저자는 JD, AH로 ((SLS에), EU-F​​P7 프로그램 &quot;자동화&quot;, 문화원 카르노 프로그램 11 (JD, CS, CS에) 뉴욕의 파스퇴르 재단의 재정 지원에 대한 감사의 뜻을 연장하고 싶습니다 , AR, RT, SLS) 및 RT, SLS에 프로젝트 IMNOS (), 코니 - 하루 뒤에 자선 재단 (SLS), 분자 이미징의 유럽 석사 (IT로), 지역 일드 프랑스 (France) 프로그램 MODEXA (SLS), 참깨 (SLS) 및 DimMalInf (SLS, RT), Biologie - 상테 엔 ANR 프로그램 그랑 Investissement 드 난 Avenir에서 인프라 Nationales : 프랑스 LifebioImaging (FLI) 프랑스 생활 이미징 (RT, SLS), 프랑스 (France) 바이오 이미징 (JD, SLS) 및 파스퇴르 연구소, 파리. 또한, 저자는 시약을 위해, 호세 Bengoechea과 허버트 슈바이처에게 감사의 말씀을 전합니다. 또한, 저자는 항체를 생성 신디 Fevre에게 감사의 말씀을 전합니다.

1. 시약 <ol><li> 구매 또는 럭스 ABCDE 21 표현 수정 대장균 등의 발광 박테리아와 적절한 배양 배지를 개발, 장염의 fischeri, Photobacterium의 SP에. 폐렴 간균 22. </li><li> 표준 조리법에 따라 생리 식염수 (0.9 % NaCl을) 문화 미디어 솔루션을 준비합니다. E.보기 대장균 및 K. 폐렴은 37 ° C 및 V에서 루리아 베르 타니 (LB)에서 성장했다 의 fischeri와 LB의 Photobacterium 특검팀은 22 ℃에서 0.5 M NaCl로 보충 </li><li> 구입 또는 Q-추적자 (705) 등의 형광 프로브를 취득 (40 nm의 직경, QD705라고 함) Q-추적자 (800) (40 nm의 직경 QD800이라 함), 형광 (40 nm의 직경) 및 비 형광 폴리스티렌 마이크로 스피어 ( 48 nm의 직경), 및 종래의 형광 염료. </li><li> 세균의 라벨에 필요한 시약을 준비합니다. </li><li> 에 대한 액세스를 확인그러한 IVIS 스펙트럼으로서 전체 동물의 생물 발광 이미 저는, 그 발광 파장 및 노출 시간의 넓은 범위에서 신호를 검출 할 수있다. 생물 발광 측정 할 수있는 플레이트 리더는 여기에 설명 된 실험의 대부분을 위해 충분합니다. </li></ol> 연료의 2. 기본 발생 반복 <ol><li> 표준 배양 접시에 각각의 식민지에서 시작, 발광 박테리아의 하룻밤 문화를 시작합니다. 여기에, V. 의 fischeri를 사용 하였다. </li><li> 실험의 날, 새로운 하위 문화를 시작하고 OD 1.5 600 얻을 때까지 그들을 진행 할 수 있습니다. 비교 가능한 결과를 생성하기 위해 그들이 강한 신호를 생성하는 유사한 성장 상태에서 박테리아를 사용하는 것이 가장 좋다. 이 OD 600 일정하게 유지하여 안심하실 수 있습니다. </li><li> QD705 또는 생리 식염수 (PS)의 5 μL 하나에 각각의 100 μL의 분취 량을 결합하고 standa에 PS 895 μL에 추가RD 분광 큐벳. IVIS 스펙트럼에 못 큐벳을 놓고 적절한 필터 세트에서 측정을 수행. 여기서, 710-730 nm의 방출 필터를 사용 하였다. </li></ol> 3. 연료 이상의 다양한 거리 <ol><li> 두 감소 된 (1 ㎖)를 입력 QD705 50 μL 또는 1 ㎖의 PS의 총 부피의 비 형광 48 nm의 폴리스티렌 마이크로의 97.2 μL 하나 플라스틱 광도계 큐벳. 이는 두 개의 엔티티 사이의 전체 부피당 유사한 고체 표면적을 보장한다. </li><li> 표준 검정 테이프 또는 광을 차단할 수있는 다른 불투명 한 재료로 세 번째 큐벳을 넣는하여 광원 베트를 준비합니다. 조심스럽게 베트의 반대편에 두 개의 동일한 광학 창을 준비하고 있습니다. </li><li> 직접 광원 베트의 양쪽에 이전에 작성 큐벳을 놓습니다. V.