Los autores desean expresar su agradecimiento por el apoyo financiero de la Fundación Pasteur de Nueva York (JD, CS, CS), la EU-FP7 programa &quot;Automation&quot; (SLS), el Programa de Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) y el Proyecto IMNOS (a RT, SLS), la Fundación Conny-Maeve Charitable (SLS), European Masters in Molecular Imaging (a él), los programas de la Región Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) y DimMalInf (SLS, RT), la ANR Programa Grandes Investissement de l&#39;avenir Infraestructuras Nacionales en Biologie-Santé: Francia LifebioImaging (FLI) Francia Vida Imaging (RT, SLS), Francia Bioimaging (JD, SLS) y la Institut Pasteur, París. Además, los autores desean agradecer a José Bengoechea y Herbert Schweizer para reactivos. Además, los autores les gustaría agradecer a Cindy Fevre que generó los anticuerpos.

1. Reactivos <ol><li> Compra o desarrollar bacterias luminiscentes y medios de cultivo adecuados, tales como Escherichia coli modificada que expresa el ABCDE lux 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Prepare una solución salina fisiológica (0,9% NaCl) y soluciones de medios de cultivo de acuerdo a las recetas estándar. E. coli y K. pneumoniae se cultivaron en medio Luria Bertani (LB) a 37 ° C, y V. fischeri y Photobacterium SP en LB suplementado con NaCl 0,5 M a 22 ° C. </li><li> Compra o adquisición de sondas fluorescentes tales como Q-Tracker 705 (40 nm de diámetro, referido como QD705), Q-Tracker 800 (40 nm de diámetro, referido como QD800), fluorescente (40 nm de diámetro) y las microesferas de poliestireno no fluorescentes ( 48 nm de diámetro), y colorantes fluorescentes convencionales. </li><li> Preparar los reactivos necesarios para el etiquetado bacteriana. </li><li> Asegurar el acceso atodo un reproductor de imágenes de bioluminiscencia animal, tal como un espectro IVIS, que es capaz de detectar la señal en un amplio rango de longitudes de onda de emisión y los tiempos de exposición. Un lector de placas capaz de mediciones de bioluminiscencia será suficiente para la mayoría de los experimentos descritos aquí. </li></ol> 2. Recapitulación básico de FUEL <ol><li> A partir de colonias individuales en placas de cultivo estándar, iniciar cultivos de una noche de bacterias luminiscentes. Aquí, V. Se han usado fischeri. </li><li> El día del experimento, iniciado subculturas frescos y les permite progresar hasta que se logre una DO 600 de 1 a 1,5. Con el fin de obtener resultados comparables, es mejor usar las bacterias en los estados de crecimiento similares en donde se produzca señales intensas. Esto puede ser asegurada por mantener el OD 600 constante. </li><li> Combine alícuotas de 100 l de cada uno, ya sea con 5 l de QD705 o solución salina fisiológica (PS), y luego añadir 895 l de PS en standacubetas ª espectroscópicas. Coloque las cubetas llenas en el espectro IVIS y tomar las medidas en virtud de los conjuntos de filtros apropiados. Aquí, se utilizó el filtro de emisión de 710-730 nm. </li></ol> 3. FUEL a distintas distancias <ol><li> Llenar dos volumen reducido (1 ml) cubetas fotométricas de plástico, ya sea con 50 l de QD705 o 97,2 l de no fluorescentes microesferas de poliestireno 48 nM en un volumen total de 1 ml de PS. Esto asegura superficie sólida similar al volumen total entre las dos entidades. </li><li> Preparar una cubeta de fuente de luz encerrando una tercera cubeta con cinta negro estándar o de algún otro material opaco capaz de bloquear la luz. Prepare cuidadosamente dos ventanas ópticas idénticos en lados opuestos de la cubeta. </li><li> Coloque las cubetas previamente llenados directamente sobre cada lado de la cubeta de la fuente de luz. Añadir una alícuota de 1 ml de V. cultura fischeri u otro (es decir, luminiscente E. coli o Photobacterium sp) de una subcultura fresca en la cubeta de la fuente de luz y se cubre con un material opaco, como