Los autores desean expresar su agradecimiento por el apoyo financiero de la Fundación Pasteur de Nueva York (JD, CS, CS), la EU-FP7 programa &quot;Automation&quot; (SLS), el Programa de Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) y el Proyecto IMNOS (a RT, SLS), la Fundación Conny-Maeve Charitable (SLS), European Masters in Molecular Imaging (a él), los programas de la Región Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) y DimMalInf (SLS, RT), la ANR Programa Grandes Investissement de l&#39;avenir Infraestructuras Nacionales en Biologie-Santé: Francia LifebioImaging (FLI) Francia Vida Imaging (RT, SLS), Francia Bioimaging (JD, SLS) y la Institut Pasteur, París. Además, los autores desean agradecer a José Bengoechea y Herbert Schweizer para reactivos. Además, los autores les gustaría agradecer a Cindy Fevre que generó los anticuerpos.

1. Reactivos <ol><li> Compra o desarrollar bacterias luminiscentes y medios de cultivo adecuados, tales como Escherichia coli modificada que expresa el ABCDE lux 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Prepare una solución salina fisiológica (0,9% NaCl) y soluciones de medios de cultivo de acuerdo a las recetas estándar. E. coli y K. pneumoniae se cultivaron en medio Luria Bertani (LB) a 37 ° C, y V. fischeri y Photobacterium SP en LB suplementado con NaCl 0,5 M a 22 ° C. </li><li> Compra o adquisición de sondas fluorescentes tales como Q-Tracker 705 (40 nm de diámetro, referido como QD705), Q-Tracker 800 (40 nm de diámetro, referido como QD800), fluorescente (40 nm de diámetro) y las microesferas de poliestireno no fluorescentes ( 48 nm de diámetro), y colorantes fluorescentes convencionales. </li><li> Preparar los reactivos necesarios para el etiquetado bacteriana. </li><li> Asegurar el acceso atodo un reproductor de imágenes de bioluminiscencia animal, tal como un espectro IVIS, que es capaz de detectar la señal en un amplio rango de longitudes de onda de emisión y los tiempos de exposición. Un lector de placas capaz de mediciones de bioluminiscencia será suficiente para la mayoría de los experimentos descritos aquí. </li></ol> 2. Recapitulación básico de FUEL <ol><li> A partir de colonias individuales en placas de cultivo estándar, iniciar cultivos de una noche de bacterias luminiscentes. Aquí, V. Se han usado fischeri. </li><li> El día del experimento, iniciado subculturas frescos y les permite progresar hasta que se logre una DO 600 de 1 a 1,5. Con el fin de obtener resultados comparables, es mejor usar las bacterias en los estados de crecimiento similares en donde se produzca señales intensas. Esto puede ser asegurada por mantener el OD 600 constante. </li><li> Combine alícuotas de 100 l de cada uno, ya sea con 5 l de QD705 o solución salina fisiológica (PS), y luego añadir 895 l de PS en standacubetas ª espectroscópicas. Coloque las cubetas llenas en el espectro IVIS y tomar las medidas en virtud de los conjuntos de filtros apropiados. Aquí, se utilizó el filtro de emisión de 710-730 nm. </li></ol> 3. FUEL a distintas distancias <ol><li> Llenar dos volumen reducido (1 ml) cubetas fotométricas de plástico, ya sea con 50 l de QD705 o 97,2 l de no fluorescentes microesferas de poliestireno 48 nM en un volumen total de 1 ml de PS. Esto asegura superficie sólida similar al volumen total entre las dos entidades. </li><li> Preparar una cubeta de fuente de luz encerrando una tercera cubeta con cinta negro estándar o de algún otro material opaco capaz de bloquear la luz. Prepare cuidadosamente dos ventanas ópticas idénticos en lados opuestos de la cubeta. </li><li> Coloque las cubetas previamente llenados directamente sobre cada lado de la cubeta de la fuente de luz. Añadir una alícuota de 1 ml de V. cultura fischeri u otro (es decir, luminiscente E. coli o Photobacterium sp) de una subcultura fresca en la cubeta de la fuente de luz y se cubre con un material opaco, como papel negro para reducir la contaminación de