Die Studie wurde zum Teil durch die Interne Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt.

Das beschriebene Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den NIH Regeln für die Verwendung von menschlichen Gewebeproben verwendet. 1. Gewebepräparation <ol><li> Vor Beginn erhalten menschlichen Gewebeproben nach Institutional Review Board (IRB)-Protokolle. </li><li> Wählen Sie die Art des Gewebes / der Zellenblock und die entsprechenden Verarbeitungsverfahren [Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), gefroren, oder Ethanol-fixierten und in Paraffin eingebetteten (Efpe)]. Formalin-Fixierung sorgt für eine optimale Histologie, gefolgt von Ethanol-Fixierung und schockgefroren. Jedoch kann die Fixierung und Gewebebearbeitungsmethoden DNA, RNA und Protein-Menge und Qualität für nachfolgende molekulare Analyse beeinflussen und sollten berücksichtigt werden. </li><li> Schneiden Sie die Gewebe / Zellblockabschnitte auf den Objektträger Art (Glas, Glas-Membran-oder Metallrahmen Membran) der Wahl. SIVQ Analyse funktioniert genauso gut auf allen drei Folientypen. Bitte beachten Sie, dass die Pseudo-Deckglas-Methode (siehe unten) mit Xylol und Ethanol kann auf den Metallrahmen Membran Objektträgern durchgeführt werden, da der Schieber muss auf der Stufe invertiert werden. </li><li> Wählen Sie ein oder chemisch-IHC-basierte Gewebe Fleck auf Zellen von Interesse aus dem Hintergrund zu identifizieren. Beachten Sie, dass Färbeverfahren können auch auf DNA-, RNA-und Protein-Qualität und Quantität des Gewebes. Testen Sie das Gewebe nach dem Färben auf die Grundlinie Qualität von Biomolekülen, bevor Sie fortfahren mit dem Protokoll zu beurteilen. Immunhistochemie (IHC) mit DAB 15, Immunfluoreszenz, schnell rot, de-novo-, Toluidinblau und Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) (unveröffentlichte Daten): SIVQ-LCM hat sich auf Gewebe / Zytologie Folien mit Buntdurchgeführt worden. </li></ol> 2. Specimen Imaging <ol><li> Last gleitet auf den Motortisch des Mikrodissektionsgerät und starten Sie die zugehörige Software. Wählen Sie die Kontrollkästchen, um die Positionen der geladenen Folien bestimmen und sicherzustellen, dass die aufgenommenen Bilddateien sind im JPEG-Format gespeichert werden. </li><li> Optimieren Sie die imAlter Qualität durch die Anpassung der Helligkeit und Schärfe des Bildes auf dem Bildschirm, entweder mit dem manuellen Fokus-Rad oder über die Software der Dissektion Instruments. <ol><li> Mit der Bild-Toolbox-Software innerhalb der Dissektion Instruments, stellen Sie die Helligkeit der Lampe und Kamera-Gewinn entsprechend. Beispiel Werte sind Helligkeit = 60 und Gain = 220, mit dem Diffusor. </li><li> Konzentrieren Sie sich entweder manuell oder mit der Autofokus-Funktion in der Software. