Les auteurs tiennent à exprimer leur gratitude pour le soutien financier de la Fondation Pasteur de New York (JD, CS, CS), l&#39;UE-FP7 programme &quot;Automation&quot; (SLS), le Programme Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) et le Projet IMNOS (à la température ambiante, SLS), la Fondation Conny-Maeve bienfaisance (SLS), l&#39;European Masters en imagerie moléculaire (à l&#39;informatique), les programmes Région Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) et DimMalInf (SLS, RT), l&#39;ANR Programme Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastructures Nationales en Biologie-Santé: France LifebioImaging (FLI) France Vie Imaging (RT, SLS), France Bioimaging (JD, SLS) et le Institut Pasteur, Paris. En outre, les auteurs tiennent à remercier, José Bengoechea et Herbert Schweizer pour réactifs. En outre, les auteurs tiennent à remercier Cindy Fèvre qui a généré des anticorps.

Une. Réactifs <ol><li> Achat ou de développer des bactéries luminescentes et les milieux de culture appropriés, tels que Escherichia coli modifiée exprimant l&#39;ABCDE lux 21, Vibrio fischeri, sp Photobacterium. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Préparer le sérum physiologique (NaCl 0,9%) et des solutions de milieux de culture selon des recettes standard. E. coli et K. pneumoniae ont été cultivées en milieu Luria Bertani (LB) à 37 ° C, et V. fischeri et Photobacterium sp dans du LB complété avec 0,5 M de NaCl à 22 ° C. </li><li> Acheter ou acquérir des sondes fluorescentes telles que la Q-suiveur 705 (40 nm de diamètre, dénommé QD705), Q-suiveur 800 (nm de diamètre 40, dénommée QD800), fluorescent (40 nm de diamètre) et de microsphères de polystyrène non-fluorescentes ( 48 nm de diamètre), et les colorants fluorescents conventionnels. </li><li> Préparer les réactifs nécessaires pour l&#39;étiquetage bactérienne. </li><li> Assurer l&#39;accès àensemble un imageur de bioluminescence animal, tel qu&#39;un spectre IVIS, qui est capable de détecter des signaux dans une large gamme de longueurs d&#39;onde d&#39;émission et des durées d&#39;exposition. Un lecteur de plaque capable de mesures de bioluminescence sera suffisant pour la plupart des expériences décrites ici. </li></ol> 2. Récapitulatif de base de FUEL <ol><li> A partir de colonies individuelles sur des plaques de culture standard, commencer cultures de la nuit de bactéries luminescentes. Ici, V. fischeri ont été utilisés. </li><li> Le jour de l&#39;expérimentation, lancer des sous-cultures fraîches et de leur permettre de progresser jusqu&#39;à une DO 600 de 1-1,5 est atteint. Afin de produire des résultats comparables, il est préférable d&#39;utiliser des bactéries dans les États de croissance similaires dans lesquels ils produisent des signaux intenses. Ceci peut être assuré en maintenant la DO 600 constante. </li><li> Combiner des aliquotes de 100 pl de chacun soit 5 pi de QD705 ou de sérum physiologique (PS), puis ajouter 895 ul de PS en standacuvettes rd spectroscopiques. Placer les cuvettes remplies dans le spectre IVIS et prendre les mesures dans les jeux de filtres appropriés. Ici, le filtre d&#39;émission de 710 à 730 nm a été utilisée. </li></ol> 3. Carburant sur des distances variables <ol><li> Remplir deux volume réduit (1 ml) photométriques des cuvettes en plastique avec soit 50 ul de QD705 ou 97,2 pi de non-fluorescentes 48 nm microsphères de polystyrène dans un volume total de 1 ml PS. Cela garantit surface solide similaire par volume total entre les deux entités. </li><li> Préparer une cuvette de source de lumière en enfermant une troisième cuve avec du ruban noir standard ou d&#39;un autre matériau opaque capable de bloquer la lumière. Préparer soigneusement deux fenêtres optiques identiques sur les côtés opposés de la cuvette. </li><li> Placer les cuvettes préalablement remplis directement sur chaque côté de la cuvette de la source lumineuse. Ajouter une fraction aliquote de 1 ml de V. culture fischeri ou autre (c.