Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude pour le soutien financier de la Fondation Pasteur de New York (JD, CS, CS), l&#39;UE-FP7 programme &quot;Automation&quot; (SLS), le Programme Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) et le Projet IMNOS (à la température ambiante, SLS), la Fondation Conny-Maeve bienfaisance (SLS), l&#39;European Masters en imagerie moléculaire (à l&#39;informatique), les programmes Région Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) et DimMalInf (SLS, RT), l&#39;ANR Programme Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastructures Nationales en Biologie-Santé: France LifebioImaging (FLI) France Vie Imaging (RT, SLS), France Bioimaging (JD, SLS) et le Institut Pasteur, Paris. En outre, les auteurs tiennent à remercier, José Bengoechea et Herbert Schweizer pour réactifs. En outre, les auteurs tiennent à remercier Cindy Fèvre qui a généré des anticorps.

Une. Réactifs <ol><li> Achat ou de développer des bactéries luminescentes et les milieux de culture appropriés, tels que Escherichia coli modifiée exprimant l&#39;ABCDE lux 21, Vibrio fischeri, sp Photobacterium. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Préparer le sérum physiologique (NaCl 0,9%) et des solutions de milieux de culture selon des recettes standard. E. coli et K. pneumoniae ont été cultivées en milieu Luria Bertani (LB) à 37 ° C, et V. fischeri et Photobacterium sp dans du LB complété avec 0,5 M de NaCl à 22 ° C. </li><li> Acheter ou acquérir des sondes fluorescentes telles que la Q-suiveur 705 (40 nm de diamètre, dénommé QD705), Q-suiveur 800 (nm de diamètre 40, dénommée QD800), fluorescent (40 nm de diamètre) et de microsphères de polystyrène non-fluorescentes ( 48 nm de diamètre), et les colorants fluorescents conventionnels. </li><li> Préparer les réactifs nécessaires pour l&#39;étiquetage bactérienne. </li><li> Assurer l&#39;accès àensemble un imageur de bioluminescence animal, tel qu&#39;un spectre IVIS, qui est capable de détecter des signaux dans une large gamme de longueurs d&#39;onde d&#39;émission et des durées d&#39;exposition. Un lecteur de plaque capable de mesures de bioluminescence sera suffisant pour la plupart des expériences décrites ici. </li></ol> 2. Récapitulatif de base de FUEL <ol><li> A partir de colonies individuelles sur des plaques de culture standard, commencer cultures de la nuit de bactéries luminescentes. Ici, V. fischeri ont été utilisés. </li><li> Le jour de l&#39;expérimentation, lancer des sous-cultures fraîches et de leur permettre de progresser jusqu&#39;à une DO 600 de 1-1,5 est atteint. Afin de produire des résultats comparables, il est préférable d&#39;utiliser des bactéries dans les États de croissance similaires dans lesquels ils produisent des signaux intenses. Ceci peut être assuré en maintenant la DO 600 constante. </li><li> Combiner des aliquotes de 100 pl de chacun soit 5 pi de QD705 ou de sérum physiologique (PS), puis ajouter 895 ul de PS en standacuvettes rd spectroscopiques. Placer les cuvettes remplies dans le spectre IVIS et prendre les mesures dans les jeux de filtres appropriés. Ici, le filtre d&#39;émission de 710 à 730 nm a été utilisée. </li></ol> 3. Carburant sur des distances variables <ol><li> Remplir deux volume réduit (1 ml) photométriques des cuvettes en plastique avec soit 50 ul de QD705 ou 97,2 pi de non-fluorescentes 48 nm microsphères de polystyrène dans un volume total de 1 ml PS. Cela garantit surface solide similaire par volume total entre les deux entités. </li><li> Préparer une cuvette de source de lumière en enfermant une troisième cuve avec du ruban noir standard ou d&#39;un autre matériau opaque capable de bloquer la lumière. Préparer soigneusement deux fenêtres optiques identiques sur les côtés opposés de la cuvette. </li><li> Placer les cuvettes préalablement remplis directement sur chaque côté de la cuvette de la source lumineuse. Ajouter une fraction aliquote de 1 ml de V. culture fischeri ou autre (c.