המחקר נתמך בחלקו על ידי תכנית המחקר העירונית של המכונים הלאומיים לבריאות, המכון לאומי לסרטן, מרכז לחקר הסרטן.

הפרוטוקול המתואר הועסק על פי כללי NIH על השימוש בדגימות רקמה אנושיות. 1. הכנת רקמה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני ההתחלה, להשיג דגימות רקמה אנושיות על פי מוסדית מועצה לביקורת פרוטוקולים (IRB). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את סוג בלוק רקמה / תא ושיטת עיבוד מקביל [קבוע פורמלין פרפין, מוטבע (FFPE), קפוא, או קבוע אתנול (EFPE) פרפין, מוטבע]. קיבעון פורמלין מספק היסטולוגיה האופטימלית, ואחריו קיבעון אתנול ופלאש קפוא. עם זאת, שיטות עיבוד קיבעון ורקמה יכולות להשפיע על ה-DNA, RNA, וכמות חלבון ואיכות לניתוח מולקולרי במורד הזרם וצריכה להיחשב. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חותכים את חלקי גוש רקמה / תא על סוג השקופית (זכוכית, זכוכית קרום, או קרום מסגרת מתכת) של בחירה. ניתוח SIVQ עובד באותה מידה בכל שלושת סוגי השקופיות. שים לב כי השיטה פסאודו coverslip (שיפורט להלן) עם xylenes ואיתןol לא יכול להתבצע על שקופיות קרום מסגרת מתכת מאז השקופיות חייבת להיות הפוכה על הבמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר כתם רקמה כימי או מבוסס IHC כדי לזהות תאים של עניין מהרקע. שים לב ששיטות הצביעה יכולות להשפיע גם על DNA, RNA, ואיכות חלבון וכמות של הרקמה. בדוק את הרקמה לאחר הצביעה כדי להעריך את האיכות בסיסית של ביומולקולות לפני שתמשיך עם הפרוטוקול. SIVQ-LCM שבוצע בשקופיות רקמה / ציטולוגיה מוכתמת ב: אימונוהיסטוכימיה (IHC) עם 15 DAB, immunofluorescence, אדום מהיר, דה נובו אדומה, toluidine הכחול, וhematoxylin ו eosin (H &amp; E) (נתונים שלא פורסמו). </li></ol> 2. דגימת הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העומס מחליק על הבמה הממונעת של מכשיר microdissection ולהפעיל את התוכנה בנושא. בחר בתיבות הסימון כדי לייעד את עמדותיהם של השקופיות עמוסות ולהבטיח את קבצי תמונה שנתפסו הם יישמרו בפורמט jpeg. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייעל imאיכות גיל ידי כוונון הבהירות והמיקוד של התמונה על המסך, או באמצעות גלגל הפוקוס הידני או באמצעות התוכנה של המכשיר לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בארגז הכלים של התמונה בתוך התוכנה של המכשיר לנתיחה, קבע את רווח בהירות המנורה ומצלמה כראוי. ערכי דוגמא הם בהירות = 60 ורווח = 220, עם המפזר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פוקוס באופן ידני או עם תכונת פוקוס אוטומטי בתוכנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ללכוד תמונת סקירת תמונה ממוזערת של השקופית לספק מפת דרכים לתהליך הנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לקבלת איכות תמונה אופטימלית של שקופיות uncoverslipped, לנצל את המפזר מתחת למעבה על המכשיר, או, להוסיף כמות קטנה (~ 30 μl) של או אתנול או xylenes כדי לשפר את המדד עקשן (פסאודו coverslip). בעת השימוש בxylenes, להיות מודע שהם חייבים לשמש אמצעי בטיחות רעיל ותקין, ובכלל זה השימוש במנדף וחלוק מעבדה מגן, משקפי מגן עיניים, וכפפות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אין להניח את כובע LCM בשקופית עד פתרון אתנול או xylenes יש פינה או הפולימרים על המכסה יהיו מעוות לחלוטין. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט בשקופיות ותמונות לכידתו של האזורים להיות גזורים ב10X, 20X, 40X או הגדלה. במידת צורך, לשפר את התמונה עם תוכנה כגון תיקון שגיאות אוטומטי (בתמונת מנהל Microsoft Office) כמתואר 22 בעבר. תמונות חייבת להיות בשבי בפורמט jpeg כדי לאפשר להם להיות מחדש מיובא לתוך תוכנת בחירה האוטומטית. </li></ol> 3. ניתוח האלגוריתם של התמונה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העברת תמונות שנתפסו ממכשיר microdissection לתיקיית SIVQ. להתקין ולפתוח את חבילות תוכנת ArcturusXT, AutoScan וSIVQ במחשב המחובר למכשיר לנתיחה. לקבלת גישה לתוכנת SIVQ, אנא צור קשר עם ד&quot;ר יוליסס Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> SIVQ להרחיב ולטעון את התמונה שצולמה (JPEG) של עניין. &lt;/ Li&gt; <li style=";text-align:right;direction:rtl"> נווט לאזור של ריבית ו / או להתאים את גודל חלונות הראווה (Viewport 5 ו -6). בתוכנת SIVQ, Viewport 5 מראה את התמונה מראש העיבוד וViewport 6 מציג את התמונה לאחר עיבוד 16. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הגודל של וקטור הטבעת ומספר הצלצולים לשמש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר בתכונת התמונה הנשוא להיות בשבי על ידי לחיצה ימנית על זה בViewport 6. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על &quot;סריקה&quot; כדי לנתח את התמונה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> התאם את ההסתברות הסטטיסטית של התאמת תמונה באמצעות שני ברים זזים. בר העליון מתאים את הספציפיות וקטור הכלליים, והוא משמש להוציא שטח מהסריקה הראשונית (עם רגישות כפי שהוגדר על ידי משתנה &quot;Stat&quot; נבחר) שעשוי לייצג שטח כלול מוגזם. לעומת זאת, את המחוון הנמוך מנוצל כדי להגביר את הרגישות, לאחר סריקה מתבצעת, מתוך הכוונה להגדיל את השטח שיסווג כמשחק. שני פקדי מחוון אלה UTIליזה משתנה &quot;Stat&quot; כסף רגישות בסיסית הראשוני. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי לשמור את התמונה, לחץ על &quot;שמירה בשם JPEG&quot; (תמונה נשמרה כעת בתיקיית C :/ vq_test / תמונות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> נתח את התמונה עם האלגוריתם. הפלט של ניתוח האלגוריתם צריך לגרום לתמונה מבוארת שזה יהיה בשימוש בSIVQ-LCM. נכון לעכשיו, הגרסה הנוכחית של מנוע ליבת SIVQ היא בבדיקת גרסת הבטא עם הציפייה כי הגרסה המלאה הייצור (Q1 זמין 2014) תשלב ערכת פיתוח תוכנה מלאה (SDK) וממשק תכנות יישומים (API) לשילוב פשוטים של מסננים המרחבי נוצר על ידי משתמש וצעדי עיבוד נתוני זרימת עבודה במורד הזרם עם מנוע התאמת טבעת הליבה. SDK זה יחולק עם סט של תיעוד מלא. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שHeatmap SIVQ משתנה לצבע אדום אחיד. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצא את התמונה. זה חיוני כדי להטביע מחדש את קואורדינטות positional בעמ &#39;תמונת JPEG OST-ניתוח באמצעות עורך HEX כדי להדביק בכותרת הקובץ מתמונת מכשיר נתיחה המקורית. הנתונים המתאימים, ניתן למצוא בין &quot;התחלה של תמונה&quot; סמן (0xFF, 0xD8) ואת הסמן הראשון &quot;הגדרת קוונטיזציה טבלה&quot; (0xFF, 0xDB). </li></ol> 4. Microdissection <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את כובע LCM במרכזו של האזור של עניין, שבו התמונות שנתפסו לניתוח SIVQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כיול ובקרת איכות (QC) לייזרי UV / IR ולייעל את הפרמטרים, ובם חשמל, משך זמן, מקומות לייזר, ומהירות חיתוך UV (כפי שהומלץ על ידי היצרן). לבצע כיולים אלה לפני מחדש יבוא התמונה מנותחת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> AutoScanXT הפתוח (תוכנת בחירה אוטומטית) ולייבא את התמונה ניתחה מג :/ vq_test תיקייה / תמונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאמן את תוכנת בחירה האוטומטית להכיר בביאור SIVQ וליצור את המפה לנתיחה. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי ליצור traiקובץ נינג, בחר ארבעה אזורים של עניין (בסימן &quot;עיגולים כחולים&quot;) על &quot;צבע אדום&quot; של התמונה ניתחה SIVQ. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את אזורי הרקע (מסומנים על ידי &quot;ריבועים אדומים&quot;) שלא להיות גזור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחץ על הכפתור &quot;נתח&quot; כדי ליצור את קובץ אימון, אותו ניתן לשמור לשימושים שלאחר מכן. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע microdissection באמצעות אינפרא אדום המתאים (IR) ו / או אולטרה סגול לייזרים (UV). <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> העתק את האזורים שנבחרו על התמונה &quot;בשידור חי&quot;. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בארגז הכלים &quot;microdissect&quot;, בחר בלכידת IR המתאימה או כפתורי חיתוך UV. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר הנתיחה הושלמה, להעביר את כובע LCM לתחנת QC וללכוד תמונה של רקמות / תאים גזורים. גישה נוספת היא למקם את הכובע על אזור ריק בשקופית לפני שתעביר אותו לתחנת QC, זה מאפשר למשתמש לצלם תמונות בהגדלות שונות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl">ללכוד תמונה של אזור הרקמה של עניין לאחר microdissection כדי להעריך עוד יותר מרים את יעילות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם התאים הרצויים כבר ניתחו בהצלחה, לחץ על הכפתור &quot;השלב הנוכחי&quot; בתוכנת ArcturusXT ולהסיר את כובע LCM ליזום הליך המיצוי המולקולרי לניתוח במורד הזרם. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing.">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li><li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens.">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine.">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711 (2013).</li><li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

