Çalışma Ulusal Sağlık Enstitüleri İntramural Araştırma Programı, Ulusal Kanser Enstitüsü, Kanser Araştırma Merkezi tarafından kısmen desteklenmiştir.

Açıklanan protokol, insan doku örneklerinin kullanımı NIH kurallarına uygun olarak kullanıldı. 1.. Doku Hazırlanması <ol><li> Önce başına, Kurumsal Değerlendirme Kurulu (KİK) protokolleri doğrultusunda insan doku örnekleri elde. </li><li> Doku / hücre blok türü ve buna tekabül eden işleme yöntemi [dondurulmuş formalinle sabitlenmiş parafine gömülmüş (FFPE), etanol ya da sabitlenmiş parafine gömülmüş (EFPE)] seçin. Formalin fiksasyon etanol tespit ve flaş dondurulmuş ardından, optimum histoloji sağlar. Bununla birlikte, sabitleme ve doku işleme yöntemleri DNA, RNA ve protein miktarı ve alt moleküler analiz için kalitesini etkileyebilir ve dikkate alınmalıdır. </li><li> Seçim kayıcı türü (cam, cam membran veya metal çerçeve membranı) üzerine doku / hücre blok bölümleri kesilir. SIVQ analizler her üç slayt tiplerinde eşit derecede iyi çalışır. Şunu unutmayın ki sahte-lamel yöntem iksilenler ve Ethan ile (aşağıda tarif edilmiştir)slayt sahnede ters olmalıdır yana ol metal çerçeve membran slaytlar üzerinde gerçekleştirilemez. </li><li> Arka ilgi hücreleri belirlemek için bir kimyasal veya İHK-tabanlı doku leke seçin. Bu boyama yöntemleri de DNA, RNA ve protein kalitesi ve doku miktarını etkileyebilir. Protokolü ile devam etmeden önce biyomoleküllerin temel kalitesini değerlendirmek için boyandıktan sonra doku sınayın. DAB 15, immunofloresan, hızlı, kırmızı, de novo kırmızı, mavi toluidin ve hematoksilen ve eozin (H &amp; E) (yayınlanmamış veri) ile immünhistokimyasal (İHK): SIVQ-LCM ile boyanan doku / sitoloji slaytlar üzerinde yapılmıştır. </li></ol> 2.. Numune Görüntüleme <ol><li> Yük mikrodisseksiyon aracın motorlu sahneye slaytlar ve ilgili yazılımı başlatmak. Yüklenen slaytlar pozisyonlarını tayin ve yakalanan görüntü dosyalarını jpeg formatında kaydedilecek sağlamak için onay kutularını seçin. </li><li> Im optimizeyaş manuel odaklama tekerlek veya diseksiyonu cihazın yazılımı aracılığıyla kullanarak, ekrandaki görüntünün parlaklığını ve odak ayarlayarak kalitesi. <ol><li> Diseksiyon cihazın yazılımına Görüntü Araç Kutusu&#39;nu kullanarak, uygun bir lamba parlaklığı ve kamera kazanç ayarlayın. Örnek değerler difüzör ile, parlaklık = 60 ve kazanç = 220 bulunmaktadır. </li><li> Elle veya yazılım otofokus özelliği ile odaklanın. </li></ol></li><li> Diseksiyon işlemi için bir yol haritası sağlamak için slayt bir küçük bakış görüntü yakalayın. <ol><li> Bir uncoverslipped sürgünün en iyi görüntü kalitesini sağlamak için, alet üzerinde kondansatör