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Thumbnail-Übersicht Bild von der Folie, um einen Fahrplan für die Dissektion Prozess zu ermöglichen. <ol><li> Für eine optimale Bildqualität eines uncoverslipped Rutsche, nutzen Sie den Diffusor unterhalb des Kondensators auf das Instrument, oder, eine kleine Menge (~ 30 ul) entweder Ethanol oder Xylole um die feuerfeste Index (pseudo-Deckglas) zu verbessern. Bei der Verwendung von Xylol, bewusst sein, sie sind giftig und ordnungsgemäße Sicherheitsmaßnahmen verwendet werden müssen, einschließlich der Verwendung von einer Abzugshaube und Schutzlaborkittel, Schutzbrille und Handschuhe. </li><li> Stellen Sie den LCM Kappe auf der Folie, bis das Ethanol oder Xylole Lösung wurde komplett gelöscht oder das Polymer auf der Kappe verzerrt. </li></ol></li><li> Navigieren Sie die Folie und die Aufnahmen der Bereiche zu 10X, 20X oder 40X Vergrößerung seziert werden. Wenn nötig, das Image mit einer Software wie Autokorrektur (in Microsoft Office Picture Manager) wie zuvor beschrieben 22. Die Bilder müssen im JPEG-Format, um sie in den automatisierten Auswahlsoftware wieder importiert werden, damit erfasst werden. </li></ol> 3. Algorithmus Analyse der Bild <ol><li> Über aufgenommenen Bilder von der Mikrodissektionsgerät auf die SIVQ-Ordner. Installieren und öffnen Sie die ArcturusXT, Autoscan und SIVQ Softwarepakete auf dem Computer auf die Dissektion Gerät angebracht sind. Für den Zugriff auf die Software SIVQ, kontaktieren Sie bitte Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Offene SIVQ und laden Sie das aufgenommene Bild (jpeg) von Interesse. &lt;/ Li&gt; <li> Navigieren Sie zu dem Bereich von Interesse und / oder die Größe der Anzeigefenster (Viewport-5 &amp; 6). In der SIVQ Software Viewport 5 zeigt die Vorverarbeitung Bild-und Viewport-6 zeigt die Post-Processing-Bild 16. </li><li> Wählen Sie die Größe des Rings und der Anzahl der Vektor-Ringe zu verwenden. </li><li> Wählen Sie das Prädikat Bild-Funktion, um mit der rechten Maustaste darauf in Viewport 6 erfasst werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Scan&quot;, um das Bild zu analysieren. </li><li> Stellen Sie die statistische Wahrscheinlichkeit Bildabgleich mit den beiden Gleitschienen. Der obere Balken stellt die Gesamt Vektor Spezifität und wird verwendet, um Bereich von der ersten Scan auszuschließen sind (mit Sensibilität, wie durch die ausgewählten Variablen &quot;Stat&quot; definiert), die übermäßige enthalten Bereich darstellen kann. Umgekehrt ist der untere Schieber verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, nachdem eine Prüfung durchgeführt wird, mit der Absicht der Erhöhung der Fläche, die als eine Übereinstimmung klassifiziert wird. Beide Schieberegler utiren den &quot;Stat&quot;-Variable als Anfangsgrundlinie Empfindlichkeitsschwelle. </li><li> Um das Bild zu speichern, klicken Sie auf &quot;Speichern als jpeg&quot; (Bild wird nun im Ordner c :/ vq_test / Bilder gespeichert). </li><li> Analyse des Bildes mit dem Algorithmus. Der Ausgang des Analysealgorithmus muss in einer kommentierten Bild führen, damit es in SIVQ-LCM verwendet werden. Derzeit ist die aktuelle Version des SIVQ Kerntriebwerk in der Beta-Version Testen mit der Erwartung, dass die volle Produktionsversion (verfügbar ab Q1 2014) wird eine vollständige Software Development Kit (SDK) und Application Programming Interface (API) für die vereinfachte Integration von nehmen User-generierten Raumfilter