This project was supported by grants NIH NIGMS 8P41 GM103540-28 and P50-GM076516

הכנת .1 לדוגמא <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמור על תאי CHOK1 בצלוחיות תרבית רקמה באמצעות DMEM בתוספת 10% בסרום שור העובר ו100 IU / מ&quot;ל ​​של פניצילין 50 מיקרוגרם / מ&quot;ל ​​של סטרפטומיצין. דגירה התאים בחממה humidified 5% CO 2 על 37 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> קציר ולאחר מכן תאי צלחת CHOK1 על מיקרו היטב בקוטר 14 מ&quot;מ בעובי של 0.16 מ&quot;מ משטח. תאי זרע לצפיפות אופטימלית להדמיה, סביב confluency 60-70%. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> דגירה תאי הלילה בשעה 37 ° C, 5% CO 2. שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS (האנק נאגר מלוח פתרון), ודגירת תאים בתמיסה המכילה 50 ננומטר של Lysotracker DND26 הירוק ו150 ננומטר של ירוק גשש טובולין. דגירה תאים לשעה 1 ב37 מעלות צלזיוס. שלב אופציונאלי: לפני הדגירה, לבצע כתם נוסף עם צבע המיטוכונדריה צביעת מטריצה ​​(25 ננומטר). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שוטף את התאים שלוש פעמים בHBSS כדי להסיר כל צבע מאוגד. הוסף בינוני צמיחת DMEM טרי לפני מתאר לעצמיing התאים. </li></ol> 2 תצורות מיקרוסקופ מיקרוסקופ למעקב אחר החלקיקים המתוארים בפרוטוקול הווידאו מורכב על המסגרת של מיקרוסקופ זמין מסחרי הפוך (איור 4). מודולים עם זאת מסחריים למעקב אחר חלקיקים מסלולית 3D זמינים כעת. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש השני קוהרנטית Chameleon-Ultra Ti: femtosecond מקור אור עירור לייזר Sa, עם טווח אורכי גל פלט מתכונן בין 690 ננומטר ננומטר-1,040. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא שקרן הלייזר מיושרת ביציאה האחורית של מיקרוסקופ באמצעות מראות מצופה IR. קרן הלייזר מוחלשת באמצעות צלחת חצי גל מסתובבת ואחריו מקטב ליניארי קלציט. להחליש את הקרן, כך שההספק הממוצע במדגם הוא בין mW 0.5 ו2. הערה: קרן הלייזר באה לידי ביטוי על ידי זוג מראות ומונעות גלונומטר מנוע המאפשרות שליטה על המיקום והמסלול של הקרן הממוקדת במטוס המדגם. בתצורה אופיינית קרן לייזר collimated יציאה של מראות גלונומטר מורחבת (10X) עוברת דרך הרחבה קרן, לפני שנכנסת לחלק האחורי של מטרת מיקרוסקופ לאחר ההשתקפות במראה dichroic קצר לעבור. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את אור פלואורסצנטי מהמדגם על ידי הצבת מטרה מספרית מים גבוהות צמצם (60X, NA 1.2) לתוך נתיב האור. בחר קוביית מסנן הקרינה על פי אורכי גל הפליטה הרצויים בכל תצורת ערוץ אחד או שתיים. מעסיק מסנני bandpass הפליטה כדי לבחור את טווח הספקטרום של הקרינה הנפלטת נוסף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את המדגם על במה ממונעת, ולהתאים את התנועה העדינה של מטרת מיקרוסקופ באמצעות piezo-בקר אובייקטיבי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכוון את האור מקוביית המסנן לתוך צינורות מכפיל שבו האות מופלה ונשלחו לכרטיס רכישת נתונים I / O דיגיטלי. הערה: מחשב שנוצר צורות גל הם הפלט האנלוגי של I / O הכרטיס והם provided לסורקים לשלוט אלקטרוניקה. קלט ספירת פוטון מהמכפיל ואות הפלט לסורקים נמדד ונשלט באמצעות כרטיס קלט / פלט על ידי המעבדה לתוכנת Dynamics הקרינה SimFCS. </li></ol> .3 הדמיה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מקם את התאים על הבמה ולהתמקד באמצעות תאורת אור מועברת. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור להדמית סריקת סריקה לזהות את התאים ששלבו את הצבע וכדי להמחיש את microtubules הבסיסי. זהה את האזור הראשוני שבו תנועת שלפוחית ​​היא הווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ברגע ששלפוחית ​​בודדת מזוהה, להגדיר את הפרמטרים למעקב ההקפה הבאים: <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את הרדיוס של המסלול כדי להגדיר את הגודל של הסריקה המעגלית בהתאם לגודל של החלקיקים במעקב. לפולט נקודה, להגדיר את הרדיוס של המסלול שווה למותנים של פונקצית מורחים פוינט (כוחות הביטחון הפלסטיניים) של קורה העירור על מנת למקסם את הרגישות ותגובה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את צירילהרחיק כדי להגדיר את המרחק בין שני המסלולים המבוצעים בתרגום עמדת החלקיקים לאורך הכיוון הצירי. הגדר את המרחק הצירי ל1.5-3 פעמים המותניים כוחות הביטחון הפלסטיניים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את הזמן להתעכב בהתאם לבהירות של החלקיקים כדי להגדיר את המשך הזמן על כל נקודה של המסלול, שגם יקבע את שיעור הלבנת תמונה. השתמש להתעכב זמן בין 10-100 μsec. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הגדר את מספר נקודות בכל מסלול ל64 או 128 להניב תקופות מסלול בצו של 4-32 אלפיות שני ולספק רזולוציה גבוהה זמנית לקביעת עמדת החלקיקים. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשנות את DC אות לקזז נשלחה למראות כדי למרכז את הקרן על החלקיק דרך ממשק המשתמש הגרפי באמצעות בחירת סמן בדימוי שנסרק סריקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להתחיל לעקוב אחר על ידי מעבר למצב מיקרוסקופ מסריקת הדמיה לסריקה מסלולית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את אוסף המשוב ונתונים. </li></ol> .4 Trajectניתוח אורים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בתוכנה כדי להציג את הקרינה שנאסף בכל נקודה לאורך המסלול ובכל נקודה בצורה של &quot;שטיח עוצמה &#39;זמן. העצמה שנאסף לאורך השטיח מספקת מידע על האינטראקציה של החלקיקים עם אובייקטים בהירים אחרים. להשתמש בתוכנה כדי להציג את שני מידע המסלול (כלומר עקירת DC לאורך הזמן של x, y וסורקים של -piezo z), כמו גם את עוצמת הקרינה שנאספו מהצינור מכפיל לאורך זמן בצורת סדרת זמן של. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בייצוג סדרת הזמן ומידע &#39;שטיח עוצמה&#39; כדי לבחור רק אזור של עניין במסלול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להשתמש בתוכנה כדי להציג הקרנת 2D של החלק הנבחר של מסלול החלקיק. בחר את הפקדים המתאימים לצבע קוד המסלול בהתאם לעוצמת הקרינה של חלקיקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האפשרות להציג pמסלול מאמר ב3D, וצבע קוד אותו בהתאם לעוצמת הקרינה. סובב את המסלול ב3D באמצעות הפקדים כדי להמחיש את התכונות של תנועת הליזוזום לאורך microtubule. </li></ol>

