研究は、米国立衛生研究所、国立癌研究所、癌研究センターの学内研究プログラムによって部分的にサポートされていました。

記載されたプロトコルは、ヒト組織試料の使用に関するNI​​Hルールに従って使用した。 1。組織標本<ol><li>開始する前に、治験審査委員会（IRB）のプロトコルに従って、ヒト組織標本を得る。 </li><li>組織/セルブロックとそれに対応する処理方法[ホルマリン固定パラフィン包埋（FFPE）、冷凍、またはエタノール固定パラフィン包埋（EFPE）]の種類を選択します。ホルマリン固定はエタノール固定および急速冷凍した後、最適な組織像を提供しています。しかしながら、固定および組織処理方法は、下流の分子分析のためにDNA、RNA、およびタンパク質の量と質に影響を与えることができると考えるべきである。 </li><li>選択したスライド型（ガラス、膜、ガラス、または金属フレーム膜）上に組織/細胞ブロック切片を切った。 SIVQ分析は、すべての3のスライド型に対しても同様に動作します。ご注意ください擬似カバースリップ法キシレンとイーサンに（後述）スライドステージ上で反転されなければならないのでオールメタルフレームメンブレンスライド上で行うことができない。 </li><li>背景から目的の細胞を識別するために、化学またはIHCベースの組織染色を選択します。その染色方法はまた、DNA、RNA、および蛋白質および組織の量に影響を与えることができます。プロトコルを実行する前に、生体分子のベースラインの質を評価するために染色した後、組織をテストします。 DAB 15、免疫蛍光で免疫組織化学（IHC）、ファストレッド、 デノボレッド、トルイジンブルー、ヘマトキシリンおよびエオシン（H＆E）（未発表データ）：SIVQ-LCMを用いて染色した組織/細胞診スライド上で行われた。 </li></ol> 2。試料イメージング<ol><li>負荷は顕微解剖機器の電動ステージ上にスライドさせると関連するソフトウェアを起動します。ロードされたスライドの位置を指定し、撮影された画像ファイルはJPEG形式で保存されるべきであることを確認するためのチェックボックスをオンにします。 </li><li> IMを最適化年齢マニュアルフォーカスホイールまたは切開具のソフトウェアを介してのいずれかを用いて、画面上の画像の明るさ、焦点を調整することにより品質。 <ol><li>解剖器のソフトウェア内の画像のツールボックスを使用して、適切にランプの明るさやカメラのゲインを設定します。値の例は、ディフューザと、明るさ= 60とゲイン= 220である。 </li><li>手動で、またはソフトウェアでのオートフォーカス機能でピント合わせ。 </li></ol></li><li>解剖プロセスのためのロードマップを提供するために、スライドのサムネイルの概要イメージをキャプチャします。 <ol><li> uncoverslippedスライドの最適な画像品質を得るには、測定器、凝縮器下のディフューザーを使用する、または、耐火インデックス（擬似カバースリップ）を向上させるために、エタノールまたはキシレンのどちらかを少量（〜30μl）を加える。キシレンを使用する場合は、換気フード、保護白衣、アイゴーグル、手袋の使用を含め、これらは有毒で、適切な安全対策を使用しなければならないしていることに注意してください。 </li><li>エタノールまたはキシレン溶液が完全にクリアされたか、キャップ上のポリマーが歪みますまで、スライド上のLCMキャップを置かないでください。 </li></ol></li><li>スライドを移動して、10X、20X、40Xまたは倍率で解剖されるべき領域の画像をキャプチャします。必要に応じて、以前に22を説明したように（マイクロソフトオフィスピクチャーマネージャーで）などの自動修正などのソフトウェアを使用してイメージを高める。画像は、彼らが自動化された選定ソフトに再インポートできるようにJPEG形式でキャプチャする必要があります。 </li></ol>画像の3。アルゴリズムの解析<ol><li>転送はSIVQフォルダに顕微解剖機器からの映像を捕獲した。解剖器に接続されたコンピュータ上でArcturusXT、オートスキャンとSIVQソフトウェアパッケージをインストールして開きます。 SIVQソフトウェアへのアクセスのために、博士はユリシーズバリス（ulysses@med.umich.edu）までお問い合わせください。 </li><li>オープンSIVQ、目的の撮影した画像（JPEG）をロードします。&lt;/李&gt; <li>関心のある領域に移動し、/または表示窓（ビューポート5および6）のサイズを調整します。 