Die Autoren möchten ihre Dankbarkeit für die finanzielle Unterstützung aus dem Pasteur-Stiftung in New York, um JD, AH erstrecken (JD, CS, CS), der EU-FP7-Programm &quot;Automation&quot; (SLS), dem Institut Carnot Programm 11 ( , AR, RT, SLS) und Projekt IMNOS (RT, SLS), der Conny-Maeve Charitable Foundation (SLS), die European Masters in Molecular Imaging (IT), der Region Ile-de-France-Programme MODEXA (SLS), SESAME (SLS) und DimMalInf (SLS, RT), der ANR-Programm Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastrukturen Nationales de Biologie-Santé: Frankreich LifebioImaging (FLI) Frankreich Life Imaging (RT, SLS), Frankreich Bioimaging (JD, SLS) und der Institut Pasteur in Paris. Außerdem möchten die Autoren zu danken für Reagenzien, José Bengoechea und Herbert Schweizer. Weiterhin würde die Autoren gerne Cindy Fevre, die die Antikörper erzeugt danken.

1. Reagenzien <ol><li> Kauf oder Leuchtbakterien entwickeln und geeignete Kulturmedien wie modifizierte Escherichia coli die Lux ABCDE 21 exprimieren, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Bereiten physiologischer Kochsalzlösung (0,9% NaCl) und Kultur-Media-Lösungen nach Standardrezepturen. E. coli und K. pneumoniae wurden in Luria-Bertani (LB) bei 37 º C gezüchtet und V. und Photobacterium fischeri sp in LB, ergänzt mit 0,5 M NaCl bei 22 ° C. </li><li> Kauf erwerben oder Fluoreszenzsonden wie Q-Tracker 705 (40 nm Durchmesser, die als QD705), Q-Tracker 800 (40 nm Durchmesser, die als QD800), Fluoreszenz (40 nm Durchmesser) und nicht fluoreszierenden Polystyrol-Mikrokügelchen ( 48 nm Durchmesser) und herkömmliche Fluoreszenzfarbstoffe. </li><li> Bereiten Sie die notwendigen Reagenzien für die bakterielle Kennzeichnung. </li><li> Stellen Sie Zugriff aufeine ganze Tier Biolumineszenz-Bildgeber, wie beispielsweise ein IVIS Spectrum, ist, dass in der Lage-Erfassungssignal unter einer Vielzahl von Emissionswellenlängen und Belichtungszeiten. Ein Plattenlesegerät für Biolumineszenz-Messungen wird für die meisten der hier beschriebenen Experimente ausreichen. </li></ol> 2. Zusammenfassung der Grund FUEL <ol><li> Ausgehend von einzelnen Kolonien auf Standard-Kulturplatten, Start-Nacht-Kulturen von Leuchtbakterien. Hier V. fischeri verwendet. </li><li> Der Tag des Experimentierens, initiieren neue Subkulturen und es ihnen ermöglichen, den Fortschritt, bis eine OD 600 von 1 bis 1,5 erreicht. Um vergleichbare Ergebnisse zu erzielen ist es am besten, um Bakterien in ähnlichen Wachstums Staaten, in denen sie intensive Signale erzeugen zu verwenden. Dies kann, indem die OD 600 konstant gewährleistet werden. </li><li> Kombinieren von 100 &amp;mgr; l Aliquots von jeweils entweder 5 ul QD705 oder physiologischer Kochsalzlösung (PS), und dann in 895 ul PS hinzufügen in standard spektroskopische Küvetten. Legen Sie die gefüllte Küvetten in das IVIS Spectrum und die Messungen unter den entsprechenden Filtersätze. Hierbei wurde die 710 bis 730 nm-Emissionsfilter verwendet. </li></ol> 3. FUEL über unterschiedliche Entfernungen <ol><li> Füllen zwei reduzierten Volumen (1 ml) aus Kunststoff photometrischer Küvetten mit entweder 50 ul QD705 oder 97,2 ul nicht-fluoreszierenden 48 nm Polystyrolmikrosphären in einem Gesamtvolumen von 1 ml PS. Dies gewährleistet ähnliche feste Oberfläche pro Volumen zwischen den beiden Einheiten. </li><li> Bereiten Sie eine Lichtquelle Küvette durch einschließen eine dritte Küvette mit Standard-Schwarz-Band oder einem anderen undurchsichtigen Material in der Lage ist, Licht zu blockieren. Zwei identische optische Fenster sorgfältig vorzubereiten auf gegenüberliegenden Seiten der Küvette. </li><li> Legen Sie die zuvor gefüllten Küvetten direkt auf jeder Seite der Lichtquelle Küvette. In einer 1 ml-Aliquot V. fischeri oder andere Kultur (dh Leucht E. coli oder Photobacterium