<ol>
	<li>So, P. T., Dong, C. Y., Masters, B. R., Berland, K. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Two+photon+excitation+fluorescence+microscopy.">Two photon excitation fluorescence microscopy.</a> Annu Rev Biomed Eng. 2, 399-429 (2000).</li><li>Dupont, A., Lamb, D. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Nanoscale+three+dimensional+single+particle+tracking.">Nanoscale three dimensional single particle tracking.</a> Nanoscale. 3, 4532-4541 (2011).</li><li>Estrada, L. C., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+nanometer+images+of+biological+fibers+by+directed+motion+of+gold+nanoparticles.">3D nanometer images of biological fibers by directed motion of gold nanoparticles.</a> Nano Lett. 11, 4656-4660 (2011).</li><li>Kis-Petikova, K., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Distance+measurement+by+circular+scanning+of+the+excitation+beam+in+the+two+photon+microscope.">Distance measurement by circular scanning of the excitation beam in the two photon microscope.</a> Microscopy Research and Technique. 63, 34-49 (2004).</li><li>Levi, V., Ruan, Q., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3+D+particle+tracking+in+a+two+photon+microscope+application+to+the+study+of+molecular+dynamics+in+cells.">3 D particle tracking in a two photon microscope application to the study of molecular dynamics in cells.</a> Biophys J. 88, 2919-2928 (2005).</li><li>Lund, F. W., Wustner, D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+comparison+of+single+particle+tracking+and+temporal+image+correlation+spectroscopy+for+quantitative+analysis+of+endosome+motility.">A comparison of single particle tracking and temporal image correlation spectroscopy for quantitative analysis of endosome motility.</a> Journal of Microscopy. 252, 169-188 (2013).</li><li>Nath, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Spreading+of+Neurodegenerative+Pathology+via+Neuron+to+Neuron+Transmission+of+beta+Amyloid.">Spreading of Neurodegenerative Pathology via Neuron to Neuron Transmission of beta Amyloid.</a> Journal of Neuroscience. 32, 8767-8777 (2012).</li><li>Balint, S., Vilanova, I. V., Alvarez, A. S., Lakadamyali, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Correlative+live+cell+and+superresolution+microscopy+reveals+cargo+transport+dynamics+at+microtubule+intersections.">Correlative live cell and superresolution microscopy reveals cargo transport dynamics at microtubule intersections.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 110, 3375-3380 (2013).</li><li>Huotari, J., Helenius, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Endosome+maturation.">Endosome maturation.</a> Embo Journal. 30, 3481-3500 (2011).</li><li>Ragan, T., So, P. T., Kwon, H. S., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=3D+particle+tracking+on+the+two+photon+microscope.">3D particle tracking on the two photon microscope.</a> Multiphoton Microscopy in the Biomedical Sciences. 2, 247-258 (2001).</li><li>Konig, K., So, P. T. C., Mantulin, W. W., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cellular+response+to+near-infrared+femtosecond+laser+pulses+in+two+photon+microscopes.">Cellular response to near-infrared femtosecond laser pulses in two photon microscopes.</a> Optics Letters. 22, 135-136 (1997).</li><li>Caviston, J. P., Holzbaur, E. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Microtubule+motors+at+the+intersection+of+trafficking+and+transport.">Microtubule motors at the intersection of trafficking and transport.</a> Trends Cell Biol. 16, 530-537 (2006).</li><li>Cardarelli, F., Lanzano, L., Gratton, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Capturing+directed+molecular+motion+in+the+nuclear+pore+complex+of+live+cells.">Capturing directed molecular motion in the nuclear pore complex of live cells.</a> Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America. 109, 9863-9868 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