의 1 mL를 추가 의 fischeri 또는 다른 문화 (즉, 발광 대장균 또는 Photobacterium의광원 베트로 새로운 하위 문화에서 P) 및 빛 오염을 줄이기 위해 같은 검은 종이와 같은 불투명 한 재료로 커버. </li><li> 각각 노출 10 배, 30, 및 30 초와 같은 전체 빛과 710-730 nm의 방출 필터와 같은 적합한 방출 필터 아래에 세 개의 큐벳 시각화. </li><li> 중앙 베트에서 동등한 더 거리에 모두 외부 큐벳 위치를 변경 한 후 다시 시각화. 3cm의 마지막 대면 (감소 된 베트 중심) 거리가 달성 될 때까지 반복합니다. 각 단계에서, QD705 위치를 확인하기 위해 형광 이미지 (450-480 nm의 여기, 710-730 nm의 방출을) 취득. </li></ol> 4. 잠재적 연료 쌍을 조사 <ol><li> 기타의 음의 컨트롤과 비 형광 나노 입자와 형광 또는 관심의 형광 나노 입자 하나, 그리고 PS 또는 PS 하나를 포함하는 1 ㎖ 솔루션으로 두 가지 감소 된 큐벳을 입력합니다. 일에전자 작업은 표 1에 설명 된대로 잠재적 인 상업적으로 이용 가능한 연료의 형광 및 형광 나노 입자의 다양한을 조사하고, 여기에 보여 주었다. </li><li> 신선한 V.의 1 mL를 추가 의 fischeri 또는 반대편에 위치한 두 물리적으로 동일한 광학 창을 포함하는 검게 아웃 세 번째 큐벳에 다른 발광 박테리아. 이러한 검은 종이로 불투명 한 물질로 큐벳을 커버. </li><li> 짧지 만 같은 거리의 장소에서 두 감소 된 검게 아웃 베트의 양쪽에 큐벳과 적절한 필터에서 시각화. 여기에서, 0.7 cm의 거리를 사용 하였다. 다른 형광으로 반복합니다. </li></ol> 5. 대상으로 연료 <ol><li> 발광 박테리아에 특정 비오틴 항체를 준비합니다. K.에 대한 예를 들어, 여기에 기본 항체 특정 폐렴 (α - KP)를 EZ-링크 술포-NHS-LC 비오틴을 함유하는 용액을 사용하여 비오틴 화시켰다. </lI&gt; <li> 2 분 동안 원심 분리 (1,500 XG)에서 탈염 열을 사용하여 항체에서 과잉 시약을 제거합니다. </li><li> 단백질 농도를 결정하고 HABA 분석하여 바이오 티 닐화 된 항체의 수준을 결정하기 위하여 표준 브래드 포드 분석법을 사용한다. </li><li> 16 비오틴 AB 당 잔류 최종 치환의 최종 학위의 결과로, 40 ㎕의 α - KP 항체 100 μL (1X PBS에 용해 된 10 mM을) 혼합하여 α-KP-비오 바이오틴 항체 (AB) 배치를 얻 10 ㎎의 ML-1의 단백질 농도. </li><li> 복수를 사용하여 하룻밤, 문화를 복제 적절한 프로토콜 다음 상기 항체 세척 박테리아를 표적으로한다. <ol><li> 특히, K. 씻어 1X PBS에서 폐렴, 4의 OD에 1X PBS에 재현 탁 (약 4 × 10 8 CFU ML -1 OD-1). </li><li> 각 복제의 경우, 100 ㎕의 PBS를 품어 α -KP 항체 (컨트롤의 10 ㎕의 α-KP-biotB 10 ㎕의 PBS) 및 30 ℃에서 90 분 동안 100 ㎕의 세포 196 ㎕의 PBS에 1X PBS에 세포를 세 번 씻어에 resuspend. </li></ol></li><li> QD705 스트렙 타비 딘 복합체로 세포를 라벨과 동일한 두 볼륨으로들을 나눕니다. </li><li> 하나의 솔루션으로 세 번 세척 한 다음 적절한 볼륨으로 그것을 재현 탁. </li><li> 블랙 96 - 웰 플레이트의 각각의 우물에 세척하고, 씻지 않은 솔루션을 100 μl를 배포합니다. 그 결과 총 라이트에서 발광, 490-510 nm의 및 710-730 nm의 필터를 측정한다. 형광 물질의 농도는 450-480 nm의 여기 및 710-730 nm의 발광을 이용하여 결정될 수있다. </li></ol>

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저자는 금융 이익을 경쟁 선언합니다. JD, SB, KLR와 SLS는 유럽 특허 EP10290158.4에 기여하고 세계 지적 재산권기구 특허 출원 WO/2011/117847.