sp) aus einer neuen Subkultur in die Lichtquelle einsetzen und decken Sie es mit einem undurchsichtigen Material, wie schwarzes Papier, jede leichte Verschmutzungen zu reduzieren. </li><li> Visualisieren Sie die drei Küvetten unter den entsprechenden Emissionsfilter wie der Gesamt Licht und 710-730 nm Emissionsfilter, mit Belichtungszeiten von 10, 30 und 30 Sekunden auf. </li><li> Neupositionierung sowohl externe Küvetten bei äquivalenten weiteren Abständen von der zentralen Küvette, und dann wieder zu visualisieren. Wiederholen, bis eine endgültige face-to-face (Zentral reduziert Volumen Küvette) Abstand von 3 cm erreicht. Bei jedem Schritt wird ein Fluoreszenzbild erhalten (450-480 nm Anregung, 710 bis 730 nm Emission), um die Lage QD705 validieren. </li></ol> 4. Untersuchung Mögliche FUEL Pairs <ol><li> Füllen zwei reduzierten Volumen Küvetten mit 1 ml Lösung, die entweder ein Fluorophor oder eine fluoreszierende Nanopartikel von Interesse in einem, oder PS und PS mit nicht-fluoreszierende Nanopartikel als negative Kontrolle in die andere. In the Arbeit zeigte hier eine Vielzahl von potentiellen Handel erhältlich FUEL Fluorophore und Fluoreszenz-Nanopartikel wurden untersucht, wie in Tabelle 1 dargestellt. </li><li> In einer 1 ml-Aliquot frisch V. fischeri oder andere Leuchtbakterien zu einem verdunkelten dritten Küvette mit zwei physikalisch gleiche optische Fenster auf gegenüberliegenden Seiten entfernt. Decken Sie die Küvette mit einem undurchsichtigen Substanz, wie ein Stück schwarzes Papier. </li><li> Bei einem kurzen, aber gleichen Abstand Platz die beiden reduzierten Volumen Küvetten auf beiden Seiten des abgedunkelten Küvette und visualisieren unter den entsprechenden Filter. Hier ist ein Abstand von 0,7 cm wurde verwendet. Wiederholen Sie mit den anderen Fluorophore. </li></ol> 5. Gezielte FUEL <ol><li> Bereiten Sie speziell auf die Leuchtbakterien biotinylierten Antikörpern. Zum Beispiel ist hier primären Antikörper spezifisch an K. pneumoniae (α-Kp) wurden mit einer Lösung, die EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin biotinyliert. </li&gt; <li> Überschüssiges Reagenz von den Antikörpern mit Entsalzungssäulen unter Zentrifugation (1500 × g) für 2 min. </li><li> Verwenden Sie ein Standard-Bradford-Test, um die Proteinkonzentration zu bestimmen und bestimmen den Grad der Antikörper Biotinylierung von HABA-Assay. </li><li> Erhalten, die α-KP-Biot biotinylierten Antikörpers (Ab) Chargen durch Mischen von 100 &amp;mgr; l (10 mM, in 1x PBS) mit 40 ul α-Kp Antikörper, was zu einer endgültigen Substitutionsgrad von 16 Biotinresten pro Ak und einem abschließenden Proteinkonzentration von 10 mg ml -1. </li><li> Die Verwendung mehrerer Kulturen über Nacht zu replizieren, zielen die gewaschenen Bakterien, die mit den oben genannten Antikörpern nach dem entsprechenden Protokoll. <ol><li> Insbesondere, waschen Sie die K. pneumoniae in 1x PBS und Resuspendieren in 1 × PBS auf eine OD von 4 (ca. 4 × 10 8 CFU ml -1 OD -1). </li><li> Für jede Wiederholung, Inkubation 100 ul PBS, α -Kp Antikörper (10 ul α-KP-biotB oder 10 ul PBS für die Kontrolle) und 100 &amp;mgr; l Zellen für 90 min bei 30 ° C. In 1x PBS in 196 ul PBS Waschen Sie die Zellen dreimal, und resuspendieren. </li></ol></li><li> Beschriften Sie die Zellen mit dem QD705 Streptavidin-Konjugat und teilen sie in zwei gleichwertige Bände. </li><li> Drei mal waschen und dann eine Lösung resuspendieren sie in die entsprechende Lautstärke. </li><li> Verteilen von 100 &amp;mgr; l der gewaschenen und ungewaschenen Lösungen in einzelne Vertiefungen einer schwarzen 96-Well-Platte. Messen Sie die resultierende Lumineszenz unter der Gesamt Licht, 490-510 nm und 710-730 nm-Filter. Fluorophorkonzentration kann mit 450 bis 480 nm Anregungs-und 710 bis 730 nm Emission bestimmt werden. </li></ol>

