O estudo foi financiado em parte pelo Programa de Pesquisa Intramural dos Institutos Nacionais de Saúde, Instituto Nacional do Câncer, Centro de Pesquisa do Câncer.

O protocolo descrito foi utilizado em conformidade com as normas do NIH sobre a utilização de amostras de tecidos humanos. 1. Preparação de Tecidos <ol><li> Antes do início, obter amostras de tecidos humanos de acordo com a Institutional Review Board (IRB) protocolos. </li><li> Escolha o tipo de bloco de tecido / célula e correspondente método de processamento [fixadas em formalina embebido em parafina (FFPE), congelados ou fixo-etanol (EFPE) incluído em parafina]. Fixação formalina fornece histologia ideal, com fixação de etanol e flash congelado. No entanto, métodos de transformação e de fixação do tecido podem afectar o ADN, ARN, e a quantidade de proteína e de qualidade para análise molecular e a jusante devem ser considerados. </li><li> Corte as seções do bloco de tecido / célula para o tipo de slide (vidro, vidro da membrana, ou membrana estrutura de metal) de escolha. Análise SIVQ funciona igualmente bem em todos os três tipos de slides. Por favor, note que o método pseudo-lamela (descrito abaixo) com xilenos e Ethanol não pode ser realizado nas lâminas de membrana de armação de metal uma vez que a lâmina tem de ser invertida no palco. </li><li> Selecione uma mancha tecido química ou com base em IHC para identificar as células de interesse do fundo. Note-se que os métodos de coloração pode também afectar o ADN, ARN, e qualidade e quantidade de tecido de proteína. Teste o tecido após coloração para avaliar a qualidade da linha de base de biomoléculas, antes de prosseguir com o protocolo. SIVQ-LCM foi realizada em lâminas de tecido / citologia coradas com: imuno-histoquímica (IHQ) com DAB 15, imunofluorescência, vermelho rápido, de novo vermelho, azul de toluidina e hematoxilina e eosina (H &amp; E) (dados não publicados). </li></ol> 2. Specimen Imagem <ol><li> Carga desliza no palco motorizado do instrumento microdissection e lançar o software relacionado. Marque as caixas de seleção para designar as posições das lâminas carregadas e garantir que os arquivos de imagens captadas devem ser salvos no formato jpeg. </li><li> Otimizar o imqualidade idade, ajustando o brilho eo foco da imagem na tela, usando o anel de foco manual ou através do software do instrumento de dissecação. <ol><li> Usando a caixa de ferramentas Imagem no software do instrumento de dissecação, definir o ganho de brilho da lâmpada e câmera de forma adequada. Exemplo de valores de brilho são = 60 = 220 e ganho, com o difusor. </li><li> Concentre-se manualmente ou com o recurso de foco automático no software. </li></ol></li><li> Capturar uma imagem panorâmica miniatura do slide para fornecer um roteiro para o processo de dissecação. <ol><li> Para melhor qualidade de imagem de um slide de uncoverslipped, utilizar o difusor abaixo do condensador sobre o instrumento, ou, adicionar uma pequena quantidade (~ 30 mL) de etanol ou xilenos para melhorar o índice refratário (pseudo-lamela). Ao utilizar xilenos, estar ciente de que eles são deve ser utilizado medidas de segurança adequadas e tóxicas, incluindo o uso de um exaustor e jaleco de proteção, óculos de proteção dos olhos, e luvas. </li><li> NÃO coloque a tampa da LCM no slide até a solução de etanol ou xilenos foi completamente limpo ou o polímero na tampa será distorcida. </li></ol></li><li> Navegue o slide e capturar imagens das áreas a serem dissecados em 10X, 20X ou 40X de ampliação. Se necessário, melhorar a imagem com software como AutoCorreção (no Microsoft Office Picture Manager), como descrito anteriormente 22. As imagens devem ser capturadas em formato jpeg, que lhes permitam ser re-importado para o software de seleção automática. </li></ol> 3. Algoritmo Análise da Imagem <ol><li> Transferência de imagens capturadas a partir do instrumento microdissection para a pasta SIVQ. Instalar e abrir os pacotes de software ArcturusXT, AutoScan e SIVQ no computador conectado ao instrumento de dissecação. Para ter acesso ao software SIVQ, por favor, entre em contato com o Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Abrir SIVQ e carregar a imagem capturada (jpeg) de interesse. &lt;/ Li&gt; <li> Navegar para a área de interesse e / ou ajustar o tamanho das janelas de visor de visualização (5 e 6). No software SIVQ, Viewport 5 mostra a imagem de pré-processamento e Viewport 6 mostra a imagem pós-processamento 16. </li><li> Escolher o tamanho do vector de anel e o número de anéis de ser utilizados. </li><li> Selecione