FUEL의 근본적인 데모 단순히 형광 나노 입자 또는 양자점으로 발광 박테리아를 혼합함으로써 달성 될 수있다. 두 기관은 물리적으로 분리하고 효율적인 RET 거리 이상으로 유지 될 것입니다. 더 어려운 관내 및 생체 내에서 모두 FUEL 신호 최적화이다. 시험관 조건에서로하고, 광 흡수가없는 상태 모두, 보통 과량 형광 물질의 첨가는 FUEL 응답을 최대화하기에 충분한 것이다. 그러나, 정적 또는 충돌하는 작은 담금질 높은 농도의 현상에서 형광 신호의 손실로 이어질 수 있습니다. 독립적으로 발광 소스 및 형광 물질의 농도를 변화시킴으로써, 일련의 희석을 수행하는 것은 원하는 농도를 최적화하는 것을 도울 것이다. 생체 내 농도 하에서 확립하고 FUEL의 최적화는 더 어렵고 사례별로 해결 될 필요가있다. 그것은 공동을 생성하기가 어려울 수있다ndition 형광 실체 발광 소스에 의해 광학적으로 액세스 할 수있는. 이와 같이, 2 개의 잔기에 직접 공동 주사로 시작하는 것은 최적의 조건 하에서 FUEL의 성공에 관한 정보를 제공 할 수있다. 표준 프로토콜은 알렉사 시리즈와 양자점과 같은 형광 실체와 라벨 박테리아와 진핵 세포에 존재한다. 종종이 감소 세포 생존 또는 변경 신진 대사 활동과 같은 원치 않는 효과로 이어질 수 항체 표면 기능화 또는 활성화가 필요합니다. 이것을 극복하기 위해, 항체 또는 활성화 제의 최적 량은 형광 라벨을 최대화하면서, 즉 셀룰러 교란을 최소화하는 데 필요한 결정하는 것이 중요하다. 양자점의 사용 때문에 그들의 특질 넓은 여기 스펙트럼 좁고 가변 방출 스펙트럼, 및 큰 스톡스 시프트의 가능성을 유익하다. 그러나 양자점은 세포 독성이 될 수 있으며, 어떤 경우에는 바람직하지 않을 수있다. <p클래스 = &quot;jove_content&quot;&gt; 연료는 많은 BRET 실험 13에 존재하고 발광 및 형광 다양한 소스에 적용 할 수있는 현상이다. 지금까지 연료에서 발생하는 광자는 비특이적 상호 작용 또는 잘못 설계된 BRET 실험으로 인한 불행한 배경 신호의 제품으로 간주되었다. 그것은 우리가 원하지 않는 신호의 유틸리티를 식별 할 수 있었다 여기에서 입증 실험의 종류 만입니다. 도시 된 예에서는 발광 박테리아가 형광 실체의 다양한 표준 형광 반응을 도출 할 수있는 확산 여기 원으로서 작용한다. 또한, 인해 실질적인 작동 거리, 그것은 연료 BRET의 발생없이 구성 될 수 있지만, 일반적으로 BRET 연료에서 기여하지 않고 관찰 할 수 없다는 결론을하는 것이 안전합니다. 중요한 인해 표적 요건의 부족, FUEL는 BRET 및 C 사이에 존재하는 간극 공간을 커버하는 데 사용할 수onventional 전체 - 동물 이미징 기술.

