Yazarlar JD, AH ((SLS), AB-FP7 programı &quot;Otomasyon&quot;, Institut Carnot Programı 11 (JD, CS, CS) New York Pasteur Vakfı&#39;nın maddi destek için şükranlarını sunarım , AR, RT, SLS) ve RT, SLS Projesi IMNOS (), Conny-Maeve Vakfı (SLS), Moleküler Görüntüleme European Masters (BT), Bölge Ile de France programları MODEXA (SLS), SUSAM (SLS) ve DimMalInf (SLS, RT), Biologie-Santé en ANR Program Grandes Investissement de L&#39;Avenir Altyapılar Nationales: Fransa LifebioImaging (FLI) Fransa Yaşam Görüntüleme (RT, SLS), Fransa Biyogörüntüleme (JD, SLS) ve Institut Pasteur, Paris. Ayrıca, yazarlar reaktifler için, José Bengoechea ve Herbert Schweizer teşekkür etmek istiyorum. Ayrıca, yazarlar antikorları oluşturulan Cindy FEVRE teşekkür etmek istiyorum.

1.. Reaktifler <ol><li> Satın alma ya da lux ABCDE 21 ifade değiştirilmiş Escherichia coli gibi ışıldayan bakteri ve uygun kültür ortamı geliştirmek, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22.. </li><li> Standart tariflere göre, fizyolojik tuzlu su (% 0.9 NaCl) ve kültür ortamı çözelti hazırlayın. E. coli ve K. pneumoniae 37 ° C arasında ve V&#39;de Luria Bertani (LB) içinde büyütülmüştür fischeri ve LB içinde Photobacterium sp 22 ° C &#39;de 0.5 M NaCI ile takviye edilmiş </li><li> Satın alma veya Q-izci 705 floresan probları kazanmak, (40 nm çapında, QD705 olarak anılacaktır) Q-800 izci (40 nm çapında, QD800 olarak anılacaktır), floresan (40 nm çapında) ve floresan olmayan bir polistiren mikro-küreler ( 48 nm çapında) ve geleneksel floresan boyalar. </li><li> Bakteriyel etiketleme için gerekli reaktifleri hazırlayın. </li><li> Erişimlerini sağlamakBöyle bir IVIS Spektrumu olarak bir bütün hayvan biyoışıldama görüntüleme, bu emisyon dalga boyları ve pozlama süresi geniş bir yelpazede altında sinyalini saptayabilir. Biyoışıldama ölçümleri edebilen bir levha okuyucu, burada açıklanan deneylerin çoğu için yeterli olacaktır. </li></ol> YAKIT 2. Temel Rekapütülasyon <ol><li> Standart kültür plakaları üzerinde tek koloniler başlayarak, luminesan bakteri kültürleri, gece boyunca başlar. Burada, V. fischeri kullanılmıştır. </li><li> Deney günü taze altkültürler başlatmak ve OD 1-1,5 600 sağlanana kadar onları ilerleme sağlar. Karşılaştırılabilir sonuçlar üretmek için onlar yoğun sinyalleri üretmek olduğu benzer büyüme eyalette bakteri kullanmak en iyisidir. Bu OD 600 sabit tutarak emin olabilirsiniz. </li><li> QD705 ya da fizyolojik tuzlu su (PS) 5 ul ya da her bir 100 ul alikotları birleştirin ve daha sonra Standa içine PS 895 ul eklerd spektroskopik küvetler. IVIS Spectrum içine doldurulan küvetler yerleştirin ve uygun filtre setleri altında ölçümler almak. Burada, 710-730 nm emisyon filtresi kullanılmıştır. </li></ol> 3.. YAKIT fazla Değişen Mesafeler <ol><li> Iki düşük hacmi (1 mi) doldurun QD705 50 ul ya da 1 ml PS bir toplam hacim içinde floresan olmayan 48 nm polistiren mikro 97,2 ul ya da plastik fotometrik küvetleri. Bu iki taraf arasındaki toplam hacmi başına benzer katı bir yüzey alanı sağlamaktadır. </li><li> Standart siyah bant veya ışığı bloke edebilen diğer bazı opak malzeme ile üçüncü bir küvet kaplayarak bir ışık kaynağı küvet hazırlayın. Dikkatlice küvet ters tarafta iki özdeş optik pencere hazırlar. </li><li> Doğrudan ışık kaynağı küvet her iki yanı üzerine önceden doldurulmuş küvetler yerleştirin. V&#39;luk bir 1 ml&#39;lik bir şişe ekleme fischeri veya diğer kültür (yani ışıldayan E. coli veya Photobacterium sışık kaynağı küvete taze altkültürlerden p) ve herhangi bir ışık kirliliği azaltmak için böyle siyah kağıt gibi opak bir malzeme ile örtün. </li><li> Sırasıyla maruz kalma süreleri 10, 30, ve 30 saniye ile birlikte, bu tür toplam ışık ve 710-730 nm emisyon filtreleri gibi uygun emisyon filtreleri altında üç küvetler görselleştirmek. </li><li> Merkez küvetten gelen eşdeğer ileri mesafelerde hem dış küvetler yeniden konumlandırmak ve yeniden görselleştirmek. 