altında difüzör kullanmak veya, refrakter indeksi (yalancı lamel) geliştirmek için, etanol ya da ksilen ya da küçük bir miktar (~ 30 ul) ekleyin. Ksilen kullanırken, bir davlumbaz ve koruyucu laboratuvar önlüğü, gözlük, göz, ve eldiven kullanımı dahil, toksik ve uygun güvenlik önlemleri kullanılmalıdır edilmektedir farkında olmak. </li><li> Etanol veya iksilenler çözüm tamamen temizlenir veya kapağı üzerindeki polimer bozuk olacak kadar slaytta LCM kap koymayın. </li></ol></li><li> 10X, 20X, 40X büyütme veya disseke edilecek alanların slayt ve fotoğraf çekimi gidin. Gerekirse, daha önce 22 açıklandığı gibi (Microsoft Office Picture Manager) Otomatik Düzelt olarak yazılım ile imajını geliştirmek. Görüntüler onları otomatik seçim yazılımı yeniden ithal izin vermek için jpeg formatında ele olmalıdır. </li></ol> Görüntü 3. Algoritma Analizi <ol><li> Transferi SIVQ klasörüne mikrodisseksiyon cihazdan çekilen görüntüleri. Yükleyin ve diseksiyon cihaza bağlı bilgisayara ArcturusXT, Otomatik Tarama ve SIVQ yazılım paketlerini açın. SIVQ yazılımına erişim için, Dr Ulysses BALIS (ulysses@med.umich.edu) ile irtibata geçiniz. </li><li> Açık SIVQ ve çekilen görüntüyü ilgi (jpeg) yükleyin. &lt;/ Li&gt; <li> Ilgi alanına gidin ve / veya vitrinlerde (Çerçevesi 5 ve 6) boyutunu ayarlayın. SIVQ yazılım, Viewport 5 ön-işleme görüntüyü gösterir ve Çerçevesi 6 post-processing görüntüsünü 16 göstermektedir. </li><li> Halka vektör ve kullanılacak halkaların sayısı boyutunu seçin. </li><li> ViewPort&#39;un 6 üzerine sağ tıklayarak çekilecek yüklem görüntü özelliğini seçin. </li><li> Görüntüyü analiz etmek &quot;tarama&quot; tıklayın. </li><li> İki kayar çubuklarını kullanarak görüntü eşleştirme istatistiksel olasılığını ayarlayın. Üst bar genel vektör özgüllük ayarlar ve (seçilen &quot;Stat&quot; değişkeni tarafından tanımlanan hassasiyet ile) aşırı dahil alanını temsil edebilir ki ilk tarama alanı dışlamak için kullanılır. Tersine, daha düşük bir sürgü tarama yapıldıktan sonra bir eşleşme olarak sınıflandırılır artan alanının amacı ile, duyarlılığı artırmak için kullanılmaktadır. Bu kaymak kontrollerin Hem İYEilk temel hassasiyet eşiği olarak lizedirler &quot;Stat&quot; değişken. </li><li> Görüntüyü kaydetmek için, (görüntü şimdi c :/ vq_test klasörü / resimlerim kaydedilir) &quot;jpeg olarak kaydetmek&quot; tıklayın. </li><li> Algoritması ile görüntüyü analiz. Algoritma analiz çıktısı SIVQ-LCM kullanılmak için açıklamalı bir görüntü ile sonuçlanması gerekmektedir. Şu anda, SIVQ çekirdek motor güncel sürümü tam üretim versiyonu (mevcut Q1 2014) basitleştirilmiş entegrasyonu için tam bir yazılım geliştirme