SIVQソフトウェアでは、ビューポート5は、前処理画像を示すとビューポート6は、後処理画像16を示している。 </li><li>リングベクトルと、使用するリングの数のサイズを選択します。 </li><li>ビューポート6でそれを右クリックしてキャプチャされる述語画像特徴を選択します。 </li><li>画像を分析する「スキャン」をクリックしてください。 </li><li> 2つのスライドバーを利用した画像マッチングの統計的確率を調整します。上部のバーには、全体のベクトル特異性を調整し、（選択された「統計」変数で定義されている感度の）過度含ま面積を表すことができ、初期スキャンから地域を除外するために使用されている。逆に、下側スライダーは、スキャンが実行された後に試合であると分類された領域の増大を意図して、感度を高めるために利用される。これらのスライダコントロールの両方がUTI初期ベースライン感度閾値としてリゼ &quot;統計&quot;変数。 </li><li>画像を保存するには、（画像は現在C :/ vq_testフォルダ/写真に保存されている）「JPEGとして保存」をクリックしてください。 </li><li>アルゴリズムを用いて画像を分析します。アルゴリズム解析の出力はSIVQ-LCMに使用されるための注釈画像をもたらす必要がある。現在、SIVQコアエンジンの現在のバージョンは、フル生産バージョン（利用可能Q1 2014）の単純化された統合のための完全なソフトウェア開発キット（SDK）、アプリケーション·プログラミング·インターフェース（API）を組み込むことを見込んでベータ版テスト中ユーザが生成した空間フィルタと、コアリングマッチングエンジン下流ワークフローデータ処理ステップ。このSDKには、ドキュメントの完全なセットと一緒に配布されます。 <ol><li> SIVQヒートマップを均一赤色に変化していることを確認します。 </li></ol></li><li>画像をエクスポートします。これは、Pに位置座標を再埋め込むことが不可欠であるオリジナルの解剖計器イメージからファイルヘッダに貼り付けることが進エディタを使用して、OST分析JPEG画像。適切なデータ」は、画像の開始」マーカー（0xFFの、0xD8）と第「量子化テーブルを定義する「マーカー（0xFFの、0xDB）との間で見つけることができる。 </li></ol> 4。マイクロダイセクション<ol><li>画像はSIVQ解析のために捕獲された関心領域の中心にLCMキャップを置きます。 </li><li>キャリブレーションと品質管理（QC）、UV / IRレーザーとパワー、継続時間、レーザーの位置、および（メーカーが推奨するように）、UVカット速度を含むパラメータを最適化します。解析された画像を再インポートする前に、これらのキャリブレーションを実行します。 </li><li>オープンAutoScanXT（自動化された選択ソフトウェア）およびc :/ vq_testフォルダ/写真から解析された画像をインポートします。 </li><li> SIVQ注釈を認識し、解剖マップを作成するための自​​動化された選択ソフトウェアを訓練。 <ol><li> TRAIを作成するには寧ファイル、SIVQ解析された画像の「赤ペンキ」に（「青い円」でマーク）は、対象の4領域を選択する。 </li><li>解剖されるべきではなく、（「赤い四角」でマーク）背景領域を選択します。 </li><li>その後の使用のために保存することができ、トレーニングファイルを生成するために、「分析」ボタンをクリックしてください。 </li></ol></li><li>適切な赤外線（IR）および/または紫外線（UV）レーザを使用したマイクロダイセクションを行う。 <ol><li> 「ライブ」画像に、選択した領域をコピーします。 </li><li> 「顕微解剖」ツールボックスで、適切なIRキャプチャやUVカットのボタンを選択します。 </li></ol></li><li>切開が完了した後、QC局にLCMキャップを移動させ、解剖した組織/細胞の画像を取り込む。別のアプローチは、これは、ユーザが様々な倍率で撮影することができ、従来QCステーションに移動するスライドの空白領域上にキャップを配置することである。 </li><li>効率をさらに引き上げる評価するためにマイクロダイセクション後に、関心のある組織領域の画像をキャプチャします。 </li><li>所望の細胞が正常に解剖されている場合は、下流の分析のための分子の抽出手順を開始するArcturusXTソフトウェアで「現段階」ボタンをクリックし、LCMキャップを取り外します。 </li></ol>