-à-luminescent E. coli ou Photobacterium sp) à partir d&#39;une sous-culture fraîche dans la cuvette de la source lumineuse et le couvrir avec un matériau opaque, tel que du papier noir pour réduire la contamination de la lumière. </li><li> Visualisez les trois cuvettes dans les filtres d&#39;émission appropriés, tels que la lumière totale et 710-730 filtres d&#39;émission nm, avec des temps d&#39;exposition de 10, 30 et 30 secondes, respectivement. </li><li> Repositionner les deux cuvettes externes à de plus grandes distances équivalentes de la cuvette centrale, puis de visualiser à nouveau. Répétez l&#39;opération jusqu&#39;à une distance finale face-à-face (au centre de la cuvette réduite en volume) de 3cm est atteint. A chaque étape, acquérir une image de fluorescence (450 à 480 nm d&#39;excitation, de 710 à 730 nm émission) pour valider l&#39;emplacement de QD705. </li></ol> 4. Enquête paires potentielles de carburant <ol><li> Remplir deux cuvettes à faible débit de 1 ml avec des solutions contenant soit un fluorophore ou une nanoparticule fluorescente d&#39;intérêt dans une, et PS PS ou avec des nanoparticules non fluorescents comme le témoin négatif dans l&#39;autre. En ee travail a démontré ici, une variété de potentiels disponibles dans le commerce fluorophores carburant et nanoparticules fluorescentes ont été étudiés, comme indiqué dans le tableau 1. </li><li> Ajouter une aliquote de 1 ml V. frais fischeri ou d&#39;autres bactéries luminescentes à une troisième cuve black-out contenant deux fenêtres optiques physiquement égaux situés sur les côtés opposés. Couvrir la cuve avec une substance opaque comme un morceau de papier noir. </li><li> A un endroit à courte distance mais égale les deux cuvettes de volume réduit des deux côtés de la cuvette black-out et de visualiser sous les filtres appropriés. Ici, une distance de 0,7 cm a été utilisé. Répéter l&#39;opération avec les autres fluorophores. </li></ol> 5. CARBURANT ciblée <ol><li> Préparer des anticorps biotinylés spécifiques pour les bactéries luminescentes. Par exemple, des anticorps primaires spécifiques ici à K. pneumoniae (α-Kp) ont été biotinylé en utilisant une solution contenant du EZ-Link Sulfo-NHS-LC-biotine. </li&gt; <li> Enlever l&#39;excès de réactif des anticorps en utilisant des colonnes de dessalage sous centrifugation (1500 xg) pendant 2 min. </li><li> Utiliser un dosage de Bradford standard pour déterminer la concentration en protéine et de déterminer le degré de biotinylation anticorps par dosage de HABA. </li><li> Obtenir l&#39;anticorps biotinylé α-Kp-biot (AB) des lots par mélange de 100 ul (10 mM, on le dissout dans 1 x PBS) avec 40 ul d&#39;anticorps α-Kp, résultant en un degré final de la substitution de 16 résidus de biotine par Ab et une finale concentration en protéines de 10 mg ml -1. </li><li> Utilisation multiple nuit reproduire cultures, de cibler les bactéries lavées avec les anticorps ci-dessus en suivant le protocole approprié. <ol><li> Plus précisément, laver le K. pneumoniae dans PBS 1x, et remettre en suspension dans PBS 1x à une DO de 4 (environ 4 x 10 8 UFC ml -1 OD -1). </li><li> Pour chaque répétition, incuber 100 pi de PBS, α -Anticorps Kp (10 pi α-Kp-biotB ou 10 pi de PBS pour le contrôle) et 100 cellules de pi pendant 90 min à 30 ° C. Laver les cellules trois fois en PBS 1x, et remettre en suspension dans 196 ul de PBS. </li></ol></li><li> Étiqueter les cellules avec le conjugué QD705 de streptavidine et les diviser en deux volumes équivalents. </li><li> Laver une solution à trois reprises et remettre en suspension dans un volume approprié alors. </li><li> Distribuer 100 ul des solutions lavés et non lavés dans des puits individuels d&#39;une plaque de 96 puits noir. Mesurer la luminescence résultante sous la lumière totale, 490-510 nm et 710-730 nm filtres. concentration en fluorophore peut être déterminée à l&#39;aide de 450 à 480 nm d&#39;excitation et d&#39;émission de 710 à 730 nm. </li></ol>

