Gli autori desiderano estendere la loro gratitudine per il sostegno finanziario della Fondazione Pasteur di New York (JD, CS, CS), l&#39;EU-FP7 programma &quot;Automation&quot; (SLS), il Programma di Carnot Institut 11 (JD, AH , AR, RT, SLS) e Project Imnos (a RT, SLS), la Fondazione di beneficenza Conny-Maeve (SLS), il Master Europeo in Imaging Molecolare (a IT), i programmi Regione Ile de France MODEXA (SLS), SESAME (SLS) e DimMalInf (SLS, RT), l&#39;ANR Programma Grandes Investissement de l&#39;avenir Infrastrutture Nationales en Biologie-Santé: Francia LifebioImaging (FLI) Francia Vita Imaging (RT, SLS), Francia Bioimmagini (JD, SLS) e il Institut Pasteur di Parigi. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare, José Bengoechea e Herbert Schweizer per i reagenti. Inoltre, gli autori desiderano ringraziare Cindy Fevre che ha generato gli anticorpi.

1. Reagenti <ol><li> Acquisto o sviluppare batteri luminescenti e terreni di coltura appropriati, come modificato Escherichia coli che esprime il ABCDE lux 21, Vibrio fischeri, Photobacterium sp. Klebsiella pneumoniae 22. </li><li> Preparare soluzione fisiologica (0.9% NaCl) e soluzioni di coltura dei media secondo le ricette standard. E. coli e K. pneumoniae sono state coltivate in Luria Bertani (LB) a 37 ° C, e V. fischeri e Photobacterium sp in LB integrate con 0,5 M NaCl a 22 ° C. </li><li> Acquistare o acquisire sonde fluorescenti come Q-tracker 705 (40 nm di diametro, denominato QD705), Q-tracker 800 (40 nm di diametro, denominato QD800), fluorescente (diametro 40 nm) e microsfere di polistirene non fluorescenti ( 48 nm di diametro), e coloranti fluorescenti convenzionali. </li><li> Preparare i reagenti necessari per l&#39;etichettatura batterica. </li><li> Garantire l&#39;accesso allaun intero imager bioluminescenza animale, come un IVIS Spectrum, che è in grado di rilevare il segnale in un&#39;ampia gamma di lunghezze d&#39;onda di emissione e tempi di esposizione. Un lettore di micropiastre in grado di misurazioni bioluminescenza sarà sufficiente per la maggior parte degli esperimenti qui descritti. </li></ol> 2. Riepilogo base di FUEL <ol><li> A partire dalle colonie individuali su piastre di coltura standard, avviare colture durante la notte di batteri luminescenti. Qui, V. sono stati utilizzati fischeri. </li><li> Il giorno di sperimentazione, avviare sottoculture freschi e permettere loro di progredire fino a raggiungere un diametro esterno 600 di 1-1,5. Per produrre risultati comparabili è meglio usare batteri negli stati di crescita simili in cui si producono segnali intensi. Questo può essere assicurata mantenendo la OD 600 costante. </li><li> Combinare aliquote di 100 microlitri da ogni sia con 5 ml di QD705 o soluzione salina fisiologica (PS), e poi aggiungere a 895 ml di PS in standaCuvette rd spettroscopiche. Mettere le cuvette riempiti nel IVIS Spectrum e prendere le misure sotto gli appositi set di filtri. Qui, è stato utilizzato il filtro di emissione 710-730 nm. </li></ol> 3. FUEL Oltre distanze variabili <ol><li> Riempire due volume ridotto (1 ml) cuvette fotometriche di plastica sia con 50 ml di QD705 o 97,2 ml di non fluorescenti 48 nm microsfere di polistirolo in un volume totale di 1 ml PS. Questo garantisce simile superficie solida per volume totale tra le due entità. </li><li> Preparare una cuvetta sorgente luminosa racchiudendo una terza cuvetta con nastro nero standard o qualche altro materiale opaco capace di bloccare la luce. Preparare accuratamente due finestre ottiche identiche sui lati opposti della cuvetta. </li><li> Collocare le cuvette precedentemente riempiti direttamente su entrambi i lati della cuvetta sorgente luminosa. Aggiungere una aliquota 1 ml di V. cultura fischeri o altro (cioè