L&#39;étude a été financée en partie par le Programme de recherche intra-muros des Instituts nationaux de la santé, Institut national du cancer, Centre de recherche sur le cancer.

Le protocole décrit a été utilisé conformément aux règles du NIH sur l&#39;utilisation des échantillons de tissus humains. 1. Préparation des tissus <ol><li> Avant de commencer, obtenir des échantillons de tissus humains selon (CISR) Les protocoles d&#39;examen institutionnel. </li><li> Choisissez le type de bloc de tissus / cellules et la méthode de traitement correspondant [fixés au formol et inclus en paraffine (FFPE), congelés, ou de l&#39;éthanol-fixe paraffine (EFPE)]. Fixation au formol fournit histologie optimale, suivie par la fixation de l&#39;éthanol et surgelés. Cependant, de fixation et de tissus méthodes de traitement peuvent affecter l&#39;ADN, l&#39;ARN, et la quantité et de la qualité pour l&#39;analyse moléculaire des protéines en aval et doivent être pris en considération. </li><li> Couper les sections de bloc de tissu / cellules sur le type coulissant (verre, verre à membrane, membrane ou structure métallique) de choix. Analyse SIVQ fonctionne aussi bien sur les trois types de diapositives. S&#39;il vous plaît noter que la méthode pseudo-lamelle (décrit ci-dessous) avec les xylènes et ethanol ne peut être effectuée sur les lames de la membrane de structure métallique depuis la diapositive doit être inversée sur la scène. </li><li> Sélectionner une tache chimique ou à base d&#39;un tissu IHC pour identifier les cellules d&#39;intérêt à partir de l&#39;arrière-plan. Notez que les méthodes de coloration peuvent également affecter l&#39;ADN, de l&#39;ARN, et la qualité et la quantité de protéine du tissu. Testez le tissu après coloration pour évaluer la qualité de base de biomolécules avant de poursuivre avec le protocole. SIVQ-LCM a été réalisée sur des lames de tissu / cytologie colorées avec: immunohistochimie (IHC) avec DAB 15, immunofluorescence, rouge rapide, de novo rouge, bleu de toluidine, et hématoxyline et l&#39;éosine (H &amp; E) (données non publiées). </li></ol> 2. Échantillons Imaging <ol><li> Charge glisse sur la platine motorisée de l&#39;instrument de microdissection et lancer le logiciel connexe. Sélectionnez les cases à cocher pour désigner les positions des lames chargées et s&#39;assurer que les fichiers image capturés doivent être enregistrés au format jpeg. </li><li> Optimiser l&#39;imla qualité de l&#39;âge en ajustant la luminosité et netteté de l&#39;image sur l&#39;écran, en utilisant la molette de mise au point manuelle ou par le logiciel de l&#39;instrument de dissection. <ol><li> Utilisation de la Boîte à outils de l&#39;image dans le logiciel de l&#39;instrument de dissection, régler le gain de luminosité de la lampe et l&#39;appareil photo de manière appropriée. Des exemples de valeurs sont la luminosité = 60 et le gain = 220, avec le diffuseur. </li><li> Concentrez soit manuellement ou avec la fonction de mise au point automatique dans le logiciel. </li></ol></li><li> Capturer une image d&#39;ensemble des vignettes de la glissière pour fournir une feuille de route pour le processus de dissection. <ol><li> Pour optimiser la qualité d&#39;une lame uncoverslipped d&#39;image, utiliser le diffuseur au-dessous du condenseur sur l&#39;instrument, ou, ajouter une petite quantité (~ 30 pi) de l&#39;éthanol ou de xylène pour améliorer l&#39;indice de réfraction (pseudo-lamelle). Lors de l&#39;utilisation des xylènes, être conscients qu&#39;ils sont les mesures de sécurité appropriées toxiques et doivent être utilisées, y compris l&#39;utilisation d&#39;une hotte et une blouse de protection, des lunettes de protection et des gants. </li><li> Ne pas placer le couvercle de LCM sur la lame jusqu&#39;à ce que la solution de l&#39;éthanol ou les xylènes a complètement disparu ou le polymère sur le plafond sera déformée. </li></ol></li><li> Naviguer sur le toboggan et de capturer des images des zones à disséqués à 10X, 20X, ou 40X. Si nécessaire, améliorer l&#39;image avec un logiciel comme la correction automatique (dans Microsoft Office Picture Manager) comme décrit précédemment 22. Les images doivent être capturées en format jpeg pour leur permettre d&#39;être réimportés dans le logiciel de sélection automatique. </li></ol> 3. L&#39;algorithme d&#39;analyse de l&#39;image <ol><li> Transfert des images capturées à partir de l&#39;instrument de microdissection au dossier SIVQ. Installer et ouvrir les logiciels ArcturusXT, balayage automatique et SIVQ sur l&#39;ordinateur relié à l&#39;instrument de dissection. Pour accéder au logiciel de SIVQ, s&#39;il vous plaît communiquer avec M. Ulysse Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Ouvrir SIVQ et charger l&#39;image capturée (jpeg) d&#39;intérêt. &lt;/ Li&gt; <li> Naviguer à la zone d&#39;intérêt et / ou d&#39;ajuster la taille