Name: sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument
Uploaded: 2014-07-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 37 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument at JoVE.com

Die Studie wurde zum Teil durch die Interne Research Program der National Institutes of Health, National Cancer Institute, Center for Cancer Research unterstützt.

Das beschriebene Protokoll wurde in Übereinstimmung mit den NIH Regeln für die Verwendung von menschlichen Gewebeproben verwendet. 1. Gewebepräparation <ol><li> Vor Beginn erhalten menschlichen Gewebeproben nach Institutional Review Board (IRB)-Protokolle. </li><li> Wählen Sie die Art des Gewebes / der Zellenblock und die entsprechenden Verarbeitungsverfahren [Formalin fixierten und in Paraffin eingebetteten (FFPE), gefroren, oder Ethanol-fixierten und in Paraffin eingebetteten (Efpe)]. Formalin-Fixierung sorgt für eine optimale Histologie, gefolgt von Ethanol-Fixierung und schockgefroren. Jedoch kann die Fixierung und Gewebebearbeitungsmethoden DNA, RNA und Protein-Menge und Qualität für nachfolgende molekulare Analyse beeinflussen und sollten berücksichtigt werden. </li><li> Schneiden Sie die Gewebe / Zellblockabschnitte auf den Objektträger Art (Glas, Glas-Membran-oder Metallrahmen Membran) der Wahl. SIVQ Analyse funktioniert genauso gut auf allen drei Folientypen. Bitte beachten Sie, dass die Pseudo-Deckglas-Methode (siehe unten) mit Xylol und Ethanol kann auf den Metallrahmen Membran Objektträgern durchgeführt werden, da der Schieber muss auf der Stufe invertiert werden. </li><li> Wählen Sie ein oder chemisch-IHC-basierte Gewebe Fleck auf Zellen von Interesse aus dem Hintergrund zu identifizieren. Beachten Sie, dass Färbeverfahren können auch auf DNA-, RNA-und Protein-Qualität und Quantität des Gewebes. Testen Sie das Gewebe nach dem Färben auf die Grundlinie Qualität von Biomolekülen, bevor Sie fortfahren mit dem Protokoll zu beurteilen. Immunhistochemie (IHC) mit DAB 15, Immunfluoreszenz, schnell rot, de-novo-, Toluidinblau und Hämatoxylin und Eosin (H &amp; E) (unveröffentlichte Daten): SIVQ-LCM hat sich auf Gewebe / Zytologie Folien mit Buntdurchgeführt worden. </li></ol> 2. Specimen Imaging <ol><li> Last gleitet auf den Motortisch des Mikrodissektionsgerät und starten Sie die zugehörige Software. Wählen Sie die Kontrollkästchen, um die Positionen der geladenen Folien bestimmen und sicherzustellen, dass die aufgenommenen Bilddateien sind im JPEG-Format gespeichert werden. </li><li> Optimieren Sie die imAlter Qualität durch die Anpassung der Helligkeit und Schärfe des Bildes auf dem Bildschirm, entweder mit dem manuellen Fokus-Rad oder über die Software der Dissektion Instruments. <ol><li> Mit der Bild-Toolbox-Software innerhalb der Dissektion Instruments, stellen Sie die Helligkeit der Lampe und Kamera-Gewinn entsprechend. Beispiel Werte sind Helligkeit = 60 und Gain = 220, mit dem Diffusor. </li><li> Konzentrieren Sie sich entweder manuell oder mit der Autofokus-Funktion in der Software. </li></ol></li><li> Nehmen Sie ein Thumbnail-Übersicht Bild von der Folie, um einen Fahrplan für die Dissektion