Gli autori desiderano estendere la loro gratitudine per il sostegno finanziario della Fondazione Pasteur di New York (JD, CS, CS), l&#39;EU-FP7 programma &quot;Automation&quot; (SLS), il Programma di Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) e Project Imnos (a RT, SLS), la Fondazione di beneficenza Conny-Maeve (SLS), il Master Europeo in Imaging Molecolare (a IT), i programmi Regione Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) e DimMalInf (SLS, RT), l&#39;ANR Programma Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastrutture Nationales en Biologie-Santé: Francia LifebioImaging (FLI) Francia Vita Imaging (RT, SLS), Francia Bioimmagini (JD, SLS) e il Institut Pasteur di Parigi. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare, José Bengoechea e Herbert Schweizer per i reagenti. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Cindy Fevre che ha generato gli anticorpi.

1. Reagenti <ol><li> Acquisto o sviluppare batteri luminescenti e terreni di coltura appropriati, come modificato Escherichia coli che esprime il ABCDE lux 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Preparare soluzione fisiologica (0.9% NaCl) e soluzioni di coltura dei media secondo le ricette standard. E. coli e K. pneumoniae sono state coltivate in Luria Bertani (LB) a 37 ° C, e V. fischeri e Photobacterium sp in LB integrate con 0,5 M NaCl a 22 ° C. </li><li> Acquistare o acquisire sonde fluorescenti come Q-tracker 705 (40 nm di diametro, denominato QD705), Q-tracker 800 (40 nm di diametro, denominato QD800), fluorescente (diametro 40 nm) e microsfere di polistirene non fluorescenti ( 48 nm di diametro), e coloranti fluorescenti convenzionali. </li><li> Preparare i reagenti necessari per l&#39;etichettatura batterica. </li><li> Garantire l&#39;accesso allaun intero imager bioluminescenza animale, come un IVIS Spectrum, che è in grado di rilevare il segnale in un&#39;ampia gamma di lunghezze d&#39;onda di emissione e tempi di esposizione. Un lettore di micropiastre in grado di misurazioni bioluminescenza sarà sufficiente per la maggior parte degli esperimenti qui descritti. </li></ol> 2. Riepilogo base di FUEL <ol><li> A partire dalle colonie individuali su piastre di coltura standard, avviare colture durante la notte di batteri luminescenti. Qui, V. sono stati utilizzati fischeri. </li><li> Il giorno di sperimentazione, avviare sottoculture freschi e permettere loro di progredire fino a raggiungere un diametro esterno 600 di 1-1,5. Per produrre risultati comparabili è meglio usare batteri negli stati di crescita simili in cui si producono segnali intensi. Questo può essere assicurata mantenendo la OD 600 costante. </li><li> Combinare aliquote di 100 microlitri da ogni sia con 5 ml di QD705 o soluzione salina fisiologica (PS), e poi aggiungere a 895 ml di PS in standaCuvette rd spettroscopiche. Mettere le cuvette riempiti nel IVIS Spectrum e prendere le misure sotto gli appositi set di filtri. Qui, è stato utilizzato il filtro di emissione 710-730 nm. </li></ol> 3. FUEL Oltre distanze variabili <ol><li> Riempire due volume ridotto (1 ml) cuvette fotometriche di plastica sia con 50 ml di QD705 o 97,2 ml di non fluorescenti 48 nm microsfere di polistirolo in un volume totale di 1 ml PS. Questo garantisce simile superficie solida per volume totale tra le due entità. </li><li> Preparare una cuvetta sorgente luminosa racchiudendo una terza cuvetta con nastro nero standard o qualche altro materiale opaco capace di bloccare la luce. Preparare accuratamente due finestre ottiche identiche sui lati opposti della cuvetta. </li><li> Collocare le cuvette precedentemente riempiti direttamente su entrambi i lati della cuvetta sorgente luminosa. Aggiungere una aliquota 1 ml di V. cultura fischeri o altro (cioè luminescenti E. coli o Photobacterium sp) da una subcultura fresche nella cuvetta sorgente luminosa e coprire con un materiale