מיכאל ר Emmert-באק הוא ממציא על פטנטים שנערכו-NIH מכסים microdissection ללכוד לייזר ומקבל תשלומים מבוססי תמלוגים באמצעות תכנית העברת NIH הטכנולוגיה.

אנו מציגים פרוטוקול ליישום SIVQ-LCM לmicrodissect תאי האפיתל immunostained מרקמת שד אנושי FFPE. השימוש באלגוריתם ניתוח תמונה, כגון SIVQ, מפחית את הכמות של ידיים על הזמן הנדרש לתהליך microdissection. זוהי התקדמות חשובה פוטנציאלי עבור השדה מאז ומפעיל ומאמץ הוא בדרך כלל צעד שער הגבלה לנתיחה המדויק...

שפותח במקור באמצע 1990, microdissection ללכוד לייזר (LCM) מאפשר למשתמש ללכוד בדיוק תאים ספציפיים או אזורים סלולריים מקטע רקמה היסטולוגית באמצעות הדמיה מיקרוסקופית 1, 2. מחקרים רבים השוו ניתוח מולקולרי של LCM לעומת שריטות רקמה להמחיש את הערך של 3-12 השיטה. בנוסף, ישנם שלושה פרסומי פרוטוקול וידאו בטכנולוגיה שזמינות לצפייה 13, 14. עם זאת, למרות הערך המוכח שלה, LCM יכול להיות מייגע ומפרך כאשר היעד של עניין הוא אוכלוסיית תאים מפוזרת בסעיף הטרוגנית רקמות, או כאשר מספר גדול של תאים נדרשים ליישומים במורד הזרם ספציפיים כגון פרוטאומיקה. הנטל שהוטל על המפעיל האנושי הוביל אותנו לפתח גישה לנתיחה אוטומטית למחצה לLCM על ידי שילוב של אלגוריתם ניתוח תמונה רב עוצמה כדי להנחות את תהליך LCM 15. &lt;כיתת p = &quot;jove_content&quot;&gt; בשיתוף עם אוניברסיטת מישיגן, המעבדה שלנו בNIH האריכה את פותח בעבר ודיווח קוונטיזציה וקטור מרחבית בלתי משתנה אלגוריתם (SIVQ) באופן שיאפשר לה למחצה להפוך את תהליך הבחירה לרקמות פנימי ל מודרך microdissection, ובכך זמין כלי עם פתולוג או מדען חיים בראש. קוונטיזציה וקטור במרחב בלתי משתנה (SIVQ) היא אלגוריתם המאפשר למשתמש פשוט &quot;לחץ&quot; על תכונה היסטולוגית של עניין כדי ליצור וקטור טבעת (תכונת תמונה נשוא) שניתן להשתמש בם כדי לחפש את התמונה היסטולוגית כל, התאמה לסף הסטטיסטי צורך כ16-21. מפת החום כתוצאה מציגה את האיכות של משחקים לתכונת תמונת נשוא הראשונית ומומרת לאחר מכן לתוך צבע אחד מפת ביאור (אדום) שיכול להיות מיובאת לתוך מכשיר LCM. תוכנה אוטומטי הבחירה, AutoScanXT, לאחר מכן נעשה שימוש כדי לצייר מפה מבוססתבביאור של SIVQ מנחה את לכידתו של תאי היעד מן מדגם הרקמות. הפרוטוקול מפורט להלן מתאר את היישום של SIVQ לתוך העבודה microdissection.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM הוא מתודולוגיה חדשה לאוטומציה ומייעלת את התהליך מסורתי יותר, המשתמש תלוי לייזר לנתיחה. מטרתו ליצור טכנולוגיה מתקדמת, במהירות להתאמה אישית פלטפורמה לנתיחה בלייזר. בדו&quot;ח זה, אנו מתארים את השילוב של תוכנת ניתוח התמונה מרחבית הקבועים וקטור קוונטיזציה (SIVQ) על גבי מכשיר ArcturusXT. מערכת ArcturusXT מכילה גם אינפרא אדום (IR) ואולטרה סגול לייזר (UV), המאפשר לתא ספציפי או ניתוחי שטח גדולים. המטרה העיקרית היא לשפר את המהירות, דיוק, ושחזור של נתיחת הלייזר כדי להגדיל את התפוקה לדוגמא. גישה חדשנית זו מאפשרת microdissection של שני רקמות אנושיות במחקר ובזרימות עבודה קלינית בבעלי חיים ו.