Prozess zu ermöglichen. <ol><li> Für eine optimale Bildqualität eines uncoverslipped Rutsche, nutzen Sie den Diffusor unterhalb des Kondensators auf das Instrument, oder, eine kleine Menge (~ 30 ul) entweder Ethanol oder Xylole um die feuerfeste Index (pseudo-Deckglas) zu verbessern. Bei der Verwendung von Xylol, bewusst sein, sie sind giftig und ordnungsgemäße Sicherheitsmaßnahmen verwendet werden müssen, einschließlich der Verwendung von einer Abzugshaube und Schutzlaborkittel, Schutzbrille und Handschuhe. </li><li> Stellen Sie den LCM Kappe auf der Folie, bis das Ethanol oder Xylole Lösung wurde komplett gelöscht oder das Polymer auf der Kappe verzerrt. </li></ol></li><li> Navigieren Sie die Folie und die Aufnahmen der Bereiche zu 10X, 20X oder 40X Vergrößerung seziert werden. Wenn nötig, das Image mit einer Software wie Autokorrektur (in Microsoft Office Picture Manager) wie zuvor beschrieben 22. Die Bilder müssen im JPEG-Format, um sie in den automatisierten Auswahlsoftware wieder importiert werden, damit erfasst werden. </li></ol> 3. Algorithmus Analyse der Bild <ol><li> Über aufgenommenen Bilder von der Mikrodissektionsgerät auf die SIVQ-Ordner. Installieren und öffnen Sie die ArcturusXT, Autoscan und SIVQ Softwarepakete auf dem Computer auf die Dissektion Gerät angebracht sind. Für den Zugriff auf die Software SIVQ, kontaktieren Sie bitte Dr. Ulysses Balis (ulysses@med.umich.edu). </li><li> Offene SIVQ und laden Sie das aufgenommene Bild (jpeg) von Interesse. &lt;/ Li&gt; <li> Navigieren Sie zu dem Bereich von Interesse und / oder die Größe der Anzeigefenster (Viewport-5 &amp; 6). In der SIVQ Software Viewport 5 zeigt die Vorverarbeitung Bild-und Viewport-6 zeigt die Post-Processing-Bild 16. </li><li> Wählen Sie die Größe des Rings und der Anzahl der Vektor-Ringe zu verwenden. </li><li> Wählen Sie das Prädikat Bild-Funktion, um mit der rechten Maustaste darauf in Viewport 6 erfasst werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Scan&quot;, um das Bild zu analysieren. </li><li> Stellen Sie die statistische Wahrscheinlichkeit Bildabgleich mit den beiden Gleitschienen. Der obere Balken stellt die Gesamt Vektor Spezifität und wird verwendet, um Bereich von der ersten Scan auszuschließen sind (mit Sensibilität, wie durch die ausgewählten Variablen &quot;Stat&quot; definiert), die übermäßige enthalten Bereich darstellen kann. Umgekehrt ist der untere Schieber verwendet, um die Empfindlichkeit zu erhöhen, nachdem eine Prüfung durchgeführt wird, mit der Absicht der Erhöhung der Fläche, die als eine Übereinstimmung klassifiziert wird. Beide Schieberegler utiren den &quot;Stat&quot;-Variable als Anfangsgrundlinie Empfindlichkeitsschwelle. </li><li> Um das Bild zu speichern, klicken Sie auf &quot;Speichern als jpeg&quot; (Bild wird nun im Ordner c :/ vq_test / Bilder gespeichert). </li><li> Analyse des Bildes mit dem Algorithmus. Der Ausgang des Analysealgorithmus muss in einer kommentierten Bild führen, damit es in SIVQ-LCM verwendet werden. Derzeit ist die aktuelle Version des SIVQ Kerntriebwerk in der Beta-Version Testen mit der Erwartung, dass die volle Produktionsversion (verfügbar ab Q1 2014) wird eine vollständige Software Development Kit (SDK) und Application Programming Interface (API) für die vereinfachte Integration von nehmen User-generierten Raumfilter und nachgelagerten Workflow Datenverarbeitungsschritte mit dem Kernring passenden Motor. Das SDK wird mit einem kompletten Satz der Dokumentation verteilt werden. <ol><li> Sicherzustellen, dass die SIVQ heatmap wird auf eine gleichmäßige rote Farbe verändert. </li></ol></li><li> Exportieren Sie das Bild. Es ist wichtig, wieder einzubetten, die die Positionskoordinaten in der pOST-Analyse-JPEG-Bild mit Hilfe eines HEX-Editor, um in der Datei-Header aus dem Originalbild Dissektionsinstrument einfügen. Die entsprechenden Daten können zwischen &quot;Start of Image&quot;-Marker (0xFF, 0xD8) und dem ersten &quot;Define Quantisierung Table&quot;-Marker (0xFF, 0xDB) gefunden werden. </li></ol> 4. Microdissection <ol><li> Platzieren Sie den LCM Kappe in der Mitte der Region von Interesse, wo die Bilder wurden für die Analyse eingefangen SIVQ. </li><li> Kalibrieren und Qualitätskontrolle (QC) die UV / IR-Laser und die Parameter, einschließlich Energie, Dauer-, Laser-Standorten und UV Schnittgeschwindigkeit (wie vom Hersteller empfohlen) optimieren. Führen Sie diese Kalibrierungen vor dem erneuten Import der Bild analysiert. </li><li> Offene AutoScanXT (automatisierte Auswahl-Software) und importieren Sie die analysierte Bild von c :/ vq_test Ordner / Bilder. </li><li> Trainieren Sie die automatisierte Software, um die Auswahl SIVQ Annotation erkennen und schaffen die Dissektion der Karte. <ol><li> Um ein Trai erstellenning-Datei, wählen vier Regionen von Interesse (durch &quot;blaue Kreise&quot; gekennzeichnet) auf der &quot;rote Farbe&quot; der SIVQ analysierte Bild. </li><li> Wählen Sie die Hintergrundbereiche (durch das &quot;rote Quadrate&quot; gekennzeichnet), die nicht seziert werden. </li><li> Klicken Sie auf &quot;Analyze&quot;-Taste, um die Trainingsdatei, die für die spätere Verwendungen gespeichert werden können, zu erzeugen. </li></ol></li><li> Führen Mikrodissektion mit der entsprechenden Infrarot-(IR) und / oder Ultraviolett (UV)-Laser. <ol><li> Kopieren Sie die ausgewählten Bereiche auf die &quot;Live&quot;-Bild. </li><li> In der &quot;microdissect&quot; Toolbox, wählen Sie die entsprechende Capture IR-oder UV-Schneid Tasten. </li></ol></li><li> Nachdem die Präparation abgeschlossen ist, bewegen Sie den LCM Kappe an der QC-Station und erfassen ein Bild der präparierten Gewebe / Zellen. Ein weiterer Ansatz ist die Kappe auf einen leeren Bereich der Folie vor dem Verschieben in den QC-Station zu platzieren, ermöglicht dies dem Benutzer, Bilder bei verschiedenen Vergrößerungen zu nehmen. </li><li>Nehmen Sie ein Bild der Gewebebereich von Interesse nach Mikrodissektion zur weiteren Beurteilung Hebeeffizienz. </li><li> Wenn die gewünschten Zellen wurden erfolgreich seziert wurde, klicken Sie auf den &quot;gegenwärtigen Zeitpunkt&quot; in der ArcturusXT Software und entfernen Sie die LCM Kappe, um die molekulare Extraktionsverfahren für Downstream-Analyse zu starten. </li></ol>