opaco, come carta nera per ridurre qualsiasi contaminazione luce. </li><li> Visualizzare i tre cuvette sotto i filtri di emissione adeguate come la luce totale e 710-730 filtri di emissione nm, con tempi di esposizione di 10, 30 e 30 secondi rispettivamente. </li><li> Riposizionare entrambe le cuvette esterni a distanze maggiori equivalenti dal cuvetta centrale, e quindi visualizza di nuovo. Ripetere l&#39;operazione fino ad ottenere una distanza finale faccia-a-faccia (centrale a volume ridotto cuvetta) di 3cm. Ad ogni passo, acquisire una immagine di fluorescenza (450-480 nm di eccitazione, 710-730 nm di emissione) per convalidare la posizione QD705. </li></ol> 4. Indagare coppie CARBURANTE potenziali <ol><li> Riempire due cuvette volume ridotto con soluzioni 1 ml contenenti sia un fluoroforo o una nanoparticella fluorescente di interesse in una, e PS o PS con nanoparticelle non fluorescenti come controllo negativo nell&#39;altro. In the lavoro ha dimostrato qui, una serie di potenziali fluorofori carburante disponibile in commercio e nanoparticelle fluorescenti sono stati studiati come indicato nella Tabella 1. </li><li> Aggiungere un&#39;aliquota 1 ml di V. fresco fischeri o altri batteri luminescenti ad un terzo cuvetta oscurati contenente due finestre ottiche fisicamente uguali situati da parti opposte. Coprire la cuvetta con una sostanza opaca come un pezzo di carta nera. </li><li> In un luogo distanza breve ma uguali i due cuvette volume ridotto su entrambi i lati della vaschetta black-out e visualizzare sotto i filtri appropriati. Qui, è stata utilizzata una distanza di 0,7 cm. Ripetere con gli altri fluorofori. </li></ol> 5. FUEL mirata <ol><li> Preparare anticorpi biotinilati specifici ai batteri luminescenti. Ad esempio, gli anticorpi primari specifici qui per K. pneumoniae (α-Kp) sono stati biotinilato utilizzando una soluzione contenente EZ-Link solfo-NHS-LC-biotina. </li&gt; <li> Rimuovere l&#39;eccesso di reagente da anticorpi utilizzando colonne dissalazione sotto centrifugazione (1500 xg) per 2 minuti. </li><li> Utilizzare un saggio standard di Bradford per determinare la concentrazione di proteine ​​e determinare il grado di anticorpo biotinylation mediante saggio HABA. </li><li> Ottenere l&#39;anticorpo biotinilato α-Kp-Biot (AB) lotti miscelando 100 microlitri (10 mM, disciolto in PBS 1x) con 40 microlitri di anticorpo α-Kp, risultando in un grado finale di sostituzione di 16 residui biotina per Ab e una finale concentrazione proteica di 10 mg ml -1. </li><li> Utilizzando aerei durante la notte replicare culture, bersaglio i batteri lavati con gli anticorpi di cui sopra seguenti il ​​protocollo appropriato. <ol><li> In particolare, lavare il K. pneumoniae in 1x PBS e risospendere in 1x PBS ad un diametro esterno di 4 (ca. 4 x 10 8 CFU ml -1 OD -1). </li><li> Per ogni replica, incubare 100 microlitri di PBS, α -Anticorpi kp (10 microlitri α-Kp-biotB o 10 microlitri di PBS per il controllo) e 100 cellule microlitri per 90 min a 30 ° C. Lavare le cellule tre volte in 1x PBS e risospendere in 196 microlitri di PBS. </li></ol></li><li> Etichettare le cellule con il coniugato QD705 streptavidina e dividerli in due volumi equivalenti. </li><li> Lavare un&#39;unica soluzione tre volte e poi risospendere in volume appropriato. </li><li> Distribuire 100 ml di soluzioni lavate e non lavate in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti nero. Misurare la luminescenza risultante con la luce totale, 490-510 nm e 710-730 nm filtri. Concentrazione fluoroforo può essere determinata utilizzando 450-480 nm di eccitazione e di emissione 710-730 nm. </li></ol>

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Gli autori dichiarano concorrenti interessi finanziari. JD, SB, KLR e SLS contribuito a EP10290158.4 europeo dei brevetti e la World Intellectual Property Organization domanda di brevetto WO/2011/117847.