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L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+enriched+populations+of+neurons+or+single+neurons+for+gene+expression+analysis+after+traumatic+brain+injury.">Laser capture microdissection of enriched populations of neurons or single neurons for gene expression analysis after traumatic brain injury.</a> J Vis Exp. (74), (2013).</li><li>Iyer, E. P., Cox, D. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Laser+capture+microdissection+of+Drosophila+peripheral+neurons.">Laser capture microdissection of Drosophila peripheral neurons.</a> J Vis Exp. (39), (2010).</li><li>Hipp, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=SIVQ-aided+laser+capture+microdissection:+A+tool+for+high-throughput+expression+profiling.">SIVQ-aided laser capture microdissection: A tool for high-throughput expression profiling.</a> Journal of pathology informatics. 2, 19 (2011).</li><li>Hipp, J. D., Cheng, J. Y., Toner, M., Tompkins, R. G., Balis, U. 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C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+microdissection+adapted+to+commercial+laser+dissection+instruments.">Expression microdissection adapted to commercial laser dissection instruments.</a> Nature. 6, 457-467 (2011).</li></ol>

マイケル·R·エマート、バックにはレーザーキャプチャーマイクロダイセクションをカバーするNIH-保有する特許に関する発明者であり、NIH技術移転プログラムを通じてロイヤルティ報酬を受け取る。

私たちは、FFPEヒト乳房組織から免疫染色上皮細胞を顕微解剖するSIVQ-LCMの適用のためのプロトコルを提示する。例えばSIVQなどの画像解析アルゴリズムの使用は、実践的な顕微解剖処理に要する時間の量を減少させる。オペレータの時間と労力は、通常、目的の細胞の正確な解剖のための律速段階であるので、これはフィールドの潜在的に重要な進歩である。それは可能性が高いだけでなく、...

もともと、1990年代半ばに開発されたレーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）は、正確に微小な可視化1、2を介して組織学的組織切片から特定 ​​の細胞または細胞領域をキャプチャすることを可能にする。組織の擦り傷に対してLCMの分子分析を比較する多くの研究は、方法3-12の値を示している。また、13、14を表示するために利用可能な技術の3つのビデオプロトコルの出版物があります。関心対象の標的が不均一組織切片中の分散細胞集団である場合、又は多数の細胞は、例えばプロテオミクスのような特定のダウンストリームアプリケーションに必要とされるときが、その実証された値にもかかわらず、LCMは、退屈で面倒であることができる。人間のオペレータの負担は、LCMプロセス15をガイドするために強力な画像解析アルゴリズムを組み合わせることで、LCMのための半自動化された解剖的なアプローチを開発するために私たちを導いた。 &lt;ミシガン大学と共同で、Pクラスは= &quot;jove_content&quot;&gt;、NIHの研究室では、拡張され、以前に開発され、固有の組織選択プロセスを半自動化することを可能にするための方法で空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）アルゴリズムを報告したこのように念頭に置いて、病理学者や生命科学者で利用可能なツールとなり、マイクロダイセクションを導いた。空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）は、ユーザーが単純に統計的閾値の調整、全体の組織学的画像を検索するために使用することができ、リングベクトル（述語画像特徴）を作成し、目的の組織学的な特徴を「クリック」することを可能にするアルゴリズムです16〜21を必要に応じて実行します。得られた熱マップは初期述語画像特徴との一致の品質を表示し、その後に、LCM機器にインポートすることができ、単一の色（赤）の注釈マップに変換されます。自動化された選択ソフトウェア、AutoScanXTは、次に基づいてマップを描画するために使用されるSIVQの注釈に組織サンプルからの標的細胞の捕捉を案内する。以下の詳細なプロトコルは、マイクロダイセクションワークフローにSIVQの実装について説明します。