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Michael R. Emmert-Buck ist ein Erfinder auf NIH-statt Patente für Laser Mikrodissektion und erhält lizenzbasierten Vergütungen durch die NIH Technologie-Transfer-Programm.

Wir stellen ein Protokoll für die Anwendung SIVQ-LCM auf immun Epithelzellen aus FFPE menschlichem Brustgewebe microdissect. Die Verwendung eines Bildanalysealgorithmus, wie SIVQ, reduziert die Menge der Handhabungszeit für die Mikrodissektion Prozess erforderlich. Dies ist eine potentiell wichtige Neuerung, da Bediener Zeit und Mühe ist typischerweise der geschwindigkeitsbestimmende Schritt für die präzise Präparation von Zellen von Interesse. In dem vorliegenden Protokoll, die wir speziell angepasste unser Verfa...

Ursprünglich in der Mitte der 1990er Jahre entwickelt, die Laser Mikrodissektion (LCM) ermöglicht dem Benutzer, genau zu erfassen spezifische Zellen oder Zellbereiche von einem histologischen Gewebeschnitt mittels mikroskopischer Visualisierung 1, 2. Viele Studien, die molekulare Analyse von LCM gegen Kratzer Gewebe veranschaulichen den Wert der Methode 12.3. Darüber hinaus gibt es drei Videoprotokoll Veröffentlichungen über die Technologie, die für die Anzeige von 13, 14 verfügbar sind. Doch trotz seiner bewährten Wert, LCM kann langwierig und mühsam sein, wenn das Ziel von Interesse ist eine verteilte Zellpopulation in einer heterogenen Gewebeschnitt, oder wenn eine große Anzahl von Zellen sind für bestimmte Downstream-Anwendungen wie Proteomics erforderlich. Die Belastung für den menschlichen Bediener platziert führte uns zu einer halbautomatischen Präparation Ansatz für LCM durch die Kombination eines leistungsfähigen Bildanalyse-Algorithmus, um die LCM-Verfahren 15 führen zu entwickeln. &lt;p class = &quot;jove_content&quot;&gt; In Zusammenarbeit mit der University of Michigan, unserem Labor am NIH erweitert die bereits entwickelten und berichtete ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ)-Algorithmus in einer Art und Weise, um es in semi-automatisiert das Gewebe Auswahlprozess, damit Eigen geführt Mikrodissektion, wodurch ein Werkzeug zur Verfügung mit dem Pathologen oder Lebenswissenschaftler im Auge. Ortsinvariantem Vektor-Quantisierung (SIVQ) ist ein Algorithmus, der Benutzer einfach &quot;Klick&quot; auf einem histologischen Merkmal von Interesse, um einen Ring-Vektor (Prädikat Bild Funktion), die verwendet werden können, um den gesamten histologischen Bild erstellen zu suchen, die Anpassung der statistischen Schwelle erlaubt nach Bedarf 16-21. Die entstehende Wärme Karte zeigt die Qualität der Übereinstimmungen mit dem Anfangsbild Prädikat-Funktion und wird anschließend in einer einzigen Farbe (rot) Beschriftungskarte, die in das LCM Instrument importiert werden können umgewandelt. Anschließend wird die automatisierte Auswahl-Software, AutoScanXT, verwendet, um eine Karte zu ziehen Basisauf SIVQ Anmerkungs Führung der Erfassung der Zielzellen aus der Gewebeprobe. Das detaillierte Protokoll beschreibt die Umsetzung der in den SIVQ Mikrodissektion Workflow.

<table><tbody><tr><td>Positive Charged Glass Slides</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951Plus-001</td><td></td></tr><tr><td>Xylenes, ACS reagent, &amp;ge;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&amp;nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>247642</td><td>CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td></tr><tr><td>Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td><td>The Warner-Graham Company</td><td>6.505E+12</td><td>CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td></tr><tr><td>Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td><td>Life Technologies</td><td>ARCTURUSXT</td><td></td></tr><tr><td>AutoScanXT Software</td><td>Life Technologies</td><td></td><td>An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td></tr><tr><td>Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td><td>University of Michigan</td><td></td><td>This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td></tr></tbody></table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM ist eine neue Methode, die automatisiert und rationalisiert die traditionelle, benutzerabhängige Laser Dissektion Prozess. Es zielt darauf ab, eine fortschrittliche, schnell anpassbar Laser Dissektion Plattform-Technologie erstellen. In diesem Bericht beschreiben wir die Integration der Bildanalyse-Software ortsinvariantem Vektor Quantisierung (SIVQ) auf die ArcturusXT Instrument. Die ArcturusXT System enthält sowohl eine Infrarot-(IR) und Ultraviolett-(UV) Laser, so dass für bestimmte Zelle oder große Fläche Dissektionen. Das Hauptziel ist es, die Geschwindigkeit, Genauigkeit und Reproduzierbarkeit des Laser-Dissektion, Probendurchsatz zu erhöhen verbessern. Dieser neue Ansatz ermöglicht Mikrodissektion von tierischen und menschlichen Geweben in der Forschung und der klinischen Arbeitsabläufe.