papel negro para reducir la contaminación de luz. </li><li> Visualice los tres cubetas bajo los filtros de emisión apropiadas tales como la luz total y filtros de emisión 710-730 nm, con tiempos de exposición de 10, 30 y 30 segundos, respectivamente. </li><li> Vuelva a colocar las dos cubetas externos a otras distancias equivalentes de la cubeta central, y luego visualizar de nuevo. Repita hasta que se logre una distancia final cara a cara (central a la reducción del volumen de la cubeta) de 3 cm. En cada paso, adquirir una imagen de fluorescencia (450-480 nm de excitación, 710-730 nm de emisión) para validar la ubicación QD705. </li></ol> 4. Investigar pares potencial combustible <ol><li> Llene dos cubetas de volumen reducido con 1 ml de soluciones que contenían o bien un fluoróforo o una nanopartícula fluorescente de interés en uno, y PS o PS con nanopartículas no fluorescentes como el control negativo en el otro. En the trabajo demostró aquí, una variedad de potenciales fluoróforos combustible disponible comercialmente y nanopartículas fluorescentes fueron investigados como se indica en la Tabla 1. </li><li> Añadir una alícuota de 1 ml de V. fresca fischeri u otras bacterias luminiscentes a una tercera cubeta oscuras-que contiene dos ventanas ópticas físicamente iguales situados en lados opuestos. Tapar la cubeta con una sustancia opaca, como una hoja de papel negro. </li><li> En un lugar de corta distancia, pero igual las dos cubetas de volumen reducido en ambos lados de la cubeta a oscuras-y visualizar bajo los filtros adecuados. Aquí, se utilizó una distancia de 0,7 cm. Repita con el resto de los fluoróforos. </li></ol> 5. FUEL Targeted <ol><li> Preparar anticuerpos biotinilados específicos para las bacterias luminiscentes. Por ejemplo, los anticuerpos primarios específicos aquí en K. pneumoniae (α-PK) se biotinilaron utilizando una solución que contiene EZ-Link sulfo-NHS-LC-biotina. </li&gt; <li> Eliminar el exceso de reactivo de los anticuerpos utilizando columnas de desalación bajo centrifugación (1.500 xg) durante 2 min. </li><li> Utilice un ensayo estándar de Bradford para determinar la concentración de proteína y determinar el grado de biotinilación de anticuerpos mediante un ensayo de HABA. </li><li> Obtener el anticuerpo biotinilado α-PK-Biot (Ab) lotes mediante la mezcla de 100 l (10 mM, disuelto en 1x PBS) con 40 l de anticuerpo α-PK, lo que resulta en un grado final de sustitución de 16 residuos de biotina por AB y una final concentración de proteína de 10 mg ml -1. </li><li> El uso de múltiples replicar noche culturas, apuntan a las bacterias lavadas con los anticuerpos antes mencionados siguiendo el protocolo adecuado. <ol><li> En concreto, se lava la K. pneumoniae en 1x PBS, y se vuelve a suspender en 1 x PBS a una DO de 4 (ca. 4 x 10 8 UFC ml -1 OD-1). </li><li> Para cada repetición, se incuban 100 l de PBS, α -Anticuerpos Kp (10 l α-Kp-biotB o 10 l de PBS para el control) y 100 células l durante 90 min a 30 ° C. Lavar las células tres veces en PBS 1x, y resuspender en 196 l de PBS. </li></ol></li><li> Etiquetar las células con el conjugado estreptavidina QD705 y dividirlos en dos volúmenes equivalentes. </li><li> Lave una solución y tres veces y luego volver a suspender en el volumen apropiado. </li><li> Distribuir 100 l de las soluciones lavadas y sin lavar en pocillos individuales de una placa de 96 pocillos de color negro. Mida la luminiscencia resultante bajo la luz total, desde 490 hasta 510 nm y 710-730 nm filtros. Concentración de fluoróforo se puede determinar usando 450-480 nm de excitación y 710-730 nm de emisión. </li></ol>

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Los autores declaran que compiten intereses financieros. JD, SB, KLR y SLS contribuyeron a EP10290158.4 Europea de Patentes y la Organización Mundial de la Propiedad Intelectual la solicitud de patente WO/2011/117847.