o recurso de imagem predicado a ser capturada pelo botão direito sobre ele na Viewport 6. </li><li> Clique em &quot;Scan&quot; para analisar a imagem. </li><li> Ajustar a probabilidade estatística da imagem correspondente, utilizando as duas barras deslizantes. A barra superior ajusta a especificidade global do vetor, e é utilizado para excluir a área a partir da pesquisa inicial (com sensibilidade, tal como definido pela variável selecionado &quot;Dados&quot;) que podem representar excessiva área incluída. Por outro lado, a barra inferior é utilizado para aumentar a sensibilidade, depois de uma análise é executada, com a intenção de aumentar a área que é classificada como sendo um jogo. Ambos os controles deslizantes utilize a variável &quot;Dados&quot;, como o limiar de sensibilidade ao início do estudo. </li><li> Para salvar a imagem, clique em &quot;salvar como jpeg&quot; (imagem agora está salvo na pasta c :/ vq_test / fotos). </li><li> Analisar a imagem com o algoritmo. A saída do algoritmo de análise deve resultar numa imagem anotada para que possa ser utilizado em SIVQ-LCM. No momento, a versão atual do motor central SIVQ está em testes beta versão com a expectativa de que a versão de produção total (disponível Q1 2014) irá incorporar um kit de desenvolvimento de software completo (SDK) e uma interface de programação de aplicativo (API) para a integração simplificada de filtros espaciais gerados por usuários e as etapas de processamento de dados de fluxo de trabalho a jusante com o motor correspondente anel central. Este SDK será distribuído com um conjunto completo de documentação. <ol><li> Verifique se o heatmap SIVQ é alterado para uma cor vermelha uniforme. </li></ol></li><li> Exporte a imagem. É essencial para a re-inserir as coordenadas de posição do post-análise de imagem JPEG usando um editor de HEX para colar no cabeçalho do arquivo a partir da imagem instrumento dissecção originais. Os dados apropriados podem ser encontradas entre o &quot;Início da Imagem&quot; marcador (0xFF, 0xD8) eo primeiro &quot;Definir Quantização Table&quot; marcador (0xFF, 0xDB). </li></ol> 4. Microdissecção <ol><li> Coloque a tampa LCM no centro da região de interesse, onde as imagens foram capturadas para análise SIVQ. </li><li> Calibrar e Controle de Qualidade (CQ) os lasers UV / IR e otimizar os parâmetros, incluindo a energia, a duração, locais de laser, e velocidade de corte UV (como recomendado pelo fabricante). Execute estas calibrações antes de voltar a importar a imagem analisada. </li><li> Abrir AutoScanXT (software seleção automática) e importar a imagem analisada a partir de c :/ vq_test pasta / pics. </li><li> Treinar o software de selecção automática para reconhecer a anotação SIVQ e criar o mapa de dissecação. <ol><li> Para criar um training arquivo, selecione quatro regiões de interesse (marcadas por &quot;círculos azuis&quot;) sobre a &quot;tinta vermelha&quot; da imagem analisada SIVQ. </li><li> Selecione as áreas de fundo (marcadas por &quot;quadrados vermelhos&quot;) que não estão a ser dissecado. </li><li> Clique no botão &quot;Analisar&quot; para gerar o arquivo de treinamento, que pode ser guardado para usos posteriores. </li></ol></li><li> Realizar microdissecção usando o apropriado infravermelho (IR) e / ou ultravioleta (UV) lasers. <ol><li> Copie as áreas selecionadas para a imagem &quot;ao vivo&quot;. </li><li> Na caixa de ferramentas &quot;microdissect&quot;, selecione a captura IR apropriado ou botões de corte UV. </li></ol></li><li> Após a dissecção é completa, mova a tampa de LCM para a estação de QC e capturar uma imagem dos tecidos / células dissecadas. Outra abordagem é o de colocar a tampa sobre uma área vazia do slide antes de movê-lo para a estação de QC, o que permite ao usuário tirar fotos em várias ampliações. </li><li>Capturar uma imagem da área de tecido de interesse após microdissecção para avaliar ainda mais levantando a eficiência. </li><li> Se as células desejadas foram dissecados com êxito, clique no botão &quot;estágio atual&quot; no software ArcturusXT e retire a tampa LCM dar início ao processo de extração molecular para análise de downstream. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li><li>El-Serag, H. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens.">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

Michael R. Emmert-Buck é um inventor de patentes NIH-realizadas cobrindo captura de microdissecção a laser e recebe pagamentos baseados em direitos autorais por meio do Programa de Transferência de Tecnologia NIH.