Ein FFPE menschlichen Brustgewebeschnitt wurde für Zytokeratin AE1/AE3 mit einem Standard-IHC-Protokoll 23 immun. Nach dem Färben wurde das Gewebe auf dem Objektträger ArcturusXT Stufe angeordnet, und die SIVQ LCM-Protokoll wurde, wie oben beschrieben eingeleitet. Da das Gewebe nicht für die Mikrodissektion Deckglas versehen werden, die IHC + gefärbten Zellen schwierig sein, visuell zu erkennen (Abbildung 1A). Um somit eine bessere Indexanpassung und ein verbessertes Bild bereitzustellen...

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SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen.

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Aufrufe.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM ist ein innovativer Ansatz, der einen Computer-Algorithmus, räumlich invarianten Vektor Quantisierung (SIVQ) nutzt, um den Laser Mikrodissektion Verfahren (LCM) zu fahren. Die SIVQ LCM-Workflow die Geschwindigkeit und Genauigkeit der Mikrodissektion stark verbessert, mit Anwendungen in der Forschung und klinischen Umgebungen. 

Serie: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Online Size-exclusion and Ion-exchange Chromatography on a SAXS Beamline

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, particle size and shape, and surface-to-volume ratio of macromolecules. The technique is applicable to a very wide variety of solution conditions spanning a broad range of concentrations, pH values, ionic strengths, temperatures, additives, etc., but the sample is required to be monodisperse. This caveat led to the implementation of liquid chromatography systems on SAXS beamlines. Here, we describe the upstream integration of size-exclusion (SEC) and ion-exchange chromatography (IEC) on a beamline, different methods for optimal background subtraction, and data reduction. As an example, we describe how we use SEC- and IEC-SAXS on a fragment of the essential vaccinia virus protein D5, consisting of a D5N helicase domain. We determine its overall shape and molecular weight, showing the hexameric structure of the protein.

The determination of the solution structure of a protein by small angle X-ray scattering (SAXS) requires monodisperse samples. Here, we present two possibilities to ensure minimal delays between sample preparation and data acquisition: online size-exclusion chromatography (SEC) and online ion-exchange chromatography (IEC).

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Biological small angle X-ray scattering (BioSAXS) is a powerful technique in molecular and structural biology used to determine solution structure, ...

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Quantitative and Qualitative Method for Sphingomyelin by LC-MS Using Two Stable Isotopically Labeled Sphingomyelin Species

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Here, we present a protocol to quantify and qualify each sphingomyelin species using multiple reaction monitoring and MS/MS/MS mode, respectively.

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Ingenieurwesen

Measurements of Long-range Electronic Correlations During Femtosecond Diffraction Experiments Performed on Nanocrystals of Buckminsterfullerene

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the results of femtosecond X-ray free electron laser (XFEL) experiments. An increasing number of experimental observations have shown that although nuclear motion can be negligible, given a short enough incident pulse duration, electronic motion cannot be ignored. The current and widely accepted models assume that although electrons undergo dynamics driven by interaction with the pulse, their motion could largely be considered &#39;random&#39;. This would then allow the supposedly incoherent contribution from the electronic motion to be treated as a continuous background signal and thus ignored. The original aim of our experiment was to precisely measure the change in intensity of individual Bragg peaks, due to X-ray induced electronic damage in a model system, crystalline C60. Contrary to this expectation, we observed that at the highest X-ray intensities, the electron dynamics in C60 were in fact highly correlated, and over sufficiently long distances that the positions of the Bragg reflections are significantly altered. This paper describes in detail the methods and protocols used for these experiments, which were conducted both at the Linac Coherent Light Source (LCLS) and the Australian Synchrotron (AS) as well as the crystallographic approaches used to analyse the data.

We describe an experiment designed to probe the electronic damage induced in nanocrystals of Buckminsterfullerene (C60) by intense, femtosecond pulses of X-rays. The experiment found that, surprisingly, rather than being stochastic, the X-ray induced electron dynamics in C60 are highly correlated, extending over hundreds of unit cells within the crystals1.

Messungen von Langstrecken elektronische Korrelationen während Femtosekunden Beugungsexperimente auf Nanokristallen Buckminsterfulleren durchgeführt

The precise details of the interaction of intense X-ray pulses with matter are a topic of intense interest to researchers attempting to interpret the ...