La manifestación fundamental de FUEL puede lograrse simplemente mediante la mezcla de bacterias luminiscentes con nanopartículas o puntos cuánticos fluorescentes. Las dos entidades serán separados físicamente y permanecen más allá de cualquier distancia RET eficiente. Más difícil es la optimización de la señal COMBUSTIBLE tanto in vitro como in vivo. En condiciones in vitro, con y sin un absorbedor óptico presente, por lo general la adición de un exceso fluoróforo será suficiente para maximizar la respuesta de combustible. Sin embargo, a altas concentraciones fenómenos tales como la atenuación estática o de colisión puede conducir a una pérdida de señal fluorescente. Realización de una serie de diluciones variando de forma independiente de la concentración de la fuente luminiscente y el fluoróforo ayudará a optimizar las concentraciones deseadas. El establecimiento y la optimización de combustible bajo las concentraciones in vivo es mucho más difícil y debe ser abordado en una base de caso por caso. Puede ser difícil para crear un condition donde la entidad fluorescente se puede acceder ópticamente por la fuente luminiscente. Como tal, comenzando con los compañeros de las inyecciones directas de los dos restos puede proporcionar información sobre el éxito de combustible bajo condiciones óptimas. Existen protocolos estándar para las bacterias de etiquetado y células eucariotas con las entidades fluorescentes tales como la serie Alexa y puntos cuánticos. A menudo esto requiere funcionalización de la superficie o de la activación con anticuerpos, que puede conducir a efectos no deseados, como reducción de la viabilidad celular o la actividad metabólica alterada. Para superar esto, es importante para determinar la cantidad óptima de anticuerpo o agente de activación necesario que minimiza las perturbaciones celulares y aumentar al máximo el etiquetado fluorescente. El uso de puntos cuánticos es ventajoso debido a su amplia característicamente espectros de excitación, espectro de emisión estrecho y sintonizable, y la posibilidad de un gran desplazamiento de Stokes. Sin embargo, los puntos cuánticos pueden ser citotóxicos y pueden no ser deseable en algunos casos. <pclase = &quot;jove_content&quot;&gt; combustible es un fenómeno que está presente en muchos experimentos BRET 13 y es aplicable a una variedad de fuentes luminiscentes y fluorescentes. Hasta ahora, los fotones procedentes del combustible se consideraron el producto de interacciones no específicas o una señal de fondo desafortunado resultado de experimentos BRET mal diseñados. Es sólo con el tipo de experimentos se ha demostrado aquí que hemos sido capaces de identificar la utilidad de esta señal no deseada. En los ejemplos mostrados, las bacterias luminiscentes actúan como una fuente de excitación difusa capaz de provocar una respuesta fluorescente estándar a partir de una amplia variedad de entidades fluorescentes. Además, debido a la distancia de trabajo sustancial, es seguro concluir que mientras que el combustible se puede construir sin la aparición de BRET, en BRET en general no puede ser observado sin una contribución de FUEL. Es importante destacar que, debido a la falta de un requisito de la orientación, el combustible puede ser utilizado para cubrir la brecha espacial que existe entre BRET y Clas técnicas de imagen en los animales intactos onventional.