kiti (SDK) ve uygulama programlama arabirimi (API) dahil olacağı beklentisi ile beta sürümü test olduğunu kullanıcı tarafından oluşturulan uzaysal filtreler ve çekirdek halka eşleşen motor ile aşağı akışı veri işleme adımlar. Bu SDK belgelerine tam bir set ile dağıtılacaktır. <ol><li> SIVQ heatmap bir düzgün kırmızı renge değişir emin olun. </li></ol></li><li> Görüntü ihracat. Bu p konum koordinatları yeniden gömmek için gereklidirOrijinal diseksiyon enstrüman görüntü dosyası başlığı yapıştırmak için bir HEX editörü kullanarak ost-analiz jpeg görüntü. Uygun veri &quot;Image Start&quot; işaretleyici (0xFF, 0xD8) ve ilk &quot;Kuantalama Tablo tanımla&quot; işaretleyici (0xFF, 0xDB) arasında bulunabilir. </li></ol> 4. Mikrodiseksiyon <ol><li> Görüntüler SIVQ analizi için yakalanan ilgi bölgesi, merkezinde LCM kapağı yerleştirin. </li><li> Kalibre ve Kalite Kontrol (QC) UV / IR lazerler ve güç, süre, lazer yerle ve (üretici tarafından önerilen gibi) UV kesim hız dahil parametrelerini optimize. Analiz görüntüyü yeniden ithal etmeden önce bu kalibrasyonları gerçekleştirin. </li><li> Açık AutoScanXT (otomatik seçim yazılımı) ve c :/ vq_test klasörü / resimlerim gelen analiz görüntüyü içe. </li><li> SIVQ notunu tanımak ve diseksiyon haritası oluşturmak için otomatik seçim yazılımı eğitin. <ol><li> Bir Trai oluşturmak içinning dosyası, SIVQ analiz görüntünün &quot;kırmızı boya&quot; on (&quot;mavi daireler&quot; ile işaretlenmiş) ilgi dört bölge seçin. </li><li> Disseke olması değildir (&quot;kırmızı kareler&quot; ile işaretlenmiş) arka plan alanları seçin. </li><li> Sonraki kullanımlar için kaydedilebilir eğitim dosyası oluşturmak için &quot;Analyze&quot; butonuna tıklayın. </li></ol></li><li> Uygun kızılötesi (IR) ve / veya ultraviyole (UV) lazerler kullanılarak mikrodiseksiyon gerçekleştirin. <ol><li> &quot;Canlı&quot; görüntüsünün üzerine seçili alanları kopyalayın. </li><li> &quot;Microdissect&quot; Araç kutusunda, uygun IR yakalama veya UV kesme düğmelerini seçin. </li></ol></li><li> Diseksiyon tamamlandıktan sonra, QC istasyonuna LCM kapağı taşımak ve disseke doku / hücrelerin bir görüntü yakalamak. Başka bir yaklaşım önce QC istasyonuna hareketli slayt boş bir alanı kap yerleştirmek için, bu kullanıcının çeşitli büyütme fotoğraf çekmek için izin verir. </li><li>Verimliliği daha da kaldırma değerlendirmek için Mikrodiseksiyon sonra ilgi doku alanının görüntüsünü yakalayabilir. </li><li> İstediğiniz hücreleri başarıyla disseke varsa, ArcturusXT yazılım &quot;mevcut sahne&quot; butonuna tıklayın ve alt analizi için moleküler çıkarma prosedürünü başlatmak için LCM kapağı çıkarın. </li></ol>