Nós apresentamos um protocolo para a aplicação de SIVQ-LCM para microdissect células epiteliais imunoistoquímica de FFPE tecido mamário humano. O uso de um algoritmo de análise de imagem, tal como SIVQ, reduz a quantidade de mão-de tempo necessário para o processo de microdissecção. Este é um avanço potencialmente importante para o campo de tempo e uma vez que o esforço do operador é tipicamente o passo limitante da velocidade para a dissecção precisa das células de interesse. No presente protocolo, es...

Originalmente desenvolvido em meados dos anos 1990, a captura a laser microdissecção (LCM), permite ao usuário capturar com precisão células específicas ou regiões celulares de uma secção de tecido histológico via visualização microscópica 1, 2. Muitos estudos comparando a análise molecular de LCM contra arranhões tecido ilustrar o valor do método 3-12. Além disso, há três publicações de protocolo de vídeo sobre a tecnologia que está disponível para visualização 13, 14. No entanto, apesar de seu valor comprovado, LCM pode ser tedioso e trabalhoso quando o alvo de interesse é uma população de células dispersas em uma seção de tecido heterogêneo, ou quando um grande número de células são necessárias para aplicações a jusante específicas, como a proteômica. A carga colocada sobre o operador humano nos levou a desenvolver uma abordagem dissecação semi-automatizado para LCM pela combinação de um algoritmo de análise de imagem poderosa para orientar o processo LCM 15. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; Em colaboração com a Universidade de Michigan, nosso laboratório no NIH estendeu o previamente desenvolvido e relatado espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) algoritmo de forma a permitir que ele semi-automatizar o processo de seleção de tecido intrínseco à guiados microdissection, tornando assim disponível uma ferramenta com o patologista ou cientista vida em mente. Espacialmente invariante quantização vetorial (SIVQ) é um algoritmo que permite que o usuário simplesmente &quot;clicar&quot; sobre uma característica histológica de interesse para criar um vetor de toque (recurso de imagem predicado) que pode ser usado para procurar toda a imagem histológica, o ajuste do limiar estatístico conforme necessário 16-21. O mapa de calor resultante exibe a qualidade de jogos para o recurso inicial imagem predicado e é posteriormente convertido em uma única cor (vermelho) mapa anotação que pode ser importado para o instrumento LCM. O software de seleção automatizada, AutoScanXT, é então usada para desenhar um mapa com basena anotação do SIVQ guiar a captura das células alvo da amostra de tecido. O protocolo detalhado abaixo descreve a implementação de SIVQ no fluxo de trabalho microdissection.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM é uma nova metodologia que automatiza e simplifica o, o processo de dissecação de laser mais tradicional dependente do usuário. O objetivo é criar uma, rapidamente personalizável tecnologia laser avançada plataforma de dissecção. Neste relatório, nós descrevemos a integração do software de análise de imagem e espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ) sobre o instrumento ArcturusXT. O sistema contém um ArcturusXT infravermelho (IV) e ultravioleta (UV) de laser, permitindo celular específico ou grandes dissecações da área. O objetivo principal é melhorar a velocidade, precisão e reprodutibilidade da dissecção de laser para aumentar a produtividade de amostras. Esta nova abordagem facilita microdissection de animais e tecidos humanos em investigação e fluxos de trabalho clínicos.

A secção de tecido FFPE materno foi histoquímica para citoqueratina AE1/AE3 usando um protocolo padrão IHC 23. Após a coloração, o tecido foi colocado deslizante na fase ArcturusXT e o protocolo SIVQ-LCM foi iniciado como descrito acima. Uma vez que o tecido não pode ser lamínulas por microdissecção, as células coradas + IHC pode ser difícil de discernir visualmente (Figura 1A). Assim, para proporcionar um melhor índice correspondente e uma melhoria da imagem, xilenos foram adic...

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SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM é uma abordagem inovadora que utiliza um algoritmo de computador, espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ), para conduzir o processo a laser microdissection captura (LCM). O fluxo de trabalho SIVQ-LCM melhora a velocidade e precisão da microdissecção, com aplicações tanto na pesquisa e na clínica.

Protocolo SIVQ-LCM para o Instrumento ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.5K visualizações.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM é uma abordagem inovadora que utiliza um algoritmo de computador, espacialmente invariantes Quantização Vetorial (SIVQ), para conduzir o processo a laser microdissection captura (LCM). O fluxo de trabalho SIVQ-LCM melhora a velocidade e precisão da microdissecção, com aplicações tanto na pesquisa e na clínica. 