des fenêtres d&#39;affichage (Viewport 5 &amp; 6). Dans le logiciel de SIVQ, Fenêtre 5 montre l&#39;image de pré-traitement et Fenêtre 6 montre l&#39;image post-traitement 16. </li><li> Choisir la taille du vecteur d&#39;anneau et le nombre de cycles à utiliser. </li><li> Sélectionnez le prédicat d&#39;image caractéristique d&#39;être capturé par un clic droit sur elle dans fenêtre 6. </li><li> Cliquez sur &quot;scan&quot; pour analyser l&#39;image. </li><li> Ajuster la probabilité statistique d&#39;appariement d&#39;images en utilisant les deux barres coulissantes. La barre supérieure permet de régler la spécificité globale de vecteur, et est utilisé pour exclure la zone de l&#39;analyse initiale (avec une sensibilité telle que définie par la variable sélectionnée &quot;Stat&quot;) qui peuvent représenter zone comprise excessive. Inversement, le curseur du bas est utilisé pour augmenter la sensibilité, après une analyse est effectuée, avec l&#39;intention de la zone de plus en plus qui est classé comme étant un match. Ces deux contrôles de curseur UTIliser la variable &quot;Stat&quot; que le seuil initial de sensibilité de base. </li><li> Pour enregistrer l&#39;image, cliquez sur &quot;enregistrer sous jpeg&quot; (l&#39;image est maintenant enregistré dans c :/ vq_test dossier / photos). </li><li> Analyser l&#39;image avec l&#39;algorithme. La sortie de l&#39;analyse de l&#39;algorithme doit aboutir à une image annotée pour qu&#39;il puisse être utilisé dans SIVQ-LCM. À l&#39;heure actuelle, la version actuelle du moteur de base SIVQ est en version beta test avec l&#39;espoir que la version de production complet (disponible Q1 2014) intégrera un kit de développement logiciel complet (SDK) et l&#39;interface de programmation d&#39;application (API) pour une intégration simplifiée de filtres spatiaux générés par les utilisateurs en aval et les étapes de traitement des données de flux de travail avec le moteur bague assortie de base. Ce SDK sera distribué avec un ensemble complet de documentation. <ol><li> Assurez-vous que la carte thermique SIVQ est remplacée par une couleur rouge uniforme. </li></ol></li><li> Exporter l&#39;image. Il est essentiel d&#39;incorporer de nouveau les coordonnées de position dans la post-analyse d&#39;images jpeg en utilisant un éditeur hexadécimal à coller dans l&#39;en-tête de fichier de l&#39;image originale de l&#39;instrument de dissection. Les données appropriées peuvent être trouvées entre &quot;Début de l&#39;image&quot; marqueur (0xFF, 0xD8) et le premier &quot;Définir quantification tableau&quot; marqueur (0xFF, 0xDB). </li></ol> 4. Microdissection <ol><li> Placer le capuchon de LCM au centre de la région d&#39;intérêt, où les images ont été capturées pour l&#39;analyse de SIVQ. </li><li> Étalonner et de contrôle de qualité (QC), les lasers UV / IR et optimiser les paramètres, y compris l&#39;énergie, la durée, les lieux de laser, et la vitesse de coupe UV (tel que recommandé par le fabricant). Réaliser ces étalonnages avant de réimporter l&#39;image analysée. </li><li> Ouvrir AutoScanXT (logiciel de sélection automatique) et importer l&#39;image analysée à partir de c :/ vq_test dossier / photos. </li><li> Former le logiciel de sélection automatique de reconnaître l&#39;annotation de SIVQ et créer la carte de dissection. <ol><li> Pour créer un training fichier, sélectionner quatre régions d&#39;intérêt (marquées par &quot;cercles bleus») sur la &quot;peinture rouge&quot; de l&#39;image analysée de SIVQ. </li><li> Sélectionnez les zones de fond (marquées par &quot;carrés rouges&quot;) qui ne sont pas à être disséqué. </li><li> Cliquez sur le bouton &quot;Analyser&quot; pour générer le fichier de formation, qui peut être sauvegardé pour les utilisations ultérieures. </li></ol></li><li> Effectuer la microdissection à l&#39;aide du infrarouge approprié (IR) et / ou ultraviolet (UV) des lasers. <ol><li> Copiez les zones sélectionnées sur l&#39;image «live». </li><li> Dans le &quot;microdissect« boîte à outils, sélectionnez la capture d&#39;IR approprié ou boutons de coupe UV. </li></ol></li><li> Après la dissection est terminée, déplacer le bouchon de LCM à la station de QC et capturer une image des tissus / cellules disséquées. Une autre approche consiste à placer le bouchon sur une zone vide de la diapositive avant de passer à la station de Québec, ce qui permet à l&#39;utilisateur de prendre des photos à différents grossissements. </li><li>Capturer une image de la zone de tissu d&#39;intérêt après microdissection pour mieux évaluer l&#39;efficacité de levage. </li><li> Si les cellules souhaitées ont été disséqués avec succès, cliquez sur le bouton &quot;présente étape&quot; dans le logiciel ArcturusXT et enlever le bouchon de LCM pour lancer la procédure d&#39;extraction moléculaire pour l&#39;analyse en aval. </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