La manifestazione fondamentale del carburante può essere realizzato semplicemente mescolando batteri luminescenti con nanoparticelle fluorescenti o QD. Le due entità saranno fisicamente separati e restano là di ogni efficiente distanza RET. Più difficile è l&#39;ottimizzazione del segnale FUEL sia in vitro che in vivo. In condizioni in vitro, con e senza un assorbitore ottico presenti, di solito l&#39;aggiunta di un eccesso di fluoroforo sarà sufficiente a massimizzare la risposta del combustibile. Tuttavia, a concentrazioni elevate fenomeni come quenching statico o collisione può portare ad una perdita di segnale fluorescente. L&#39;esecuzione di una serie di diluizioni variando autonomamente la concentrazione della sorgente luminescente e il fluoroforo aiuterà ad ottimizzare le concentrazioni desiderate. La creazione e l&#39;ottimizzazione di carburante in concentrazioni vivo è molto più difficile e deve essere affrontato caso per caso. Può essere difficile creare un condition dove l&#39;entità fluorescente può essere letta otticamente dalla sorgente luminescente. In quanto tale, a cominciare da co-iniezioni dirette delle due frazioni in grado di fornire informazioni riguardanti il ​​successo di FUEL in condizioni ottimali. Esistono protocolli standard per i batteri di etichettatura e cellule eucariotiche con entità fluorescenti come la serie Alexa e QD. Spesso questo richiede funzionalizzazione superficiale o attivazione con anticorpi, che può portare ad effetti indesiderati come la vitalità cellulare ridotta o attività metabolica alterata. Per ovviare a questo, è importante determinare la quantità ottimale di anticorpo o l&#39;agente di attivazione necessario che minimizza perturbazioni cellulari massimizzando la marcatura fluorescente. L&#39;uso di QD è vantaggioso a causa della loro caratteristicamente ampio spettro di eccitazione, spettri di emissione stretta e sintonizzabile, e la possibilità di un grande spostamento di Stokes. Tuttavia, QD possono essere citotossici e non possono essere desiderabile in alcuni casi. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; CARBURANTE è un fenomeno che è presente in molti esperimenti BRET 13 ed è applicabile ad una varietà di fonti luminescenti e fluorescenti. Fino ad ora, i fotoni derivanti da CARBURANTE sono stati considerati il ​​prodotto di interazioni non specifiche o un segnale di fondo sfortunato risultanti da esperimenti BRET mal progettati. E &#39;solo con il tipo di esperimenti hanno dimostrato qui che siamo stati in grado di identificare l&#39;utilità di questo segnale non desiderato. Negli esempi illustrati, i batteri luminescenti agiscono come fonte di eccitazione diffusa in grado di suscitare una risposta fluorescente standard da una grande varietà di entità fluorescenti. Inoltre, a causa della notevole distanza di lavoro, è lecito concludere che mentre il carburante può essere costruito senza il verificarsi di BRET, in BRET generale, non può essere osservato senza il contributo di FUEL. È importante sottolineare che, a causa della mancanza di un requisito di targeting, carburante può essere utilizzata per coprire il gap spaziale esistente tra BRET ectecniche di imaging intero animale onventional.