바이러스 1, 2, 박테리아 3, 작은 포유 동물 등의 생물의 유전 적 변형은 4 유도 또는 구조적으로 표현 생물 발광 하나에 매우 성공적 널리 5-7 보여 주었다. 생물 발광, 자연적으로 발생하는 시약을 포함하는 생체 내 화학 발광 반응은 외부 광원에 대한 필요없이 광을 생성하는 장점을 갖는다. 이와 같이, 생물 발광 이미징 형광 이미징 8 찾았 자동 비특이적 신호의 일반적인 단점 고통받지 않는다. 감지 된 신호가 의도 된 소스로부터 유래 전적으로 이후 결과적 생물 발광은 상당한 신호 대 잡음비를 갖는다. 많은 모델은 생체 외 및 생체 내 응용 프로그램 9에 Photorhabdus의 luminescens에서 럭스 오페론 (480 및 490 nm의 사이에서 중심 최대 발광)을 이용하고 있지만, 작은 mamm에서의 사용루게릭 병으로 인해 이미징 조건의 본질에 문제가있다; 광학 헤모글로빈 등의 흡수, 이러한 조직과 뼈 등의 산란 제의 파고 드는 존재가 강하게 노란색 파장 3 파랑에 영향을줍니다. 설계 반딧불 루시 페라 제 (최대 발광 617nm에서)의 발현은 최근 크게 광 흡수 (10)을 극복하지만, 여전히 영향을 산란 될 수있는 도구를 제공하고, 개발 및 통합되었습니다. 응답에서, 빨간 이동 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛) 11 ~ 13을 사용하여, 650-900 nm의 최소화 흡수 및 분산의 영역의 원하는 광학 창에 방출 된 신호를 여러 시도가 있었다. 신호 검출을 향상시키는 도구로서뿐만 셉터와 도너 형광 추가로 생물 발광 소스를 사용 BRET은 제한된 성공을 발견했다. 이 현상의 정액 예를 들어, &quot;자기 조명 양자 도트로4; (SIQDs) (14)로 구성되어 닐라 외부 폴리머 라이신 층에 바인딩 luciferases를 레니 포르 미스 수정 의 상용 양자 도트 (양자점). 기질을 첨가 할 때, 얻어진 발광 생물 반응 레드 광자의 상당한 생산을 생성 양자점에서 형광 방출을 유도한다. 그러나 이러한 SIQDs는 생리 학적으로 관련 이벤트의 생체 내 시각화에 적용을 제한했다. 이 제한된 적용 가능성으로 인해 SIQDs이 유전자에 의해 코딩 될 수없고, 따라서 폴리머 외피의 이차 변형을 요구하기 때문에, 기관, 세포 또는 그 유전자에 이중 프로브를 연결하는 어려움 쉽다. 적용 가능성을 개선하기 위해, luciferases가 발광 코어에 직접 결합되어 대안 SIQDs는 최근 15 사용되어왔다. SIQD 개념의 오프 구축, 더 적용 BRET 시스템에에 Cypridina 루시 페라 제를 부착하여 달성되었다675 nm의 460 nm의에서 상당한 빨간 변화를 생산하면서 구체적으로 마우스에서 종양을 표적으로 할 수 있었다 염료 16, docyanine. 비 복사 에너지 전달을 받아야하는, 브렛은 형광 대응과 같은 기본 제약 조건을 다음과 기증자 방출 및 수용체의 여기 스펙트럼 두 부분 사이의 작동 거리 사이에 강한 스펙트럼 중첩이 있어야의 순서에 있어야합니다 포스터 반경 (5-14 nm의 두 번 포스터 반경 (17)의 효과가 최대 거리로, 기증자 수용체 쌍에 따라 다름). 이 거리는 의존성이 크게 검출을 향상시키기위한 수단으로 BRET을 사용하여 관찰 할 수있는 이벤트의 종류를 제한한다. 최근 새로운 접근은 시험 관내 및 생체 내 조건에서 모두 확인되고 아래에서 증명되었다. 브렛, 발광 (연료)에서 18, 19 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기반을 구축 </suP&gt; 또한 발광 및 형광 구성 요소 사이에 강한 스펙트럼 중첩이 필요합니다. 그러나, BRET 달리 FUEL는 발광 원으로부터 방출 된 광자는이어서 형광 양자 수율에 따라 적색 편이 된 광자를 방출 광학적 접근 형광 물질에 의해 흡수된다 완전히 복사 과정이다. BRET에 가깝다,이 접근법은 또한 광 흡수제의 존재 촬상의 제약을 극복하기 위해 사용될 수있다. 생성 된 적색 이동으로 인해 감쇠의 감소 및 광 산란 효과의 감소로 검출 된 신호의 전반적인 증가와 특이도를 제공한다. FUEL은 럭스 오페론과 양자점 (18, 19)을 발현하는 생물 발광 대장균 사이에서 발생하는 것으로보고되었다. SIQDs에 실험적으로 유사하지만, 근본적인 차이가 존재합니다 : 발광 소스가 fo를 수있는 형광, 물리적으로 결합 될 수 있도록 연료, 그것은 필요가 없습니다형광 프로브의 유전자 인코딩을 r에. 인해 발광 박테리아와 양자점 사이 FUEL의 성공적인 검출에,이 기술은 표면 (피부)와 깊은 조직 (폐, 간) 등 포도상 구균 폐렴 Klebsiellia 같은 감염 모두에 적용 할 수있는 가능성이있다. 실험적인 의미의보고 이래, FUEL 수락 발광 및 형광 쌍을 예측하는데 사용될 수있는 강력한 수학적 모델 (20)을 포함하도록 진화하고 있으며, 그 응용은 양자 수율이 같은 광 물리 특성의 식별에 사용을 포함하도록 확장 하였다. 우리는 연료의 기본 기술의 몇 가지 아래에 설명합니다. 첫째, 우리는 짧은 (μm의) 긴 (cm) 모두에 근본적으로 BRET에서 연료를 구별하는 작업 거리를,이 현상에 대한 증거를 보여줍니다. 둘째, 우리는 형광 물질과 형광 나노 입자의 다양한 검사하여 가능한 연료 쌍을 확장. THIRD는, 연료 응용 프로그램은 대상 및 비 대상 연료 쌍을 비교하여 조사 하였다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의해 형광이 시험 관내 및 생체 내에서 증가 된 신호와 대비 향상을 생산하는 복사 여기 방출하는 과정입니다. 생물 발광 공명 에너지 전달 (브렛), 아직 같은 기본 원칙의 많은 연료의 주가는 크게 발광 소스와 형광 실체 사이의 허용 작업 거리에서 다르다. BRET 효과적으로 2 배 포스터 반경 일반적 미만 14 ㎚의 최대로 제한되지만, FUEL은 광 흡수체의 부재 μM까지의 거리에서 또는 심지어 cm 발생할 수있다. 여기에서 우리는 현상 뒤에 관련 원칙을 검토하여 연료의 기초와 응용을 확장하고 형광체 및 형광 나노 입자의 다양한과의 호환성을 보여줍니다. 또한, 항체 대상 연료의 유틸리티를 탐구한다. 여기에 나타낸 예는 FUEL가 APPL 위해 이용 될 수 있다는 증거를 제공브레 브레 전통 전체 동물 영상 사이에 존재하는 공간 빈 공간을 채우는 수 없습니다 ications.