<ol>
	<li>Hu, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+human+immunodeficiency+virus+type+1+protease+biosensor+assay+using+bioluminescence+resonance+energy+transfer.">A human immunodeficiency virus type 1 protease biosensor assay using bioluminescence resonance energy transfer.</a> J Virol Methods. 128, 93-103 (2005).</li><li>Contag, C. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualizing+gene+expression+in+living+mammals+using+a+bioluminescent+reporter.">Visualizing gene expression in living mammals using a bioluminescent reporter.</a> Photochem Photobiol. 66, 523-531 (1997).</li><li>Badr, C. E., Tannous, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging:+progress+and+applications.">Bioluminescence imaging: progress and applications.</a> Trends in Biotechnology. 29, 624-633 (2011).</li><li>Maywood, E. S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Analysis+of+core+circadian+feedback+loop+in+suprachiasmatic+nucleus+of+mCry1-luc+transgenic+reporter+mouse.">Analysis of core circadian feedback loop in suprachiasmatic nucleus of mCry1-luc transgenic reporter mouse.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 110, 9547-9552 (2013).</li><li>Condeelis, J., Weissleder, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+Vivo+Imaging+in+Cancer.">In Vivo Imaging in Cancer.</a> Cold Spring Harbor Perspectives in Biology. , (2010).</li><li>Madero-Visbal, R. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+imaging+correlates+with+tumor+progression+in+an+orthotopic+mouse+model+of+lung+cancer.">Bioluminescence imaging correlates with tumor progression in an orthotopic mouse model of lung cancer.</a> Surgical Oncology. 21, 23-29 (2012).</li><li>Thalhofer, C. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+imaging+of+transgenic+Leishmania+parasites+in+a+live+host.">In vivo imaging of transgenic Leishmania parasites in a live host.</a> J Vis Exp. 10, (2010).</li><li>Troy, T., Jekic-McMullen, D., Sambucetti, L., Rice, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Quantitative+comparison+of+the+sensitivity+of+detection+of+fluorescent+and+bioluminescent+reporters+in+animal+models.">Quantitative comparison of the sensitivity of detection of fluorescent and bioluminescent reporters in animal models.</a> Molecular Imaging: Official Journal of the Society for Molecular Imaging. 3, 9-23 (2004).</li><li>Michelini, E., Cevenini, L., Mezzanotte, L., Roda, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+probes+and+visualization+of+bioluminescence.">Luminescent probes and visualization of bioluminescence.</a> Methods Mol Biol. 574, 1-13 (2009).</li><li>Branchini, B. R., Ablamsky, D. M., Rosenberg, J. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Chemically+Modified+Firefly+Luciferase+Is+an+Efficient+Source+of+Near-Infrared+Light.">Chemically Modified Firefly Luciferase Is an Efficient Source of Near-Infrared Light.</a> Bioconjugate Chemistry. 21, 2023-2030 (2010).</li><li>Saito, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Luminescent+proteins+for+high-speed+single-cell+and+whole-body+imaging.">Luminescent proteins for high-speed single-cell and whole-body imaging.</a> Nat Commun. 3, 1262 (2012).</li><li>Dragulescu-Andrasi, A., Chan, C. T., De, A., Massoud, T. F., Gambhir, S. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Bioluminescence+resonance+energy+transfer+(BRET)+imaging+of+protein-protein+interactions+within+deep+tissues+of+living+subjects.">Bioluminescence resonance energy transfer (BRET) imaging of protein-protein interactions within deep tissues of living subjects.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 108, 12060-12065 (2011).</li><li>Bacart, J., Corbel, C., Jockers, R., Bach, S., Couturier, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+BRET+technology+and+its+application+to+screening+assays.">The BRET technology and its application to screening assays.</a> Biotechnology Journal. 3, 311-324 (2008).</li><li>So, M. -. K., Xu, C., Loening, A. M., Gambhir, S. S., Rao, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dot+conjugates+for+in+vivo+imaging.">Self-illuminating quantum dot conjugates for in vivo imaging.