La modificazione genetica degli organismi, quali virus 1, 2, 3, batteri o piccoli mammiferi 4 a uno indurre o bioluminescenza costitutivamente espresso, ha avuto molto successo ed ampiamente dimostrata 5-7. Bioluminescenza, una reazione chemiluminescente in vivo coinvolge reagenti presenti naturalmente, ha il vantaggio di produrre luce senza la necessità di una fonte di luce esterna. Come tale, l&#39;imaging bioluminescente non soffre degli inconvenienti comuni di segnale-auto e non specifico trovati da imaging di fluorescenza 8. Di conseguenza, bioluminescenza ha un significativo rapporto segnale-rumore in quanto qualsiasi segnale rilevato proviene esclusivamente dalla sorgente destinata. Mentre molti modelli hanno sfruttato l&#39;operone lux da luminescens Photorhabdus (massimo di emissione centrato tra 480 e 490 nm) in vitro e in vivo applicazioni 9, il suo uso in piccola mammals è problematico a causa della natura stessa delle condizioni di imaging; l&#39;esistenza pervade di assorbitori ottici, come emoglobina e agenti di dispersione, come tessuti e ossa, influisce fortemente blu a lunghezze d&#39;onda giallo 3. L&#39;espressione di una lucciola luciferasi allestita (massimo di emissione a 617 nm), è stato recentemente sviluppato e integrato, fornendo uno strumento che supera notevolmente l&#39;assorbimento ottico 10, ma è ancora soggetto ad effetti di scattering. In risposta, ci sono stati diversi tentativi di red-shift del segnale emesso nella finestra ottica desiderata di 650-900 nm, una regione di assorbimento ridotto al minimo e dispersione, utilizzando la risonanza bioluminescenza trasferimento di energia (BRET) 11-13. Come strumento per migliorare la rilevazione del segnale, BRET, che utilizza una sorgente bioluminescente come donatore e un fluoroforo aggiunto come accettore, ha trovato un successo limitato. Come un esempio fondamentale di questo fenomeno, &quot;punti quantici auto-illuminante4; (SIQDs) 14 costituiti modificato Renilla reniformis luciferases legati allo strato di polimero-lisina esterno punti di commercialmente disponibile quantici (QD). Su substrato Inoltre, la reazione di bioluminescenza risultante induce l&#39;emissione di fluorescenza dai QD, generando una significativa produzione di fotoni rossi. Tuttavia, questi SIQDs hanno limitato l&#39;applicabilità di visualizzazione in vivo di eventi fisiologicamente rilevanti. Questa limitata applicabilità è probabilmente dovuto alla difficoltà di collegare la sonda doppia all&#39;organo, cella o gene di interesse, poiché i SIQDs non possono essere geneticamente codificati e richiedere pertanto una modifica secondario del guscio di polimero. Per migliorare la loro applicabilità, SIQDs alternativi, dove i luciferasi sono tenuti direttamente al core luminescenti, recentemente sono stati impiegati 15. Costruendo fuori del concetto SIQD, un sistema di BRET più applicabile stata ottenuta collegando Cypridina luciferasi in undocyanine tintura 16, che era specificamente diretta tumori nei topi mentre produce un cambiamento sostanziale rosso da 460 nm a 675 nm. Per sottoporsi trasferimento di energia non radiativo, BRET segue gli stessi vincoli primari come la sua controparte fluorescente: ci deve essere una forte sovrapposizione spettrale tra l&#39;emissione del donatore e l&#39;accettore spettri di eccitazione e la distanza di lavoro tra le due porzioni devono essere dell&#39;ordine del raggio Förster (5-14 nm a seconda della coppia donatore-accettore, con un efficace distanza massima pari al doppio del raggio Förster 17). Questa dipendenza distanza limita notevolmente le tipologie di eventi che possono essere osservati con BRET come un mezzo per migliorare il rilevamento. Recentemente un nuovo approccio è stato identificato e dimostrato sotto sia in vitro che in condizioni in vivo. Costruire fuori la fondazione di BRET, Fluorescenza da Unbound eccitazione di luminescenza (FUEL) 18, 19 </sup&gt; richiede anche una forte