공명 에너지 전달 (RET)을 발광 공여체 및 종료 기증자로부터의 에너지가 강한 쌍극자 - 쌍극자 상호 작용 (13)을 통해 수용체로부터 형광 반응을 유도 할 수있다 형광 수용체 사이의 비방 상호 작용이다. 화학 발광 형광체 (23, 24), (13) 및 생물 발광 도너를 사용하여 설명되었지만 RET는, 주로 필요 도너 및 억 셉터 발광 여기 스펙트럼 간의 한 강한 스펙트럼 오버랩;. 2 개의 엔티티 사이의 적절한 회전 정렬.; 3. 0.5 ~ 2 배보다 더 큰 작동 거리 기증자와 수용체 (17)의 포스터 반경, R 0,. RET와 대조, 연료는 생물 발광 박테리아로 발광 소스, 이러한 형광 또는 형광 나노 입자로 흡수 및 제 단체에 의해 다시 방출되는 광자를 방출 할 때 발생하는 레드 시프트 배출 SPECT를원래 발광 소스의 럼. 따라서, FUEL는 집중된 자극을 사용하지 않고, 아직 표준 epifluorescent 조건 유사한 표준 여기 발광 과정을 따른다. 이 증거는 쉽게 발광 박테리아와 높은 형광 양자 도트의 단순한 혼합에 의해 관찰 될 수있다. QD705가 아닌 형광 폴리스티렌 미세 제어 (그림 1A)에 비해 솔루션도했다 때 비브리오 SP의 존재에 빨간 신호에 상당한 증가가 관찰된다. 생물 발광 본질적 알데히드 기판, 루시퍼 라제, 및 ATP를 생성하는 데 필요한 구성 요소는, 모든 제조 및 세포질 내에 포함된다. 또한, 효소 luminophore 생산 박테리아 세포질 (도 1B) 내에 발생한다. 다른 곳에서보고 된 바와 같이, 박테리아의 내측 및 외측 막 사이의 거리는 일반적으로 30보다 큰 NM 25-27 상당한 RET를 허용하지 않는 거리이다발생합니다. 더 엔도 시토 시스 또는 흡수의 다른 수단이 없기 때문에뿐만 아니라, 형광 나노 입자는 세균의 세포질로 교차하지 않습니다. 함께, 이러한 제약 조건은 연료가 발광 박테리아가 형광 나노 입자와 혼합 할 때 발생하는 지배적 여기 발광 현상을 나타냅니다. 이전에 표시 한 바와 같이, 연료는 RET의 범위를 넘어 존재합니다. 거리에 FUEL 의존성을 조사하기 위해, 표준 감소 된 분광 큐벳은 형광 물질의 용액을 함유 한, 분산을위한 제어 할 적절한 컨트롤을 포함하는 제 및 제 신선한 발광 용액의 분취 량을 함유하여 사용될 수있다. 이것은 중앙 큐벳이 발광 광원으로부터 어떤 잠재적 광 오염을 줄이기 위해, 대향면에 위치한 적어도 두 개의 동일한 광학 창 저장 흑 테이프 또는 다른 불투명 물질을 사용하여 포위하는 것이 필수적이다. 또한, 나머지 두 개의 큐벳이 필요중앙 큐벳의 양측에 등 간격으로 배치 될 수있다. 마지막으로, 신선한 발광 용액, 세균 또는 화학 발광을 이용하여, 최대 광 생산을 보장하기 위해, 각 실험에 사용한다. 적절한 배치되면, 원하는 필터 아래 발광 신호를 획득. 후자의 데이터 만이 도시되어 있지만 전체 빛과 710-730 nm의 필터는,이 경우에 사용되었다. 각 획득 후에 3cm (그림 2)에 1.0 cm에서 점진적으로 얼굴을 맞대고 거리를 증가시킨다. 마지막으로, 가장 밝은 지점까지의 모든 데이터를 정상화. 여기에 사용 된 예에서, 이것은 발광 소스 및 QD705 함유 큐벳 사이의 최단 거리 (D = 1cm)에서 발생 하였다. 이 방법을 사용 가능한 FUEL 신호는 최종 수집은 광 흡수체의 부재하에, FUEL 가능한 모든 공명 에너지 전달을 넘어 거리에서 발생할 수 있다는 것을 제안하고 만 순수 방사로 설명 될 수까지 관찰 할 수있다효과. 데이터를 피팅하는 것은 D -1 D -2 의존성에 다음 거리 D의 함수로서 신호의 감소를 보여준다. 기하학적 구성에 따라, 커패시터의 거리 의존성 및 포인트 소스에 대한 역 제곱 법칙 후자 갑 대응한다. 이 결과는 큐벳 구경의 크기와, 발광 원 및 형광체 사이의 거리 관련 그러므로 전반적인 취득 설정과 일치한다. 연료는 양자 도트에 적용뿐만 아니라, 알렉사 시리즈에서 형광 마이크로 (표 2)에 이르기까지 형광의 넓은 범위를 사용하여 관찰 할 수 있습니다뿐만 아니라. 컨트롤에 필적하기 위해서, 각종 형광체의 동등 농도 표기 및 나노 입자의 총 표면적은 (표 1) 일정하게 유지. 자신의 적절한 통제가 아닌 형광과 (PS 또는 PS에 형광 나노 입자를 비교하여폴리스티렌 마이크로 스피어), 신호의 상당한 증가는 각 형광 실체의 발광 최대로 관찰된다. 신호 규모 상대적인 증가는 형광 발광 최대 발광 최대 발광로부터 먼 어디에 발생하였습니다. 이는 발광 원의 넓은 발광 스펙트럼과 비교하여 형광 신호의 증가 된 특이성이 가장 쉽다. 두 개의 발광 최대 값이 잘 분리되지 않은 경우 반대로, 가장 신뢰할 수있는 연료 신호가 발견되었다. 흥미롭게도, 뚜렷한 연료 신호는 비드 (350 형광 등가물) 당 존재하는 형광 물질의 상당한 양으로 인해 대부분의 스펙트럼 차이가 최소한의 경우에도 노란 미소와 함께 발견되었다. 여기에 표시된 결과는 적절한 조건에서 연료 내가 모두에서 더 많은 관련 응용 프로그램에 대한 선택의 프로브 짓는 수 형광의 다양한 달성 할 수 있음을 나타냅니다N의 생체 외 및 생체 내 조건에서. 관찰 된 연료 신호의 의미는 표준 두 꼬리 학생의 T-테스트를​​ 사용하여 측정 하였다. 따라서 만 Alexa555 사용 발광 소스와 호환되지 않는 것으로 밝혀졌다. 연료 타겟팅의 효과를 탐구하기 위해, 바이오틴 항체는 발광 박테리아와 스트렙 타비 딘 결합 된 양자점을 대상으로 하였다. 이는 세균이나 발광 소스 luminophore 및 해당 형광체 사이 RET의 가능성을 최소화하기 위해 충분한 두께의 층을 제공하는 것이 중요하다. 배양과 결합되지 않은 항체를 제거하는 세척 한 후, 비오틴 표지 박테리아는 다음 컨트롤로, 분할 된 솔루션 및 제거하기 위해 추가로 세척에 노출 된 한 세트의 비 접착 스트렙 타비 딘 - 복합 QD705 또는 비 작용 QD705 중 하나에 노출되어 QD705. 여기에, 네 조건, 결과 발광는 총 빛, 490-510 nm의에서 관찰되었다D 후자 만이 필터는 데이터 분석에 사용 되더라도 710-730 nm의 필터. QD705의 존재는 450-480 nm의 여기 및 710-730 nm의 방출 필터를 사용하여 비교 하​​였다. 솔루션을 씻지 않은 상태 (그림 3)에 남아있는 때 조사를 우리는 레드 시프트 신호 없음의 차이가 거의 발견했다. 이 조건에서 얻어진 형광 신호는 QD705 동수 모두 표적 및 비 표적 상태에서 본 것을 제안, 상당히 유사한 것으로 발견된다. 그러나, 언 바운드 QD705을 제거하기 위해 샘플을 세척하는 것은 자신이 아닌 대상 컨트롤에 비해 대상으로 세균에 대한 상대 빨간 신호에 거의 두 배 증가를 제공합니다. 형광의 조사는 QD705의 유무를 확인하기 위해 사용될 수있다. 비교적, 대상 세척 조건이 거의 3 배 씻지 않은 상태보다, 아직 만 감소 생성 된 적색 편이였다 형광 강도의 결과30 % 순수 구속 조건 하에서 박테리아 타겟팅 적색 편이 방출의 증가를 초래할 것이라는 점을 시사. 이 강력 미래의 애플리케이션을위한 대상 연료의 유틸리티를 연루. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51549/51549fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51549/51549fig1.jpg" /> 도 1. 발광 박테리아 및 상업적으로 입수 한 양자점 간의 상호 작용 FUEL 레드 광자 생산 증가에 이르게한다. 