Chemie

High Speed Sub-GHz Spectrometer for Brillouin Scattering Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a non-contact measurement method that can be used to obtain direct readouts of viscoelastic material properties. It has been a useful tool in material characterization, structural monitoring and environmental sensing. In the past, Brillouin spectroscopy has usually employed scanning Fabry-Perot etalons to perform spectral analysis. This process requires high illumination power and long acquisition times, making the technique unsuitable for biomedical applications. A recently introduced novel spectrometer overcomes this challenge by employing two VIPAs in a cross-axis configuration. This innovation enables sub-Gigahertz (GHz) resolution spectral analysis with sub-second acquisition time and illumination power within the safety limits of biological tissue. The multiple new applications facilitated by this improvement are currently being explored in biological research and clinical application.

Here we present a protocol to build a rapid Brillouin spectrometer. Cascading virtually imaged phase array (VIPA) etalons achieve a measurement speed more than 1,000 times faster than traditional scanning Fabry-Perot spectrometers. This improvement provides the means for Brillouin analysis of tissue and biomaterials at low power levels in vivo.

High Speed ​​Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

The goal of this protocol is to build a parallel high-extinction and high-resolution optical Brillouin spectrometer. Brillouin spectroscopy is a ...

Biotechnik

X-ray Beam Induced Current Measurements for Multi-Modal X-ray Microscopy of Solar Cells

X-ray beam induced current (XBIC) measurements allow mapping of&#160;the nanoscale performance of electronic devices such as solar cells. Ideally, XBIC is employed simultaneously with other techniques within a multi-modal X-ray microscopy approach. An example is given herein combining XBIC with X-ray fluorescence to enable point-by-point correlations of the electrical performance with chemical composition. For the highest signal-to-noise ratio in XBIC measurements, lock-in amplification plays a crucial role. By this approach, the X-ray beam is modulated by an optical chopper upstream of the sample. The modulated X-ray beam induced electrical signal is amplified and demodulated to the chopper frequency using a lock-in amplifier. By optimizing low-pass filter settings, modulation frequency, and amplification amplitudes, noise can efficiently be suppressed for the extraction of a clear XBIC signal. A similar setup can be used to measure the X-ray beam induced voltage (XBIV). Beyond standard XBIC/XBIV measurements, XBIC can be measured with bias light or bias voltage applied such that outdoor working conditions of solar cells can be reproduced during in-situ and operando measurements. Ultimately, the multi-modal and multi-dimensional evaluation of electronic devices at the nanoscale enables new insights into the complex dependencies between composition, structure, and performance, which is an important step towards solving the materials&#39; paradigm.

A setup for X-ray beam induced current measurements at synchrotron beamlines is described. It unveils the nanoscale performance of solar cells and extends the suite of techniques for multi-modal X-ray microscopy. From wiring to signal-to-noise optimization, it is shown how to perform state-of-the-art XBIC measurements at a hard X-ray microprobe.

Röntgenstrahl-Induzierte Strommessungen für die multimodale Röntgenmikroskopie von Solarzellen

X-ray beam induced current (XBIC) measurements allow mapping of&#160;the nanoscale performance of electronic devices such as solar cells. Ideally, XBIC is ...

Sample Preparation and Transfer Protocol for In-Vacuum Long-Wavelength Crystallography on Beamline I23 at Diamond Light Source