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="586">
	<tbody>
		<tr height="43">
			<td height="43" style="height:43px;width:216px;">Positive Charged Glass Slides</td>
			<td style="width:84px;">Thermo Scientific</td>
			<td style="width:119px;">4951Plus-001</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Xylenes, ACS reagent, &#8805;98.5% xylenes + ethylbenzene basis&#160;</td>
			<td style="width:84px;">Sigma Aldrich</td>
			<td style="width:119px;">247642</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Ethyl Alcohol, U.S.P. 200 Proof, Anhydrous</td>
			<td style="width:84px;">The Warner-Graham Company</td>
			<td style="width:119px;">6.505E+12</td>
			<td style="width:167px;">CAUTION: PLEASE USE PROPER SAFETY PROCEDURES.</td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">Arcturus CapSure Macro LCM Caps</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">LCM0211</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="64">
			<td height="64" style="height:64px;width:216px;">ArcturusXT Laser Microdissection Instrument</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;">ARCTURUSXT</td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="127">
			<td height="127" style="height:127px;width:216px;">AutoScanXT Software</td>
			<td style="width:84px;">Life Technologies</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">An optional image analysis program for the ArcturusXT Laser Microdissection Device. This is software is required for SIVQ-LCM.</td>
		</tr>
		<tr height="169">
			<td height="169" style="height:169px;width:216px;">Spatially Invariant Vector Quantization (SIVQ)</td>
			<td style="width:84px;">University of Michigan</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">This tool suite is publicly available for academic collaborations. For access to the SIVQ algorithm, please contact Dr. Ulysses Balis [Ulysses@med.umich.edu]</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

sivq-lcm protocol for the arcturusxt instrument

SIVQ-LCMは、より伝統的な、ユーザ依存レーザー解剖プロセスを自動化し、合理化する新たな方法論である。それは、高度な、急速にカスタマイズ可能なレーザー解剖プラットフォーム技術の創出を目指しています。本稿では、ArcturusXT機器に画像解析ソフトウエア空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）の統合について説明します。 ArcturusXTシステムは、特定の細胞や大面積の解剖を可能に赤外線（IR）、紫外線（UV）レーザーの両方が含まれています。主要な目標は、速度、精度、およびサンプルスループットを向上させるレーザー解剖の再現性を改善することである。この新しいアプローチは、研究と臨床のワークフローで動物およびヒト組織の両方のマイクロダイセクションを容易にします。

FFPEヒト乳房組織切片は、標準的なIHCプロトコール23を用いてサイトケラチンAE1/AE3に対して免疫染色した。染色後、組織スライドはArcturusXTステージ上に置き、上記のようにSIVQ-LCMプロトコルが開始した。組織顕微解剖のためにカバースリップすることができないので、+ IHC染色された細胞は、視覚的に（ 図1A）を識別することは困難である。これにより、より良好な屈折?...

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SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

SIVQ-LCMは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のプロセスを駆動するために、コンピュータアルゴリズム、空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）を活かした革新的なアプローチである。 SIVQ-LCMのワークフローを大幅に研究と臨床現場の両方でアプリケーションと、マイクロダイセクションの速度と精度を向上させます。

ArcturusXT楽器のSIVQ-LCMプロトコル

SIVQ-LCM is a new methodology that automates and streamlines the more traditional, user-dependent laser dissection process.&#160;It aims to create an ...

sivq-lcm-protocol-for-the-arcturusxt-instrument

Research

JoVE Journal

Biology

8.5K ビュー.  National Institutes of Health.  SIVQ-LCMは、レーザーキャプチャーマイクロダイセクション（LCM）のプロセスを駆動するために、コンピュータアルゴリズム、空間的に不変ベクトル量子化（SIVQ）を活かした革新的なアプローチである。 SIVQ-LCMのワークフローを大幅に研究と臨床現場の両方でアプリケーションと、マイクロダイセクションの速度と精度を向上させます。 

ビデオ: SIVQ-LCM Protocol for the ArcturusXT Instrument

Protocol for Mosquito Rearing (A. gambiae)

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night cycle. For this procedure, you'll need mosquito cages, 10% sterile sucrose solution, paper towels, beaker, whatman filter paper, glass feeders, human blood and serum, water bath, parafilm, distilled water, clean plastic trays, mosquito food (described below), mosquito net to cover the trays, vacuum, and a collection chamber to collect adults.