두 분광 큐벳 신선한 V. 100 μL 분취 량을 함유하는 용액으로 채워졌다 IVIS 스펙트럼 및 인수 방출 스펙트럼에 배치되기 전에 1.5의 OD 600, PS 895 μL 및 QD705 또는 생리 식염수 (PS)의 5 μL 하나와의 fischeri 문화. 적색 신호에서의 상당한 증가로 인해의 존재로 이루어진다QD705, 710-730 nm의 방출 필터 (A)에서의 제어에 비해 초 -1 • cm -2 (P • 초 -1 • cm -2) • 검출 된 광자의 증가에 의해 언급 될 수있는. 여기서, 균의 이중 막은 발광 잔기 (청색 원)의 상호 작용과 QD705 (검은 동그라미)를 제외한다. 후자 자유롭게 벌크 용액 (B)에 분포하는 동안 갑은 세균의 세포질에서 발견된다. 각 세균 솔루션 = 3 N은. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51549/51549fig1highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 2" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51549/51549fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51549/51549fig2.jpg" /> 연료의 그림 2. 증거 거리의 compl에 발생etely 공명 에너지 전달을 제외하고. 분광 큐벳 QD705 50 ㎕의 생리 식염수 950 μL (PS) 또는 비 형광 48 nm의 폴리스티렌 마이크로의 97.2 μL와 PS의 902.8 μL 하나를 함유 한 용액으로 가득하고, 반대편에 등 간격으로 배치했다 OD 1.5의 600에서 신선한 발광 Photobacterium SP는 1 ㎖를 포함하는 중앙 검은 베트의. 중앙 베트는 방출 된 광자 자유롭게 분산 할 수 있도록 두 개의 동일한 광학 창을했다. 1.0 cm에서 3cm까지의 거리 (D) 영상을 획득, 붉은 빛의 관찰 생산은 연료가 공명 에너지 전달에 의해 달성 할 수없는 거리에서 발생할 수 있다는 증거를 표시하는 거리의 함수로 감소했다. 강도는 역 제곱 법칙 (왼쪽)과 유사 D -2 의존성을 가지고 나타났다. 동일한 프로토콜은 E.위한 하였다 대장균 (오른쪽). 그 결과 추세선은 개념 그쪽에 양식을 보유T 박테리아는 빛의 점 오염원으로 작용하고 있습니다. 세 개의 독립적 인 거리 측정치의 총 고유 배양을 이용하여 각각 획득 하였다. 오차 막대는 각 지점에 존재한다. 경우에 따라 오차 막대는 정규화 된 강도를 나타내는 데 사용되는 기호를보다 작았 다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51549/51549fig2highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/51549/51549fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/51549/51549fig3.jpg" /> 그림 3. 대상 (특정) 및 비 대상 (벌크 용액) 연료. K.의 비교 폐렴은 비오틴 항체로 작용하고 스트렙 타비 딘 - 라벨 (대상) 또는 비 표지 (비 대상) QD705 중 하나에 노출되었다. 그 결과 솔루션은 동일하게 디비했다DED와 한 세트 PBS의 초기 볼륨으로 재현 탁 전에 PBS로 3 회 세척 하였다. 솔루션은 다음 검은 96 - 웰 플레이트 (파란색 막대로 표시) 490-510 nm의 (500 NM)와 710-730 nm의 (720 NM) 방출 필터에서 관찰 된 생물 발광의 개별 우물에 분배 하였다. P의 • 초 -1 • cm -2 각 웰의 720 nm의 필터에서 발견은 각각의 P의 • 초 같은 웰의 500 nm의에서 -1 • cm -2 생물 발광 강도로 정규화 하였다. epifluorescent 여기에서 얻어진 상대 형광 강도는 450-480 nm의 여기 및 710-730 nm의 방출 필터 (빨간색 막대로 표시)을 사용하여 측정 하였다. 생물 발광 형광 신호 없음 차이로 약간은 씻지 않은 조건 (씻지 않은 대상과 씻지 대상)에서 관찰되었다. 이 바인딩과 자유 부동 QD705는 발광 생물 광자에 의해 동등하게 흥분했다 제안합니다. 세탁, N시상대 빨간 신호에 이른 두 가지의 차이는 제어 (비 대상으로 세척)에 비해 (세척 대상) QD705 표지 세균 관찰되었다. 비 표적 세탁에 QD705의 부재는 형광 신호의 부족에 의해 확인 및 대상 씻어 상태에서 QD705 라벨을 확인 하였다. 데이터는 K.의 4 개의 독립적 인 문화에서입니다 폐렴은. 명확하게하기 위해, 전설 QD705 여기의 소스를 나타냅니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51549/51549fig3highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr height="26"><td height="26" style="height:26px;"> 형광 </td><td> 집중 </td><td> μL </td><td> PS (μL) </td><td> λ 최대 EX / EM (NM) </td><td> 매연 필터 (N<html> M) </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> 알렉사 555 </td><td style="width:116px;"> 37.2 μM </td><td style="width:88px;"> 4.77 </td><td style="width:88px;"> 995.23 </td><td style="width:119px;"> 565분의 555 </td><td style="width:152px;"> 570-590 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> 알렉사 568 </td><td style="width:116px;"> 37.2 μM </td><td style="width:88px;"> 4.77 </td><td style="width:88px;"> 995.23 </td><td style="width:119px;"> 603분의 578 </td><td style="width:152px;"> 590-610 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> 알렉사 633 </td><td style="width:116px;"> 37.2 μM </td><td style="width:88px;"> 4.77 </td><td style="width:88px;"> 995.23 </td><td style="width:119px;"> 637분의 632 </td><td style="width:152px;"> 650-670 </td></tr><tr height="21">폭 : 108px; &quot;&gt; 알렉사 700 </td><td style="width:116px;"> 37.2 μM </td><td style="width:88px;"> 4.77 </td><td style="width:88px;"> 995.23 </td><td style="width:119px;"> 723분의 702 </td><td style="width:152px;"> 710-730 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"></td><td