למרות ההתקדמות העצומה בטכניקות הקרינה מיקרוסקופיה וinstrumentations בשנים האחרונות, להשגת מסלולים של חלקיקי ניאון בשלושה ממדים עם רזולוציה גבוהה זמנית נשאר אתגר בתחום. אם רזולוציה גבוהה זמנית הושגה חלקיקי מעקב בשני ממדים, הרחבה לכיוון הצירי בדרך כלל מביאה לירידה דרסטית בת...

מספר גדול של גישות פותחו עד כה כדי לעקוב אחר חלקיקי ניאון בשלושה ממדים באמצעות מיקרוסקופ. רוב הגישות מסתמכות על השימוש במצלמות מהירות, מתאימות באופן אידיאלי למעקב בשני ממדים, בשילוב בדרך כלל עם שינויים מותאמים אישית של אופטיקה הפליטה של ​​מיקרוסקופ כדי להשיג מעקב בכיוון הצירי. מיקרוסקופי סריקת לייזר (או confocal או שני פוטונים) כמקובל יכול לעקוב אחר חלקיקי ניאון על ידי ביצוע רצף של z-ערימות זמן, למרות שתהליך זה הוא בדרך כלל זמן רב, ומניב רזולוציה זמן סבירה (10 Hz) רק אם במעקב החלקיקים הוא המשיך במרכז אזור הדמיה סריקה קטן על ידי מנגנון משוב פעיל 2. הרעיון של נעילה לחלקיקים הוא הבסיס של שיטת המעקב מסלולית. במקום סריקה לסרוק מסלול מעגלי מתבצע סביב חלקיקי הניאון. עוצמת הקרינה לאורךהמסלול בדיוק מתאים את עמדת חלקיקי 4. העמדה המקומית של החלקיקים לאחר מכן ניתן להשתמש כדי להניע סורקי מיקרוסקופ ומחדש מרכז המסלול בעמדת החלקיקים. סורקי גלונומטר של המיקרוסקופ מונעים על ידי מתח אנלוגי. רכיב AC של מתח זה מאפשר לבצע מסלול עם קרן הלייזר הממוקדת, כלומר סינוס וקוסינוס גל פנה למראות X וסריקת Y יאפשר ביצוע מסלול מעגלי. DC לקזז של האות מקל לשנות את מיקומו של מרכז המסלול. ברגע שתקופת מסלול נקבעה ואת צורת הגל לאות AC מוגדרת, מערכת המשוב צריכה לעדכן את רכיב DC רק של האות. תוכנה מסוגלת לקרוא את אות הניאון שנאסף מהגלאים נדרשה לשלוט הסורקים וגלאים, כדי לחשב את המיקום של החלקיק ולעדכן את DC אתנקבע. למשוב מוצלח הדמיה בחירה זהירה של הפרמטרים המסלול (גודל ועיתוי) דרוש ופרמטרים אלה צריכים להיות מותאמים המבוססים על המאפיינים של חלקיקי הניאון שיש צורך לעקוב אחר. היסודות הפיזיים ומתמטיים של הטכניקה תוארו ב4,5 העבר עבור שני יישומי 2D and 3D. בפרוטוקול זה אנו מתארים בקצרה את רכיבי החומרה המרכזיים של ההתקנה, ובפירוט רב יותר נדרשים הבחירה של הפרמטרים והכנת המדגם לניסוי טיפוסי מאפשר לנו הבא לעקירתם של הליזוזום ברזולוציה גבוהה זמנית בתוך תא חי.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="525">
	<tbody>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;width:197px;">Name</td>
			<td style="width:160px;">Company</td>
			<td style="width:168px;">Model</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Lysotracker DND 26</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>L-7526</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">tubuline tracker Green</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>T34075</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Mitotracker RED</td>
			<td>Life technologies</td>
			<td>M7512</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Coherent Chamelon- ultra II TI</td>
			<td>Coherent</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Calcite polarize</td>
			<td>Melles Griot Glan&#160;</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Galvanometer-motor mirror</td>
			<td>Cambridge technologies</td>
			<td>M 6350</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Dichroic mirror</td>
			<td>Chroma technologies</td>
			<td>700 DCSPXR</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Motorized stage</td>
			<td>ASI</td>
			<td>MS2000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Piezo&#160;</td>
			<td>PI</td>
			<td>P721-LLQ</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Photomultiplier tube</td>
			<td>Hamamatsu</td>
			<td>H7422P-40</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Data acquisition card</td>
			<td>IO tech</td>
			<td>PCI 1128-4000</td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;"></td>
			<td></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="20">
			<td height="20" style="height:20px;">Imaging software</td>
			<td>LFD</td>
			<td>Global for images-SimFCS</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