Michael R. Emmert-Buck est un inventeur sur les brevets NIH-détenus couvrant microdissection laser et reçoit des paiements sur la base de droits à travers le Programme de transfert de technologie NIH.

Nous présentons un protocole pour l&#39;application de SIVQ-LCM à microdissect cellules épithéliales immunocolorées de FFPE tissu mammaire humain. L&#39;utilisation d&#39;un algorithme d&#39;analyse d&#39;image, tel que SIVQ, réduit la quantité de mains sur le temps requis pour le processus de microdissection. Il s&#39;agit d&#39;un progrès potentiellement important pour le domaine de temps et d&#39;efforts depuis l&#39;opérateur est typiquement l&#39;étape limitante pour la dissection précise des cellules d&...

Initialement développé dans le milieu des années 1990, microdissection laser (LCM) permet à l&#39;utilisateur de capturer précisément des cellules spécifiques ou des régions cellulaires à partir d&#39;une section de tissu histologique par visualisation microscopique 1, 2. De nombreuses études comparant l&#39;analyse moléculaire de LCM contre les éraflures de tissus illustrent l&#39;intérêt de la méthode 3-12. En outre, il ya trois publications de protocole vidéo sur la technologie qui sont disponibles pour l&#39;affichage 13, 14. Cependant, en dépit de sa valeur éprouvée, LCM peut être fastidieuse et laborieuse lorsque la cible d&#39;intérêt est une population de cellules dispersées dans une coupe de tissu hétérogène, ou quand un grand nombre de cellules sont nécessaires pour des applications spécifiques en aval telles que la protéomique. La charge qui pèse sur l&#39;opérateur humain nous a conduit à développer une approche semi-automatique dissection pour LCM en combinant un algorithme d&#39;analyse d&#39;image puissant pour guider le processus de LCM 15. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; En collaboration avec l&#39;Université du Michigan, notre laboratoire du NIH étendu précédemment développé et rapporté spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) algorithme de manière à lui permettre de semi-automatiser le processus de sélection des tissus intrinsèque à guidée microdissection, rendant ainsi disponible un outil avec le pathologiste ou la vie scientifique à l&#39;esprit. Spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) est un algorithme qui permet à l&#39;utilisateur de simplement &quot;cliquer&quot; sur une caractéristique histologique d&#39;intérêt pour créer un vecteur d&#39;anneau (de caractéristique d&#39;image prédicat) qui peut être utilisé pour rechercher l&#39;ensemble de l&#39;image histologique, en ajustant le seuil statistique 16 à 21 selon les besoins. La carte de chaleur résultante affiche la qualité des matchs à la fonction initiale de l&#39;image sous-jacente et est ensuite converti en une seule couleur (rouge) de la carte d&#39;annotation qui peut être importé dans l&#39;instrument de LCM. Le logiciel de sélection automatique, AutoScanXT, est ensuite utilisé pour dessiner une carte à base desur l&#39;annotation de guidage SIVQ la capture de cellules cibles à partir de l&#39;échantillon de tissu. Le protocole détaillé ci-dessous décrit la mise en œuvre de SIVQ dans le workflow de microdissection.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM est une nouvelle méthodologie qui automatise et rationalise le processus de dissection laser dépend utilisateur plus traditionnel. Il vise à créer une plate-forme technologique de dissection laser de pointe, rapidement personnalisable. Dans ce rapport, nous décrivons l&#39;intégration du logiciel d&#39;analyse d&#39;image spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ) sur l&#39;instrument ArcturusXT. Le système contient à la fois un ArcturusXT infrarouge (IR) et ultraviolet (UV), laser, permettant une cellule particulière ou de grandes dissections de la région. Le but principal est d&#39;améliorer la vitesse, la précision et la reproductibilité de la dissection laser pour augmenter le débit d&#39;échantillons. Cette nouvelle approche facilite microdissection des deux tissus animaux et humains dans la recherche et la gestion des patients.