und nachgelagerten Workflow Datenverarbeitungsschritte mit dem Kernring passenden Motor. Das SDK wird mit einem kompletten Satz der Dokumentation verteilt werden. <ol><li> Sicherzustellen, dass die SIVQ heatmap wird auf eine gleichmäßige rote Farbe verändert. </li></ol></li><li> Exportieren Sie das Bild. Es ist wichtig, wieder einzubetten, die die Positionskoordinaten in der pOST-Analyse-JPEG-Bild mit Hilfe eines HEX-Editor, um in der Datei-Header aus dem Originalbild Dissektionsinstrument einfügen. Die entsprechenden Daten können zwischen &quot;Start of Image&quot;-Marker (0xFF, 0xD8) und dem ersten &quot;Define Quantisierung Table&quot;-Marker (0xFF, 0xDB) gefunden werden. </li></ol> 4. Microdissection <ol><li> Platzieren Sie den LCM Kappe in der Mitte der Region von Interesse, wo die Bilder wurden für die Analyse eingefangen SIVQ. </li><li> Kalibrieren und Qualitätskontrolle (QC) die UV / IR-Laser und die Parameter, einschließlich Energie, Dauer-, Laser-Standorten und UV Schnittgeschwindigkeit (wie vom Hersteller empfohlen) optimieren. Führen Sie diese Kalibrierungen vor dem erneuten Import der Bild analysiert. </li><li> Offene AutoScanXT (automatisierte Auswahl-Software) und importieren Sie die analysierte Bild von c :/ vq_test Ordner / Bilder. </li><li> Trainieren Sie die automatisierte Software, um die Auswahl SIVQ Annotation erkennen und schaffen die Dissektion der Karte. <ol><li> Um ein Trai erstellenning-Datei, wählen vier Regionen von Interesse (durch &quot;blaue Kreise&quot; gekennzeichnet) auf der &quot;rote Farbe&quot; der SIVQ analysierte Bild. </li><li> Wählen Sie die Hintergrundbereiche (durch das &quot;rote Quadrate&quot; gekennzeichnet), die nicht seziert werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Analyze&quot;-Taste, um die Trainingsdatei, die für die spätere Verwendungen gespeichert werden können, zu erzeugen. </li></ol></li><li> Führen Mikrodissektion mit der entsprechenden Infrarot-(IR) und / oder Ultraviolett (UV)-Laser. <ol><li> Kopieren Sie die ausgewählten Bereiche auf die &quot;Live&quot;-Bild. </li><li> In der &quot;microdissect&quot; Toolbox, wählen Sie die entsprechende Capture IR-oder UV-Schneid Tasten. </li></ol></li><li> Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, bewegen Sie den LCM Kappe an der QC-Station und erfassen ein Bild der präparierten Gewebe / Zellen. Ein weiterer Ansatz ist die Kappe auf einen leeren Bereich der Folie vor dem Verschieben in den QC-Station zu platzieren, ermöglicht dies dem Benutzer, Bilder bei verschiedenen Vergrößerungen zu nehmen. </li><li>Nehmen Sie ein Bild der Gewebebereich von Interesse nach Mikrodissektion zur weiteren Beurteilung Hebeeffizienz. </li><li> Wenn die gewünschten Zellen wurden erfolgreich seziert wurde, klicken Sie auf den &quot;gegenwärtigen Zeitpunkt&quot; in der ArcturusXT Software und entfernen Sie die LCM Kappe, um die molekulare Extraktionsverfahren für Downstream-Analyse zu starten. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li><li>El-Serag, H. 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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