La modificación genética de organismos, tales como virus 1, 2, 3, bacterias o pequeños mamíferos 4 a cualquiera de inducir o bioluminiscencia expresan constitutivamente, ha sido muy exitoso y ampliamente demostrado 5-7. La bioluminiscencia, una reacción quimioluminiscente en vivo que implica los reactivos de origen natural, tiene la ventaja de la producción de luz sin la necesidad de una fuente de luz externa. Como tal, bioluminiscente de imágenes no sufre de los inconvenientes comunes de la señal de auto-y no específicos encontrados a partir de imágenes de fluorescencia 8. En consecuencia, la bioluminiscencia tiene una relación significativa de señal a ruido, ya que cualquier señal detectada se origina únicamente a partir de la fuente deseada. Mientras que muchos modelos han explotado el operón lux de Photorhabdus luminescens (máximo de emisión centrado entre 480 y 490 nm) para in vitro y en aplicaciones in vivo 9, su uso en pequeña mammALS ha sido problemática debido a la propia naturaleza de las condiciones de formación de imágenes; la existencia omnipresente de absorbentes ópticos, tales como la hemoglobina, y agentes de dispersión, tales como el tejido y el hueso, afectan en gran medida a longitudes de onda azul amarillas 3. La expresión de una luciferasa de luciérnaga ingeniería (máximo de emisión a 617 nm) se ha desarrollado e incorporado recientemente, proporcionando una herramienta que supera en gran medida la absorción óptica 10, pero todavía está sujeta a los efectos de dispersión. En respuesta, se han producido varios intentos de desplazamiento al rojo de la señal emitida en la ventana óptica deseada de 650 a 900 nm, una región de absorción minimizado y dispersión, utilizando la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET) 11-13. Como una herramienta para mejorar la detección de señal, BRET, que utiliza una fuente bioluminiscente como el donante y un fluoróforo añadido como aceptor, se ha encontrado un éxito limitado. Como ejemplo seminal de este fenómeno, &quot;puntos cuánticos con iluminación propia4; (SIQDs) 14 consisten de modificación de Renilla reniformis luciferasas unidos a la capa de polímero de lisina externa puntos cuánticos de disponible en el mercado (puntos cuánticos). Después de la adición de sustrato, la reacción bioluminiscente resultante induce la emisión de fluorescencia de los puntos cuánticos, la generación de una producción significativa de fotones rojos. Sin embargo, estos SIQDs han aplicabilidad limitada para la visualización en vivo de eventos fisiológicamente relevantes. Esta aplicabilidad limitada es probablemente debido a la dificultad de unir la sonda dual para el órgano, célula o gen de interés, ya que los SIQDs no pueden ser codificados genéticamente y por lo tanto, requerirían una modificación secundaria de la cubierta de polímero. Para mejorar su aplicabilidad, SIQDs alternativas, cuando las luciferasas están vinculados directamente al núcleo luminiscente, recientemente se han empleado 15. La construcción de fuera del concepto SIQD, un sistema de BRET más aplicable se consiguió uniendo Cypridina luciferasa a una endocyanine tinte 16, que era capaz de dirigirse específicamente tumores en ratones, mientras que la producción de un cambio sustancial de color rojo de 460 nm a 675 nm. Para someterse a la transferencia de energía no radiante, BRET sigue las mismas restricciones primarias como su contraparte fluorescente: tiene que haber un fuerte solapamiento espectral entre la emisión de los donantes y los espectros de excitación del aceptor y la distancia de trabajo entre las dos mitades deben estar en el orden del radio de Förster (5-14 nm en función de la pareja donante-aceptante, con una distancia máxima efectiva de dos veces el radio Förster 17). Esta dependencia de la distancia limita en gran medida los tipos de eventos que se pueden observar utilizando BRET como un medio para mejorar la detección. Recientemente se identificó un nuevo enfoque y demostrarse en tanto in vitro como en condiciones in vivo. Construido a partir de la fundación de BRET, Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) 18, 19 </sup&gt; también requiere un fuerte solapamiento espectral entre la luminiscencia y componentes fluorescentes. Sin embargo, a diferencia de BRET, el combustible es un proceso completamente radiativo mediante el cual el fotón emitido desde la fuente luminiscente es absorbida por un fluoróforo ópticamente accesible, que posteriormente emite un fotón desplazada al rojo de acuerdo con el rendimiento cuántico fluoróforo. Similar a BRET, este enfoque también se puede utilizar para superar las limitaciones de formación de imágenes en presencia de absorbentes ópticos. El desplazamiento hacia el rojo resultante proporciona un aumento global y la especificidad en la señal detectada debido a una disminución en la atenuación y una reducción de los efectos de dispersión óptica. De combustible se ha informado de que se produzca entre Escherichia coli bioluminiscentes que expresan el operón lux y puntos cuánticos 18, 19. Si bien experimentalmente similar a los SIQDs, existe una diferencia fundamental: en el combustible, no es necesario para la fuente luminiscente de estar físicamente unido al fluoróforo, que permite FOr codificación genética de la sonda luminiscente. Debido a la detección exitosa de combustible entre bacterias luminiscentes y puntos cuánticos, es posible que esta técnica se podría aplicar a ambos superficial (piel) y el tejido profundo (pulmón, hígado) infecciones tales como Staphylococcus aureus y Klebsiellia pneumoniae. Desde el informe de su significado experimental, combustible ha evolucionado para incluir un modelo matemático robusto 20 que se puede utilizar para predecir luminiscente aceptable y pares fluorescentes, y sus aplicaciones se han expandido para incluir su uso en la identificación de características fotofísicas tales como rendimiento cuántico. A continuación se describen algunas de las técnicas básicas de FUEL. En primer lugar, se muestra evidencia de este fenómeno sobre tanto a corto (m) y largo (cm) distancias de trabajo, que distingue fundamentalmente COMBUSTIBLE de BRET. En segundo lugar, expansión a partir de los posibles pares de combustible en el examen de una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Third, aplicaciones de combustible se investigan mediante la comparación de pares COMBUSTIBLE dirigidos y no dirigidos.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
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		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescencia por consolidar excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) es un proceso de excitación-emisión de radiación que produce aumento de la señal y la mejora del contraste in vitro e in vivo. Porcentajes de combustible de muchos de los mismos principios subyacentes como la transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia (BRET), sin embargo, difiere en gran medida en las distancias de trabajo aceptables entre la fuente luminiscente y la entidad fluorescente. Mientras BRET se limita efectivamente a un máximo de 2 veces el radio de Förster, habitualmente menos de 14 nm, el combustible puede ocurrir a distancias de hasta micras o incluso cm en ausencia de un absorbente óptico. Aquí ampliamos sobre el fundamento y la aplicabilidad de FUEL mediante la revisión de los principios pertinentes que justifican el fenómeno y demostrar su compatibilidad con una amplia variedad de fluoróforos y nanopartículas fluorescentes. Además, la utilidad de COMBUSTIBLE de anticuerpos dirigidos se explora. Los ejemplos mostrados aquí demuestran que el combustible puede ser utilizado para la aplicaciones donde BRET no es posible, llenando el vacío espacial que existe entre BRET y de imagen animal completamente tradicional.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos.