</a> Nat Biotechnol. 24, 339-343 (2006).</li><li>Wu, Q., Chu, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Self-illuminating+quantum+dots+for+highly+sensitive+in+vivo+real-time+luminescent+mapping+of+sentinel+lymph+nodes.">Self-illuminating quantum dots for highly sensitive in vivo real-time luminescent mapping of sentinel lymph nodes.</a> Int J Nanomedicine. 7, 3433-3443 (2012).</li><li>Wu, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+far-red+luminescence+imaging+of+a+biomarker+based+on+BRET+from+Cypridina+bioluminescence+to+an+organic+dye.">In vivo far-red luminescence imaging of a biomarker based on BRET from Cypridina bioluminescence to an organic dye.</a> Proc Natl Acad Sci USA. 106, 15599-15603 (2009).</li><li>Piston, D. W., Kremers, G. -. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescent+protein+FRET:+the+good,+the+bad+and+the+ugly.">Fluorescent protein FRET: the good, the bad and the ugly.</a> Trends Biochem Sci. 32, 407-414 (2007).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=in+Imaging,+Manipulation,+and+Analysis+of+Biomolecules,+Cells,+and+Tissues.">in Imaging, Manipulation, and Analysis of Biomolecules, Cells, and Tissues.</a> , 790210-790219 (2011).</li><li>Dragavon, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vivo+excitation+of+nanoparticles+using+luminescent+bacteria.">In vivo excitation of nanoparticles using luminescent bacteria.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences. 109, 8890-8895 (2012).</li><li>Holland, A. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=In+vitro+characterization+of+fluorescence+by+unbound+excitation+from+luminescence:+Broadening+the+scope+of+energy+transfer.">In vitro characterization of fluorescence by unbound excitation from luminescence: Broadening the scope of energy transfer.</a> Methods. , (2013).</li><li>Choi, K. -. H., Schweizer, H. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=mini-Tn7+insertion+in+bacteria+with+single+attTn7+sites:+example+Pseudomonas+aeruginosa.">mini-Tn7 insertion in bacteria with single attTn7 sites: example Pseudomonas aeruginosa.</a> Nat. Prot. 1, 153-161 (2006).</li><li>Riottot, M. M., Fournier, J. M., Jouin, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Direct+evidence+for+the+involvement+of+capsular+polysaccharide+in+the+immunoprotective+activity+of+Klebsiella+pneumoniae+ribosomal+preparations.">Direct evidence for the involvement of capsular polysaccharide in the immunoprotective activity of Klebsiella pneumoniae ribosomal preparations.</a> Infect Immun. 31, 71-77 (1981).</li><li>Becker, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fluorescence+lifetime+imaging--techniques+and+applications.">Fluorescence lifetime imaging--techniques and applications.</a> J Microsc. 247, 119-136 (2012).</li><li>Rogers, K. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Visualization+of+local+Ca2++dynamics+with+genetically+encoded+bioluminescent+reporters.">Visualization of local Ca2+ dynamics with genetically encoded bioluminescent reporters.</a> Eur J Neurosci. 21, 597-610 (2005).</li><li>Dubochet, J., McDowall, A. W., Menge, B., Schmid, E. N., Lickfeld, K. G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Electron+microscopy+of+frozen-hydrated+bacteria.">Electron microscopy of frozen-hydrated bacteria.</a> Journal of Bacteriology. 155, 381-390 (1983).</li><li>Graham, L. L., Harris, R., Villiger, W., Beveridge, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Freeze-substitution+of+gram-negative+eubacteria:+general+cell+morphology+and+envelope+profiles.">Freeze-substitution of gram-negative eubacteria: general cell morphology and envelope profiles.</a> Journal of Bacteriology. 173, 1623-1633 (1991).</li><li>Hobot, J. A., Carlemalm, E., Villiger, W., Kellenberger, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Periplasmic+gel:+new+concept+resulting+from+the+reinvestigation+of+bacterial+cell+envelope+ultrastructure+by+new+methods.">Periplasmic gel: new concept resulting from the reinvestigation of bacterial cell envelope ultrastructure by new methods.</a> Journal of Bacteriology. 160, 143-152 (1984).</li></ol>