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Die Autoren erklären, konkurrierenden Interessen. JD, SB, KLR und SLS beigetragen Europäischen Patent EP10290158.4 und der Weltorganisation für geistiges Eigentum Patentanmeldung WO/2011/117847.

Die fundamentale Demonstration der FUEL kann einfach durch Mischen mit Leuchtbakterien fluoreszierende Nanopartikel oder Quantenpunkte erreicht werden. Die beiden Elemente werden physisch getrennt und bleiben über jeden effizienten RET Distanz. Schwieriger ist die Kraftstoffsignal Optimierung sowohl in vitro als auch in vivo. Unter in vitro Bedingungen, mit und ohne einem vorhandenen optischen Absorber, üblicherweise die Zugabe eines Überschusses Fluorophor ausreicht, um das Brennstoffverhalten zu maximieren. Bei hohen Konzentrationen Phänomene wie statische oder Stoßlöschung kann zu einem Verlust der Fluoreszenzsignal führen. Durchführen einer Verdünnungsreihe durch unabhängiges Variieren der Konzentration der Leuchtquelle und dem Fluorophor wird helfen, die gewünschten Konzentrationen zu optimieren. Der Aufbau und die Optimierung von FUEL unter in vivo-Konzentrationen ist viel schwieriger und muss auf einer Fall-zu-Fall-Basis behandelt werden. Es kann schwierig sein, ein Co erstellenndition wo die fluoreszierenden Einheit kann optisch durch die Leuchtquelle genutzt werden. Als solche kann beginnend mit Injektionen direkte Zusammenarbeit der beiden Gruppierungen geben Auskunft über den Erfolg der FUEL unter optimalen Bedingungen. Standard-Protokolle existieren zum Etikettieren Bakterien und eukaryontische Zellen mit fluoreszierenden Einheiten wie die Alexa Serie und QD. Oft erfordert dies Funktionalisierung von Oberflächen oder Aktivierung mit Antikörpern, die zu unerwünschten Wirkungen wie die Lebensfähigkeit der Zellen reduziert oder verändert Stoffwechselaktivität führen kann. Um dies zu überwinden, ist es wichtig zu bestimmen, die optimale Menge des Antikörpers oder Aktivierungsmittel benötigt, die zellulären Störungen minimiert und maximiert die Fluoreszenzmarkierung. Die Verwendung von Quantenpunkten ist wegen ihrer charakteristischen breiten Anregungsspektren, schmal und abstimmbare Emissionsspektren und der Möglichkeit, eine große Stokes-Verschiebung von Vorteil. Allerdings können QDs zytotoxischen und nicht wünschenswert sein kann in einigen Fällen. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; FUEL ist ein Phänomen, das in vielen Experimenten BRET 13 vorhanden ist, und ist für eine Vielzahl von Lumineszenz-und Fluoreszenzquellen. Bis jetzt wurden die Photonen von FUEL resultierenden als das Produkt von nicht-spezifischen Wechselwirkungen oder einem unglücklichen Hintergrundsignal von schlecht gestalteten BRET Experimente ergeben. Es ist nur mit der Art von Experimenten zeigte, dass hier konnten wir die Nützlichkeit dieses unerwünschte Signal zu identifizieren. In den gezeigten Beispielen verhalten sich die Leuchtbakterien als diffuses Anregungsquelle, die zur Auslösung einer Standardfluoreszenzantwort von einer Vielzahl von Fluoreszenzeinheiten. Außerdem ist es aufgrund der erheblichen Arbeitsabstand, ist es sicher zu dem Schluss, dass, während Kraftstoff kann ohne das Auftreten von BRET konstruiert werden, im allgemeinen BRET kann nicht ohne eine Beteiligung FUEL beobachtet werden. Wichtig ist, dass aufgrund des Fehlens eines Zielanforderung kann Brennstoff verwendet, um die räumliche Lücke zwischen BRET und c besteht abzudeckenonventional ganze Tier-Bildgebungsverfahren.