3cm son yüz-yüze (azaltılmış hacmi küvete merkezi) mesafe elde edilinceye kadar tekrarlayın. Her adımda, QD705 yerini doğrulamak için bir floresan görüntü (450-480 nm uyarma, 710-730 nm emisyon) kazanır. </li></ol> 4. Potansiyel YAKIT Çiftleri Araştırılması <ol><li> Diğer negatif kontrol olarak floresan olmayan nanopartiküller ile bir flüorofor ya da ilgi konusu bir floresan nanoparçacık birinde ve PS veya PS birini içeren 1 ml çözümler ile iki azaltılmış hacimli küvetler doldurun. The çalışma Tablo 1 &#39;de gösterildiği gibi potansiyel ticari olarak temin edilebilen YAKIT florofor ve floresan nanopartiküllerin çeşitli incelenmiştir, burada gösterdi. </li><li> Taze V&#39;luk bir 1 ml&#39;lik bir şişe ekleme fischeri veya ters tarafta bulunan iki fiziksel olarak eşit optik pencerelerini içeren bir karartılmış üçüncü küvete diğer ışıldayan bakteri. Bu siyah bir kağıt parçası gibi bir opak madde ile küvet örtün. </li><li> Kısa ama eşit mesafe yerde iki hacminde karartılmış küvetin iki tarafında küvetler ve uygun filtrelerin altında görselleştirmek. Burada, 0.7 cm&#39;lik bir mesafe kullanılmıştır. Diğer fluoroforlar tekrarlayın. </li></ol> 5.. Hedeflenen YAKIT <ol><li> , Işık yayan bakterilerin özgü biyotinlenmiş antikorlar hazırlayın. K. Örneğin, burada birincil antikorlar spesifik pneumoniae (α-Kp) EZ-link Sülfo-NHS-LC-Biotin ihtiva eden bir çözelti kullanılarak biyotinile edilmiştir. </li&gt; <li> 2 dakika boyunca santrifüje (1,500 x g) altında tuz giderme sütunları kullanılarak antikorlardan fazla reaktif çıkarın. </li><li> Protein konsantrasyonunu belirlemek ve HABA tahlili ile antikor biyotinilasyon derecesini belirlemek için standart Bradford tahlili kullanarak. </li><li> 16 biotin Ab başına artıkları ve nihai bir ikame son derece ile sonuçlanan, 40 ul α-Kp antikor ile 100 ul (1 x PBS içinde çözülmüş 10 mM,) karıştırılarak α-Kp-biot biyotinile antikor (Ab) toplu halde elde edilir 10 mg ml -1 protein konsantrasyonu. </li><li> Birden kullanılarak gece boyunca kültürler çoğaltmak uygun protokol aşağıdaki belirtilen antikorlar ile yıkandı bakterileri. <ol><li> Özel olarak, yıkama K. 1x PBS pneumoniae ve 4 OD&#39;ye 1x PBS içinde tekrar süspansiyon (yaklaşık 4 x 10 ml 8 CFU -1 OD -1). </li><li> Her çoğaltmak için, 100 ul PBS inkübe, α -Kp antikorları (kontrol için 10 ul α-Kp-biotB ya da 10 | il PBS) ile 30 ° C&#39;de 90 dakika boyunca 100 ul hücre 196 ul PBS 1x PBS içinde hücreleri üç kez yıkayın ve tekrar süspansiyon. </li></ol></li><li> QD705 streptavidin bağı ile hücreleri etiketlemek ve iki eşdeğer ciltlik bölün. </li><li> Bir çözüm üç kez yıkayın ve sonra uygun hacim içine tekrar süspansiyon. </li><li> , Siyah 96 oyuklu plakanın her bir gözeneğine içine yıkanmış ve yıkanmamış çözümler 100 ul dağıtın. Çıkan toplam Işığında ışıldama, 490-510 nm ve 710-730 nm filtreler ölçün. Florofor konsantrasyon 450-480 nm eksitasyon ve 710-730 nm emisyon kullanılarak belirlenebilir. </li></ol>

<ol>
	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

Yazarlar mali çıkarlarının rekabet beyan. JD, SB, KLR ve SLS Avrupa Patent EP10290158.4 katkıda ve Dünya Fikri Mülkiyet Örgütü Patent Başvurusu WO/2011/117847.