Les auteurs déclarent les intérêts financiers concurrents. JD, SB, KLR et SLS contribué à EP10290158.4 européen des brevets et l&#39;Organisation mondiale de la propriété intellectuelle demande de brevet WO/2011/117847.

La démonstration fondamentale de carburant peut être réalisée par simple mélange de bactéries luminescentes avec des nanoparticules ou points quantiques fluorescentes. Les deux entités seront physiquement séparés et restent au-delà de n&#39;importe quelle distance de RET efficace. Plus difficile est l&#39;optimisation du signal de FUEL à la fois in vitro et in vivo. Dans des conditions in vitro, à la fois avec et sans un absorbeur optique présente, en général l&#39;addition d&#39;un excès de fluorophore sera suffisant pour maximiser la réaction du combustible. Cependant, à des concentrations élevées phénomènes tels que la trempe statique ou de collision peut conduire à une perte de signal fluorescent. Réalisation d&#39;une série de dilutions par la variation indépendante de la concentration de la source luminescente et le fluorophore permettra d&#39;optimiser les concentrations désirées. La mise en place et l&#39;optimisation de carburant sous des concentrations in vivo est beaucoup plus difficile et doit être traité au cas par cas. Il peut être difficile de créer un condition où l&#39;entité fluorescente peut être accédé par la source optique luminescent. En tant que tel, en commençant par co-injection directe des deux parties peut fournir des informations quant à la réussite de carburant dans des conditions optimales. Protocoles standards existent pour les bactéries d&#39;étiquetage et les cellules eucaryotes avec des entités fluorescentes telles que la série et les points quantiques Alexa. Souvent, cela nécessite une fonctionnalisation de surface ou l&#39;activation d&#39;anticorps, ce qui peut conduire à des effets indésirables tels que la viabilité des cellules ou réduit l&#39;activité métabolique altérée. Pour y remédier, il est important de déterminer la quantité optimale de l&#39;anticorps ou de l&#39;agent d&#39;activation préalable qui minimise les perturbations cellulaires tout en maximisant le marquage fluorescent. L&#39;utilisation de points quantiques est avantageux en raison de leur caractéristique large spectre d&#39;excitation, les spectres d&#39;émission étroite et accordable, et la possibilité d&#39;un déplacement de Stokes. Cependant, les points quantiques peuvent être cytotoxiques et peuvent ne pas être souhaitable dans certains cas. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; CARBURANT est un phénomène qui est présent dans de nombreuses expériences de BRET 13 et est applicable à une variété de sources fluorescentes et luminescentes. Jusqu&#39;à présent, les photons provenant du combustible ont été considérés comme le produit d&#39;interactions non spécifiques ou un signal de fond malheureux résultant des expériences de BRET mal conçus. C&#39;est seulement avec le type d&#39;expériences démontré ici que nous avons pu identifier l&#39;utilité de ce signal parasite. Dans les exemples représentés, les bactéries luminescentes agissent comme une source d&#39;excitation diffuse capable de déclencher une réponse fluorescent standard à partir d&#39;une grande variété d&#39;entités fluorescentes. En outre, en raison de la distance de travail importante, il est raisonnable de conclure que, bien que le carburant peut être construit sans l&#39;apparition de BRET, dans BRET général ne peut pas être observé sans une contribution de FUEL. Il est important, en raison de l&#39;absence d&#39;une obligation de ciblage, le carburant peut être utilisé pour couvrir l&#39;écart spatiale qui existe entre BRET et ctechniques d&#39;imagerie animal entier onventional.