Die gentechnische Veränderung von Organismen wie Viren 1, 2, 3 Bakterien oder kleine Säugetiere 4 bis entweder induzieren oder konstitutiv Biolumineszenz, ist sehr erfolgreich und weithin demonstriert 5-7. Biolumineszenz in vivo eine chemilumineszierende Reaktion, die natürlich vorkommende Reagenzien, hat den Vorteil der Erzeugung von Licht, ohne die Notwendigkeit für eine externe Lichtquelle. Als solches ist die Biolumineszenz-Bildgebung nicht von den gemeinsamen Nachteile der automatischen und nicht-spezifische Signal von Fluoreszenz-Bildgebungs 8 gefunden leiden. Folglich hat die Biolumineszenz ein signifikantes Signal-zu-Rausch-Verhältnis, da jeder erfaßte Signal vom beabsichtigten Quelle stammt ausschließlich. Während viele Modelle haben die lux-Operon aus Photorhabdus luminescens (Emissionsmaximum zwischen 480 und 490 nm zentriert) für in-vitro-und in vivo-Anwendungen 9 genutzt, deren Verwendung in kleinen mammALS ist aufgrund der Natur der Abbildungsbedingungen problematisch; der durchdringenden Existenz von optischen Absorber, wie Hämoglobin und Streumittel, wie Gewebe und Knochen, stark beeinflussen blau nach gelb 3 Wellenlängen. Der Ausdruck eines konstruierten Leuchtkäfer-Luciferase (Emissionsmaximum bei 617 nm) wurde vor kurzem entwickelt und verarbeitet, die für ein Werkzeug, das stark überwindet optische Absorption 10, ist aber noch unter dem Vorbehalt Streueffekte. In Reaktion gab es mehrere Versuche, Rotverschiebung des emittierten Signals in das gewünschte optische Fenster 650-900 nm, einem Bereich minimiert Absorption und Streuung, mit Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET) 11-13. Als Mittel zur Signalerfassung zu verbessern, BRET, die ein Biolumineszenz-Quelle als dem Donor-Fluorophor und einem zusätzlichen als Akzeptor verwendet wurden begrenzte Erfolge verzeichnet. Ein Samen Beispiel für dieses Phänomen, &quot;selbstleuchtende Quantenpunkte4; (SIQDs) 14 bestehen aus modifizierten Renilla reniformis Luciferase mit dem externen Polymer-Lysin-Schicht gebunden von kommerziell verfügbaren Quantenpunkte (QP). Nach Substratzugabe, die resultierende Biolumineszenzreaktion induziert Fluoreszenzemission aus den Quantenpunkten, wodurch eine signifikante Produktion von roten Photonen. Allerdings sind diese SIQDs haben Anwendbarkeit in vivo Darstellung von physiologisch relevanten Ereignisse beschränkt. Diese begrenzte Anwendbarkeit ist wahrscheinlich auf die Schwierigkeiten bei der Verknüpfung der dualen Sonde mit der Organ-, Zell-oder Gen von Interesse, da die SIQDs nicht genetisch codiert werden, und daher wäre eine sekundäre Modifikation der Polymerhülle erforderlich. Um ihre Anwendbarkeit zu verbessern, alternative SIQDs, wo die Luciferasen sind direkt mit dem lumineszierenden Kern gebunden ist, wurden kürzlich 15 eingesetzt. Aufbauend auf der SIQD Konzept wurde ein mehr für BRET-System durch das Anbringen Cypridina Luciferase auf einen dadurch erreichtdocyanine Farbstoff 16, der in der Lage gezielt Tumore in Mäusen während eine beträchtliche Rotverschiebung von 460 nm bis 675 nm war. Nicht-strahlenden Energietransfer durchlaufen ist, folgt BRET die gleichen Einschränkungen wie die primäre Leuchtstoffgegen: es muss eine starke spektrale Überlappung zwischen der Donor-Emission und Akzeptor-Anregungsspektren und der Arbeitsabstand zwischen den beiden Einheiten sein müssen, in der Größenordnung von BE Förster-Radius (5-14 nm in Abhängigkeit von der Donor-Akzeptor-Paar, mit einer wirksamen maximalen Abstand von zweimal der Förster-Radius 17). Diese Abstandsabhängigkeit stark begrenzt die Ereignistypen, die mit BRET als Mittel zur Erkennung zu verbessern beobachtet werden können. Kürzlich wurde ein neuer Ansatz identifiziert und sowohl in vitro als auch in vivo Bedingungen, unter Beweis gestellt. Aufbauend auf den Grundstein für BRET, Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) 18, 19 </sup&gt; erfordert auch eine starke spektrale Überlappung zwischen der Lumineszenz-und Fluoreszenzkomponenten. Jedoch anders als BRET wird Kraftstoff völlig Strahlungsprozess, wobei die emittierten Photonen von der Leuchtquelle durch eine optisch zugänglichen Fluorophor, das anschließend emittiert ein Photon rotverschoben gemäß der Quantenausbeute Fluorophor absorbiert. Akin zu BRET kann dieser Ansatz auch verwendet, um die Zwänge der Bildgebung in der Gegenwart von optischen Absorber überwunden werden. Die resultierende rote Verschiebung gibt einen Gesamtanstieg und Spezifität in dem erfassten Signal aufgrund einer Abnahme der Dämpfung und eine Verringerung der optischen Streueffekte. Treibstoff wurde berichtet, dass zwischen Biolumineszenz Escherichia coli das lux-Operon und QD 18, 19 exprimieren auftreten. Während experimentell ähnlich den SIQDs besteht ein wesentlicher Unterschied: bei Kraftstoff, ist es nicht notwendig, daß die lumineszierenden Quelle zu sein physikalisch gebunden an das Fluorophor, das ermöglicht for genetischen Kodierung des Leuchtsonde. Aufgrund der erfolgreichen Erkennung von FUEL zwischen Leuchtbakterien und Quantenpunkte ist es möglich, dass diese Technik sowohl oberflächlich (Haut) und tiefe Gewebe (Lunge, Leber) Infektionen wie Staphylococcus aureus und Klebsiellia pneumoniae angewendet werden. Seit dem Bericht seiner experimentellen Bedeutung hat FUEL entwickelt, um eine robuste mathematische Modell 20, die verwendet werden können, um eine akzeptable Lumineszenz-und Fluoreszenzpaare vorherzusagen sind, und ihre Anwendungen haben erweitert, um den Einsatz bei der Identifizierung von photophysikalischen Eigenschaften wie Quantenausbeute aufweisen. Wir beschreiben im Folgenden einige der grundlegenden Techniken der FUEL. Zuerst zeigen wir Beweise für dieses Phänomen über kurz (um) und lang (cm) Arbeitsabstände, die sich grundlegend unterscheidet von FUEL BRET. Zweitens haben wir auf die mögliche Kraftstoffpaare zu erweitern durch die Untersuchung einer Vielzahl von Fluorophoren und fluoreszierende Nanopartikel. Third werden die Kraftstoffanwendungen durch den Vergleich gezielte und nicht gezielte FUEL Paare untersucht.