style="width:116px;"></td><td style="width:88px;"></td><td style="width:88px;"></td><td style="width:119px;"></td><td style="width:152px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> 비 형광 </td><td style="width:116px;"> 2.62 % 고형분 </td><td style="width:88px;"> 9.72 </td><td style="width:88px;"> 990.28 </td><td style="width:119px;"></td><td style="width:152px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> μSph 핑크 </td><td style="width:116px;"> 5 % 고형분 </td><td style="width:88px;"> 4.77 </td><td style="width:88px;"> 995.23 </td><html><td style="width:119px;"> 605분의 580 </td><td style="width:152px;"> 610-630 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> μSph 노란색 </td><td style="width:116px;"> 5 % 고형분 </td><td style="width:88px;"> 4.77 </td><td style="width:88px;"> 995.23 </td><td style="width:119px;"> 515분의 505 </td><td style="width:152px;"> 510-530 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"></td><td style="width:116px;"></td><td style="width:88px;"></td><td style="width:88px;"></td><td style="width:119px;"></td><td style="width:152px;"></td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;width:108px;"> QD705 </td><td style="width:116px;"> 2 μM </td><td style="width:88px;"> 5 </td><td style="width:88px;"> 995 </td><td style="width:119px;"> 705분의 465 </td><td style="width:152px;"> 710-730 </td></tr><tr height="22">높이 : 22px; 폭 : 108px; &quot;&gt; QD800 </td><td style="width:116px;"> 2 μM </td><td style="width:88px;"> 5 </td><td style="width:88px;"> 995 </td><td style="width:119px;"> 705분의 465 </td><td style="width:152px;"> 790-810 </td></tr></tbody></table> 표 1. 연료 시위에서 사용되는 형광 물질의 속성. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><tbody align="center"><tr><td rowspan="2"></td><td rowspan="2"> 제어 </td><td rowspan="2"> 필터 </td><td colspan="2"> 형광 </td><td colspan="2"> 제어 </td><td rowspan="2"> P 값 </td></tr><tr height="21"><td> P · 초 -1 · cm -2 </td><td> SD </td><td> P · 초 -1 · cm -2 </td><td> SD </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> A555 </td><td> PS </td><td> 580 </td><td> 1.08 × 10 7 </td><td> 3.31 × 10 6 </td><td> 9.09 × 10 6 </td><td> 1.75 × 10 6 </td><td> 0.233 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> A568 </td><td> PS </td><td> 600 </td><td> 8.47 × 10 6 </td><td> 4.23 × 10 6 </td><td> 4.49 × 10 6 </td><td> 9.71 × 10 5 </td><td> 0.094 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> A633 </td><td> PS </td><td> (660) </td><td> 2.40 × 10 6 </td><td> 1.25 × 10 6 </td><td> 7.85 × 10 5 </td><td> 2.39 × 10 5 </td><td> 0.046 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> A700 </td><td> PS </td><td> (720) </td><td> 5.53 × 10 5 </td><td> 2.46 × 10 5 </td><td> 1.54 × 10 5 </td> &lt;TD&gt; 6.05 × 10 4 </td><td> 0.026 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MSPH 노란색 </td><td> 비 형광 μspheres </td><td> (520) </td><td> 1.19 × 10 8 </td><td> 4.85 × 10 7 </td><td> 5.79 × 10 7 </td><td> 1.99 × 10 7 </td><td> 0.057 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> MSPH 핑크 </td><td> 비 형광 μspheres </td><td> (620) </td><td> 2.37 × 10 7 </td><td> 1.36 × 10 7 </td><td> 2.16 × 10 6 </td><td> 8.00 × 10 5 </td><td> 0.026 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> QD705 </td><td> 비 형광 μspheres </td><td> (720) </td><td> 1.76 × 10 7 </td><td> 7.33 × 10 6 </td><td> 2.08 × 10 5 </td><td> 7.16 × 10 4 </td><td> 0.007 </td></tr><tr height="21"><td height="21" style="height:21px;"> QD800</td><td> 비 형광 μspheres </td><td> 800 </td><td> 7.79 × 10 6 </td><td> 4.72 × 10 6 </td><td> 3.60 × 10 4 </td><td> 1.52 × 10 4 </td><td> 0.023 </td></tr></tbody></table> 형광 및 연료와 호환 형광 나노 입자의 표 2. 확인.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