luminescenti E. coli o Photobacterium sp) da una subcultura fresche nella cuvetta sorgente luminosa e coprire con un materiale opaco, come carta nera per ridurre qualsiasi contaminazione luce. </li><li> Visualizzare i tre cuvette sotto i filtri di emissione adeguate come la luce totale e 710-730 filtri di emissione nm, con tempi di esposizione di 10, 30 e 30 secondi rispettivamente. </li><li> Riposizionare entrambe le cuvette esterni a distanze maggiori equivalenti dal cuvetta centrale, e quindi visualizza di nuovo. Ripetere l&#39;operazione fino ad ottenere una distanza finale faccia-a-faccia (centrale a volume ridotto cuvetta) di 3cm. Ad ogni passo, acquisire una immagine di fluorescenza (450-480 nm di eccitazione, 710-730 nm di emissione) per convalidare la posizione QD705. </li></ol> 4. Indagare coppie CARBURANTE potenziali <ol><li> Riempire due cuvette volume ridotto con soluzioni 1 ml contenenti sia un fluoroforo o una nanoparticella fluorescente di interesse in una, e PS o PS con nanoparticelle non fluorescenti come controllo negativo nell&#39;altro. In the lavoro ha dimostrato qui, una serie di potenziali fluorofori carburante disponibile in commercio e nanoparticelle fluorescenti sono stati studiati come indicato nella Tabella 1. </li><li> Aggiungere un&#39;aliquota 1 ml di V. fresco fischeri o altri batteri luminescenti ad un terzo cuvetta oscurati contenente due finestre ottiche fisicamente uguali situati da parti opposte. Coprire la cuvetta con una sostanza opaca come un pezzo di carta nera. </li><li> In un luogo distanza breve ma uguali i due cuvette volume ridotto su entrambi i lati della vaschetta black-out e visualizzare sotto i filtri appropriati. Qui, è stata utilizzata una distanza di 0,7 cm. Ripetere con gli altri fluorofori. </li></ol> 5. FUEL mirata <ol><li> Preparare anticorpi biotinilati specifici ai batteri luminescenti. Ad esempio, gli anticorpi primari specifici qui per K. pneumoniae (α-Kp) sono stati biotinilato utilizzando una soluzione contenente EZ-Link solfo-NHS-LC-biotina. </li&gt; <li> Rimuovere l&#39;eccesso di reagente da anticorpi utilizzando colonne dissalazione sotto centrifugazione (1500 xg) per 2 minuti. </li><li> Utilizzare un saggio standard di Bradford per determinare la concentrazione di proteine ​​e determinare il grado di anticorpo biotinylation mediante saggio HABA. </li><li> Ottenere l&#39;anticorpo biotinilato α-Kp-Biot (AB) lotti miscelando 100 microlitri (10 mM, disciolto in PBS 1x) con 40 microlitri di anticorpo α-Kp, risultando in un grado finale di sostituzione di 16 residui biotina per Ab e una finale concentrazione proteica di 10 mg ml -1. </li><li> Utilizzando aerei durante la notte replicare culture, bersaglio i batteri lavati con gli anticorpi di cui sopra seguenti il ​​protocollo appropriato. <ol><li> In particolare, lavare il K. pneumoniae in 1x PBS e risospendere in 1x PBS ad un diametro esterno di 4 (ca. 4 x 10 8 CFU ml -1 OD -1). </li><li> Per ogni replica, incubare 100 microlitri di PBS, α -Anticorpi kp (10 microlitri α-Kp-biotB o 10 microlitri di PBS per il controllo) e 100 cellule microlitri per 90 min a 30 ° C. Lavare le cellule tre volte in 1x PBS e risospendere in 196 microlitri di PBS. </li></ol></li><li> Etichettare le cellule con il coniugato QD705 streptavidina e dividerli in due volumi equivalenti. </li><li> Lavare un&#39;unica soluzione tre volte e poi risospendere in volume appropriato. </li><li> Distribuire 100 ml di soluzioni lavate e non lavate in singoli pozzetti di una piastra a 96 pozzetti nero. Misurare la luminescenza risultante con la luce totale, 490-510 nm e 710-730 nm filtri. Concentrazione fluoroforo può essere determinata utilizzando 450-480 nm di eccitazione e di emissione 710-730 nm. </li></ol>