luz. </li><li> Visualice los tres cubetas bajo los filtros de emisión apropiadas tales como la luz total y filtros de emisión 710-730 nm, con tiempos de exposición de 10, 30 y 30 segundos, respectivamente. </li><li> Vuelva a colocar las dos cubetas externos a otras distancias equivalentes de la cubeta central, y luego visualizar de nuevo. Repita hasta que se logre una distancia final cara a cara (central a la reducción del volumen de la cubeta) de 3 cm. En cada paso, adquirir una imagen de fluorescencia (450-480 nm de excitación, 710-730 nm de emisión) para validar la ubicación QD705. </li></ol> 4. Investigar pares potencial combustible <ol><li> Llene dos cubetas de volumen reducido con 1 ml de soluciones que contenían o bien un fluoróforo o una nanopartícula fluorescente de interés en uno, y PS o PS con nanopartículas no fluorescentes como el control negativo en el otro. En the trabajo demostró aquí, una variedad de potenciales fluoróforos combustible disponible comercialmente y nanopartículas fluorescentes fueron investigados como se indica en la Tabla 1. </li><li> Añadir una alícuota de 1 ml de V. fresca fischeri u otras bacterias luminiscentes a una tercera cubeta oscuras-que contiene dos ventanas ópticas físicamente iguales situados en lados opuestos. Tapar la cubeta con una sustancia opaca, como una hoja de papel negro. </li><li> En un lugar de corta distancia, pero igual las dos cubetas de volumen reducido en ambos lados de la cubeta a oscuras-y visualizar bajo los filtros adecuados. Aquí, se utilizó una distancia de 0,7 cm. Repita con el resto de los fluoróforos. </li></ol> 5. FUEL Targeted <ol><li> Preparar anticuerpos biotinilados específicos para las bacterias luminiscentes. Por ejemplo, los anticuerpos primarios específicos aquí en K. pneumoniae (α-PK) se biotinilaron utilizando una solución que contiene EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina. </li&gt; <li> Eliminar el exceso de reactivo de los anticuerpos utilizando columnas de desalación bajo centrifugación (1.500 xg) durante 2 min. </li><li> Utilice un ensayo estándar de Bradford para determinar la concentración de proteína y determinar el grado de biotinilación de anticuerpos mediante un ensayo de HABA. </li><li> Obtener el anticuerpo biotinilado α-PK-Biot (Ab) lotes mediante la mezcla de 100 l (10 mM, disuelto en 1x PBS) con 40 l de anticuerpo α-PK, lo que resulta en un grado final de sustitución de 16 residuos de biotina por AB y una final concentración de proteína de 10 mg ml -1. </li><li> El uso de múltiples replicar noche culturas, apuntan a las bacterias lavadas con los anticuerpos antes mencionados siguiendo el protocolo adecuado. <ol><li> En concreto, se lava la K. pneumoniae en 1x PBS, y se vuelve a suspender en 1 x PBS a una DO de 4 (ca. 4 x 10 8 UFC ml -1 OD-1). </li><li> Para cada repetición, se incuban 100 l de PBS, α -Anticuerpos Kp (10 l α-Kp-biotB o 10 l de PBS para el control) y 100 células l durante 90 min a 30 ° C. Lavar las células tres veces en PBS 1x, y resuspender en 196 l de PBS. </li></ol></li><li> Etiquetar las células con el conjugado estreptavidina QD705 y dividirlos en dos volúmenes equivalentes. </li><li> Lave una solución y tres veces y luego volver a suspender en el volumen apropiado. </li><li> Distribuir 100 l de las soluciones lavadas y sin lavar en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos de color negro. Mida la luminiscencia resultante bajo la luz total, desde 490 hasta 510 nm y 710-730 nm filtros. Concentración de fluoróforo se puede determinar usando 450-480 nm de excitación y 710-730 nm de emisión. </li></ol>

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	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

Los autores declaran que compiten intereses financieros. JD, SB, KLR y SLS contribuyeron a EP10290158.4 Europea de Patentes y la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual la solicitud de patente WO/2011/117847.