Une section de tissu mammaire humain FFPE a été immunocoloré pour cytokératine AE1/AE3 utilisant un protocole IHC norme 23. Après coloration, la lame de tissu a été posé sur la platine et le protocole ArcturusXT SIVQ-LCM a été ouverte comme décrit ci-dessus. Depuis le tissu ne peut pas être une lamelle de microdissection, les cellules colorées + IHC peuvent être difficiles à discerner visuellement (figure 1A). Ainsi, pour assurer une meilleure adaptation d&#39;indice et une ima...

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SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM est une approche novatrice qui exploite un algorithme informatique, spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ), à conduire la microdissection par capture laser (LCM) de processus. Le flux de travail SIVQ-LCM améliore grandement la vitesse et la précision de microdissection, avec des applications à la fois dans la recherche et les milieux cliniques.

Protocole SIVQ-LCM pour l&#39;instrument ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.5K vues.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM est une approche novatrice qui exploite un algorithme informatique, spatialement invariant quantification vectorielle (SIVQ), à conduire la microdissection par capture laser (LCM) de processus. Le flux de travail SIVQ-LCM améliore grandement la vitesse et la précision de microdissection, avec des applications à la fois dans la recherche et les milieux cliniques. 

Vidéo: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protocole pour l&#39;élevage des moustiques (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

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Biologie

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Isolement des neutrophiles Protocole

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

La préparation des Drosophile Les embryons destinés à Live-imagerie utilisant le protocole goutte suspendue

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

Un protocole pour la production de KLRG1 tétramère

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Un protocole simple pour extraire l&#39;hémocytes de chenilles sauvages

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

Protocole de numérisation de l&#39;horloge pour l&#39;analyse d&#39;image: Plugins ImageJ

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Un protocole pour laboratoire logement de Turquoise cyprinodonte (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

Un protocole d'écran mutant de signalisation de transmission de force tactile et répétable de travail pour l'étude de la thigmomorphogenesis d'une plante modèle Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Un protocole simple pour cartographier les caractéristiques de l’architecture du système racinaire végétal

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Quantification de la mitophagie chez C. elegans et une lignée cellulaire de cancer du foie

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Pleins feux sur l’auteur : Détection de la mitophagie chez Caenorhabditis elegans et les cellules de mammifères à l’aide de colorants spécifiques aux organites  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Détection de la mitophagie chez Caenorhabditis elegans et des cellules de mammifères à l’aide de colorants spécifiques aux organites

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...