sovrapposizione spettrale tra l&#39;luminescenti e componenti fluorescenti. Tuttavia, a differenza di BRET, CARBURANTE è un processo completamente radiativo cui il fotone emesso dalla sorgente luminescente viene assorbito da un fluoroforo otticamente accessibili, che emette successivamente un fotone rosso-spostato secondo la resa quantica fluoroforo. Simile a BRET, questo approccio può essere utilizzato anche per superare i vincoli dell&#39;imaging in presenza di assorbitori ottici. Il conseguente spostamento verso il rosso fornisce un aumento globale e specificità nel segnale rilevato a causa di una diminuzione di attenuazione e una riduzione degli effetti di scattering ottici. FUEL è stato riscontrato tra bioluminescenti Escherichia coli che esprimono l&#39;operone lux e QD 18, 19. Mentre sperimentalmente simile alle SIQDs, esiste una differenza fondamentale: nel carburante, non è necessario per la sorgente luminescente di essere fisicamente legato al fluoroforo, che permette for codifica genetica della sonda luminescente. A causa della rilevazione di successo CARBURANTE tra batteri luminescenti e QD, è possibile che questa tecnica può essere applicata sia superficiale (pelle) e dei tessuti profondi (polmone, fegato) infezioni come Staphylococcus aureus e Klebsiellia pneumoniae. Dalla relazione del suo significato sperimentale, CARBURANTE è evoluto per includere un modello matematico robusto 20 che può essere utilizzato per prevedere luminescente accettabile e coppie fluorescenti, e le sue applicazioni sono estese e comprendono l&#39;utilizzo in identificazione delle caratteristiche fotofisiche come resa quantica. Descriviamo qui di seguito alcune delle tecniche di base di FUEL. In primo luogo, vi mostriamo le prove di questo fenomeno sia su breve (micron) e lunga (cm) distanze di lavoro, che distingue fondamentalmente carburante dal BRET. In secondo luogo, ci espandiamo sulle possibili coppie COMBUSTIBILE esaminando una vasta gamma di fluorofori e nanoparticelle fluorescenti. Third, applicazioni carburante sono indagato confrontando coppie COMBUSTIBILE mirati e non mirati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) è un processo di eccitazione-emissione radiativa che produce un aumento del segnale e contrast enhancement in vitro e in vivo. Condivide COMBUSTIBILE molti dei principi sottesi al trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET), ma differiscono notevolmente nelle distanze di lavoro accettabili tra la sorgente luminescenti e l&#39;entità fluorescente. Mentre BRET è efficacemente limitato ad un massimo di 2 volte il raggio Förster, comunemente inferiore a 14 nm, CARBURANTE può verificarsi a distanze fino a pm o addirittura cm in assenza di un assorbitore ottico. Qui ci espandiamo sul fondamento e l&#39;applicabilità di FUEL rivedendo pertinenti principi alla base del fenomeno e dimostrare la sua compatibilità con una vasta gamma di fluorofori e nanoparticelle fluorescenti. Inoltre, l&#39;utilità di FUEL anticorpo mirato è esplorato. Gli esempi qui riportati forniscono la prova che il carburante può essere utilizzato per applICATIONS dove BRET non è possibile, riempiendo il vuoto spaziale che esiste tra Bret e tradizionale complesso di imaging animali.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Ampliare la fondazione e l&#39;applicabilità di fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) attraverso la rilevazione dei principi rilevanti e dimostrando la sua compatibilità con un gran numero di fluorofori e condizioni di anticorpi mirati.

A Step Beyond BRET: Fluorescenza da Unbound eccitazione di luminescenza (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K Views.  Institut Pasteur.  Ampliare la fondazione e l'applicabilità di fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) attraverso la rilevazione dei principi rilevanti e dimostrando la sua compatibilità con un gran numero di fluorofori e condizioni di anticorpi mirati. 