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, chlorine, or calcium, that are often natively present in macromolecules. This enables the direct structure solution of proteins and nucleic acids via experimental phasing without the need of additional labelling. To eliminate the significant air absorption of X-rays in this wavelength regime, these experiments are performed in a vacuum environment. Beamline I23 at Diamond Light Source, UK, is the first synchrotron instrument of its kind, designed and optimized for MX experiments in the long wavelength range towards 5 &#197;. 
To make this possible, a large vacuum vessel encloses all endstation components of the sample environment. The necessity to maintain samples at cryogenic temperatures during storage and data collection in vacuum requires the use of thermally conductive sample holders. This facilitates efficient heat removal to ensure sample cooling to approximately 50 K. The current protocol describes the procedures used for sample preparation and transfer of samples into vacuum on beamline I23. Ensuring uniformity in practices and methods already established within the macromolecular crystallography community, sample cooling to liquid nitrogen temperature can be performed in any laboratory setting equipped with standard MX tools. 
Cryogenic storage and transport of samples only require standard commercially available equipment. Specialized equipment is required for the transfer of cryogenically cooled crystals from liquid nitrogen into the vacuum endstation. Bespoke sample handling tools and a dedicated Cryogenic Transfer System (CTS) have been developed in house. Diffraction data collected on samples prepared using this protocol show excellent merging statistics, indicating that the quality of samples is unaltered during the procedure. This opens unique opportunities for in-vacuum MX in a wavelength range beyond standard synchrotron beamlines.

Here, we present a protocol for cryogenic sample preparation and transfer of crystals into the vacuum endstation on beamline I23 at Diamond Light Source, for long-wavelength macromolecular X-ray crystallography experiments.

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Long-wavelength macromolecular crystallography (MX) exploits the anomalous scattering properties of elements, such as sulfur, phosphorus, potassium, ...

A Guide to Structured Illumination TIRF Microscopy at High Speed with Multiple Colors

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular level in the chemical and biomedical sciences. Although commercial SIM systems are available, systems that are custom designed in the laboratory can outperform commercial systems, the latter typically designed for ease of use and general purpose applications, both in terms of imaging fidelity and speed. This article presents an in-depth guide to building a SIM system that uses total internal reflection (TIR) illumination and is capable of imaging at up to 10 Hz in three colors at a resolution reaching 100 nm. Due to the combination of SIM and TIRF, the system provides better image contrast than rival technologies. To achieve these specifications, several optical elements are used to enable automated control over the polarization state and spatial structure of the illumination light for all available excitation wavelengths. Full details on hardware implementation and control are given to achieve synchronization between excitation light pattern generation, wavelength, polarization state, and camera control with an emphasis on achieving maximum acquisition frame rate. A step-by-step protocol for system alignment and calibration is presented and the achievable resolution improvement is validated on ideal test samples. The capability for video-rate super-resolution imaging is demonstrated with living cells.

This article provides an in depth guide for the assembly and operation of a structured illumination microscope operating with total internal reflection fluorescence illumination (TIRF-SIM) to image dynamic biological processes with optical super-resolution in multiple colors.

Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben

Optical super-resolution imaging with structured illumination microscopy (SIM) is a key technology for the visualization of processes at the molecular ...

Quantitative Atomic-Site Analysis of Functional Dopants/Point Defects in Crystalline Materials by Electron-Channeling-Enhanced Microanalysis

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident high-energy electron beam is rocked with the submicrometric pivot point fixed on a specimen. This method enables us to quantitatively derive the site occupancies and site-dependent chemical information of impurities or intentionally doped functional elements in a specimen, using energy-dispersive X-ray spectroscopy and electron energy-loss spectroscopy attached to a scanning transmission electron microscope, which is of significant interest to current materials science, particularly related to nanotechnologies. This scheme is applicable to any combination of elements even when the conventional Rietveld analysis by X-ray or neutron diffraction occasionally fails to provide the desired results because of limited sample sizes and close scattering factors of neighboring elements in the periodic table. In this methodological article, we demonstrate the basic experimental procedure and analysis method of the present beam-rocking microanalysis.

We provide a general outline of quantitative microanalysis methods for estimating the site occupancies of impurities and their chemical states by taking advantage of electron-channeling phenomena under incident electron beam-rocking conditions, which reliably extract information from minority species, light elements, oxygen vacancies, and other point/line/planar defects.

Quantitative Atom-Standortanalyse von funktionellen Dopants/Punktdefekten in kristallinen Materialien durch Elektronenkanaling-verstärkte Mikroanalyse

A novel elemental and chemical analysis scheme based on electron-channeling phenomena in crystalline materials is introduced, where the incident ...