Yakıtın temel gösterilmesi sadece flüoresan nanopartiküller ya da QDS ile lüminesan bakteri karıştırılarak elde edilebilir. İki kişiler fiziksel olarak ayrılmış ve herhangi bir etkili RET mesafe ötesinde kalır edilecektir. Daha zor in vitro ve in vivo hem de YAKIT sinyal iyileştirmedir. In vitro koşullar altında, ve bir optik absorber mevcut olmadan, hem de genellikle aşırı fluorofor eklenmesinin YAKIT tepkisini maksimuma çıkarmak için yeterli olacaktır. Ancak, bu tür statik veya çarpışma su verme gibi yüksek konsantrasyonlarda olgulara floresan sinyalinin bir kaybına yol açabilir. Bağımsız bir şekilde, ışık yayan kaynağı ve fluorofor konsantrasyonu değiştirilerek bir seyreltme serisi yapılması istenen konsantrasyonları optimize etmek için yardımcı olacaktır. Vivo konsantrasyonlarda altında kurulması ve yakıt optimizasyonu çok daha zordur ve bir vaka-by-case bazında ele alınması gerekiyor. Bir co oluşturmak zor olabilirndition floresan varlık ışıldayan kaynağı tarafından optik ulaşılabilir nerede. Bu nedenle, her iki kısımların doğrudan eş enjeksiyonu ile başlayan ve optimal koşullar altında YAKIT başarısı ile ilgili bilgiler sağlayabilir. Standart protokoller örneğin Alexa serisi ve QDS gibi floresan elemanlar ile etiketleme bakteri ve ökaryotik hücreler için vardır. Genellikle bu azalması hücre canlılığı veya değiştirilmiş metabolik aktivite gibi istenmeyen etkilere yol açabilir antikorlarla yüzey işlevselleştirilmesini veya aktivasyon gerektirir. Bunun üstesinden gelmek için, bu antikor veya aktivasyon maddesinin optimal miktarı flüoresan etiketleme maksimize ederken, hücresel bozulmaları en aza indirir gerekli belirlemek için önemlidir. QDS kullanılması nedeniyle tipik olarak geniş uyarma spektrumları, dar ve ayarlanabilir emisyon spektrumları ve büyük bir Stokes kayması olasılığı avantajlıdır. Bununla birlikte, QDS sitotoksik olabilir ve bazı durumlarda arzu edilir olmayabilir. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; YAKIT birçok Bret deneylerde 13 bulunur ve Işıklı ve floresan çeşitli kaynaklardan için geçerli bir olgudur. Şimdiye kadar, yakıt edilen fotonlar, spesifik olmayan etkileşimleri ya da kötü tasarlanmış deneylerden elde edilen BRET talihsiz bir arka plan sinyalinin ürün olarak kabul edildi. Biz bu istenmeyen sinyalin programını belirlemek mümkün Burada gösterilen deney türü ile sadece. Gösterilen örneklerde, ışık yayan bakteriler floresan birimlerinin çeşitli standart bir floresan tepkisi ortaya çıkarma yeteneğine sahip bir yaygın uyarım kaynağı olarak hareket ederler. Üstelik, önemli bir çalışma mesafesine, bu YAKIT BRET oluşumu olmadan inşa edilebilir olsa da, genel olarak BRET yakıt katkısı olmadan gözlemlenemeyen sonucuna güvenlidir. Önemli bir şekilde, bir hedef ihtiyacının olmaması nedeniyle, yakıt BRET ve c arasında bulunan uzaysal açığı için kullanılabilironventional bütün hayvan görüntüleme teknikleri.