3d orbital tracking in a modified two-photon microscope: an application to the tracking of intracellular vesicles

מטרת פרוטוקול וידאו זה היא לדון כיצד לבצע ולנתח ניסוי מסלולית ניאון תלת ממדי מעקב אחר חלקיקים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה 1. בניגוד לגישות קונבנציונליות (סריקה סריקה או שדה רחב המבוסס על ערימה של מסגרות), המעקב מסלולית 3D מאפשר למקם ופעל עם מרחבית גבוהה (10 דיוק ננומטר) ורזולוציה של זמן (תגובת תדר 50 הרץ) עקירת 3D של חלקיקי ניאון נעו על אורך קשקשים של מאות מיקרונים 2. השיטה מבוססת על אלגוריתם משוב ששולט בחומרה של מיקרוסקופ סריקת לייזר שני פוטונים על מנת לבצע מסלול מעגלי מסביב לאובייקט להיות במעקב: מנגנון המשוב ישמור את אובייקט הניאון במרכז על ידי שליטה על התזוזה של קרן הסריקה 3-5. כדי להדגים את היתרונות של טכניקה זו, אנחנו אחרי אברון זז מהר, הליזוזום, בתוך אלתא iving 6,7. תאים היו מצופים על פי פרוטוקולים סטנדרטיים, ומוכתם באמצעות צבע מסחרי הליזוזום. אנו דנים בקצרה את תצורת החומרה ובפירוט רב יותר את תוכנת שליטה, לבצע ניסוי מעקב מסלולית 3D בתוך תאי חיים. אנו דנים בפירוט הפרמטרים הנדרשים על מנת לשלוט במיקרוסקופ הסריקה ולאפשר התנועה של האלומה במסלול סגור סביב החלקיקים. אנו מסיקים על ידי המדגימים כיצד שיטה זו ניתן להשתמש ביעילות כדי לעקוב אחר התנועה מהירה של הליזוזום שכותרתו לאורך microtubules ב3D בתוך תא חי. יזוזומים יכולים לנוע במהירויות בטווח של 0.4-0.5 מיקרומטר / sec, בדרך כלל מוצגות תנועה בבימויו לאורך רשת microtubule 8.

על פי פרוטוקול זה מעקב אחר חלקיקים מהירים 3D יחיד יכול להתבצע בתוך תאי חיים באמצעות מיקרוסקופ שני פוטונים שונה כדי לעקוב אחר התזוזה של יזוזומים שכותרתו fluorescently. הניסוי בוצע מתחקה אחרים הליזוזום מבודד נע בתוך התא לאחר תהליך התבגרות endosome 9. יזוזומים היו מוכתמים בא?...

Watch this Scientific Journal Video about 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles at JoVE.com

3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope.

3D Orbital מעקב במיקרוסקופ שני פוטונים השתנה: בקשה למעקב של תאיים שלפוחית

The objective of this video protocol is to discuss how to perform and analyze a three-dimensional fluorescent orbital particle tracking experiment using a ...

3d-orbital-tracking-modified-two-photon-microscope-an-application-to

Research

JoVE Journal

Bioengineering

10.1K Views.  University of California, Irvine. In this video protocol we track - at high speed and in three dimensions - fluorescently labeled lysosomes within living cells, using the orbital tracking method in a modified two-photon microscope. 