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Gli autori dichiarano concorrenti interessi finanziari. JD, SB, KLR e SLS contribuito a EP10290158.4 europeo dei brevetti e la World Intellectual Property Organization domanda di brevetto WO/2011/117847.

La manifestazione fondamentale del carburante può essere realizzato semplicemente mescolando batteri luminescenti con nanoparticelle fluorescenti o QD. Le due entità saranno fisicamente separati e restano là di ogni efficiente distanza RET. Più difficile è l&#39;ottimizzazione del segnale FUEL sia in vitro che in vivo. In condizioni in vitro, con e senza un assorbitore ottico presenti, di solito l&#39;aggiunta di un eccesso di fluoroforo sarà sufficiente a massimizzare la risposta del combustibile. Tuttavia, a concentrazioni elevate fenomeni come quenching statico o collisione può portare ad una perdita di segnale fluorescente. L&#39;esecuzione di una serie di diluizioni variando autonomamente la concentrazione della sorgente luminescente e il fluoroforo aiuterà ad ottimizzare le concentrazioni desiderate. La creazione e l&#39;ottimizzazione di carburante in concentrazioni vivo è molto più difficile e deve essere affrontato caso per caso. Può essere difficile creare un condition dove l&#39;entità fluorescente può essere letta otticamente dalla sorgente luminescente. In quanto tale, a cominciare da co-iniezioni dirette delle due frazioni in grado di fornire informazioni riguardanti il ​​successo di FUEL in condizioni ottimali. Esistono protocolli standard per i batteri di etichettatura e cellule eucariotiche con entità fluorescenti come la serie Alexa e QD. Spesso questo richiede funzionalizzazione superficiale o attivazione con anticorpi, che può portare ad effetti indesiderati come la vitalità cellulare ridotta o attività metabolica alterata. Per ovviare a questo, è importante determinare la quantità ottimale di anticorpo o l&#39;agente di attivazione necessario che minimizza perturbazioni cellulari massimizzando la marcatura fluorescente. L&#39;uso di QD è vantaggioso a causa della loro caratteristicamente ampio spettro di eccitazione, spettri di emissione stretta e sintonizzabile, e la possibilità di un grande spostamento di Stokes. Tuttavia, QD possono essere citotossici e non possono essere desiderabile in alcuni casi. <pclass = &quot;jove_content&quot;&gt; CARBURANTE è un fenomeno che è presente in molti esperimenti BRET 13 ed è applicabile ad una varietà di fonti luminescenti e fluorescenti. Fino ad ora, i fotoni derivanti da CARBURANTE sono stati considerati il ​​prodotto di interazioni non specifiche o un segnale di fondo sfortunato risultanti da esperimenti BRET mal progettati. E &#39;solo con il tipo di esperimenti hanno dimostrato qui che siamo stati in grado di identificare l&#39;utilità di questo segnale non desiderato. Negli esempi illustrati, i batteri luminescenti agiscono come fonte di eccitazione diffusa in grado di suscitare una risposta fluorescente standard da una grande varietà di entità fluorescenti. Inoltre, a causa della notevole distanza di lavoro, è lecito concludere che mentre il carburante può essere costruito senza il verificarsi di BRET, in BRET generale, non può essere osservato senza il contributo di FUEL. È importante sottolineare che, a causa della mancanza di un requisito di targeting, carburante può essere utilizzata per coprire il gap spaziale esistente tra BRET ectecniche di imaging intero animale onventional.