관련 원리를 조사하고 형광 항체 타겟 조건의 다수와의 호환성을 입증하여 발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기초 및 응용 성을 확장.

브레 너머 단계 : 언 바운드 흥분에 의한 형광 발광에서 (연료)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K 조회수.  Institut Pasteur.  관련 원리를 조사하고 형광 항체 타겟 조건의 다수와의 호환성을 입증하여 발광 (연료)에서 언 바운드 흥분에 의한 형광의 기초 및 응용 성을 확장. 

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Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

막 단백질 폴딩의 열역학은 형광 분광학에 의해 측정

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

연구

생체공학

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

생활 세포의 분자 Rotors의 형광 수명 이미징

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

단계 성장 PEG-펩타이드 Hydrogels에서 β-세포 Spheroids의 생성 및 복구

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

단일 분자 형광 현미경에 의한 수용체 역학의 고해상도 시공간 분석

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

수정 된 두 개의 광자 현미경에서 3D 궤도 추적 : 세포 내 소포의 추적에 응용

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

상용 현미경에서 라이브 세포막에 분자 확산 법률에 빠른 형광 이미징

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

정식이 아닌 아미노산의 선택적 압력 관에 의해 '황금' 형광 및 질량 분석 및 형광 단백질 분석 엔지니어링

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Stretchable, 듀얼 채널, 미세 기관 칩의 확장 가능한 제작

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

실시 한 형광 현미경으로 여러 영상 모드

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.