-à-luminescent E. coli ou Photobacterium sp) à partir d&#39;une sous-culture fraîche dans la cuvette de la source lumineuse et le couvrir avec un matériau opaque, tel que du papier noir pour réduire la contamination de la lumière. </li><li> Visualisez les trois cuvettes dans les filtres d&#39;émission appropriés, tels que la lumière totale et 710-730 filtres d&#39;émission nm, avec des temps d&#39;exposition de 10, 30 et 30 secondes, respectivement. </li><li> Repositionner les deux cuvettes externes à de plus grandes distances équivalentes de la cuvette centrale, puis de visualiser à nouveau. Répétez l&#39;opération jusqu&#39;à une distance finale face-à-face (au centre de la cuvette réduite en volume) de 3cm est atteint. A chaque étape, acquérir une image de fluorescence (450 à 480 nm d&#39;excitation, de 710 à 730 nm émission) pour valider l&#39;emplacement de QD705. </li></ol> 4. Enquête paires potentielles de carburant <ol><li> Remplir deux cuvettes à faible débit de 1 ml avec des solutions contenant soit un fluorophore ou une nanoparticule fluorescente d&#39;intérêt dans une, et PS PS ou avec des nanoparticules non fluorescents comme le témoin négatif dans l&#39;autre. En ee travail a démontré ici, une variété de potentiels disponibles dans le commerce fluorophores carburant et nanoparticules fluorescentes ont été étudiés, comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Ajouter une aliquote de 1 ml V. frais fischeri ou d&#39;autres bactéries luminescentes à une troisième cuve black-out contenant deux fenêtres optiques physiquement égaux situés sur les côtés opposés. Couvrir la cuve avec une substance opaque comme un morceau de papier noir. </li><li> A un endroit à courte distance mais égale les deux cuvettes de volume réduit des deux côtés de la cuvette black-out et de visualiser sous les filtres appropriés. Ici, une distance de 0,7 cm a été utilisé. Répéter l&#39;opération avec les autres fluorophores. </li></ol> 5. CARBURANT ciblée <ol><li> Préparer des anticorps biotinylés spécifiques pour les bactéries luminescentes. Par exemple, des anticorps primaires spécifiques ici à K. pneumoniae (α-Kp) ont été biotinylé en utilisant une solution contenant du EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine. </li&gt; <li> Enlever l&#39;excès de réactif des anticorps en utilisant des colonnes de dessalage sous centrifugation (1500 xg) pendant 2 min. </li><li> Utiliser un dosage de Bradford standard pour déterminer la concentration en protéine et de déterminer le degré de biotinylation anticorps par dosage de HABA. </li><li> Obtenir l&#39;anticorps biotinylé α-Kp-biot (AB) des lots par mélange de 100 ul (10 mM, on le dissout dans 1 x PBS) avec 40 ul d&#39;anticorps α-Kp, résultant en un degré final de la substitution de 16 résidus de biotine par Ab et une finale concentration en protéines de 10 mg ml -1. </li><li> Utilisation multiple nuit reproduire cultures, de cibler les bactéries lavées avec les anticorps ci-dessus en suivant le protocole approprié. <ol><li> Plus précisément, laver le K. pneumoniae dans PBS 1x, et remettre en suspension dans PBS 1x à une DO de 4 (environ 4 x 10 8 UFC ml -1 OD -1). </li><li> Pour chaque répétition, incuber 100 pi de PBS, α -Anticorps Kp (10 pi α-Kp-biotB ou 10 pi de PBS pour le contrôle) et 100 cellules de pi pendant 90 min à 30 ° C. Laver les cellules trois fois en PBS 1x, et remettre en suspension dans 196 ul de PBS. </li></ol></li><li> Étiqueter les cellules avec le conjugué QD705 de streptavidine et les diviser en deux volumes équivalents. </li><li> Laver une solution à trois reprises et remettre en suspension dans un volume approprié alors. </li><li> Distribuer 100 ul des solutions lavés et non lavés dans des puits individuels d&#39;une plaque de 96 puits noir. Mesurer la luminescence résultante sous la lumière totale, 490-510 nm et 710-730 nm filtres. concentration en fluorophore peut être déterminée à l&#39;aide de 450 à 480 nm d&#39;excitation et d&#39;émission de 710 à 730 nm. </li></ol>

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Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents. JD, SB, KLR et SLS contribué à EP10290158.4 européen des brevets et l&#39;Organisation mondiale de la propriété intellectuelle demande de brevet WO/2011/117847.