Protocol for Mosquito Rearing A. gambiae

This video illustrates the general techniques used to rear Anopheles gambiae in the laboratory. The methods for caring for laboratory mosquitoes are demonstrated through all stages of the organism's life cycle from larvae to pupae to blood-feeding adults.

モスキート子育てのためのプロトコル（A. gambiae）

This protocol describes mosquito rearing in the insectary. The insectary rooms are maintained at 28&deg;C and ~80% humidity, with a 12 hr. day/night ...

生物学

Neutrophil Isolation Protocol

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response. Due to their key role in inflammation, neutrophil functions such as locomotion, cytokine production, phagocytosis, and tumor cell combat are extensively studied. To characterize the specific functions of neutrophils, a clean, fast, and reliable method of separating them from other blood cells is desirable for in vitro studies, especially since neutrophils are short-lived and should be used within 2-4 hours of collection. Here, we demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media that is a mixture of sodium metrizoate and Dextran 500. The procedure consists of layering whole blood over the density gradient medium, centrifugation, separation of neutrophil layer, and lysis of residual erythrocytes. Cells are then washed, counted, and resuspended in buffer to desired concentration. When performed correctly, this method has been shown to yield samples of >95% neutrophils with >95% viability.

Neutrophils are among the first cells to arrive on the site of inflammatory immune response, and their functions and mechanisms have been studied extensively in vitro. We demonstrate a standard density gradient separation method to isolate human neutrophils from whole blood using commercially available separation media.

好中球単離プロトコル

Neutrophil polymorphonuclear granulocytes (PMN) are the most abundant leukocytes in humans and among the first cells to arrive on the site of inflammatory ...

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as tissue morphogenesis, cell-cell adhesion, or cell death. Drosophila embryos expressing GFP are readily imaged using either stereoscopic or confocal microscopy. A goal of any live-imaging protocol is to minimize detrimental effects such as dehydration and hypoxia. Previous protocols for preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis have involved placing dechorionated embryos in halocarbon oil and sandwiching them between a halocarbon gas-permeable membrane and a coverslip1-3. The introduction of compression through mounting embryos in this manner represents an undesirable complication for any biomechanical-based analysis of morphogenesis. Our method, which we call the hanging drop protocol, results in excellent viability of embryos during live imaging and does not require that embryos be compressed. Briefly, the hanging drop protocol involves the placement of embryos in a drop of halocarbon oil that is suspended from a coverslip, which is, in turn, fixed in position over a humid chamber. In addition to providing gas exchange and preventing dehydration, this arrangement takes advantage of the buoyancy of embryos in halocarbon oil to prevent them from drifting out of position during timelapse acquisition. This video describes in detail how to collect and prepare Drosophila embryos for live imaging using the hanging drop protocol. This protocol is suitable for imaging dechorionated embryos using stereomicroscopy or any upright compound fluorescence microscope.

The Preparation of Drosophila Embryos for Live-Imaging Using the Hanging Drop Protocol

A simple, inexpensive, and effective method of preparing Drosophila embryos for live-imaging analysis is presented. Our protocol provides humidity and gas exchange and does not compress the Drosophila embryo. This method is suitable for GFP-based live imaging of Drosophila embryos using a stereomicroscope or upright compound microscope.

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Green fluorescent protein (GFP)-based timelapse live-imaging is a powerful technique for studying the genetic regulation of dynamic processes such as ...