Michael R. Emmert-Buck ist ein Erfinder auf NIH-statt Patente für Laser Mikrodissektion und erhält lizenzbasierten Vergütungen durch die NIH Technologie-Transfer-Programm.

Wir stellen ein Protokoll für die Anwendung SIVQ-LCM auf immun Epithelzellen aus FFPE menschlichem Brustgewebe microdissect. Die Verwendung eines Bildanalysealgorithmus, wie SIVQ, reduziert die Menge der Handhabungszeit für die Mikrodissektion Prozess erforderlich. Dies ist eine potentiell wichtige Neuerung, da Bediener Zeit und Mühe ist typischerweise der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die präzise Präparation von Zellen von Interesse. In dem vorliegenden Protokoll, die wir speziell angepasste unser Verfa...

Ursprünglich in der Mitte der 1990er Jahre entwickelt, die Laser Mikrodissektion (LCM) ermöglicht dem Benutzer, genau zu erfassen spezifische Zellen oder Zellbereiche von einem histologischen Gewebeschnitt mittels mikroskopischer Visualisierung 1, 2. Viele Studien, die molekulare Analyse von LCM gegen Kratzer Gewebe veranschaulichen den Wert der Methode 12.3. Darüber hinaus gibt es drei Videoprotokoll Veröffentlichungen über die Technologie, die für die Anzeige von 13, 14 verfügbar sind. Doch trotz seiner bewährten Wert, LCM kann langwierig und mühsam sein, wenn das Ziel von Interesse ist eine verteilte Zellpopulation in einer heterogenen Gewebeschnitt, oder wenn eine große Anzahl von Zellen sind für bestimmte Downstream-Anwendungen wie Proteomics erforderlich. Die Belastung für den menschlichen Bediener platziert führte uns zu einer halbautomatischen Präparation Ansatz für LCM durch die Kombination eines leistungsfähigen Bildanalyse-Algorithmus, um die LCM-Verfahren 15 führen zu entwickeln. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In Zusammenarbeit mit der University of Michigan, unserem Labor am NIH erweitert die bereits entwickelten und berichtete ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ)-Algorithmus in einer Art und Weise, um es in semi-automatisiert das Gewebe Auswahlprozess, damit Eigen geführt Mikrodissektion, wodurch ein Werkzeug zur Verfügung mit dem Pathologen oder Lebenswissenschaftler im Auge. Ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ) ist ein Algorithmus, der Benutzer einfach &quot;Klick&quot; auf einem histologischen Merkmal von Interesse, um einen Ring-Vektor (Prädikat Bild Funktion), die verwendet werden können, um den gesamten histologischen Bild erstellen zu suchen, die Anpassung der statistischen Schwelle erlaubt nach Bedarf 16-21. Die entstehende Wärme Karte zeigt die Qualität der Übereinstimmungen mit dem Anfangsbild Prädikat-Funktion und wird anschließend in einer einzigen Farbe (rot) Beschriftungskarte, die in das LCM Instrument importiert werden können umgewandelt. Anschließend wird die automatisierte Auswahl-Software, AutoScanXT, verwendet, um eine Karte zu ziehen Basisauf SIVQ Anmerkungs Führung der Erfassung der Zielzellen aus der Gewebeprobe. Das detaillierte Protokoll beschreibt die Umsetzung der in den SIVQ Mikrodissektion Workflow.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM ist eine neue Methode, die automatisiert und rationalisiert die traditionelle, benutzerabhängige Laser Dissektion Prozess. Es zielt darauf ab, eine fortschrittliche, schnell anpassbar Laser Dissektion Plattform-Technologie erstellen. In diesem Bericht beschreiben wir die Integration der Bildanalyse-Software ortsinvariantem Vektor Quantisierung (SIVQ) auf die ArcturusXT Instrument. Die ArcturusXT System enthält sowohl eine Infrarot-(IR) und Ultraviolett-(UV) Laser, so dass für bestimmte Zelle oder große Fläche Dissektionen. Das Hauptziel ist es, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Laser-Dissektion, Probendurchsatz zu erhöhen verbessern. Dieser neue Ansatz ermöglicht Mikrodissektion von tierischen und menschlichen Geweben in der Forschung und der klinischen Arbeitsabläufe.

Ein FFPE menschlichen Brustgewebeschnitt wurde für Zytokeratin AE1/AE3 mit einem Standard-IHC-Protokoll 23 immun. Nach dem Färben wurde das Gewebe auf dem Objektträger ArcturusXT Stufe angeordnet, und die SIVQ LCM-Protokoll wurde, wie oben beschrieben eingeleitet. Da das Gewebe nicht für die Mikrodissektion Deckglas versehen werden, die IHC + gefärbten Zellen schwierig sein, visuell zu erkennen (Abbildung 1A). Um somit eine bessere Indexanpassung und ein verbessertes Bild bereitzustellen...

Watch this Scientific Journal Video about SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument at JoVE.com

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen.

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.5K Aufrufe.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen. 

Serie: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Protokoll für Mosquito Aufzucht (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Forschung

Biologie

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Neutrophile Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Die Herstellung Drosophila Embryonen für Live-Imaging mit dem Hanging-Drop-Protokoll

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

Ein Protokoll für die Produktion von KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

A Simple Protocol für das Extrahieren Hämozyten von Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

Clock Scan Protocol für Bildanalyse: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

Ein Protokoll für Labor Housing von Türkis Killifische (Nothobranchius Furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

Ein arbeitssparendes und wiederholbares Touch-Force Signaling Mutant Screen Protocol zur Untersuchung der Thigmomorphogenese einer Modellpflanze Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

Ein einfaches Protokoll zur Kartierung der Architekturmerkmale des Pflanzenwurzelsystems

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

Quantifizierung der Mitophagie in C. elegans und einer Leberkrebszelllinie

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

Autor im Rampenlicht: Nachweis der Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

Nachweis von Mitophagie in Caenorhabditis elegans und Säugetierzellen mit organellenspezifischen Farbstoffen

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...