La manifestación fundamental de FUEL puede lograrse simplemente mediante la mezcla de bacterias luminiscentes con nanopartículas o puntos cuánticos fluorescentes. Las dos entidades serán separados físicamente y permanecen más allá de cualquier distancia RET eficiente. Más difícil es la optimización de la señal COMBUSTIBLE tanto in vitro como in vivo. En condiciones in vitro, con y sin un absorbedor óptico presente, por lo general la adición de un exceso fluoróforo será suficiente para maximizar la respuesta de combustible. Sin embargo, a altas concentraciones fenómenos tales como la atenuación estática o de colisión puede conducir a una pérdida de señal fluorescente. Realización de una serie de diluciones variando de forma independiente de la concentración de la fuente luminiscente y el fluoróforo ayudará a optimizar las concentraciones deseadas. El establecimiento y la optimización de combustible bajo las concentraciones in vivo es mucho más difícil y debe ser abordado en una base de caso por caso. Puede ser difícil para crear un condition donde la entidad fluorescente se puede acceder ópticamente por la fuente luminiscente. Como tal, comenzando con los compañeros de las inyecciones directas de los dos restos puede proporcionar información sobre el éxito de combustible bajo condiciones óptimas. Existen protocolos estándar para las bacterias de etiquetado y células eucariotas con las entidades fluorescentes tales como la serie Alexa y puntos cuánticos. A menudo esto requiere funcionalización de la superficie o de la activación con anticuerpos, que puede conducir a efectos no deseados, como reducción de la viabilidad celular o la actividad metabólica alterada. Para superar esto, es importante para determinar la cantidad óptima de anticuerpo o agente de activación necesario que minimiza las perturbaciones celulares y aumentar al máximo el etiquetado fluorescente. El uso de puntos cuánticos es ventajoso debido a su amplia característicamente espectros de excitación, espectro de emisión estrecho y sintonizable, y la posibilidad de un gran desplazamiento de Stokes. Sin embargo, los puntos cuánticos pueden ser citotóxicos y pueden no ser deseable en algunos casos. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; combustible es un fenómeno que está presente en muchos experimentos BRET 13 y es aplicable a una variedad de fuentes luminiscentes y fluorescentes. Hasta ahora, los fotones procedentes del combustible se consideraron el producto de interacciones no específicas o una señal de fondo desafortunado resultado de experimentos BRET mal diseñados. Es sólo con el tipo de experimentos se ha demostrado aquí que hemos sido capaces de identificar la utilidad de esta señal no deseada. En los ejemplos mostrados, las bacterias luminiscentes actúan como una fuente de excitación difusa capaz de provocar una respuesta fluorescente estándar a partir de una amplia variedad de entidades fluorescentes. Además, debido a la distancia de trabajo sustancial, es seguro concluir que mientras que el combustible se puede construir sin la aparición de BRET, en BRET en general no puede ser observado sin una contribución de FUEL. Es importante destacar que, debido a la falta de un requisito de la orientación, el combustible puede ser utilizado para cubrir la brecha espacial que existe entre BRET y Clas técnicas de imagen en los animales intactos onventional.

La modificación genética de organismos, tales como virus 1, 2, 3, bacterias o pequeños mamíferos 4 a cualquiera de inducir o bioluminiscencia expresan constitutivamente, ha sido muy exitoso y ampliamente demostrado 5-7. La bioluminiscencia, una reacción quimioluminiscente en vivo que implica los reactivos de origen natural, tiene la ventaja de la producción de luz sin la necesidad de una fuente de luz externa. Como tal, bioluminiscente de imágenes no sufre de los inconvenientes comunes de la señal de auto-y no específicos encontrados a partir de imágenes de fluorescencia 8. En consecuencia, la bioluminiscencia tiene una relación significativa de señal a ruido, ya que cualquier señal detectada se origina únicamente a partir de la fuente deseada. Mientras que muchos modelos han explotado el operón lux de Photorhabdus luminescens (máximo de emisión centrado entre 480 y 490 nm) para in vitro y en aplicaciones in vivo 9, su uso en pequeña mammALS ha sido problemática debido a la propia naturaleza de las condiciones de formación de imágenes; la existencia omnipresente de absorbentes ópticos, tales como la hemoglobina, y agentes de dispersión, tales como el tejido y el hueso, afectan en gran medida a longitudes de onda azul amarillas 3. La expresión de una luciferasa de luciérnaga ingeniería (máximo de emisión a 617 nm) se ha desarrollado e incorporado recientemente, proporcionando una herramienta que supera en gran medida la absorción óptica 10, pero todavía está sujeta a los efectos de dispersión. En respuesta, se han producido varios intentos de desplazamiento al rojo de la señal emitida en la ventana óptica deseada de 650 a 900 nm, una región de absorción minimizado y dispersión, utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) 11-13. Como una herramienta para mejorar la detección de señal, BRET, que utiliza una fuente bioluminiscente como el donante y un fluoróforo añadido como aceptor, se ha encontrado un éxito limitado. Como ejemplo seminal de este fenómeno, &quot;puntos cuánticos con iluminación propia4; (SIQDs) 14 consisten de modificación de Renilla reniformis luciferasas unidos a la capa de polímero de lisina externa puntos cuánticos de disponible en el mercado (puntos cuánticos). Después de la adición de