A Protocol for the Production of KLRG1 Tetramer

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. KLRG1 exists both as a monomer and as a disulfide-linked homodimer. This well-conserved receptor is found on the most mature and recently activated NK cells as well as on a subset of effector/memory T cells.
Using KLRG1 tetramer as well as other methods, E-, N-, and R-cadherins were identified as KLRG1 ligands. These Ca2+-dependent cell-cell adhesion molecules comprises of an extracellular domain containing five cadherin repeats responsible for cell-cell interactions, a transmembrane domain and a cytoplasmic domain that is linked to the actin cytoskeleton. 
Generation of the KLRG1 tetramer was essential to the identification of the KLRG1 ligands. KLRG1 tetramer is also a unique tool to elucidate the roles cadherin and KLRG1 play in regulating the immune response and tissue integrity.

This protocol describes the production of KLRG1 tetramer, which is a powerful tool for the analysis of KLRG1 ligands.

KLRG1テトラマーの生産のためのプロトコル

Killer cell lectin-like receptor G1 (KLRG1) is a type II transmembrane glycoprotein inhibitory receptor belonging to the C type lectin-like superfamily. ...

A Simple Protocol for Extracting Hemocytes from Wild Caterpillars

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle 1. In larval stages of insects belonging to the orders of Lepidoptera (moths and butterflies) and Diptera (true flies), hemocytes are formed from the lymph gland (a specialized hematopoietic organ) or embryonic cells and can be carried through to the adult stage. Embryonic hemocytes are involved in cell migration during development and chemotaxis regulation during inflammation. They also take part in cell apoptosis and are essential for embryogenesis 2. Hemocytes mediate the cellular arm of the insect innate immune response that includes several functions, such as cell spreading, cell aggregation, formation of nodules, phagocytosis and encapsulation of foreign invaders 3. They are also responsible for orchestrating specific insect humoral defenses during infection, such as the production of antimicrobial peptides and other effector molecules 4, 5. Hemocyte morphology and function have mainly been studied in genetic or physiological insect models, including the fruit fly, Drosophila melanogaster 6, 7, the mosquitoes Aedes aegypti and Anopheles gambiae 8, 9 and the tobacco hornworm, Manduca sexta 10, 11. However, little information currently exists about the diversity, classification, morphology and function of hemocytes in non-model insect species, especially those collected from the wild 12.
Here we describe a simple and efficient protocol for extracting hemocytes from wild caterpillars. We use penultimate instar Lithacodes fasciola (yellow-shouldered slug moth) (Figure 1) and Euclea delphinii (spiny oak slug) caterpillars (Lepidoptera: Limacodidae) and show that sufficient volumes of hemolymph (insect blood) can be isolated and hemocyte numbers counted from individual larvae. This method can be used to efficiently study hemocyte types in these species as well as in other related lepidopteran caterpillars harvested from the field, or it can be readily combined with immunological assays designed to investigate hemocyte function following infection with microbial or parasitic organisms 13.

Insect hemocytes carry out many important functions, both immune and non-immune, throughout all stages of insect development. Our present knowledge of hemocyte types and function comes from studies on insect genetic models. Here, we present a method for extracting, quantifying and visualizing hemocytes from wild caterpillars.

ワイルド毛虫から血液細胞を抽出するための単純なプロトコル

Insect hemocytes (equivalent to mammalian white blood cells) play an important role in several physiological processes throughout an insect's life cycle ...

Clock Scan Protocol for Image Analysis: ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a closed or segmented convex-shaped region of interest, leading to the generation of an averaged integral radial pixel-intensity profile. This protocol was originally developed in 2006, as a visual basic 6 script, but as such, it had limited distribution. To address this problem and to join similar recent efforts by others, we converted the original clock scan protocol code into two Java-based plugins compatible with NIH-sponsored and freely available image analysis programs like ImageJ or Fiji ImageJ. Furthermore, these plugins have several new functions, further expanding the range of capabilities of the original protocol, such as analysis of multiple regions of interest and image stacks. The latter feature of the program is especially useful in applications in which it is important to determine changes related to time and location. Thus, the clock scan analysis of stacks of biological images may potentially be applied to spreading of Na+ or Ca++ within a single cell, as well as to the analysis of spreading activity (e.g., Ca++ waves) in populations of synaptically-connected or gap junction-coupled cells. Here, we describe these new clock scan plugins and show some examples of their applications in image analysis.