Bu tür virüsler, 1, 2, 3 bakteri ya da küçük memeliler gibi organizmaların genetik modifikasyon 4 neden olan veya yapısal olarak ifade biyoluminesans ya da, son derece başarılı olmuştur ve yaygın olarak 5-7 göstermiştir. Bio-ışıldama, doğal olarak meydana gelen reaktif içeren bir in vivo kemilüminesan reaksiyon, harici bir ışık kaynağı için gerek kalmadan ışık üretme avantajına sahiptir. Bu nedenle, biyolojik olarak ışık veren görüntüleme flüoresan görüntüleme 8 mesafede oto-ve spesifik olmayan sinyalin ortak sakıncaları muzdarip değildir. Tespit edilen bir sinyal amaçlanan kaynağından kaynaklanan sadece tarihi Sonuç olarak, biyoışıldama önemli bir sinyal-gürültü oranına sahiptir. Birçok model in vitro ve in vivo uygulamaları için 9&#39;da Photorhabdus luminescens, lux operon&#39;u (480 ve 490 nm arasında ortalanmış emisyon maksimum) yararlanan da, küçük bir memeli konakçının olarak kullanımıals nedeniyle görüntüleme koşulların doğası sorunlu olmuştur; optik hemoglobin gibi emiciler, ve bu doku ve kemik gibi saçılma ajanların pervading varlığı, güçlü sarı dalga boylarındaki 3 mavi etkiler. Işlenmiş bir ateşböceği lusiferaz (617nm emisyon en az) ait ekspresyon son zamanlarda büyük ölçüde optik absorpsiyon 10 üstesinden gelir, ama yine de etkiler saçılma tabi olan bir araç sağlayan, geliştirilmiş ve dahil edilmiştir. Buna karşılık, kırmızı-shift biyoparlaklık rezonans enerji transferi (Bret) 11-13 kullanılarak, 650-900 nm, minimize emilim ve dağılım bir bölgenin istenilen optik penceresinin içine yayılan sinyal birden girişimleri olmuştur. Sinyal algılama geliştirmek için bir araç olarak, alıcı olarak donör ve ilave floroforun olarak biyolüminesens kaynağını kullanan Bret, sınırlı başarı buldu. Bu olayın bir seminal örneği, &quot;kendini aydınlatıcı kuantum noktalar olarak4; (SIQDs) 14 oluşur Renilla dış polimer-lizin tabakaya bağlanmış lusiferazlar reniformis modifiye piyasada mevcut kuantum noktaları (QDS). Ayrıca alt-tabaka üzerine, sonuçtaki biyolüminesans reaksiyon kırmızı bir foton önemli üretim üreten, QDS gelen floresan emisyon neden olur. Bununla birlikte, bu SIQDs fizyolojik olarak ilgili olayların vivo görselleştirme için uygulanabilirliği sınırlıdır. Bu sınırlı uygulanabilirlik nedeniyle SIQDs genetik olarak kodlanmış edilemez ve bu nedenle polimer kabuğun ikinci bir değişiklik gerektirir, çünkü, organ, hücre veya ilgi duyulan gen için çift sonda bağlama zorluğu muhtemeldir. Bunların uygulanabilirliğini geliştirmek için, lusiferazların parlak iç ye direkt olarak bağlı olan alternatif SIQDs, yakın zamanda 15, kullanılmıştır. SIQD kavramının kapalı bina, bir daha uygulanabilir Bret sistem bir in&#39;e Cypridina lüsiferoz ekleyerek elde edildi675 nm ile 460 nm arasında önemli bir kırmızı bir değişim üretirken özellikle farelerde tümörler hedefleme yeteneğine sahip olduğunu boya 16, docyanine. -Olmayan ışıma enerji transferi geçmesi, Bret onun floresan muadili olarak aynı birincil kısıtlamaları aşağıdaki gibidir: donör emisyon ve alıcı uyarım spektrumları ve iki yarımlar arasında çalışma mesafesi arasında güçlü bir spektral örtüşme olmalıdır sırasına olmalıdır Förster yarıçapı (5-14 nm iki Förster yarıçapı 17 etkili bir maksimum mesafe ile, verici-alıcı çifti bağlı olarak). Bu mesafe bağımlılık büyük ölçüde artırmak için bir algılama aracı olarak Bret kullanılarak gözlemlenebilir olay türlerini kısıtlar. Son zamanlarda yeni bir yaklaşım, in vitro ve in vivo koşullarında hem de tanımlanmış ve altında gösterilmiştir. Bret, Lüminesans (yakıt) 18, 19, bağlanmamış Uyarma tarafından Floresans temel kapalı Binası </sup&gt; Ayrıca, ışık veren ve floresan bileşenler arasında kuvvetli bir örtüşme spektral gerektirir. Bununla birlikte, farklı BRET, yakıt parlak kaynağından yayılan foton sonradan flüorofor kuantum verimi göre kırmızı kaydırılmış foton yayan bir optik olarak erişilebilir bir florofor, tarafından emilir ve böylece tamamen ışınımsal bir süreçtir. BRET benzeyen, bu yaklaşım aynı zamanda optik emicilerin mevcudiyetinde görüntüleme kısıtların üstesinden gelmek için kullanılabilir. Elde edilen kırmızı kayma zayıflama nedeniyle bir azalma ve optik saçılma etkilerin azalmasına bulgulanan sinyal içinde genel bir artış ve özgüllük sağlar. YAKIT lux operon ve QDS 18, 19 ifade eden biyolüminesans Escherichia coli arasında meydana bildirilmiştir. SIQDs deneysel benzer olsa da, temel bir fark var: Işıklı kaynak fo sağlar florofora, fiziksel sınır olduğu için YAKIT, bu gerekli değildirparlak prob genetik kodlama r. Nedeniyle, ışık yayan bakterilerin ve QDS arasında yakıtın başarılı tespiti için, bu teknik, yüzeysel (deri) ve derin doku (akciğer, karaciğer), örneğin Staphylococcus aureus ve Klebsiellia pneumoniae gibi enfeksiyonlar hem de uygulanabilir mümkündür. Deneysel önemi rapordan bu yana, YAKIT kabul Işıklı ve floresan çiftleri tahmin etmek için kullanılır olabilir sağlam bir matematiksel model 20 içerecek şekilde gelişti ve uygulamaları gibi kuantum verimi gibi fotofiziksel özelliklerinin belirlenmesinde kullanımını kapsayacak şekilde genişlettik. Biz YAKIT temel bazı teknikler aşağıda açıklanmaktadır. Öncelikle, kısa (um) ve uzun (cm) hem de üzerinde temelden Bret YAKIT ayıran çalışma mesafeleri, bu olay için kanıt gösterebilir. İkincisi, biz floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede inceleyerek olası YAKIT çiftleri üzerine genişletmek. Third, YAKIT uygulamaları hedefli ve hedefli olmayan YAKIT çiftleri karşılaştırılarak incelenmiştir.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Lüminesans (yakıt) ikinci, bağlanmamış Uyarma floresans in vitro ve in vivo olarak artan bir sinyal ve kontrast üreten bir ışıma uyarma emisyonu bir süreçtir. Biyoparlaklık Rezonans Enerji Transferi (Bret), henüz aynı temel ilkeleri birçok YAKIT hisseleri büyük ölçüde Işıklı kaynağı ve floresan varlık arasında kabul edilebilir çalışma mesafeleri farklıdır. BRET etkili bir şekilde 2 kez Förster yarıçapı, genel olarak en az 14 nm&#39;lik bir maksimum sınırlı olsa da, yakıt bir optik emme yokluğunda um kadar mesafelerde cm ya da oluşabilir. Burada fenomen arkasındaki ilgili ilkeleri gözden YAKIT temeli ve uygulanabilirliği üzerine genişletmek ve floroforlar ve floresan nanopartiküller geniş bir yelpazede ile uyumluluğunu göstermek. Ayrıca, antikor hedefli YAKIT yarar keşfedilmeden. Burada gösterilen örnek YAKIT Appl için kullanılabilir olduğunu kanıtlarBRET BRET ve geleneksel bütün hayvan görüntüleme arasında bulunan uzaysal boşluğu doldurmak mümkün değildir ications.

Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi.

BRET Ötesinde Bir Adım: Sınırsız Uyarma tarafından Flüoresan Lüminesans dan (YAKIT)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K Görüntüleme.  Institut Pasteur.  Ilgili ilkeleri ölçme ve floroforlar ve antikor hedefli koşulları çok sayıda uyumluluğunu göstererek Lüminesans (YAKIT) dan Sınırsız Uyarma tarafından Floresans temel ve uygulanabilirliğini genişletilmesi. 

Video: A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Membran Protein katlanması, Termodinamik Floresans Spektroskopisi ile ölçülür.

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Biyomühendislik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Yaşayan Hücreler Moleküler Rotorlar arasında Flüoresans Ömrü Görüntüleme

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Adım büyüme PEG-peptid Hidrojeller kaynaktan β-hücre sferoidlerin Üretimi ve Kurtarma

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Tek molekül Floresan Mikroskopi Reseptör Dinamiği Yüksek çözünürlüklü Spatiotemporal Analizi

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Modifiye İki foton mikroskop 3D Orbital Takip: Hücre içi veziküllerin İzlemeye Bir Uygulama

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Ticari Mikroskop Canlı Hücre Zarları Moleküler Difüzyon Kanunu Hızlı Floresans Görüntüleme Gönderen

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Mühendislik kanonik olmayan Amino asitler ve seçici basınç eklenmesi tarafından 'Altın' floresan ve kütle spektrometresi ve floresan göre Protein analizi

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Ölçeklenebilir gerilebilir, Çift kanal, mikrosıvısal Organ cips imalatı

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Çoklu görüntüleme modları bir floresan mikroskop ile iletken

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.