<ol>
	<li>Bonner, R. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection:+molecular+analysis+of+tissue.">Laser capture microdissection: molecular analysis of tissue.</a> Science. 278, 1481-1483 (1997).</li><li>Emmert-Buck, M. R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection.">Laser capture microdissection.</a> Science. 274, 998-1001 (1996).</li><li>Edwards, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+mammalian+tissue.">Laser capture microdissection of mammalian tissue.</a> J Vis Exp. (8), (2007).</li><li>El-Serag, H. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Gene+expression+in+Barrett's+esophagus:+laser+capture+versus+whole+tissue.">Gene expression in Barrett's esophagus: laser capture versus whole tissue.</a> Scandinavian journal of gastroenterology. 44, 787-795 (2009).</li><li>Espina, V., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser-capture+microdissection.">Laser-capture microdissection.</a> Nature. 1, 586-603 (2006).</li><li>Harrell, J. C., Dye, W. W., Harvell, D. M., Sartorius, C. A., Horwitz, K. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Contaminating+cells+alter+gene+signatures+in+whole+organ+versus+laser+capture+microdissected+tumors:+a+comparison+of+experimental+breast+cancers+and+their+lymph+node+metastases.">Contaminating cells alter gene signatures in whole organ versus laser capture microdissected tumors: a comparison of experimental breast cancers and their lymph node metastases.</a> Clinical &amp; experimental metastasis. 25, 81-88 (2008).</li><li>Rodriguez-Canales, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimal+molecular+profiling+of+tissue+and+tissue+components:+defining+the+best+processing+and+microdissection+methods+for+biomedical+applications.">Optimal molecular profiling of tissue and tissue components: defining the best processing and microdissection methods for biomedical applications.</a> Methods in molecular biology. 980, 61-120 (2013).</li><li>Silvestri, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Protein+pathway+biomarker+analysis+of+human+cancer+reveals+requirement+for+upfront+cellular-enrichment+processing.">Protein pathway biomarker analysis of human cancer reveals requirement for upfront cellular-enrichment processing.</a> Laboratory investigation; a journal of technical methods and pathology. 90, 787-796 (2010).</li><li>Eberle, F. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunoguided+laser+assisted+microdissection+techniques+for+DNA+methylation+analysis+of+archival+tissue+specimens.">Immunoguided laser assisted microdissection techniques for DNA methylation analysis of archival tissue specimens.</a> The Journal of molecular diagnostics : JMD. 12, 394-401 (2010).</li><li>Kim, H. K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distinctions+in+gastric+cancer+gene+expression+signatures+derived+from+laser+capture+microdissection+versus+histologic+macrodissection.">Distinctions in gastric cancer gene expression signatures derived from laser capture microdissection versus histologic macrodissection.</a> BMC medical genomics. 4, 48 (2011).</li><li>Klee, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Impact+of+sample+acquisition+and+linear+amplification+on+gene+expression+profiling+of+lung+adenocarcinoma:+laser+capture+micro-dissection+cell-sampling+versus+bulk+tissue-sampling.">Impact of sample acquisition and linear amplification on gene expression profiling of lung adenocarcinoma: laser capture micro-dissection cell-sampling versus bulk tissue-sampling.</a> BMC medical genomics. 2, 13 (2009).</li><li>Zheng, J., Garg, S., Wang, J., Loose, D. S., Hauer-Jensen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissected+mucosa+versus+whole+tissue+specimens+for+assessment+of+radiation-induced+dynamic+molecular+and+pathway+changes+in+the+small+intestine.">Laser capture microdissected mucosa versus whole tissue specimens for assessment of radiation-induced dynamic molecular and pathway changes in the small intestine.</a> PloS one. 8, e53711 (2013).</li><li>Boone, D. R., Sell, S. L., Hellmich, H. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spatially+Invariant+Vector+Quantization:+A+pattern+matching+algorithm+for+multiple+classes+of+image+subject+matter+including+pathology.">Spatially Invariant Vector Quantization: A pattern matching algorithm for multiple classes of image subject matter including pathology.</a> J Pathol Inform. 2, 13 (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Optimization+of+complex+cancer+morphology+detection+using+the+SIVQ+pattern+recognition+algorithm.">Optimization of complex cancer morphology detection using the SIVQ pattern recognition algorithm.</a> Anal Cell Pathol (Amst). , (2011).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Integration+of+architectural+and+cytologic+drive+n+image+algorithms+for+prostate+adenocarcinoma+identification.">Integration of architectural and cytologic drive n image algorithms for prostate adenocarcinoma identification.</a> Analytical cellular pathology. 35, 251-265 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+area+calculation+of+histopathologic+features+using+SIVQ.">Automated area calculation of histopathologic features using SIVQ.</a> Anal Cell Pathol (Amst. 34, (2011).</li><li>Cheng, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Automated+vector+selection+of+SIVQ+and+parallel+computing+integration+MATLAB:+Innovations+supporting+large-scale+and+high-throughput+image+analysis+studies.">Automated vector selection of SIVQ and parallel computing integration MATLAB: Innovations supporting large-scale and high-throughput image analysis studies.</a> Journal of pathology. 2, 37 (2011).</li><li>Roy Chowdhuri, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Semiautomated+laser+capture+microdissection+of+lung+adenocarcinoma+cytology+samples.">Semiautomated laser capture microdissection of lung adenocarcinoma cytology samples.</a> Acta Cytol. 56, 622-631 (2012).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Image+Microarrays+(IMA):+Digital+Pathology's+Missing+Tool.">Image Microarrays (IMA): Digital Pathology's Missing Tool.</a> Journal of pathology. 2, (2011).</li><li>Hanson, J. C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