La modificazione genetica degli organismi, quali virus 1, 2, 3, batteri o piccoli mammiferi 4 a uno indurre o bioluminescenza costitutivamente espresso, ha avuto molto successo ed ampiamente dimostrata 5-7. Bioluminescenza, una reazione chemiluminescente in vivo coinvolge reagenti presenti naturalmente, ha il vantaggio di produrre luce senza la necessità di una fonte di luce esterna. Come tale, l&#39;imaging bioluminescente non soffre degli inconvenienti comuni di segnale-auto e non specifico trovati da imaging di fluorescenza 8. Di conseguenza, bioluminescenza ha un significativo rapporto segnale-rumore in quanto qualsiasi segnale rilevato proviene esclusivamente dalla sorgente destinata. Mentre molti modelli hanno sfruttato l&#39;operone lux da luminescens Photorhabdus (massimo di emissione centrato tra 480 e 490 nm) in vitro e in vivo applicazioni 9, il suo uso in piccola mammals è problematico a causa della natura stessa delle condizioni di imaging; l&#39;esistenza pervade di assorbitori ottici, come emoglobina e agenti di dispersione, come tessuti e ossa, influisce fortemente blu a lunghezze d&#39;onda giallo 3. L&#39;espressione di una lucciola luciferasi allestita (massimo di emissione a 617 nm), è stato recentemente sviluppato e integrato, fornendo uno strumento che supera notevolmente l&#39;assorbimento ottico 10, ma è ancora soggetto ad effetti di scattering. In risposta, ci sono stati diversi tentativi di red-shift del segnale emesso nella finestra ottica desiderata di 650-900 nm, una regione di assorbimento ridotto al minimo e dispersione, utilizzando la risonanza bioluminescenza trasferimento di energia (BRET) 11-13. Come strumento per migliorare la rilevazione del segnale, BRET, che utilizza una sorgente bioluminescente come donatore e un fluoroforo aggiunto come accettore, ha trovato un successo limitato. Come un esempio fondamentale di questo fenomeno, &quot;punti quantici auto-illuminante4; (SIQDs) 14 costituiti modificato Renilla reniformis luciferases legati allo strato di polimero-lisina esterno punti di commercialmente disponibile quantici (QD). Su substrato Inoltre, la reazione di bioluminescenza risultante induce l&#39;emissione di fluorescenza dai QD, generando una significativa produzione di fotoni rossi. Tuttavia, questi SIQDs hanno limitato l&#39;applicabilità di visualizzazione in vivo di eventi fisiologicamente rilevanti. Questa limitata applicabilità è probabilmente dovuto alla difficoltà di collegare la sonda doppia all&#39;organo, cella o gene di interesse, poiché i SIQDs non possono essere geneticamente codificati e richiedere pertanto una modifica secondario del guscio di polimero. Per migliorare la loro applicabilità, SIQDs alternativi, dove i luciferasi sono tenuti direttamente al core luminescenti, recentemente sono stati impiegati 15. Costruendo fuori del concetto SIQD, un sistema di BRET più applicabile stata ottenuta collegando Cypridina luciferasi in undocyanine tintura 16, che era specificamente diretta tumori nei topi mentre produce un cambiamento sostanziale rosso da 460 nm a 675 nm. Per sottoporsi trasferimento di energia non radiativo, BRET segue gli stessi vincoli primari come la sua controparte fluorescente: ci deve essere una forte sovrapposizione spettrale tra l&#39;emissione del donatore e l&#39;accettore spettri di eccitazione e la distanza di lavoro tra le due porzioni devono essere dell&#39;ordine del raggio Förster (5-14 nm a seconda della coppia donatore-accettore, con un efficace distanza massima pari al doppio del raggio Förster 17). Questa dipendenza distanza limita notevolmente le tipologie di eventi che possono essere osservati con BRET come un mezzo per migliorare il rilevamento. Recentemente un nuovo approccio è stato identificato e dimostrato sotto sia in vitro che in condizioni in vivo. Costruire fuori la fondazione di BRET, Fluorescenza da Unbound eccitazione di luminescenza (FUEL) 18, 19 </sup&gt; richiede anche una forte sovrapposizione spettrale tra l&#39;luminescenti e componenti fluorescenti. Tuttavia, a differenza di BRET, CARBURANTE è un processo completamente radiativo cui il fotone emesso dalla sorgente luminescente viene assorbito da un fluoroforo otticamente accessibili, che emette successivamente un fotone rosso-spostato secondo la resa quantica fluoroforo. Simile a BRET, questo approccio può essere utilizzato anche per superare i vincoli dell&#39;imaging in presenza di assorbitori ottici. Il conseguente spostamento verso il rosso fornisce un aumento globale e specificità nel segnale rilevato a causa di una diminuzione di attenuazione e una riduzione degli effetti di scattering ottici. FUEL è stato riscontrato tra bioluminescenti Escherichia coli che esprimono l&#39;operone lux e QD 18, 19. Mentre sperimentalmente simile alle SIQDs, esiste una differenza fondamentale: nel carburante, non è necessario per la sorgente luminescente di essere fisicamente legato al fluoroforo, che permette for codifica genetica della sonda luminescente. A causa della rilevazione di successo CARBURANTE tra batteri luminescenti e QD, è possibile che questa tecnica può essere applicata sia superficiale (pelle) e dei tessuti profondi (polmone, fegato) infezioni come Staphylococcus aureus e Klebsiellia pneumoniae. Dalla relazione del suo significato sperimentale, CARBURANTE è evoluto per includere un modello matematico robusto 20 che può essere utilizzato per prevedere luminescente accettabile e coppie fluorescenti, e le sue applicazioni sono estese e comprendono l&#39;utilizzo in identificazione delle caratteristiche fotofisiche come resa quantica. Descriviamo qui di seguito alcune delle tecniche di base di FUEL. In primo luogo, vi mostriamo le prove di questo fenomeno sia su breve (micron) e lunga (cm) distanze di lavoro, che distingue fondamentalmente carburante dal BRET. In secondo luogo, ci espandiamo sulle possibili coppie COMBUSTIBILE esaminando una vasta gamma di fluorofori e nanoparticelle fluorescenti. Third, applicazioni carburante sono indagato confrontando coppie COMBUSTIBILE mirati e non mirati.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" style="width:764px;" width="764">
	<colgroup>
		<col />
		<col />
		<col />
		<col />
	</colgroup>
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:175px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:167px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td colspan="2" height="21" style="height:21px;">Escherichia coli expressing the luxABCDE operon&#160;</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>kindly provided by Jos&#233; A. Bengoechea with permission from Herbert P. Schweizer</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Klebsiella pneumoniae 52145&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>52145 is a serotype K2 reference strain</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Luria Bertani (LB)&#160;</td>
			<td style="width:175px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>standard growth media</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Q-Tracker 705&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21061MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Q-Tracker 800</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>Q21071MP</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 555</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21381</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 568</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S11226</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 633</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21375</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Alexa 700</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">S21383</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Non-fluorescent microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Polysciences, Inc</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15913</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Pink microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td>F8887</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">yellow microspheres</td>
			<td style="width:175px;">Life Sciences</td>
			<td style="width:119px;">F8888</td>
			<td>40nm diameter</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Ivis Spectrum</td>
			<td style="width:175px;">PerkinElmer</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">EZ-Link Sulfo-NHS-LC-Biotin</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Zeba Spin Desalting Columns 7K MWCO</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">21425</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">HABA assay kit&#160;</td>
			<td style="width:175px;">Thermo Scientific Pierce</td>
			<td align="right">28005</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:304px;">Bradford assay</td>
			<td style="width:175px;">Bio-Rad</td>
			<td>500-0201</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a step beyond bret: fluorescence by unbound excitation from luminescence (fuel)

Fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) è un processo di eccitazione-emissione radiativa che produce un aumento del segnale e contrast enhancement in vitro e in vivo. Condivide COMBUSTIBILE molti dei principi sottesi al trasferimento bioluminescenza Resonance Energy (BRET), ma differiscono notevolmente nelle distanze di lavoro accettabili tra la sorgente luminescenti e l&#39;entità fluorescente. Mentre BRET è efficacemente limitato ad un massimo di 2 volte il raggio Förster, comunemente inferiore a 14 nm, CARBURANTE può verificarsi a distanze fino a pm o addirittura cm in assenza di un assorbitore ottico. Qui ci espandiamo sul fondamento e l&#39;applicabilità di FUEL rivedendo pertinenti principi alla base del fenomeno e dimostrare la sua compatibilità con una vasta gamma di fluorofori e nanoparticelle fluorescenti. Inoltre, l&#39;utilità di FUEL anticorpo mirato è esplorato. Gli esempi qui riportati forniscono la prova che il carburante può essere utilizzato per applICATIONS dove BRET non è possibile, riempiendo il vuoto spaziale che esiste tra Bret e tradizionale complesso di imaging animali.

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A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Ampliare la fondazione e l&#39;applicabilità di fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) attraverso la rilevazione dei principi rilevanti e dimostrando la sua compatibilità con un gran numero di fluorofori e condizioni di anticorpi mirati.

A Step Beyond BRET: Fluorescenza da Unbound eccitazione di luminescenza (FUEL)

Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL) is a radiative excitation-emission process that produces increased signal and contrast ...

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Research

JoVE Journal

Bioengineering

A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence (FUEL)

11.5K Views.  Institut Pasteur.  Ampliare la fondazione e l'applicabilità di fluorescenza da Unbound eccitazione da luminescenza (FUEL) attraverso la rilevazione dei principi rilevanti e dimostrando la sua compatibilità con un gran numero di fluorofori e condizioni di anticorpi mirati. 

Video: A Step Beyond BRET: Fluorescence by Unbound Excitation from Luminescence FUEL

Thermodynamics of Membrane Protein Folding Measured by Fluorescence Spectroscopy

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance. The abundance of membrane proteins in cells underlies the need for comprehensive study of the folding of this ubiquitous family of proteins. Additionally, advances in our ability to characterize diseases associated with misfolded proteins have motivated significant experimental and theoretical efforts in the field of protein folding. Rapid progress in this important field is unfortunately hindered by the inherent challenges associated with membrane proteins and the complexity of the folding mechanism. Here, we outline an experimental procedure for measuring the thermodynamic property of the Gibbs free energy of unfolding in the absence of denaturant, &Delta;G&deg;H2O, for a representative integral membrane protein from E. coli. This protocol focuses on the application of fluorescence spectroscopy to determine equilibrium populations of folded and unfolded states as a function of denaturant concentration. Experimental considerations for the preparation of synthetic lipid vesicles as well as key steps in the data analysis procedure are highlighted. This technique is versatile and may be pursued with different types of denaturant, including temperature and pH, as well as in various folding environments of lipids and micelles. The current protocol is one that can be generalized to any membrane or soluble protein that meets the set of criteria discussed below.

This video article details the experimental procedure for obtaining the Gibbs free energy of membrane protein folding by tryptophan fluorescence.

Termodinamica di Folding delle proteine ​​di membrana Misurato in spettroscopia di fluorescenza

Membrane protein folding is an emerging topic with both fundamental and health-related significance.  The abundance of membrane proteins in cells ...

Ricerca

Bioingegneria

Fluorescence Lifetime Imaging of Molecular Rotors in Living Cells

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular events. Viscosity is one of the key parameters affecting the diffusion of molecules and proteins, and changes in viscosity have been linked to disease and malfunction at the cellular level.1-3 While methods to measure the bulk viscosity are well developed, imaging microviscosity remains a challenge. Viscosity maps of microscopic objects, such as single cells, have until recently been hard to obtain. Mapping viscosity with fluorescence techniques is advantageous because, similar to other optical techniques, it is minimally invasive, non-destructive and can be applied to living cells and tissues.
Fluorescent molecular rotors exhibit fluorescence lifetimes and quantum yields which are a function of the viscosity of their microenvironment.4,5 Intramolecular twisting or rotation leads to non-radiative decay from the excited state back to the ground state. A viscous environment slows this rotation or twisting, restricting access to this non-radiative decay pathway. This leads to an increase in the fluorescence quantum yield and the fluorescence lifetime. Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) of modified hydrophobic BODIPY dyes that act as fluorescent molecular rotors show that the fluorescence lifetime of these probes is a function of the microviscosity of their environment.6-8 A logarithmic plot of the fluorescence lifetime versus the solvent viscosity yields a straight line that obeys the F&ouml;rster Hoffman equation.9 This plot also serves as a calibration graph to convert fluorescence lifetime into viscosity.
Following incubation of living cells with the modified BODIPY fluorescent molecular rotor, a punctate dye distribution is observed in the fluorescence images. The viscosity value obtained in the puncta in live cells is around 100 times higher than that of water and of cellular cytoplasm.6,7 Time-resolved fluorescence anisotropy measurements yield rotational correlation times in agreement with these large microviscosity values. Mapping the fluorescence lifetime is independent of the fluorescence intensity, and thus allows the separation of probe concentration and viscosity effects. 
In summary, we have developed a practical and versatile approach to map the microviscosity in cells based on FLIM of fluorescent molecular rotors.