La démonstration fondamentale de carburant peut être réalisée par simple mélange de bactéries luminescentes avec des nanoparticules ou points quantiques fluorescentes. Les deux entités seront physiquement séparés et restent au-delà de n&#39;importe quelle distance de RET efficace. Plus difficile est l&#39;optimisation du signal de FUEL à la fois in vitro et in vivo. Dans des conditions in vitro, à la fois avec et sans un absorbeur optique présente, en général l&#39;addition d&#39;un excès de fluorophore sera suffisant pour maximiser la réaction du combustible. Cependant, à des concentrations élevées phénomènes tels que la trempe statique ou de collision peut conduire à une perte de signal fluorescent. Réalisation d&#39;une série de dilutions par la variation indépendante de la concentration de la source luminescente et le fluorophore permettra d&#39;optimiser les concentrations désirées. La mise en place et l&#39;optimisation de carburant sous des concentrations in vivo est beaucoup plus difficile et doit être traité au cas par cas. Il peut être difficile de créer un condition où l&#39;entité fluorescente peut être accédé par la source optique luminescent. En tant que tel, en commençant par co-injection directe des deux parties peut fournir des informations quant à la réussite de carburant dans des conditions optimales. Protocoles standards existent pour les bactéries d&#39;étiquetage et les cellules eucaryotes avec des entités fluorescentes telles que la série et les points quantiques Alexa. Souvent, cela nécessite une fonctionnalisation de surface ou l&#39;activation d&#39;anticorps, ce qui peut conduire à des effets indésirables tels que la viabilité des cellules ou réduit l&#39;activité métabolique altérée. Pour y remédier, il est important de déterminer la quantité optimale de l&#39;anticorps ou de l&#39;agent d&#39;activation préalable qui minimise les perturbations cellulaires tout en maximisant le marquage fluorescent. L&#39;utilisation de points quantiques est avantageux en raison de leur caractéristique large spectre d&#39;excitation, les spectres d&#39;émission étroite et accordable, et la possibilité d&#39;un déplacement de Stokes. Cependant, les points quantiques peuvent être cytotoxiques et peuvent ne pas être souhaitable dans certains cas. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; CARBURANT est un phénomène qui est présent dans de nombreuses expériences de BRET 13 et est applicable à une variété de sources fluorescentes et luminescentes. Jusqu&#39;à présent, les photons provenant du combustible ont été considérés comme le produit d&#39;interactions non spécifiques ou un signal de fond malheureux résultant des expériences de BRET mal conçus. C&#39;est seulement avec le type d&#39;expériences démontré ici que nous avons pu identifier l&#39;utilité de ce signal parasite. Dans les exemples représentés, les bactéries luminescentes agissent comme une source d&#39;excitation diffuse capable de déclencher une réponse fluorescent standard à partir d&#39;une grande variété d&#39;entités fluorescentes. En outre, en raison de la distance de travail importante, il est raisonnable de conclure que, bien que le carburant peut être construit sans l&#39;apparition de BRET, dans BRET général ne peut pas être observé sans une contribution de FUEL. Il est important, en raison de l&#39;absence d&#39;une obligation de ciblage, le carburant peut être utilisé pour couvrir l&#39;écart spatiale qui existe entre BRET et ctechniques d&#39;imagerie animal entier onventional.