Video: 3D Orbital Tracking in a Modified Two-photon Microscope: An Application to the Tracking of Intracellular Vesicles

Tracking Hypoxic Signaling within Encapsulated Cell Aggregates

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal hyperglycemia. As an alternative treatment option to exogenous insulin injection, transplantation of functional pancreatic tissue has been explored1,2. This approach offers the promise of a more natural, long-term restoration of normoglycemia. Protection of the donor tissue from the host's immune system is required to prevent rejection and encapsulation is a method used to help achieve this aim.
Biologically-derived materials, such as alginate3 and agarose4, have been the traditional choice for capsule construction but may induce inflammation or fibrotic overgrowth5 which can impede nutrient and oxygen transport. Alternatively, synthetic poly(ethylene glycol) (PEG)-based hydrogels are non-degrading, easily functionalized, available at high purity, have controllable pore size, and are extremely biocompatible,6,7,8. As an additional benefit, PEG hydrogels may be formed rapidly in a simple photo-crosslinking reaction that does not require application of non-physiological temperatures6,7. Such a procedure is described here. In the crosslinking reaction, UV degradation of the photoinitiator, 1-[4-(2-Hydroxyethoxy)-phenyl]-2-hydroxy-2-methyl-1-propane-1-one (Irgacure 2959), produces free radicals which attack the vinyl carbon-carbon double bonds of dimethacrylated PEG (PEGDM) inducing crosslinking at the chain ends. Crosslinking can be achieved within 10 minutes. PEG hydrogels constructed in such a manner have been shown to favorably support cells7,9, and the low photoinitiator concentration and brief exposure to UV irradiation is not detrimental to viability and function of the encapsulated tissue10. While we methacrylate our PEG with the method described below, PEGDM can also be directly purchased from vendors such as Sigma.
An inherent consequence of encapsulation is isolation of the cells from a vascular network. Supply of nutrients, notably oxygen, is therefore reduced and limited by diffusion. This reduced oxygen availability may especially impact &beta;-cells whose insulin secretory function is highly dependent on oxygen11-13. Capsule composition and geometry will also impact diffusion rates and lengths for oxygen. Therefore, we also describe a technique for identifying hypoxic cells within our PEG capsules. Infection of the cells with a recombinant adenovirus allows for a fluorescent signal to be produced when intracellular hypoxia-inducible factor (HIF) pathways are activated14. As HIFs are the primary regulators of the transcriptional response to hypoxia, they represent an ideal target marker for detection of hypoxic signaling15. This approach allows for easy and rapid detection of hypoxic cells. Briefly, the adenovirus has the sequence for a red fluorescent protein (Ds Red DR from Clontech) under the control of a hypoxia-responsive element (HRE) trimer. Stabilization of HIF-1 by low oxygen conditions will drive transcription of the fluorescent protein (Figure 1). Additional details on the construction of this virus have been published previously15. The virus is stored in 10% glycerol at -80&deg; C as many 150 &mu;L aliquots in 1.5 mL centrifuge tubes at a concentration of 3.4 x 1010 pfu/mL. 
Previous studies in our lab have shown that MIN6 cells encapsulated as aggregates maintain their viability throughout 4 weeks of culture in 20% oxygen. MIN6 aggregates cultured at 2 or 1% oxygen showed both signs of necrotic cells (still about 85-90% viable) by staining with ethidium bromide as well as morphological changes relative to cells in 20% oxygen. The smooth spherical shape of the aggregates displayed at 20% was lost and aggregates appeared more like disorganized groups of cells. While the low oxygen stress does not cause a pronounced drop in viability, it is clearly impacting MIN6 aggregation and function as measured by glucose-stimulated insulin secretion15. Western blot analysis of encapsulated cells in 20% and 1% oxygen also showed a significant increase in HIF-1&alpha; for cells cultured in the low oxygen conditions which correlates with the expression of the DsRed DR protein.

A method for photo-encapsulation of cells in a crosslinked PEG hydrogel is described. Hypoxic signaling within encapsulated murine insulinoma (MIN6) aggregates is tracked using a fluorescent marker system. This system allows serial examination of cells within a hydrogel scaffold and correlation of hypoxic signaling with changes in cell phenotype.

איתות hypoxic מעקב בתוך תא מצרפי Encapsulated

In Diabetes mellitus type 1, autoimmune destruction of the pancreatic &beta;-cells results in loss of insulin production and potentially lethal ...

Longitudinal Measurement of Extracellular Matrix Rigidity in 3D Tumor Models Using Particle-tracking Microrheology

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and modified as part of a set of complex, two-way mechanosensitive interactions. While the development of biologically-relevant 3D tumor models have facilitated mechanistic studies on the impact of matrix rheology on tumor growth, the inverse problem of mapping changes in the mechanical environment induced by tumors remains challenging. Here, we describe the implementation of particle-tracking microrheology (PTM) in conjunction with 3D models of pancreatic cancer as part of a robust and viable approach for longitudinally monitoring physical changes in the tumor microenvironment, in situ. The methodology described here integrates a system of preparing in vitro 3D models embedded in a model extracellular matrix (ECM) scaffold of Type I collagen with fluorescently labeled probes uniformly distributed for position- and time-dependent microrheology measurements throughout the specimen. In vitro tumors are plated and probed in parallel conditions using multiwell imaging plates. Drawing on established methods, videos of tracer probe movements are transformed via the Generalized Stokes Einstein Relation (GSER) to report the complex frequency-dependent viscoelastic shear modulus, G*(&#969;). Because this approach is imaging-based, mechanical characterization is also mapped onto large transmitted-light spatial fields to simultaneously report qualitative changes in 3D tumor size and phenotype. Representative results showing contrasting mechanical response in sub-regions associated with localized invasion-induced matrix degradation as well as system calibration, validation data are presented. Undesirable outcomes from common experimental errors and troubleshooting of these issues are also presented. The 96-well 3D culture plating format implemented in this protocol is conducive to correlation of microrheology measurements with therapeutic screening assays or molecular imaging to gain new insights into impact of treatments or biochemical stimuli on the mechanical microenvironment.