Michael R. Emmert-Buck lazer yakalama mikrodiseksiyon kapsayan NIH-tutulan patent üzerinde bir mucit ve NIH Teknoloji Transferi Programı aracılığıyla telif bazlı ödeme alır.

Biz FFPE insan göğüs dokusundan immüno-epitel hücreleri microdissect için SIVQ-LCM uygulanması için bir protokol mevcut. Örneğin SIVQ gibi bir görüntü analiz algoritması kullanılması, eller-on mikrodiseksiyon işlemi için gerekli süreyi azaltır. Operatör zaman ve çaba genellikle ilgi hücrelerinin tam diseksiyon için oran-sınırlayıcı bir adımdır, çünkü bu alan için potansiyel olarak önemli bir ilerlemedir. Büyük olasılıkla da piyasada mevcut diğer mikrodisseksiyon araçlara SIVQ ve ...

Başlangıçta 1990&#39;ların ortalarında geliştirilen lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) tam mikroskopik 1, 2 yoluyla histolojik doku bölümünden belirli hücreleri veya hücre bölgeleri yakalamak için kullanıcı sağlar. Doku sıyrıklar karşı LCM moleküler analizi de uzun çalışma yöntemi 3-12 değerini göstermektedir. Buna ek olarak, 13, 14 görüntüleme için kullanılabilir teknoloji üç video protokol yayınlar vardır. Ilgi konusu hedef doku heterojen bölüm veya zaman hücreler, çok sayıda bu tür proteomik gibi özel bir aşağı akıntı uygulamaları için gerekli olan dağılmış bir hücre nüfusu, ancak kanıtlanmış değerine rağmen, LCM sıkıcı ve zahmetli olabilir. Insan operatör yerleştirilen yük LCM süreci 15 yönlendirecek güçlü bir görüntü analizi algoritması birleştirerek LCM için bir yarı-otomatik bir diseksiyon yaklaşım geliştirmeye götürdü. &lt;Michigan Üniversitesi ile işbirliği p class = &quot;jove_content&quot;&gt;, NIH laboratuvar genişletilmiş önce geliştirilen ve içsel doku seçim sürecini yarı otomatikleştirmek için izin vermek için bir şekilde Mekansal değişmez vektör nicemlemeyi (SIVQ) algoritması bildirdi böylece akılda patolog veya yaşam bilim adamı ile kullanılabilir bir araç yapma, mikrodiseksiyon yönlendirilmelidir. Mekansal değişmez vektör sayısallaştırma (SIVQ) kullanıcı sadece istatistiksel eşik ayarlayarak, tüm histolojik resmi aramak için kullanılabilecek bir halka vektörü (yüklem görüntü özelliği) oluşturmak için bir ilgi histolojik özelliği &quot;tık&quot; sağlayan bir algoritma olarak 16-21 gerekli. Oluşan ısı haritası ilk yüklem görüntü özelliği maçların kalitesini görüntüler ve daha sonra tek bir renkle LCM alet içine alınabilir (kırmızı) açıklama haritası dönüştürülür. Otomatik seçim yazılımı, AutoScanXT, sonra esaslı bir harita çizmek için kullanılırSIVQ ait açıklama doku numunesinden hedef hücrelerin yakalama yol üzerinde. Aşağıda ayrıntılı bir protokol mikrodisseksiyon iş akışına SIVQ uygulanmasını açıklar.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCM otomatikleştirir ve daha geleneksel, kullanıcı bağımlı lazer diseksiyon sürecini düzenler yeni bir yöntemdir. Bu gelişmiş, hızlı bir şekilde özelleştirilebilir lazer diseksiyon platformu teknolojisi yaratmayı amaçlamaktadır. Bu raporda, biz ArcturusXT cihazın üzerine görüntü analiz yazılımı Mekansal Değişmeyen Vektör Kuantalama (SIVQ) entegrasyonunu açıklar. ArcturusXT sistem belirli bir hücre veya büyük alan disseksiyonlarında için izin, bir kızılötesi (IR) ve ultraviyole (UV) lazer hem de içerir. Temel amaç hızı, doğruluk ve örnek iş verimini arttırmak için lazer diseksiyon tekrarlanabilirliği geliştirmektir. Bu yeni yaklaşım, hayvan ve araştırma ve klinik iş akışları insan dokularında hem mikrodiseksiyon kolaylaştırır.