La modification génétique des organismes, tels que les virus 1, 2, 3, bactéries ou de petits mammifères 4 soit induire ou bioluminescence expriment de manière constitutive, a été très réussie et largement démontré 5-7. La bioluminescence, une réaction de chimioluminescence in vivo impliquant des réactifs d&#39;origine naturelle, présente l&#39;avantage de produire de la lumière sans la nécessité d&#39;une source de lumière externe. En tant que tel, l&#39;imagerie bioluminescente ne souffre pas des inconvénients communs de signal non-spécifique et d&#39;auto-fluorescence à partir de l&#39;imagerie trouvés 8. Par conséquent, la bioluminescence a un rapport important rapport signal-bruit étant donné que tout signal détecté provient uniquement de la source prévue. Alors que de nombreux modèles ont exploité l&#39;opéron lux de Photorhabdus luminescens (maximum d&#39;émission entre 480 et centrée sur 490 nm) pour in vitro et in vivo neuf applications, son utilisation dans les petits mammals a été problématique en raison de la nature même des conditions d&#39;imagerie; l&#39;existence d&#39;absorbeurs optiques pénétrant, telles que l&#39;hémoglobine, et des agents de dispersion, tels que des tissus et des os, affecte fortement à des longueurs d&#39;onde bleu jaune 3. L&#39;expression d&#39;une luciférase de luciole ingénierie (de maximum d&#39;émission à 617nm) a été récemment mis au point et intégré, fournissant un outil qui permet de surmonter beaucoup absorption optique 10, mais il est encore soumis à des effets de diffusion. En réponse, il ya eu plusieurs tentatives de rouge-décaler le signal émis dans la fenêtre optique désirée de 650-900 nm, une région de l&#39;absorption réduite au minimum et diffusion, en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence (BRET) 11-13. Comme un outil pour améliorer la détection du signal, BRET, qui utilise une source de bioluminescence comme donneur et un fluorophore ajoutée comme accepteur, a trouvé le succès limité. Comme un exemple précurseur de ce phénomène, les «points quantiques auto-éclairante4; (SIQDs) se composent de 14 Renilla reniformis luciférases modifiées liées à la couche de polymère externe-lysine disponible dans le commerce de points quantiques (QD). Lors de l&#39;addition de substrat, la réaction de bioluminescence résultant induit l&#39;émission de fluorescence des points quantiques, générant une production importante de photons rouges. Cependant, ces SIQDs ont applicabilité limitée à la visualisation in vivo des événements physiologiquement pertinents. Cette application limitée est probablement dû à la difficulté de lier la sonde double à l&#39;organe, la cellule ou le gène d&#39;intérêt, car les SIQDs ne peuvent pas être codés génétiquement et donc nécessiterait une modification secondaire de l&#39;enveloppe de polymère. Afin d&#39;améliorer leur applicabilité, SIQDs alternatives, où les luciférases sont liés directement à la base luminescente, ont récemment été utilisés 15. Construction d&#39;arrêt de la notion SIQD, un système de BRET plus applicable a été obtenue en attachant la luciférase de Cypridina dans undocyanine colorant 16, qui était capable de cibler spécifiquement des tumeurs chez la souris tout en produisant un décalage vers le rouge substantielle de 460 nm à 675 nm. Pour subir un transfert d&#39;énergie non radiatif, BRET suit les mêmes contraintes primaires que son homologue fluorescent: il doit y avoir une forte chevauchement spectral entre l&#39;émission des bailleurs de fonds et les spectres accepteur d&#39;excitation et la distance de travail entre les deux parties doit être de l&#39;ordre de la rayon Förster (5-14 nm en fonction de la paire donneur-accepteur, avec une distance maximale de deux fois le rayon Förster 17). Cette dépendance de la distance limite grandement les types d&#39;événements qui peuvent être observés à l&#39;aide BRET comme un moyen d&#39;améliorer la détection. Récemment, une nouvelle approche a été identifié et démontré sous la fois in vitro et dans des conditions in vivo. Développée à partir de la fondation de BRET, fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) 18, 19 </sup&gt; nécessite