Un paso más allá de BRET: Fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K vistas.  Institut Pasteur.  La ampliación de la base y la aplicabilidad de la fluorescencia por consolidar la excitación de luminiscencia (COMBUSTIBLE) mediante encuestas a los principios pertinentes y demostrar su compatibilidad con una gran variedad de fluoróforos y condiciones de anticuerpos dirigidos. 

Video: A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Termodinámica del plegado de proteínas de membrana medido por espectroscopia de fluorescencia

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Investigación

Bioingeniería

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imágenes de fluorescencia vida de rotores moleculares en las células vivas

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Generación y Recuperación de β-células esferoides de PEG-péptido de crecimiento Paso hidrogeles

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

De alta resolución espacio-temporal Análisis de la Dinámica del receptor por Casa molécula de microscopía de fluorescencia

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Rastreo Orbital 3D en un microscopio de dos fotones Modificado: una aplicación para el Seguimiento de vesículas intracelulares

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescencia Fast Imaging a la Ley de Difusión Molecular en membranas de células vivas en un microscopio Comercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingeniería 'Oro' de la fluorescencia por presión selectiva incorporación de aminoácidos no canónica y análisis de proteínas por espectrometría de masas y la fluorescencia

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Fabricación escalable de elástico, doble canal, Chips microfluídicos órgano

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Realización de múltiples modos de la proyección de imagen con un microscopio de fluorescencia

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.