Fluorescence Lifetime Imaging (FLIM) has emerged as a key technique to image the environment and interaction of specific proteins and dyes in living cells. FLIM of fluorescent molecular rotors allows mapping of viscosity in living cells.

Lifetime Imaging di fluorescenza di rotori molecolari nelle cellule viventi

Diffusion is often an important rate-determining step in chemical reactions or biological processes and plays a role in a wide range of intracellular ...

Generation and Recovery of &beta;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for culturing therapeutically relevant cells or tissues. Hydrogels prepared from poly(ethylene glycol) (PEG) derivatives are increasingly used for a variety of tissue engineering applications, in part due to their tunable and cytocompatible properties. In this protocol, we utilized thiol-ene step-growth photopolymerizations to fabricate PEG-peptide hydrogels for encapsulating pancreatic MIN6 b-cells. The gels were formed by 4-arm PEG-norbornene (PEG4NB) macromer and a chymotrypsin-sensitive peptide crosslinker (CGGYC). The hydrophilic and non-fouling nature of PEG offers a cytocompatible microenvironment for cell survival and proliferation in 3D, while the use of chymotrypsin-sensitive peptide sequence (CGGY&darr;C, arrow indicates enzyme cleavage site, while terminal cysteine residues were added for thiol-ene crosslinking) permits rapid recovery of cell constructs forming within the hydrogel. The following protocol elaborates techniques for: (1) Encapsulation of MIN6 &beta;-cells in thiol-ene hydrogels; (2) Qualitative and quantitative cell viability assays to determine cell survival and proliferation; (3) Recovery of cell spheroids using chymotrypsin-mediated gel erosion; and (4) Structural and functional analysis of the recovered spheroids.

Generation and Recovery of &amp;#946;-cell Spheroids From Step-growth PEG-peptide Hydrogels

The following protocol provides techniques for encapsulating pancreatic &#x03B2;-cells in step-growth PEG-peptide hydrogels formed by thiol-ene photo-click reactions. This material platform not only offers a cytocompatible microenvironment for cell encapsulation, but also permits user-controlled rapid recovery of cell structures formed within the hydrogels.

Generazione e recupero dei β-cellule Spheroids dal passaggio di crescita PEG-peptide idrogel

Hydrogels are hydrophilic crosslinked polymers that provide a three-dimensional  microenvironment with tissue-like elasticity and high permeability for  ...

High-resolution Spatiotemporal Analysis of Receptor Dynamics by Single-molecule Fluorescence Microscopy

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., kinetics, coexistence of different states and populations, transient interactions), which are typically hidden in ensemble measurements, such as those obtained with standard biochemical or microscopy methods. Thus, dynamic events, such as receptor-receptor interactions, can be followed in real time in a living cell with high spatiotemporal resolution. This protocol describes a method based on labeling with small and bright organic fluorophores and total internal reflection fluorescence (TIRF) microscopy to directly visualize single receptors on the surface of living cells. This approach allows one to precisely localize receptors, measure the size of receptor complexes, and capture dynamic events such as transient receptor-receptor interactions. The protocol provides a detailed description of how to perform a single-molecule experiment, including sample preparation, image acquisition and image analysis. As an example, the application of this method to analyze two G-protein-coupled receptors, i.e., &#946;2-adrenergic and &#947;-aminobutyric acid type B (GABAB) receptor, is reported. The protocol can be adapted to other membrane proteins and different cell models, transfection methods and labeling strategies.

This protocol describes how to use total internal reflection fluorescence microscopy to visualize and track single receptors on the surface of living cells and thereby analyze receptor lateral mobility, size of receptor complexes as well as to visualize transient receptor-receptor interactions. This protocol can be extended to other membrane proteins.

Ad alta risoluzione Spatiotemporal Analisi del recettore Dynamics per singola molecola di microscopia a fluorescenza

Single-molecule microscopy is emerging as a powerful approach to analyze the behavior of signaling molecules, in particular concerning those aspect (e.g., ...