Bir FFPE insan meme dokusu bölüm standart İHK protokolü 23 kullanılarak AE1/AE3 CytoKeratin immunohistokimyasal oldu. Boyama işleminden sonra, doku slayt ArcturusXT platformu üzerine yerleştirilir ve yukarıda tarif edildiği gibi SIVQ-LCM protokolü başlatıldı. Doku Mikrodiseksiyon için üstlerinden olamaz yana, İHK + lekeli hücrelerin görsel (Şekil 1A) ayırt etmek zor olabilir. Bu nedenle, daha iyi endeksi eşleşmesi ve daha iyi bir görüntü sağlamak için, ksilenler bi...

Watch this Scientific Journal Video about SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument at JoVE.com

SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCM lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) işlemi sürücü, bir bilgisayar algoritması, Mekansal Değişmeyen Vektör Nicelemek (SIVQ) sürdürür yenilikçi bir yaklaşımdır. SIVQ-LCM akışı büyük ölçüde araştırma ve klinik ortamlarda hem de uygulamaları ile, Mikrodiseksiyon hızını ve doğruluğunu artırır.

ArcturusXT Instrument için SIVQ-LCM Protokolü

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.6K Görüntüleme.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCM lazer yakalama mikrodiseksiyon (LCM) işlemi sürücü, bir bilgisayar algoritması, Mekansal Değişmeyen Vektör Nicelemek (SIVQ) sürdürür yenilikçi bir yaklaşımdır. SIVQ-LCM akışı büyük ölçüde araştırma ve klinik ortamlarda hem de uygulamaları ile, Mikrodiseksiyon hızını ve doğruluğunu artırır. 

Video: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

Sivrisinek Yetiştirme Protokolü (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

Biyoloji

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

Nötrofil İzolasyon Protokolü

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

Hazırlanması Drosophila</emAsma Bırak Protokolü kullanarak Canlı Görüntüleme> Embriyolar

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

KLRG1 tetramer Üretim için Protokol

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Protocol for Computer-Based Protein Structure and Function Prediction

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the understanding of their biological role. Although experimental methods can provide detailed information for a small fraction of these proteins, computational modeling is needed for the majority of protein molecules which are experimentally uncharacterized. The I-TASSER server is an on-line workbench for high-resolution modeling of protein structure and function. Given a protein sequence, a typical output from the I-TASSER server includes secondary structure prediction, predicted solvent accessibility of each residue, homologous template proteins detected by threading and structure alignments, up to five full-length tertiary structural models, and structure-based functional annotations for enzyme classification, Gene Ontology terms and protein-ligand binding sites. All the predictions are tagged with a confidence score which tells how accurate the predictions are without knowing the experimental data. To facilitate the special requests of end users, the server provides channels to accept user-specified inter-residue distance and contact maps to interactively change the I-TASSER modeling; it also allows users to specify any proteins as template, or to exclude any template proteins during the structure assembly simulations. The structural information could be collected by the users based on experimental evidences or biological insights with the purpose of improving the quality of I-TASSER predictions. The server was evaluated as the best programs for protein structure and function predictions in the recent community-wide CASP experiments. There are currently &gt;20,000 registered scientists from over 100 countries who are using the on-line I-TASSER server.