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			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) ist ein Strahlungs Anregungs-Emissions-Prozess, erhöhte Signal-und Kontrastverbesserung in vitro und in vivo produziert. FUEL teilt viele der gleichen Grundprinzipien wie Biolumineszenz-Resonanz-Energie-Transfer (BRET), jedoch unterscheidet sich stark in den zulässigen Arbeitsabstand zwischen der Leuchtquelle und dem fluoreszierenden Einheit. Während BRET effektiv auf ein Maximum von 2 mal dem Förster-Radius, üblicherweise weniger als 14 nm beschränkt ist, kann Kraftstoff bei Entfernungen von bis zu &amp;mgr; m oder sogar cm in Abwesenheit eines optischen Absorbers erfolgen. Hier werden wir auf das Fundament und die Anwendbarkeit der FUEL erweitern durch die Prüfung des relevanten Prinzipien, die hinter dem Phänomen und zeigen die Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und fluoreszierende Nanopartikel. Ferner ist die Nützlichkeit der Antikörper-bezogene FUEL sucht. Die hier gezeigten Beispiele belegen, dass FUEL für appl genutzt werdenikationen wo BRET nicht möglich ist, füllt die räumliche Lücke, die zwischen BRET und traditionelle ganze Tierbildgebung existiert.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Erweiterung der Grundlagen und Anwendbarkeit der Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) durch Vermessung der einschlägigen Grundsätze und demonstriert seine Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und Antikörper-bezogene Bedingungen.