également une forte chevauchement spectral entre le luminescent et composants fluorescents. Cependant, contrairement à BRET, le carburant est un processus par lequel complètement radiative du photon émis depuis la source luminescente est absorbée par un fluorophore optiquement accessible, qui émet un photon par la suite déplacée vers le rouge selon le rendement quantique de fluorophore. Akin à BRET, cette approche peut également être utilisée pour surmonter les contraintes de l&#39;imagerie en présence d&#39;absorbeurs optiques. Le décalage vers le rouge résultante fournit une augmentation globale et la spécificité dans le signal détecté en raison d&#39;une diminution de l&#39;atténuation et une réduction des effets de diffraction optiques. FUEL a été signalée entre Escherichia coli bioluminescentes exprimant l&#39;opéron lux et les points quantiques 18, 19. Bien que expérimentalement similaire aux SIQDs, une différence fondamentale existe: en carburant, il n&#39;est pas nécessaire que la source luminescente d&#39;être physiquement lié au fluorophore, ce qui permet for codage génétique de la sonde luminescente. En raison de la détection réussie du carburant entre bactéries luminescentes et des points quantiques, il est possible que cette technique pourrait être appliquée à la fois superficielle (la peau) et les tissus profonds (poumon, foie) des infections telles que Staphylococcus aureus et Klebsiellia pneumoniae. Depuis le rapport de sa signification expérimentale, FUEL a évolué pour inclure un modèle mathématique solide 20 qui peut être utilisé pour prédire luminescent acceptable et paires fluorescentes, et ses applications se sont élargies pour inclure l&#39;utilisation dans l&#39;identification des caractéristiques photophysiques tels que le rendement quantique. Nous décrivons ci-dessous quelques-unes des techniques de base du carburant. Tout d&#39;abord, nous montrons des preuves de ce phénomène tant à court (um) et à long (cm) des distances de travail, qui distingue fondamentalement CARBURANT de BRET. Deuxièmement, nous étendons sur les paires possibles de carburant par l&#39;examen d&#39;une grande variété de fluorophores et de nanoparticules fluorescentes. Third, applications de FUEL sont étudiés en comparant des paires de CARBURANT ciblées et non-ciblées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) est un processus d&#39;excitation-émission radiative qui produit le signal accrue et l&#39;amélioration de contraste in vitro et in vivo. actions de carburant Beaucoup des mêmes principes de base que le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence (BRET), mais diffère grandement dans les distances de travail acceptables entre la source luminescente et l&#39;entité fluorescente. Bien BRET est effectivement limitée à un maximum de 2 fois le rayon de Förster, communément moins de 14 nm, FUEL peut survenir à des distances allant jusqu&#39;à pm ou même cm en l&#39;absence d&#39;un absorbeur optique. Ici, nous étendons sur le fondement et l&#39;applicabilité de carburant en passant en revue les principes pertinents derrière le phénomène et de démontrer sa compatibilité avec une grande variété de fluorophores et de nanoparticules fluorescentes. En outre, l&#39;utilitaire de carburant anticorps ciblé est explorée. Les exemples présentés ici montrent que le carburant peut être utilisé pour applications où BRET n&#39;est pas possible, combler le vide spatial qui existe entre BRET et de l&#39;imagerie traditionnelle de l&#39;animal entier.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Extension de la fondation et de l&#39;applicabilité de la fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) en interrogeant les principes pertinents et démontrer sa compatibilité avec une multitude de fluorophores et les conditions d&#39;anticorps ciblés.

A Step Beyond BRET: Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K vues.  Institut Pasteur.  Extension de la fondation et de l'applicabilité de la fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) en interrogeant les principes pertinents et démontrer sa compatibilité avec une multitude de fluorophores et les conditions d'anticorps ciblés. 