La modification génétique des organismes, tels que les virus 1, 2, 3, bactéries ou de petits mammifères 4 soit induire ou bioluminescence expriment de manière constitutive, a été très réussie et largement démontré 5-7. La bioluminescence, une réaction de chimioluminescence in vivo impliquant des réactifs d&#39;origine naturelle, présente l&#39;avantage de produire de la lumière sans la nécessité d&#39;une source de lumière externe. En tant que tel, l&#39;imagerie bioluminescente ne souffre pas des inconvénients communs de signal non-spécifique et d&#39;auto-fluorescence à partir de l&#39;imagerie trouvés 8. Par conséquent, la bioluminescence a un rapport important rapport signal-bruit étant donné que tout signal détecté provient uniquement de la source prévue. Alors que de nombreux modèles ont exploité l&#39;opéron lux de Photorhabdus luminescens (maximum d&#39;émission entre 480 et centrée sur 490 nm) pour in vitro et in vivo neuf applications, son utilisation dans les petits mammals a été problématique en raison de la nature même des conditions d&#39;imagerie; l&#39;existence d&#39;absorbeurs optiques pénétrant, telles que l&#39;hémoglobine, et des agents de dispersion, tels que des tissus et des os, affecte fortement à des longueurs d&#39;onde bleu jaune 3. L&#39;expression d&#39;une luciférase de luciole ingénierie (de maximum d&#39;émission à 617nm) a été récemment mis au point et intégré, fournissant un outil qui permet de surmonter beaucoup absorption optique 10, mais il est encore soumis à des effets de diffusion. En réponse, il ya eu plusieurs tentatives de rouge-décaler le signal émis dans la fenêtre optique désirée de 650-900 nm, une région de l&#39;absorption réduite au minimum et diffusion, en utilisant le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence (BRET) 11-13. Comme un outil pour améliorer la détection du signal, BRET, qui utilise une source de bioluminescence comme donneur et un fluorophore ajoutée comme accepteur, a trouvé le succès limité. Comme un exemple précurseur de ce phénomène, les «points quantiques auto-éclairante4; (SIQDs) se composent de 14 Renilla reniformis luciférases modifiées liées à la couche de polymère externe-lysine disponible dans le commerce de points quantiques (QD). Lors de l&#39;addition de substrat, la réaction de bioluminescence résultant induit l&#39;émission de fluorescence des points quantiques, générant une production importante de photons rouges. Cependant, ces SIQDs ont applicabilité limitée à la visualisation in vivo des événements physiologiquement pertinents. Cette application limitée est probablement dû à la difficulté de lier la sonde double à l&#39;organe, la cellule ou le gène d&#39;intérêt, car les SIQDs ne peuvent pas être codés génétiquement et donc nécessiterait une modification secondaire de l&#39;enveloppe de polymère. Afin d&#39;améliorer leur applicabilité, SIQDs alternatives, où les luciférases sont liés directement à la base luminescente, ont récemment été utilisés 15. Construction d&#39;arrêt de la notion SIQD, un système de BRET plus applicable a été obtenue en attachant la luciférase de Cypridina dans undocyanine colorant 16, qui était capable de cibler spécifiquement des tumeurs chez la souris tout en produisant un décalage vers le rouge substantielle de 460 nm à 675 nm. Pour subir un transfert d&#39;énergie non radiatif, BRET suit les mêmes contraintes primaires que son homologue fluorescent: il doit y avoir une forte chevauchement spectral entre l&#39;émission des bailleurs de fonds et les spectres accepteur d&#39;excitation et la distance de travail entre les deux parties doit être de l&#39;ordre de la rayon Förster (5-14 nm en fonction de la paire donneur-accepteur, avec une distance maximale de deux fois le rayon Förster 17). Cette dépendance de la distance limite grandement les types d&#39;événements qui peuvent être observés à l&#39;aide BRET comme un moyen d&#39;améliorer la détection. Récemment, une nouvelle approche a été identifié et démontré sous la fois in vitro et dans des conditions in vivo. Développée à partir de la fondation de BRET, fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) 18, 19 </sup&gt; nécessite également une forte chevauchement spectral entre le luminescent et composants fluorescents. Cependant, contrairement à BRET, le carburant est un processus par lequel complètement radiative du photon émis depuis la source luminescente est absorbée par un fluorophore optiquement accessible, qui émet un photon par la suite déplacée vers le rouge selon le rendement quantique de fluorophore. Akin à BRET, cette approche peut également être utilisée pour surmonter les contraintes de l&#39;imagerie en présence d&#39;absorbeurs optiques. Le décalage vers le rouge résultante fournit une augmentation globale et la spécificité dans le signal détecté en raison d&#39;une diminution de l&#39;atténuation et une réduction des effets de diffraction optiques. FUEL a été signalée entre Escherichia coli bioluminescentes exprimant l&#39;opéron lux et les points quantiques 18, 19. Bien que expérimentalement similaire aux SIQDs, une différence fondamentale existe: en carburant, il n&#39;est pas nécessaire que la source luminescente d&#39;être physiquement lié au fluorophore, ce qui permet for codage génétique de la sonde luminescente. En raison de la détection réussie du carburant entre bactéries luminescentes et des points quantiques, il est possible que cette technique pourrait être appliquée à la fois superficielle (la peau) et les tissus profonds (poumon, foie) des infections telles que Staphylococcus aureus et Klebsiellia pneumoniae. Depuis le rapport de sa signification expérimentale, FUEL a évolué pour inclure un modèle mathématique solide 20 qui peut être utilisé pour prédire luminescent acceptable et paires fluorescentes, et ses applications se sont élargies pour inclure l&#39;utilisation dans l&#39;identification des caractéristiques photophysiques tels que le rendement quantique. Nous décrivons ci-dessous quelques-unes des techniques de base du carburant. Tout d&#39;abord, nous montrons des preuves de ce phénomène tant à court (um) et à long (cm) des distances de travail, qui distingue fondamentalement CARBURANT de BRET. Deuxièmement, nous étendons sur les paires possibles de carburant par l&#39;examen d&#39;une grande variété de fluorophores et de nanoparticules fluorescentes. Third, applications de FUEL sont étudiés en comparant des paires de CARBURANT ciblées et non-ciblées.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) est un processus d&#39;excitation-émission radiative qui produit le signal accrue et l&#39;amélioration de contraste in vitro et in vivo. actions de carburant Beaucoup des mêmes principes de base que le transfert d&#39;énergie de résonance de bioluminescence (BRET), mais diffère grandement dans les distances de travail acceptables entre la source luminescente et l&#39;entité fluorescente. Bien BRET est effectivement limitée à un maximum de 2 fois le rayon de Förster, communément moins de 14 nm, FUEL peut survenir à des distances allant jusqu&#39;à pm ou même cm en l&#39;absence d&#39;un absorbeur optique. Ici, nous étendons sur le fondement et l&#39;applicabilité de carburant en passant en revue les principes pertinents derrière le phénomène et de démontrer sa compatibilité avec une grande variété de fluorophores et de nanoparticules fluorescentes. En outre, l&#39;utilitaire de carburant anticorps ciblé est explorée. Les exemples présentés ici montrent que le carburant peut être utilisé pour applications où BRET n&#39;est pas possible, combler le vide spatial qui existe entre BRET et de l&#39;imagerie traditionnelle de l&#39;animal entier.