sustrato, la reacción bioluminiscente resultante induce la emisión de fluorescencia de los puntos cuánticos, la generación de una producción significativa de fotones rojos. Sin embargo, estos SIQDs han aplicabilidad limitada para la visualización en vivo de eventos fisiológicamente relevantes. Esta aplicabilidad limitada es probablemente debido a la dificultad de unir la sonda dual para el órgano, célula o gen de interés, ya que los SIQDs no pueden ser codificados genéticamente y por lo tanto, requerirían una modificación secundaria de la cubierta de polímero. Para mejorar su aplicabilidad, SIQDs alternativas, cuando las luciferasas están vinculados directamente al núcleo luminiscente, recientemente se han empleado 15. La construcción de fuera del concepto SIQD, un sistema de BRET más aplicable se consiguió uniendo Cypridina luciferasa a una endocyanine tinte 16, que era capaz de dirigirse específicamente tumores en ratones, mientras que la producción de un cambio sustancial de color rojo de 460 nm a 675 nm. Para someterse a la transferencia de energía no radiante, BRET sigue las mismas restricciones primarias como su contraparte fluorescente: tiene que haber un fuerte solapamiento espectral entre la emisión de los donantes y los espectros de excitación del aceptor y la distancia de trabajo entre las dos mitades deben estar en el orden del radio de Förster (5-14 nm en función de la pareja donante-aceptante, con una distancia máxima efectiva de dos veces el radio Förster 17). Esta dependencia de la distancia limita en gran medida los tipos de eventos que se pueden observar utilizando BRET como un medio para mejorar la detección. Recientemente se identificó un nuevo enfoque y demostrarse en tanto in vitro como en condiciones in vivo. Construido a partir de la fundación de BRET, Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) 18, 19 </sup&gt; también requiere un fuerte solapamiento espectral entre la luminiscencia y componentes fluorescentes. Sin embargo, a diferencia de BRET, el combustible es un proceso completamente radiativo mediante el cual el fotón emitido desde la fuente luminiscente es absorbida por un fluoróforo ópticamente accesible, que posteriormente emite un fotón desplazada al rojo de acuerdo con el rendimiento cuántico fluoróforo. Similar a BRET, este enfoque también se puede utilizar para superar las limitaciones de formación de imágenes en presencia de absorbentes ópticos. El desplazamiento hacia el rojo resultante proporciona un aumento global y la especificidad en la señal detectada debido a una disminución en la atenuación y una reducción de los efectos de dispersión óptica. De combustible se ha informado de que se produzca entre Escherichia coli bioluminiscentes que expresan el operón lux y puntos cuánticos 18, 19. Si bien experimentalmente similar a los SIQDs, existe una diferencia fundamental: en el combustible, no es necesario para la fuente luminiscente de estar físicamente unido al fluoróforo, que permite FOr codificación genética de la sonda luminiscente. Debido a la detección exitosa de combustible entre bacterias luminiscentes y puntos cuánticos, es posible que esta técnica se podría aplicar a ambos superficial (piel) y el tejido profundo (pulmón, hígado) infecciones tales como Staphylococcus aureus y Klebsiellia pneumoniae. Desde el informe de su significado experimental, combustible ha evolucionado para incluir un modelo matemático robusto 20 que se puede utilizar para predecir luminiscente aceptable y pares fluorescentes, y sus aplicaciones se han expandido para incluir su uso en la identificación de características fotofísicas tales como rendimiento cuántico. A continuación se describen algunas de las técnicas básicas de FUEL. En primer lugar, se muestra evidencia de este fenómeno sobre tanto a corto (m) y largo (cm) distancias de trabajo, que distingue fundamentalmente COMBUSTIBLE de BRET. En segundo lugar, expansión a partir de los posibles pares de combustible en el examen de una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Third, aplicaciones de combustible se investigan mediante la comparación de pares COMBUSTIBLE dirigidos y no dirigidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescencia por consolidar excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) es un proceso de excitación-emisión de radiación que produce aumento de la señal y la mejora del contraste in vitro e in vivo. Porcentajes de combustible de muchos de los mismos principios subyacentes como la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), sin embargo, difiere en gran medida en las distancias de trabajo aceptables entre la fuente luminiscente y la entidad fluorescente. Mientras BRET se limita efectivamente a un máximo de 2 veces el radio de Förster, habitualmente menos de 14 nm, el combustible puede ocurrir a distancias de hasta micras o incluso cm en ausencia de un absorbente óptico. Aquí ampliamos sobre el fundamento y la aplicabilidad de FUEL mediante la revisión de los principios pertinentes que justifican el fenómeno y demostrar su compatibilidad con una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Además, la utilidad de COMBUSTIBLE de anticuerpos dirigidos se explora. Los ejemplos mostrados aquí demuestran que el combustible puede ser utilizado para la aplicaciones donde BRET no es posible, llenando el vacío espacial que existe entre BRET y de imagen animal completamente tradicional.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos.

Un paso más allá de BRET: Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K vistas.  Institut Pasteur.  La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos. 