Using a Cyclic Ion Mobility Spectrometer for Tandem Ion Mobility Experiments

Accurate characterization of chemical structures is important to understand their underlying biological mechanisms and functional properties. Mass spectrometry (MS) is a popular tool but is not always sufficient to completely unveil all structural features. For example, although carbohydrates are biologically relevant, their characterization is complicated by numerous levels of isomerism. Ion mobility spectrometry (IMS) is an interesting complement because it is sensitive to ion conformations and, thus, to isomerism. 
Furthermore, recent advances have significantly improved the technique: the last generation of Cyclic IMS instruments offers additional capabilities compared to linear IMS instruments, such as an increased resolving power or the possibility to perform tandem ion mobility (IMS/IMS) experiments. During IMS/IMS, an ion is selected based on its ion mobility, fragmented, and reanalyzed to obtain ion mobility information about its fragments. Recent work showed that the mobility profiles of the fragments contained in such IMS/IMS data can act as a fingerprint of a particular glycan and can be used in a molecular networking strategy to organize glycomics datasets in a structurally relevant way. 
The goal of this protocol is thus to describe how to generate IMS/IMS data, from sample preparation to the final Collision Cross Section (CCS) calibration of the ion mobility dimension that yields reproducible spectra. Taking the example of one representative glycan, this protocol will show how to build an IMS/IMS control sequence on a Cyclic IMS instrument, how to account for this control sequence to translate IMS arrival time into drift time (i.e., the effective separation time applied to the ions), and how to extract the relevant mobility information from the raw data. This protocol is designed to clearly explain the critical points of an IMS/IMS experiment and thus help new Cyclic IMS users perform straightforward and reproducible acquisitions.

Ion mobility spectrometry (IMS) is an interesting complement to mass spectrometry for the characterization of biomolecules, notably because it is sensitive to isomerism. This protocol describes a tandem IMS (IMS/IMS) experiment, which allows the isolation of a molecule and the generation of the mobility profiles of its fragments.

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

Zusammenfassung

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Kapitel in diesem Video

Online Größenausschluss und Ionenaustausch-Chromatographie auf einem SAXS Strahlrohr

Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Anwenden von Röntgen Imaging Kristall Spektroskopie für den Einsatz als Hochtemperatur-Plasmadiagnose

Messungen von Langstrecken elektronische Korrelationen während Femtosekunden Beugungsexperimente auf Nanokristallen Buckminsterfulleren durchgeführt

High Speed Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

Röntgenstrahl-Induzierte Strommessungen für die multimodale Röntgenmikroskopie von Solarzellen

Probenvorbereitungs- und Übertragungsprotokoll für die In-Vakuum-Langwellenkristallographie auf der Beamline I23 an der Diamantlichtquelle

Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben

Quantitative Atom-Standortanalyse von funktionellen Dopants/Punktdefekten in kristallinen Materialien durch Elektronenkanaling-verstärkte Mikroanalyse

Verwendung eines zyklischen Ionenmobilitätsspektrometers für Tandemionen-Mobilitätsexperimente

SIVQ LCM-Protokoll für das Instrument ArcturusXT

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Quantitative und Qualitative Methode für Sphingomyelin von LC-MS mit zwei stabilen isotopischer beschriftet Sphingomyelin Arten

Anwenden von Röntgen Imaging Kristall Spektroskopie für den Einsatz als Hochtemperatur-Plasmadiagnose

Messungen von Langstrecken elektronische Korrelationen während Femtosekunden Beugungsexperimente auf Nanokristallen Buckminsterfulleren durchgeführt

High Speed ​​Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis

Röntgenstrahl-Induzierte Strommessungen für die multimodale Röntgenmikroskopie von Solarzellen

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Ein Leitfaden für Strukturierte Beleuchtung TIRF Mikroskopie bei hoher Geschwindigkeit mit mehreren Farben

Quantitative Atom-Standortanalyse von funktionellen Dopants/Punktdefekten in kristallinen Materialien durch Elektronenkanaling-verstärkte Mikroanalyse

Verwendung eines zyklischen Ionenmobilitätsspektrometers für Tandemionen-Mobilitätsexperimente

High Speed Unter GHz-Spektrometer für Brillouin-Streuung Analysis