Watch this Scientific Journal Video about A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL at JoVE.com

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Extension de la fondation et de l&#39;applicabilité de la fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) en interrogeant les principes pertinents et démontrer sa compatibilité avec une multitude de fluorophores et les conditions d&#39;anticorps ciblés.

A Step Beyond BRET: Fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

a-step-beyond-bret-fluorescence-unbound-excitation-from-luminescence

Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K vues.  Institut Pasteur.  Extension de la fondation et de l'applicabilité de la fluorescence par Unbound excitation de luminescence (FUEL) en interrogeant les principes pertinents et démontrer sa compatibilité avec une multitude de fluorophores et les conditions d'anticorps ciblés. 

Vidéo: A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Thermodynamique du repliement des protéines membranaires mesuré par fluorescence Spectroscopie

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Recherche

Bio-ingénierie

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Imagerie de vie de fluorescence des rotors moléculaires dans les cellules vivantes

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Génération et récupération des cellules β-Sphéroïdes partir de l&#39;étape de croissance peptidiques hydrogels de PEG-

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Haute résolution spatio-temporelle d&#39;analyse de la dynamique des récepteurs par simple molécule microscopie de fluorescence

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

Suivi 3D orbital dans un microscope à deux photons à jour: Une application au suivi des vésicules intracellulaires

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

De Fluorescence Imaging rapide à moléculaire loi Diffusion sur les membranes cellulaires en direct dans un microscope commercial

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingénierie « Golden » Fluorescence par l’Incorporation de la pression sélective d’amino-acides Non canoniques et analyse des protéines par spectrométrie de masse et de Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Fabrication évolutive d’étirable, Dual Channel, puces microfluidiques orgue

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Réalisation de multiples Modes d’imagerie avec un Microscope à Fluorescence

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.