלומר זורח E. coli או Photobacterium יםp) מתת טרי לתוך קובט מקור האור ולכסות אותו בחומר אטום, כגון נייר שחור כדי להפחית את כל זיהום אור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דמיין שלושה cuvettes תחת מסנני הפליטה המתאימים כגון האור סה&quot;כ ו710-730 מסנני פליטת ננומטר, עם זמני חשיפה של 10, 30, ו30 שניות, בהתאמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למקם את שני cuvettes החיצוני במרחקים נוספים שווי ערך מקובט המרכזי, ולאחר מכן לדמיין שוב. חזור על פעולה עד מרחק פנים אל פנים (מרכזיים לקובט נפח המופחת) סופי של 3 ס&quot;מ מושגת. בכל שלב, לרכוש תמונת פלואורסצנטי (עירור 450-480 ננומטר, 710-730 פליטת ננומטר) כדי לאמת את מיקום QD705. </li></ol> 4. חקירת צמדי דלק פוטנציאליים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא שני cuvettes נפח מופחת עם 1 פתרונות מיליליטר מכילים גם fluorophore או nanoparticle ניאון של עניין אחד, וPS או PS עם חלקיקים לא פלורסנט כביקורת השלילית באחר. העבודת הדואר הפגינה כאן, מגוון של fluorophores הפוטנציאל זמין מסחרי דלק וחלקיקי ניאון נחקר כפי שמתואר בטבלה 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוספת aliquot 1 מיליליטר של V. הטרי fischeri או חיידקים אחרים זורח לקובט השלישי מואפל המכיל שני חלונות אופטיים שווים מבחינה פיזית ממוקמים משני צדי מתרס. כסה קובט עם חומר אטום כגון פיסת נייר שחור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> במקום מרחק קצר אבל שווה שני cuvettes הנפח המופחת בכל צד של קובט המואפל ולדמיין תחת המסננים המתאימים. כאן, מרחק של 0.7 סנטימטר היה בשימוש. חזור עם fluorophores האחר. </li></ol> 5. דלק ממוקד <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן נוגדני biotinylated ספציפיים לחיידקים זורח. לדוגמא, נוגדנים כאן ראשוניים ספציפי לק pneumoniae (α-KP) היו biotinylated באמצעות תמיסה המכילה EZ-Link sulfo-NHS-LC-ביוטין. </li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר מגיב עודף מהנוגדנים באמצעות עמודות desalting תחת צנטריפוגה (1,500 XG) במשך 2 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש assay ברדפורד סטנדרטי על מנת לקבוע את ריכוז החלבון ולקבוע את מידת biotinylation נוגדנים על ידי assay Haba. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השג את נוגדן biotinylated α-KP-ביו קבוצות (AB) על ידי ערבוב 100 μl (10 מ&quot;מ, מומס ב1x PBS) עם נוגדן α-Kp 40 μl, וכתוצאה מהתואר אחרון של החלפה של 16 שאריות ביוטין לAb וסופיים ריכוז חלבון של 10 -1 מיליליטר מ&quot;ג. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש מרובה בלילה לשכפל תרבויות, למקד את החיידקים נשטפו עם הנוגדנים האמורים בעקבות הפרוטוקול המתאים. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באופן ספציפי, לשטוף את ק pneumoniae ב 1x PBS, ו resuspend ב 1x PBS לOD של 4 (בערך 4 x 10 8 CFU מיליליטר -1 OD -1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עבור כל לשכפל, דגירה 100 μl PBS, α -נוגדני KP (10 μl α-KP-biotB או 10 μl PBS לשליטה) ו100 תאי μl ל90 דקות ב30 ° C. לשטוף את התאים שלוש פעמים ב1x PBS, ו resuspend ב 196 μl PBS. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לתייג את התאים עם הצמוד streptavidin QD705 ולחלק אותם לשני כרכים מקבילים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שטוף פתרון אחד שלוש פעמים ולאחר מכן resuspend אותו לנפח המתאים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפץ של פתרונות שטף ולא רחוצים לתוך בארות בודדות של צלחת 96 היטב שחורה 100 μl. מדוד את הארה וכתוצאה תחת האור סה&quot;כ, 490-510 ננומטר, ו710-730 מסננים ננומטר. ריכוז Fluorophore ניתן לקבוע באמצעות 450-480 עירור ננומטר ו710-730 פליטת ננומטר. </li></ol>

<ol>
	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

המחברים מצהירים מתחרים אינטרסים כלכליים. JD, SB, KLR וSLS תרמו לEP10290158.4 פטנטים האירופי וארגון עולמי לקניין רוחני פטנטים היישום WO/2011/117847.