This paper describes two novel ImageJ plugins for &#39;Clock Scan&#39; image analysis. These plugins expand the functionality of the original visual basic 6 program and, most importantly, make the program available to a large research community by bundling it with the ImageJ free image analysis software package.

画像解析のためのクロックスキャンプロトコル：ImageJ Plugins

The clock scan protocol for image analysis is an efficient tool to quantify the average pixel intensity within, at the border, and outside (background) a ...

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish (Nothobranchius furzeri)

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of reference fish model systems, such as zebrafish and medaka. In recent years, an emerging fish &#8211; the turquoise killifish (Nothobranchius furzeri) &#8211; has been adopted by a growing number of research groups in the fields of biology of aging and ecology. With a captive life span of 4 - 8 months, this species is the shortest-lived vertebrate raised in captivity and allows the scientific community to test &#8211; in a short time &#8211; experimental interventions that can lead to alterations of the aging rate and life expectancy. Given the unique biology of this species, characterized by embryonic diapause, explosive sexual maturation, marked morphological and behavioral sexual dimorphism - and their relatively short adult life span -&#160;ad hoc husbandry practices are in urgent demand. This protocol reports a set of key husbandry measures that allow optimal turquoise killifish laboratory care, enabling the scientific community to adopt this species as a powerful laboratory animal model.

A Protocol for Laboratory Housing of Turquoise Killifish Nothobranchius furzeri

Laboratory housing of turquoise killifish can be scaled up&#160;to house and efficiently raise thousands of individual fish in a centralized water filtration system, employing the same infrastructure used for standard zebrafish facilities. Here we detail a list of standardized procedures that allow efficient killifish maintenance.

研究室住宅のターコイズ メダカ (による furzeri) のためのプロトコル

The development of husbandry practices in non-model laboratory fish used for experimental purposes has greatly benefited from the establishment of ...

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called thigmomorphogenesis. In past decades, several signaling components have been identified and reported for being involved in the mechanotransduction (e.g., calcium ion binding proteins and jasmonic acid biosynthesis enzymes). However, the relatively slow pace of research in the study of force signaling or thigmomorphogenesis is largely attributed to two reasons: the requirement for laborious human hand-manipulated touch induction of thigmomorphogenesis and the force strength errors associated with people&#8217;s hand-touch. To enhance the efficiency of external force loading on a plant organism, an automatic touch-force loading machine was built. This robotic arm-driven hair brush touches provide a labor-saving and easily repeatable touch-force simulation, unlimited rounds of touch repetition and adjustable touch strength. This hair touch-force loading machine can be used for both large scale screening of touch-force signaling mutants and the phenomics study of plant thigmomorphogenesis. In addition, touch materials such as human hair, can be replaced with other natural materials like animal hair, silk threads and cotton fibers. The automated moving arms on the machine may be equipped with water sprinkling nozzles and air blowers to mimic the natural forces of rain drops and wind, respectively. By using this automatic hair touch-force loading machine in combination with the hand-performed cotton swab touching, we have investigated the touch response of two force signaling mutants, MAP KINASE KINASE 1 (MKK1) and MKK2 plants. The phenomes of the touch-force loaded wild type plants and two mutants were evaluated statistically. They have exhibited significant differences in touch response.

A Labor-saving and Repeatable Touch-force Signaling Mutant Screen Protocol for the Study of Thigmomorphogenesis of a Model Plant Arabidopsis thaliana

A gentle touch-force loading machine is built from human hair brushes, robotic arms and a controller. The hair brushes are driven by robotic arms installed on the machine and move periodically to apply touch-force on plants. The strength of machine-driven hair touches is comparable to that of manually applied touches.

モデル植物アラビドプシスタリアナのチグモ形態形成の研究のための省力と反復可能なタッチフォースシグナル伝達変異スクリーンプロトコル

Plants responding to both intracellular and extracellular mechanical stimulations (or force signals) and develop special morphological changes, a called ...