Particle-tracking microrheology can be used to non-destructively quantify and spatially map changes in extracellular matrix mechanical properties in 3D tumor models.

מדידת אורך של תאי מטריקס קשיחות במודלי גידול 3D באמצעות Microrheology מעקב חלקיקים

The mechanical microenvironment has been shown to act as a crucial regulator of tumor growth behavior and signaling, which is itself remodeled and ...

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances (EPS). The EPS serves as a physical and protective scaffold that houses the bacterial cells and consists of a variety of materials that includes proteins, exopolysaccharides and DNA. The composition of the EPS may change, which remodels the mechanic properties of the biofilm to further develop or support alternative biofilm structures, such as streamers, as a response to environmental cues. Despite this, there are little quantitative descriptions on how EPS components contribute to the mechanical properties and function of biofilms. Rheology, the study of the flow of matter, is of particular relevance to biofilms as many biofilms grow in flow conditions and are constantly exposed to shear stress. It also provides measurement and insight on the spreading of the biofilm on a surface. Here, particle-tracking microrheology is used to examine the viscoelasticity and effective crosslinking roles of different matrix components in various parts of the biofilm during development. This approach allows researchers to measure mechanic properties of biofilms at the micro-scale, which might provide useful information for controlling and engineering biofilms.

In Situ Mapping of the Mechanical Properties of Biofilms by Particle-tracking Microrheology

Particle-tracking microrheology investigates the viscoelasticity of materials. Here, the technique is used to determine the viscoelasticity, creep compliance and effective crosslinking roles of different matrix components of a bacterial biofilm. The matrix consists of polymeric substances secreted by the bacteria and its components determine biofilm structure and mechanical properties.

במיפוי באתרו של התכונות מכניות של Biofilms ידי Microrheology מעקב חלקיקים

Bacterial cells are able to form surface-attached biofilm communities known as biofilms by encasing themselves in extracellular polymeric substances ...

Microfluidic Platform with Multiplexed Electronic Detection for Spatial Tracking of Particles

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to spatially fractionate the sample based on a biological property of interest. For the resultant spatial distribution to be used as the assay readout, microfluidic devices are often subjected to microscopic analysis requiring complex instrumentation with higher cost and reduced portability. To address this limitation, we have developed an integrated electronic sensing technology for multiplexed detection of particles at different locations on a microfluidic chip. Our technology, called Microfluidic CODES, combines Resistive Pulse Sensing with Code Division Multiple Access to compress 2D spatial information into a 1D electrical signal. In this paper, we present a practical demonstration of the Microfluidic CODES technology to detect and size cultured cancer cells distributed over multiple microfluidic channels. As validated by the high-speed microscopy, our technology can accurately analyze dense cell populations all electronically without the need for an external instrument. As such, the Microfluidic CODES can potentially enable low-cost integrated lab-on-a-chip devices that are well suited for the point-of-care testing of biological samples.

We demonstrate a microfluidic platform with an integrated surface electrode network that combines resistive pulse sensing (RPS) with code division multiple access (CDMA), to multiplex detection and sizing of particles in multiple microfluidic channels.

פלטפורמת microfluidic עם איתור Multiplexed אלקטרוני למערכות מעקב מרחבית של חלקיקים

Microfluidic processing of biological samples typically involves differential manipulations of suspended particles under various force fields in order to ...

Assembly and Tracking of Microbial Community Development within a Microwell Array Platform

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial distribution and activities of community members. We have developed a microwell array platform that can be used to rapidly assemble and track thousands of bacterial communities in parallel. This protocol highlights the utility of the platform and describes its use for optically monitoring the development of simple, two-member communities within an ensemble of arrays within the platform. This demonstration uses two mutants of Pseudomonas aeruginosa, part of a series of mutants developed to study Type VI secretion pathogenicity. Chromosomal inserts of either mCherry or GFP genes facilitate the constitutive expression of fluorescent proteins with distinct emission wavelengths that can be used to monitor community member abundance and location within each microwell. This protocol describes a detailed method for assembling mixtures of bacteria into the wells of the array and using time-lapse fluorescence imaging and quantitative image analysis to measure the relative growth of each member population over time. The seeding and assembly of the microwell platform, the imaging procedures necessary for the quantitative analysis of microbial communities within the array, and the methods that can be used to reveal interactions between microbial species area all discussed.