Guidelines for computer based structural and functional characterization of protein using the I-TASSER pipeline is described. Starting from query protein sequence, 3D models are generated using multiple threading alignments and iterative structural assembly simulations. Functional inferences are thereafter drawn based on matches to proteins with known structure and functions.

Bilgisayar Tabanlı Protein Yapısı ve İşlevi Tahmin Protokolü

Genome sequencing projects have ciphered millions of protein sequence, which require knowledge of their structure and function to improve the ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

Vahşi Tırtıllar gelen Hemocytes ayıklamak için basit bir protokol

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Optimized Protocol for Retinal Wholemount Preparation for Imaging and Immunohistochemistry

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ring-supported hydrophilized PTFE membrane to provide structural support to both living and fixed tissue during immunohistochemical processing, which allows for the use of a variety of protocols that would otherwise cause damage to the tissue. First, this is demonstrated with bolus loading of fluorescent markers into living retinal tissue. This method allows for quick visualization of targeted structures, while the membrane support maintains tissue integrity during the injection and allows for easy transfer of the preparation for further imaging or processing.
Second, a procedure for antibody staining in tissue fixed with carbodiimide is described. Though paraformaldehyde fixation is more common, carbodiimide fixation provides a superior substrate for the visualization of synaptic proteins. A limitation of carbodiimide is that the resulting fixed tissue is relatively fragile; however, this is overcome with the use of the supporting membrane. Retinal tissue is used to demonstrate these techniques, but they may be applied to any fragile tissue.

The protocol described here is for structural assessment of a wholemount retinal preparation. This includes descriptions of tissue dissection, mounting onto a hydrophilized polytetrafluoroethylene (PTFE) membrane insert, bolus loading with fluorescent markers, and a comparison of fixation with carbodiimide and paraformaldehyde for immunohistochemical analysis of cellular and synaptic components.

Görüntüleme ve İmmünhistokimyanın için Retina Wholemount Hazırlık için optimize edilmiş Protokolü

Working with delicate tissue can be a complicating factor when performing immunohistochemical assessment. Here, we present a method that utilizes a ...

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

Asya Tiger Sivrisinek içinde Photoperiodic Diapause RNA-seq Analizler Deneysel ve Biyoinformatik Protokolü,<em&gt; Aedes albopictus</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

A Protocol for Using Gene Set Enrichment Analysis to Identify the Appropriate Animal Model for Translational Research

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison techniques resulted in contradictory conclusions regarding the relevance of animal models for translational research. A major reason for the discrepancies between different gene expression analyses is the arbitrary filtering of differentially expressed genes. Furthermore, the comparison of single genes between different species and platforms often is limited by technical variance, leading to misinterpretation of the con/discordance between data from human and animal models. Thus, standardized approaches for systematic data analysis are needed. To overcome subjective gene filtering and ineffective gene-to-gene comparisons, we recently demonstrated that gene set enrichment analysis (GSEA) has the potential to avoid these problems. Therefore, we developed a standardized protocol for the use of GSEA to distinguish between appropriate and inappropriate animal models for translational research. This protocol is not suitable to predict how to design new model systems a-priori, as it requires existing experimental omics data. However, the protocol describes how to interpret existing data in a standardized manner in order to select the most suitable animal model, thus avoiding unnecessary animal experiments and misleading translational studies.

We provide a standardized protocol for the use of gene set enrichment analysis of transcriptomic data to identify an ideal mouse model for translational research. 
This protocol can be used with DNA microarray and RNA sequencing data and can further be extended to other omics data if data are available.

Gen kullanmak için bir protokol translasyonel araştırma için uygun hayvan modeli belirlemek için zenginleştirme çözümlemesi ayarla

Recent studies that compared transcriptomic datasets of human diseases with datasets from mouse models using traditional gene-to-gene comparison ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

Görüntü Analizi için Saat Tarama Protokolü: ImageJ Eklentileri

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...