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a modified two-photon microscope1. As opposed to conventional approaches (raster scan or wide field based on a stack of frames), the 3D orbital tracking allows to localize and follow with a high spatial (10 nm accuracy) and temporal resolution (50 Hz frequency response) the 3D displacement of a moving fluorescent particle on length-scales of hundreds of microns2. The method is based on a feedback algorithm that controls the hardware of a two-photon laser scanning microscope in order to perform a circular orbit around the object to be tracked: the feedback mechanism will maintain the fluorescent object in the center by controlling the displacement of the scanning beam3-5. To demonstrate the advantages of this technique, we followed a fast moving organelle, the lysosome, within a living cell6,7. Cells were plated according to standard protocols, and stained using a commercially lysosome dye. We discuss briefly the hardware configuration and in more detail the control software, to perform a 3D orbital tracking experiment inside living cells. We discuss in detail the parameters required in order to control the scanning microscope and enable the motion of the beam in a closed orbit around the particle. We conclude by demonstrating how this method can be effectively used to track the fast motion of a labeled lysosome along microtubules in 3D within a live cell. Lysosomes can move with speeds in the range of 0.4-0.5 &#181;m/sec, typically displaying a directed motion along the microtubule network8.

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital Inseguimento in una Modified microscopio a due fotoni: un&#39;applicazione per il monitoraggio di intracellulare vescicole

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

From Fast Fluorescence Imaging to Molecular Diffusion Law on Live Cell Membranes in a Commercial Microscope

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the regulation of many cellular functions. However, due to the fast dynamics and the tiny structures involved, a very high spatio-temporal resolution is required to catch the real behavior of molecules. Here we present the experimental protocol for studying the dynamics of fluorescently-labeled plasma-membrane proteins and lipids in live cells with high spatiotemporal resolution. Notably, this approach doesn&#8217;t need to track each molecule, but it calculates population behavior using all molecules in a given region of the membrane. The starting point is a fast imaging of a given region on the membrane. Afterwards, a complete spatio-temporal autocorrelation function is calculated correlating acquired images at increasing time delays, for example each 2, 3, n repetitions. It is possible to demonstrate that the width of the peak of the spatial autocorrelation function increases at increasing time delay as a function of particle movement due to diffusion. Therefore, fitting of the series of autocorrelation functions enables to extract the actual protein mean square displacement from imaging (iMSD), here presented in the form of apparent diffusivity vs average displacement. This yields a quantitative view of the average dynamics of single molecules with nanometer accuracy. By using a GFP-tagged variant of the Transferrin Receptor (TfR) and an ATTO488 labeled 1-palmitoyl-2-hydroxy-sn-glycero-3-phosphoethanolamine (PPE) it is possible to observe the spatiotemporal regulation of protein and lipid diffusion on &#181;m-sized membrane regions in the micro-to-milli-second time range.

Spatial distribution and temporal dynamics of plasma membrane proteins and lipids is a hot topic in biology. Here this issue is addressed by a spatio-temporal image fluctuation analysis that provides conceptually the same physical quantities of single particle tracking, but it uses small molecular labels and standard microscopy setups.

Da Veloce imaging di fluorescenza di Molecular legge Diffusione su membrane cellulare dal vivo in un microscopio commerciale

It has become increasingly evident that the spatial distribution and the motion of membrane components like lipids and proteins are key factors in the ...

Engineering 'Golden' Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and engineered variants of the green fluorescent protein from Aequorea victoria (avGFP) as well as homologs from other species already cover large parts of the optical spectrum, a spectral gap remains in the near-infrared region, for which avGFP-based fluorophores are not available. Red-shifted fluorescent protein (FP) variants would substantially expand the toolkit for spectral unmixing of multiple molecular species, but the naturally occurring red-shifted FPs derived from corals or sea anemones have lower fluorescence quantum yield and inferior photo-stability compared to the avGFP variants. Further manipulation and possible expansion of the chromophore&#39;s conjugated system towards the far-red spectral region is also limited by the repertoire of 20 canonical amino acids prescribed by the genetic code. To overcome these limitations, synthetic biology can achieve further spectral red-shifting via insertion of non-canonical amino acids into the chromophore triad. We describe the application of SPI to engineer avGFP variants with novel spectral properties. Protein expression is performed in a tryptophan-auxotrophic E. coli strain and by supplementing growth media with suitable indole precursors. Inside the cells, these precursors are converted to the corresponding tryptophan analogs and incorporated into proteins by the ribosomal machinery in response to UGG codons. The replacement of Trp-66 in the enhanced &#34;cyan&#34; variant of avGFP (ECFP) by an electron-donating 4-aminotryptophan results in GdFP featuring a 108 nm Stokes shift and a strongly red-shifted emission maximum (574 nm), while being thermodynamically more stable than its predecessor ECFP. Residue-specific incorporation of the non-canonical amino acid is analyzed by mass spectrometry. The spectroscopic properties of GdFP are characterized by time-resolved fluorescence spectroscopy as one of the valuable applications of genetically encoded FPs in life sciences.

Engineering &#039;Golden&#039; Fluorescence by Selective Pressure Incorporation of Non-canonical Amino Acids and Protein Analysis by Mass Spectrometry and Fluorescence

Synthetic biology enables the engineering of proteins with unprecedented properties using the co-translational insertion of non-canonical amino acids. Here, we presented how a spectrally red-shifted variant of a GFP-type fluorophore with novel fluorescence spectroscopic properties, termed &#34;gold&#34; fluorescent protein (GdFP), is produced in E. coli via selective pressure incorporation (SPI).