The development of microbial communities depends on a combination of factors, including environmental architecture, member abundance, traits, and interactions. This protocol describes a synthetic, microfabricated environment for the simultaneous tracking of thousands of communities contained in femtoliter wells, where key factors such as niche size and confinement can be approximated.

העצרת ומעקב אחר פיתוח הקהילה מיקרוביאלית בתוך פלטפורמת מערך Microell

The development of microbial communities depends on a combination of complex deterministic and stochastic factors that can dramatically alter the spatial ...

A Protocol for Real-time 3D Single Particle Tracking

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although various RT-3D-SPT methods have been put forward in recent years, tracking high speed 3D diffusing particles at low photon count rates remains a challenge. Moreover, RT-3D-SPT setups are generally complex and difficult to implement, limiting their widespread application to biological problems. This protocol presents a RT-3D-SPT system named 3D Dynamic Photon Localization Tracking (3D-DyPLoT), which can track particles with high diffusive speed (up to 20 &#181;m2/s) at low photon count rates (down to 10 kHz). 3D-DyPLoT employs a 2D electro-optic deflector (2D-EOD) and a tunable acoustic gradient (TAG) lens to drive a single focused laser spot dynamically in 3D. Combined with an optimized position estimation algorithm, 3D-DyPLoT can lock onto single particles with high tracking speed and high localization precision. Owing to the single excitation and single detection path layout, 3D-DyPLoT is robust and easy to set up. This protocol discusses how to build 3D-DyPLoT step by step. First, the optical layout is described. Next, the system is calibrated and optimized by raster scanning a 190 nm fluorescent bead with the piezoelectric nanopositioner. Finally, to demonstrate real-time 3D tracking ability, 110 nm fluorescent beads are tracked in water.

This protocol details the construction and operation of a real-time 3D single particle tracking microscope capable of tracking nanoscale fluorescent probes at high diffusive speeds and low photon count rates.

פרוטוקול לצורך מעקב בזמן אמת 3D חלקיק יחיד

Real-time three-dimensional single particle tracking (RT-3D-SPT) has the potential to shed light on fast, 3D processes in cellular systems. Although ...

An Orbital Shaking Culture of Mammalian Cells in O-shaped Vessels to Produce Uniform Aggregates

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based method is one of the simplest techniques for the mass production of cellular aggregates, but it does not protect the cultures against over-aggregation, which occurs when they gather at the bottom center of the culture vessel. To solve this problem, we developed an O-shaped dish and an O-shaped bag, neither of which contains a central region. Aggregates grown in either O-shaped culture vessel were noticeably more uniform in size than aggregates grown in conventional vessels. Histological analyses showed that aggregates in conventional culture dishes contained necrotic cores most likely caused by a poor oxygen supply. In contrast, aggregates that were grown in the O-shaped bag, even those with similar diameters to aggregates in conventional culture dishes, did not show necrotic cores. These results suggest that the O-shaped bag provides sufficient oxygen to the aggregates due to the oxygen permeability of the bag material. We, therefore, propose that this novel gas-permeable O-shaped culture bag is suitable for the mass production of uniform aggregates that are necessary in various biotechnological fields.

Here we present a protocol for using O-shaped vessels, specialized for suspension cultures of cellular aggregates, with orbital shaking. The HEK293 cells grown in this bag form more homogeneous aggregates than those grown in conventional culture vessels.

אורביטל טלטול התרבות של תאים בתרבית של צורת O כלי לייצר אגרגטים אחיד

Suspension cultures of mammalian cell aggregates are required for various applications in medical and biotechnological fields. The disposable bag-based ...

Segmenting Growth of Endothelial Cells in 6-Well Plates on an Orbital Shaker for Mechanobiological Studies

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and multidirectional shear stresses have all been postulated to stimulate a pro-atherosclerotic phenotype in endothelial cells, whereas high magnitude and unidirectional or uniaxial shear are thought to promote endothelial homeostasis. These hypotheses require further investigation, but traditional in vitro techniques have limitations, and are particularly poor at imposing multidirectional shear stresses on cells. 
One method that is gaining increasing use is to culture endothelial cells in standard multi-well plates on the platform of an orbital shaker; in this simple, low-cost, high-throughput and chronic method, the swirling medium produces different patterns and magnitudes of shear, including multidirectional shear, in different parts of the well. However, it has a significant limitation: cells in one region, exposed to one type of flow, may release mediators into the medium that affect cells in other parts of the well, exposed to different flows, hence distorting the apparent relation between flow and phenotype. 
Here we present an easy and affordable modification of the method that allows cells to be exposed only to specific shear stress characteristics. Cell seeding is restricted to a defined region of the well by coating the region of interest with fibronectin, followed by passivation using passivating solution. Subsequently, the plates can be swirled on the shaker, resulting in exposure of cells to well-defined shear profiles such as low magnitude multidirectional shear or high magnitude uniaxial shear, depending on their location. As before, the use of standard cell-culture plasticware allows straightforward further analysis of the cells. The modification has already allowed the demonstration of soluble mediators, released from endothelium under defined shear stress characteristics, that affect cells located elsewhere in the well.