A Simple Protocol for Mapping the Plant Root System Architecture Traits

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar tolerance to environmental challenges. An experimental protocol is presented for setting up the hydroponic system, plantlet growth, RSA spreading, and imaging. The approach used a magenta box-based hydroponic system containing polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. Experimental settings are exemplified by assessing the RSA of the plantlets under varying nutrient (phosphate [Pi]) supply. The system was established to examine the RSA of Arabidopsis, but it is readily adaptable to study other plants like Medicago sativa (Alfalfa). Arabidopsis thaliana (Col-0) plantlets are used in this investigation as an example to understand the plant RSA. Seeds are surface sterilized by treating ethanol and diluted commercial bleach, and kept at 4 &#176;C for stratification. The seeds are germinated and grown on a liquid half-MS medium on a polypropylene mesh supported by polycarbonate wedges. The plantlets are grown under standard growth conditions for the desired number days, gently picked out from the mesh, and submersed in water-containing agar plates. Each root system of the plantlets is spread gently on the water-filled plate with the help of a round art brush. These Petri plates are photographed or scanned at high resolution to document the RSA traits. The root traits, such as primary root, lateral roots, and branching zone, are measured using the freely available ImageJ software. This study provides techniques for measuring plant root characteristics in controlled environmental settings. We discuss how to (1) grow the plantlets, and collect and spread root samples, (2) obtain pictures of spread RSA samples, (3) capture the images, and (4) use image analysis software to quantify root attributes. The advantage of the present method is the versatile, easy, and efficient measurement of the RSA traits.

We use simple laboratory tools to examine the root system architecture (RSA) of Arabidopsis and Medicago. The plantlets are grown hydroponically over mesh and spread using an art brush to reveal the RSA. Images are taken using scanning or a high-resolution camera, then analyzed with ImageJ to map traits.

植物の根系アーキテクチャ特性をマッピングするための簡単なプロトコル

Comprehensive knowledge of plant root system architecture (RSA) development is critical for improving nutrient use efficiency and increasing crop cultivar ...

C. elegansおよび肝臓がん細胞株におけるマイトファジーの定量化

Detection of Mitophagy in Caenorhabditis elegans and Mammalian Cells Using Organelle-Specific Dyes

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, regulated cell death, and the generation of reactive oxygen species (ROS). ROS are vital for key biological processes. However, when uncontrolled, they can lead to oxidative injury, including mitochondrial damage. Damaged mitochondria release more ROS, thereby intensifying cellular injury and the disease state. A homeostatic process named mitochondrial autophagy (mitophagy) selectively removes damaged mitochondria, which are then replaced by new ones. There are multiple mitophagy pathways, with the common endpoint being the breakdown of the damaged mitochondria in lysosomes. 
Several methodologies, including genetic sensors, antibody immunofluorescence, and electron microscopy, use this endpoint to quantify mitophagy. Each method for examining mitophagy has its advantages, such as specific tissue/cell targeting (with genetic sensors) and great detail (with electron microscopy). However, these methods often require expensive resources, trained personnel, and a lengthy preparation time before the actual experiment, such as for creating transgenic animals. Here, we present a cost-effective alternative for measuring mitophagy using commercially available fluorescent dyes targeting mitochondria and lysosomes. This method effectively measures mitophagy in the nematode Caenorhabditis elegans and human liver cells, which indicates its potential efficiency in other model systems.

著者スポットライト:オルガネラ特異的色素を用いた線虫および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出  

Exploring mitophagy through electron microscopy, genetic sensors, and immunofluorescence requires costly equipment, skilled personnel, and a significant time investment. Here, we demonstrate the efficacy of a commercial fluorescence dye kit in quantifying the mitophagy process in both Caenorhabditis elegans and a liver cancer cell line.

オルガネラ特異的色素を用いた カエノラブディティス・エレガンス および哺乳類細胞におけるマイトファジーの検出

Mitochondria are essential for various biological functions, including energy production, lipid metabolism, calcium homeostasis, heme biosynthesis, ...