הפגנת היסוד של דלק יכולה להיות מושגת רק על ידי ערבוב של חיידקים זורח עם חלקיקים או QDs ניאון. שני הגופים יהיו מופרדים פיזי ולהישאר מעבר לכל מרחק RET יעיל. קשה יותר הוא אופטימיזציה של אות הדלק הן במבחנה in vivo. תחת תנאים במבחנה, עם או בלי הווה בולם אופטי, בדרך כלל התוספת של fluorophore העודף תהיה מספיק על מנת למקסם את תגובת הדלק. עם זאת, בתופעות ריכוזים גבוהים כגון מרווה סטטי או collisional יכול להוביל לאובדן של אות ניאון. ביצוע סדרת דילול על ידי באופן עצמאי שינוי הריכוז של המקור זורח וfluorophore יעזור לייעל את הריכוזים הרצויים. ההקמה ואופטימיזציה של דלק תחת בריכוזי vivo היא הרבה יותר קשה וצריכה להיות מטופל על בסיס מקרה לפי מקרה. זה יכול להיות קשה ליצור שיתוף<html> ndition בי ישות הניאון ניתן לגשת אופטית על ידי המקור זורח. ככזה, החל בשיתוף זריקות ישירות של שני moieties יכול לספק מידע בנוגע להצלחה של דלק בתנאים אופטימליים. פרוטוקולים סטנדרטיים קיימים לחיידקים תיוג ותאי אוקריוטים עם גופי ניאון כגון סדרת Alexa וQDs. לעתים קרובות זה דורש functionalization שטח או הפעלה עם נוגדנים, מה שעלול להוביל לתופעות לא רצויות כמו כדאיות תא מופחתות או פעילות המטבולית שונה. כדי להתגבר על זה, זה חשוב כדי לקבוע את הכמות האופטימלית של נוגדן או סוכן הפעלה דרושה שממזערת את הפרעות סלולריות תוך מיקסום ניאון התיוג. השימוש בQDs יש יתרון משום של הספקטרום הרחב שלהם אופייני עירור, ספקטרום פליטה צר ומתכונן, ואת האפשרות של שינוי סטוקס גדול. עם זאת, QDs יכול להיות ציטוטוקסיות ולא יכול להיות רצוי במקרים מסוימים. class = &quot;jove_content&quot;&gt; דלק הוא תופעה שקיימת בניסויי ברט רבים 13 וישימה למגוון רחב של זורח ומקורות ניאון. עד עכשיו, הפוטונים וכתוצאה מהדלק נחשבו התוצר של אינטראקציות שאינן ספציפיות או אות רקע מצערת כתוצאה מניסויי ברט לא תוכננו כראוי. זה רק עם הסוג של ניסויים הוכיחו כאן שאנחנו הצלחנו לזהות את התועלת של אותות לא רצויים זו. בדוגמאות שמוצגים, החיידקים זורח לפעול כמקור עירור מפוזר מסוגל לעורר תגובת ניאון סטנדרטית ממגוון רחב של גופי ניאון. כמו כן, בשל מרחק העבודה משמעותי, זה בטוח להגיע למסקנה שבזמן שהדלק יכול להיות שנבנה ללא ההתרחשות של ברט, ברט באופן כללי לא ניתן לצפות ללא תרומה מדלק. חשוב מכך, בשל חוסר דרישת מיקוד, דלק יכול לשמש כדי לכסות על הפער המרחבי הקיים בין ברט וגטכניקות הדמיה כל בעלי חי onventional.