This protocol describes a coating method to restrict endothelial cell growth to a specific region of a 6-well plate for shear stress application using the orbital shaker model.

פילוח הצמיחה של תאי אנדותל ב 6-באר צלחות על שייקר מסלולית למחקרים מכניים

Shear stress imposed on the arterial wall by the flow of blood affects endothelial cell morphology and function. Low magnitude, oscillatory and ...

An In vitro System to Gauge the Thrombolytic Efficacy of Histotripsy and a Lytic Drug

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is catheter-directed thrombolytics (CDT). To mitigate caustic side effects and the long treatment time associated with CDT, adjuvant and alternative approaches are under development. One such approach is histotripsy, a focused ultrasound therapy to ablate tissue via bubble cloud nucleation. Pre-clinical studies have demonstrated strong synergy between histotripsy and thrombolytics for clot degradation. This report outlines a benchtop method to assess the efficacy of histotripsy-aided thrombolytic therapy, or lysotripsy.
Clots manufactured from fresh human venous blood were introduced into a flow channel whose dimensions and acousto-mechanical properties mimic an iliofemoral vein. The channel was perfused with plasma and the lytic&#160;recombinant tissue-type plasminogen activator. Bubble clouds were generated in the clot with a focused ultrasound source designed for the treatment of femoral venous clots. Motorized positioners were used to translate the source focus along the clot length. At each insonation location, acoustic emissions from the bubble cloud were passively recorded, and beamformed to generate passive cavitation images. Metrics to gauge treatment efficacy included clot mass loss (overall treatment efficacy), and the concentrations of D-dimer (fibrinolysis) and hemoglobin (hemolysis) in the perfusate. There are limitations to this in vitro design, including lack of means to assess in vivo side effects or dynamic changes in flow rate as the clot lyses. Overall, the setup provides an effective method to assess the efficacy of histotripsy-based strategies to treat DVT.

Histotripsy-aided lytic delivery or lysotripsy is under development for the treatment of deep vein thrombosis. An in vitro procedure is presented here to assess the efficacy of this combination therapy. Key protocols for the clot model, image guidance, and assessment of treatment efficacy are discussed.

מערכת במבחנה לאמוד את היעילות התרומבוליטית של היסטוטרפסיה וסם ליטיק

Deep vein thrombosis (DVT) is a global health concern. The primary approach to achieve vessel recanalization for critical obstructions is ...

Improving Reproducibility to Meet Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 Guidelines in Nanoparticle Tracking Analysis

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many consider that NTA instruments and their software packages can be easily utilized following minimal training and that size calibration is feasible in-house. As both NTA acquisition and software analysis constitute EV characterization, they are addressed in Minimal Information for Studies of Extracellular Vesicles 2018 (MISEV2018). In addition, they have been monitored by Transparent Reporting and Centralizing Knowledge in Extracellular Vesicle Research (EV-TRACK) to improve the robustness of EV experiments (e.g., minimize experimental variation due to uncontrolled factors).
Despite efforts to encourage the reporting of methods and controls, many published research papers fail to report critical settings needed to reproduce the original NTA observations. Few papers report the NTA characterization of negative controls or diluents, evidently assuming that commercially available products, such as phosphate-buffered saline or ultrapure distilled water, are particulate-free. Similarly, positive controls or size standards are seldom reported by researchers to verify particle sizing. The Stokes-Einstein equation incorporates sample viscosity and temperature variables to determine particle displacement. Reporting the stable laser chamber temperature during the entire sample video collection is, therefore, an essential control measure for accurate replication. The filtration of samples or diluents is also not routinely reported, and if so, the specifics of the filter (manufacturer, membrane material, pore size) and storage conditions are seldom included. The International Society for Extracellular Vesicle (ISEV)&#39;s minimal standards of acceptable experimental detail should include a well-documented NTA protocol for the characterization of EVs. The following experiment provides evidence that an NTA analysis protocol needs to be established by the individual researcher and included in the methods of publications that use NTA characterization as one of the options to fulfill MISEV2018 requirements for single vesicle characterization.

Nanoparticle tracking analysis (NTA) is a widely used method to characterize extracellular vesicles. This paper highlights NTA experimental parameters and controls plus a uniform method of analysis and characterization of samples and diluents necessary to supplement the guidelines proposed by MISEV2018 and EV-TRACK for reproducibility between laboratories.

שיפור רבייה כדי לענות על מידע מינימלי למחקרים של שלפוחיות חוץ-תאיות 2018 הנחיות בניתוח מעקב חלקיקים

Nanoparticle tracking analysis (NTA) has been one of several characterization methods used for extracellular vesicle (EV) research since 2006. Many ...