קטע רקמת שד האנושי FFPE היה immunostained לcytokeratin AE1/AE3 באמצעות פרוטוקול IHC סטנדרטי 23. לאחר צביעה, שקופית הרקמה הוצבה על הבמה ArcturusXT ופרוטוקול SIVQ-LCM יזם כפי שתואר לעיל. מאז הרקמה לא ניתן coverslipped לmicrodissection, התאים + המוכתמים IHC יכולים להיות קשים להבחין באופן חזותי (איור 1 א).</s...

Watch this Scientific Journal Video about SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument at JoVE.com

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM הוא גישה חדשנית שרותמת אלגוריתם מחשב, מרחבית הקבועים וקטור קוונטיזציה (SIVQ), לנהוג microdissection ללכוד לייזר התהליך (LCM). זרימת העבודה SIVQ-LCM משפרת באופן משמעותי את המהירות ודיוק של microdissection, עם יישומים בשני המחקר ומסגרות קליניות.

SIVQ-LCM פרוטוקול עבור מכשיר ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Views.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM הוא גישה חדשנית שרותמת אלגוריתם מחשב, מרחבית הקבועים וקטור קוונטיזציה (SIVQ), לנהוג microdissection ללכוד לייזר התהליך (LCM). זרימת העבודה SIVQ-LCM משפרת באופן משמעותי את המהירות ודיוק של microdissection, עם יישומים בשני המחקר ומסגרות קליניות. 

Video: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

נויטרופילים בידוד פרוטוקול

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

הכנת תסיסנית עוברים Live-הדמיה באמצעות פרוטוקול Drop Hanging

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

פרוטוקול לייצור KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

פרוטוקול פשוט לחילוץ Hemocytes מזחלי Wild

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

פרוטוקול אופטימלי עבור רשתית Wholemount הכנה להדמיה ואימונוהיסטוכימיה

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

פרוטוקול להצפנה באמצעות גנים להגדיר העשרה ניתוח כדי לזהות את המודל החייתי המתאים עבור המחקר Translational

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

שעון סריקה פרוטוקול ניתוח תמונה: Plugins ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

פרוטוקול עבור המעבדה דיור של טורקיז דגים גמבוזיים (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

Emergent properties and external factors (population-level and ecosystem-level interactions, in particular) play important roles in mediating ecologically-important endpoints, though they are rarely considered in toxicological studies. D. melanogaster is emerging as a toxicology model for the behavioral, neurological, and genetic impacts of toxicants, to name a few. More importantly, species in the genus Drosophila can be utilized as a model system for an integrative framework approach to incorporate emergent properties and answer ecologically-relevant questions in&#160;toxicology research. The aim of this paper is to provide a protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants to be used as a model system for a range of phenotypic outputs and ecologically-relevant questions. More specifically, this protocol can be used to 1) link multiple biological levels of organization and understand the impact of toxicants on both individual- and population-level fitness; 2) test the impact of toxicants at different stages of developmental exposure; 3) test multigenerational and evolutionary implications of pollutants; and 4) test multiple contaminants and stressors simultaneously.

Experimental Protocol for Using Drosophila As an Invertebrate Model System for Toxicity Testing in the Laboratory

In this paper, we provide a detailed protocol for exposing species in the genus Drosophila to pollutants with the goal of studying the impact of exposure on a range of phenotypic outputs at different developmental stages and for more than one generation.