A Step Beyond BRET: Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K Aufrufe.  Institut Pasteur.  Erweiterung der Grundlagen und Anwendbarkeit der Fluoreszenz von Unbound Anregung von Lumineszenz (FUEL) durch Vermessung der einschlägigen Grundsätze und demonstriert seine Kompatibilität mit einer Vielzahl von Fluorophore und Antikörper-bezogene Bedingungen. 

Serie: A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Thermodynamik der Membrane Protein Folding durch Fluoreszenz-Spektroskopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Forschung

Biotechnik

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Fluorescence Lifetime Imaging für molekulare Rotoren in lebenden Zellen

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Erzeugung und Verwertung von β-Zellen Spheroids Von Step-Wachstum PEG-Peptid-Hydrogele

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Hochauflösende Räumlich-zeitliche Analyse der Rezeptordynamik von Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D-Tracking-Orbital in einer modifizierten Zwei-Photonen-Mikroskop: einen Antrag bei der Verfolgung von intrazellulären Vesikeln

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Von Fast Fluoreszenz-Imaging, um molekulare Diffusion Gesetz über Live Cell Membrane in einem kommerziellen Mikroskop

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Engineering-"Golden" Fluoreszenz durch Selektionsdruck Einbeziehung der nicht-kanonischen Aminosäuren und Protein-Analyse durch Massenspektrometrie und Fluoreszenz

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Skalierbare Fertigung von dehnbar, Dual Channel, mikrofluidischen Orgel Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Durchführung von mehreren Imaging-Modi mit einem Fluoreszenzmikroskop

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.