Ingegneria fluorescenza 'D'oro' per incorporazione di pressione selettiva di aminoacidi Non canonico e l'analisi della proteina di fluorescenza e di spettrometria di massa

Fluorescent proteins are fundamental tools for the life sciences, in particular for fluorescence microscopy of living cells. While wild-type and ...

Scalable Fabrication of Stretchable, Dual Channel, Microfluidic Organ Chips

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human patients. Human Organ-on-a-Chip (Organ Chip) microfluidic cell culture devices, which provide an experimental in vitro platform to assess efficacy, toxicity, and pharmacokinetic (PK) profiles in humans, may be better predictors of therapeutic efficacy and safety in the clinic compared to animal studies. These devices may be used to model the function of virtually any organ type and can be fluidically linked through common endothelium-lined microchannels to perform in vitro studies on human organ-level and whole body-level physiology without having to conduct experiments on people. These Organ Chips consist of two perfused microfluidic channels separated by a permeable elastomeric membrane with organ-specific parenchymal cells on one side and microvascular endothelium on the other, which can be cyclically stretched to provide organ-specific mechanical cues (e.g., breathing motions in lung). This protocol details the fabrication of flexible, dual channel, Organ Chips through casting of parts using 3D printed molds, enabling combination of multiple casting and post-processing steps. Porous poly (dimethyl siloxane) (PDMS) membranes are cast with micrometer sized through-holes using silicon pillar arrays under compression. Fabrication and assembly of Organ Chips involves equipment and steps that can be implemented outside of a traditional cleanroom. This protocol provides researchers with access to Organ Chip technology for in vitro organ- and body-level studies in drug discovery, safety and efficacy testing, as well as mechanistic studies of fundamental biological processes.

Here, we present a protocol that describes the fabrication of stretchable, dual channel, organ chip microfluidic cell culture devices for recapitulating organ-level functionality in vitro.

Fabbricazione scalabile di Stretchable, Dual Channel, organo di Microfluidic chip

A significant number of lead compounds fail in the pharmaceutical pipeline because animal studies often fail to predict clinical responses in human ...

Conducting Multiple Imaging Modes with One Fluorescence Microscope

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to conventional epi-fluorescence microscopy, various imaging techniques have been developed to achieve specific experimental goals. Some of the widely used techniques include single-molecule fluorescence resonance energy transfer (smFRET), which can report conformational changes and molecular interactions with angstrom resolution, and single-molecule detection-based super-resolution (SR) imaging, which can enhance the spatial resolution approximately ten&#160;to twentyfold compared to diffraction-limited microscopy. Here we present a customer-designed integrated system, which merges multiple imaging methods in one microscope, including conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based SR imaging, and multi-color single-molecule detection, including smFRET imaging. Different imaging methods can be achieved easily and reproducibly by switching optical elements. This set-up is easy to adopt by any research laboratory in biological sciences with a need for routine and diverse imaging experiments at a reduced cost and space relative to building separate microscopes for individual purposes.

Here we present a practical guide of building an integrated microscopy system, which merges conventional epi-fluorescent imaging, single-molecule detection-based super-resolution imaging, and multi-color single-molecule detection, including single-molecule fluorescence resonance energy transfer imaging, into one set-up in a cost-efficient way.

Lo svolgimento di diverse modalità di Imaging con un microscopio a fluorescenza

Fluorescence microscopy is a powerful tool to detect biological molecules in situ and monitor their dynamics and interactions in real-time. In addition to ...

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) Assays

When present in pharmaceutical products, a Gram-negative bacterial cell wall component endotoxin (often also called lipopolysaccharide) can cause inflammation, fever, hypo- or hypertension, and, in extreme cases, can lead to tissue and organ damage that may become fatal. The amounts of endotoxin in pharmaceutical products, therefore, are strictly regulated. Among the methods available for endotoxin detection and quantification, the Limulus Amoebocyte Lysate (LAL) assay is commonly used worldwide. While any pharmaceutical product can interfere with the LAL assay, nano-formulations represent a particular challenge due to their complexity. The purpose of this paper is to provide a practical guide to researchers inexperienced in estimating endotoxins in engineered nanomaterials and nanoparticle-formulated drugs. Herein, practical recommendations for performing three LAL formats including turbidity, chromogenic and gel-clot assays are discussed. These assays can be used to determine endotoxin contamination in nanotechnology-based drug products, vaccines, and adjuvants.

Detection of Endotoxin in Nano-formulations Using Limulus Amoebocyte Lysate LAL Assays

Detection of endotoxins in engineered nanomaterials represents one of the grand challenges in the field of nanomedicine. Here, we present a case study that describes the framework composed of three different LAL formats to estimate potential endotoxin contamination in nanoparticles.