ההנדסה הגנטית של אורגניזמים, כגון וירוסי 1, 2, 3 חיידקים או יונקים קטנים 4 או כדי לגרום או פליטת אור constitutively מפורש, הייתה מוצלחת מאוד והוכיחה 5-7 באופן נרחב. פליטת אור, תגובת chemiluminescent in vivo מעורבת חומרים כימיים מתרחשים באופן טבעי, יש את היתרון של הפקת אור ללא הצורך במקור אור חיצוני. ככזה, ההדמיה bioluminescent אינה סובלת מהחסרונות הנפוצים של אות אוטומטית ואינו ספציפית מצאו מדימות פלואורסצנטי 8. כתוצאה מכך, יש פליטת אור יחס אות לרעש משמעותי שכן כל אות שאותרה מקורו אך ורק מהמקור המיועד. בעוד דגמים רבים ניצלו את אופרון לוקס מluminescens Photorhabdus (מקסימום פליטה מרוכז בין 480 ו490 ננומטר) במבחנה וביישומי vivo 9, השימוש בו בmamm הקטןals היה בעייתי בשל האופי מאוד של תנאי ההדמיה; קיומה המסעיר של בולמים אופטיים, כגון המוגלובין, וסוכני פיזור, כגון רקמות ועצמות, חזק להשפיע כחול לאורכי גל צהובים 3. הביטוי של לוציפראז מהונדס גחלילית (מקסימום פליטה ב 617nm) פותח לאחרונה ומשולב, מתן כלי שמאוד מתגבר על קליטה אופטית 10, אבל עדיין כפוף לפיזור אפקטים. בתגובה, היו ניסיונות רבים לאדומים להעביר את האות הנפלטת לחלון האופטי הרצוי של 650-900 ננומטר, אזור של קליטה ופיזור ממוזערים, באמצעות העברת תהודה פליטת אור אנרגיה (ברט) 11-13. ככלי כדי לשפר את זיהוי אות, ברט, אשר משתמש במקור bioluminescent כתורם וfluorophore הוסיף כacceptor, מצא הצלחה מוגבלת. כדוגמא מכוננת של תופעה זו, &quot;נקודות קוונטיות מאיר עצמית4; (SIQDs) 14 מורכבים שונה Renilla reniformis luciferases חייב שכבת פולימר-ליזין החיצוני נקודות קוונטיות של זמינה מסחרי (QDs). על מצע בנוסף, תגובת bioluminescent וכתוצאה גורמת פליטת הקרינה מQDs, שהניבו ייצור משמעותי של פוטונים אדומים. עם זאת, SIQDs אלה תחולה מוגבלת בהדמית vivo של אירועים רלוונטיים מבחינה פיזיולוגית. תחולה מוגבלת זו היא ככל הנראה בשל הקושי של מקשר את הבדיקה הכפולה לאיבר, תא או הגן של עניין, שכן SIQDs לא ניתן מקודד גנטי ולכן ידרוש שינוי המשני של קליפת הפולימר. כדי לשפר את תחולתם, SIQDs החלופי, שבו luciferases מחויבים ישירות לליבה זורח, לאחרונה הועסק 15. בונה את של מושג SIQD, מערכת ברט ישימה יותר הושגה על ידי הצמדת לוציפראז Cypridina בdocyanine צבע 16, שהיה מסוגלת במיוחד מיקוד גידולים בעכברים תוך הפקת משמרת אדומה משמעותית מ460 ננומטר ל675 ננומטר. לעבור העברת אנרגיה לא מקרין, ברט עוקב אחר אותו אילוצים עיקריים כמו עמית הניאון שלה: שחייבת להיות חפיפה ספקטרלית חזקה בין הפליטה התורמת ואת ספקטרום עירור acceptor ומרחק העבודה בין שני moieties חייב להיות על סדר רדיוס פורסטר (5-14 ננומטר בהתאם לזוג-acceptor התורם, עם מרחק מקסימאלי יעיל של פעמיים רדיוס פורסטר 17). תלות מרחק זה מאוד מגבילה את סוגי אירועים שניתן לצפות באמצעות ברט כאמצעי כדי לשפר את זיהוי. לאחרונה גישה חדשה זוהתה והפגינה מתחת הן במבחנה בתנאי vivo. בונה את הבסיס של ברט, הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק) 18, 19 </sup&gt; גם דורש חפיפה ספקטרלית חזקה בין זורח ורכיבי ניאון. עם זאת, שלא כמו ברט, דלק הוא תהליך קרינה לחלוטין לפיה הפוטון הנפלט מהמקור זורח נספג על ידי fluorophore אופטי נגיש, אשר לאחר מכן פולט פוטון אדום העביר על פי תשואת קוונטי fluorophore. בדומה לברט, גישה זו יכולה לשמש גם כדי להתגבר על המגבלות של הדמיה בנוכחות בולמים אופטיים. המשמרת האדומה וכתוצאה מכך מספקת עלייה כללית וספציפיות באות זוהתה כתוצאה מירידה בהנחתה וצמצום השפעות פיזור אופטיות. דלק כבר דיווח להתרחש בין coli Escherichia bioluminescent להביע אופרון לוקס ו18 QDs, 19. בעוד בניסוי דומה לSIQDs, הבדל מהותי קיים: בדלק, זה לא הכרחי למקור זורח להיות כבול פיזי לfluorophore, המאפשר עבורr קידוד גנטי של החללית זורח. בשל זיהוי המוצלח של דלק בין חיידקים זורח וQDs, זה אפשרי, כי טכניקה זו יכולה להיות מיושמת על שני שטחי (עור) ורקמות עמוקות (ריאות, כבד) זיהומים כגון סטפילוקוקוס וKlebsiellia דלקת ריאות. מאז הדו&quot;ח של המשמעות הניסיונית שלה, דלק התפתח לכלול מודל מתמטי חזק 20 שיכולים לשמש כדי לחזות זורח מקובלות וזוגות ניאון, והיישומים שלה יורחבו ויכללו שימוש בזיהוי מאפייני photophysical כגון תשואת קוונטים. אנו מתארים להלן כמה מן הטכניקות הבסיסיות של דלק. ראשית, אנו מציגים ראיות לתופעה זו על שניהם קצר (מיקרומטר) וארוך (סנטימטר) מרחקים עובדים, אשר ביסוד מבדיל דלק מברט. שנית, אנו להרחיב על זוגות דלק האפשריים על ידי בחינת מגוון רחב של fluorophores וחלקיקי ניאון. Thirד, יישומי דלק נחקרים על ידי השוואת זוגות דלק ממוקד ולא ממוקדים.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק) היא תהליך עירור פליטת קרינה שמייצר אות מוגברת ושיפור לעומת במבחנה in vivo. מניות דלק רבות של אותם העקרונות הבסיסיים כמו העברת פליטת אור התהודה אנרגיה (ברט), ובכל זאת שונה מאוד במרחקי עבודה המקובלים בין המקור זורח וישות הניאון. בעוד ברט מוגבל ביעילות עד למקסימום של 2 פעמים רדיוס פורסטר, בדרך כלל פחות מ 14 ננומטר, דלק יכול להתרחש במרחקים של עד מיקרומטר או אפילו סנטימטר בהעדר בולם אופטי. כאן אנו להרחיב על הבסיס ואת הישימות של דלק ידי עיון בעקרונות הרלוונטיים מאחורי התופעה ולהדגים את התאימות שלה עם מגוון רחב של fluorophores וחלקיקי ניאון. יתר על כן, השירות של דלק ממוקד נוגדן נחקר. דוגמאות שהובאו כאן מספקות ראיות לכך שדלק יכול להיות מנוצל עבור Applications בי ברט אינו אפשרי, למלא את החלל המרחבי הקיים בין ברט וההדמיה חיה כולה מסורתית.

Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן.

שלב מעבר לברט: הקרינה על ידי מאוגד עירור מההארה (דלק)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K Views.  Institut Pasteur.  הרחבת הבסיס ותחולתה של הקרינה על ידי מאוגד עירור מהארה (דלק) על ידי מדידות העקרונות הרלוונטיים והוכחת התאימות שלה עם שפע של fluorophores ותנאים ממוקדי נוגדן. 

Video: A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

תרמודינמיקה של קיפול חלבונים ממברנה נמדד על ידי הקרינה ספקטרוסקופיה

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

חיים דימות פלואורסצנטי של הרוטורים מולקולרית בתאים חיים

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

דור ושחזור של spheroids β-תא מהידרוג שלב צמיחת PEG-פפטיד

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

רזולוציה גבוהה ניתוח Spatiotemporal של קולטן Dynamics ידי המולקולה בודדת מיקרוסקופ פלואורסצנטי

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

מהדמיה מהירה פלואורסצנטי לחוק דיפוזיה מולקולרי בקרום תא חי במיקרוסקופ מסחרי

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

הנדסת קרינה פלואורסצנטית 'הזהב' על-ידי הלחץ הסלקטיבי התאגדות של חומצות אמינו קאנונית, אנליזת חלבונים באמצעות ספקטרומטר מסה, קרינה פלואורסצנטית

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

ייצור מדרגי של הערוץ מתיחה, כפול, צ'יפס Microfluidic איברים

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

ניצוח מספר מצבי הדמיה עם מיקרוסקופ זריחה אחת

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.