Name: a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies
Uploaded: 2014-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
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저자는 중개 연구단의 기술 직원을 감사하고 싶습니다; 메리 Economou, 호세 갈반, 캐롤라인 망치, 도미니크 뮐러 Liliane Schöni 및 병리학 연구소 정보학 팀, 베른의 대학.

주 : 본 연구는 INSEL 병원, 베른, 스위스 (07-10-13)의 로컬 윤리위원회에 의해 승인되었습니다. 조직은 종양 은행 병리학 베른, 연구소, 베른 대학에서 얻을 수 있었다. 1 계획 및 설계 (컨설팅) <ol><li> 연구 문제에 대해 생각하는 대답한다. 조직 유형 결정은 프로젝트에 포함합니다. 조직 학적 구조가 질문에 대답하는 것이 중요 무엇인지 확인합니다. </li><li> 가장 유용한 코어 직경 및 프로젝트 환자 당 코어 수를 확인. 바이오 마커의 양을 기준으로 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA)의 매수를 결정하는 것은 조사한다. </li><li> 조직 마이크로 어레이 (TMA)가 생성 된 후에 같은 표본의 크기 및 분석과 같은 통계적인 측면을 고려한다. 연구에 포함 환자의 수를 결정하고 배열하기위한 제어 조직을 확립한다. </li><li> 조직 학적 검색 (또는진단) 헤 마톡 실린 및 에오신 (H &amp; E) 각 환자의 슬라이드. 간단히 슬라이드를 검토하고 프로젝트에 대한 관련 정보와 조직 검사를 포함하는 사람을 식별합니다. 참고 : 특수 염색 또는 면역 조직 화학 슬라이드 슬라이드 스캔 및 주석을 위해 필요한 경우 대신 H &amp; E 슬라이드, 파라핀 블록의 새로운 섹션을 확인 </li></ol> 2 슬라이드 스캐닝 <ol><li> PC 및 슬라이드 스캐너와 오픈 검색 소프트웨어를 켭니다. 미리보기 화면에서 밝은 필드 검색을위한 &quot;자동 모드&quot;를 선택합니다. </li><li> 슬라이드 품질 매개 변수를 조정 &quot;검색 옵션&quot;을 클릭합니다. 이 때, 슬라이드를 직접 웹하거나 로컬 드라이브 (또는 외부 드라이브)에 액세스 할 수있는 디지털 플랫폼에 스캔 할 것인지 여부를 선택하고 스캔 및 초점 포인트 수의 유형을 설정합니다. </li><li> &quot;케이스 센터&quot;로 스캔 &quot;서버 매개 변수&quot;을 클릭합니다. 이 단계에서, 더 많은 잡지를 추가 모든 슬라이드에 레이블을 설정하고슬라이드가 저장되어야한다 케이스 센터에서 폴더를 선택합니다. 각 잡지는 25 슬라이드를 보유하고있다. </li><li> 품질 확인 / 스캔을위한 실제 조직 학적 슬라이드의 청결. 70 % 에탄올로 필요한 깨끗한 슬라이드합니다. </li><li> 라벨이 안쪽으로 가리키는 잡지 당 25 슬라이드까지로드 (그림 3A) </li><li> 스캐너에 잡지를 놓습니다. 하나 이상의 매거진, 서로의 상단에 배치. </li><li> 녹색 화살표 (그림 3B)를 클릭하여 슬라이드를 스캔 시작합니다. 모든 슬라이드를 스캔하면 잡지를 언로드하고 프로그램, PC 및 슬라이드 스캐너를 차단. </li></ol> 3 디지털 슬라이드 주석 <ol><li> 디지털 슬라이드 관리 센터의 브라우저에 주소를 입력하고 무료 디지털 슬라이드 뷰어 소프트웨어를 다운로드합니다. </li><li> 디지털 슬라이드 뷰어 소프트웨어를 열고 디지털 슬라이드 (그림 4A)이 포함 된 폴더를 선택합니다. </li><li> 메모를 추가 순서를 변경하고 DIGITA 관리리터 슬라이드 폴더 나 동료에게 사용자 권한을 할당하거나 폴더에 첨부 파일을 추가합니다. </li><li> 디지털 슬라이드 뷰어에 나타납니다 원하는 디지털 슬라이드를 클릭하십시오. </li><li> 배율 도구를 사용하여 슬라이드를 평가하고 ngTMA로의 통합에 대한 관심 영역을 찾아. </li><li> &#39;TMA 주석 도구&#39;를 이용하여, 원하는 코어의 크기 및 주석의 컬러를 선택한다. (그림 4B) 그것을 클릭하여 디지털 슬라이드에 주석을 배치합니다. </li><li> ngTMA (그림 4C)에 통합에 대해 원하는 조직 학적 구조에 주석을 이동합니다. </li><li> 코어 크기 및 원하는 색상을 주석, 주석 도구를 사용하여 선택하여 다시 주석이 과정을 반복한다. 폴더에있는 모든 슬라이드의 슬라이드보기 및 주석을 반복합니다. </li><li> 또한, TMA에 0.2 ml의 튜브보다는 통합으로 PCR을위한 조직 코어를 배치합니다. 식별하기 위해 다른 색상을 사용하여 슬라이드를 주석더 분​​자 분석을 위해 이러한 관광 명소입니다. </li><li> 해당 주석과 색상으로 모든 경우의 목록을 작성합니다. </li></ol> (4) 조직 마이크로 어레이 건설 <ol><li> 조직 microarraying에 대해 원하는 순서로 블록을 정렬 모든 주석 디지털 슬라이드에 해당하는 파라핀 조직 블록을 검색합니다. </li><li> 조직 블록은 4mm 두께의 최소 권한이 있는지 확인합니다. 그렇지 않은 경우, 조직의 reembedding 필요하다. </li><li> 자동화 된 조직 마이크로 어 악기 &quot;ON&quot;PC 전원을 켭니다. 조직 마이크로 어 소프트웨어를 열고 프로젝트에 이름을 제공 </li><li> &quot;도구 변경&quot;을 수행하고 프로젝트에 필요한 공구 직경을 선택 (즉, 0.6, 1.0, 1.5, 또는 2.0 mm). </li><li> 기계에 12 &#39;받는 사람&#39;TMA 블록까지 넣습니다. 12 블록들 각각에 ID를 보내기 </li><li> 받는 사람 각각의 블록에 대한 TMA 레이아웃을 만듭니다. 행, 열 및 empt의 수와 TMA 디자인을 준수Y 라인뿐만 아니라 코어 사이의 거리입니다. 받는 사람 각각의 블록에 대한 새로운 레이아웃을 만들거나 반복적으로 동일한 레이아웃을 사용합니다. </li><li> 첫 번째 코어를 적용하려면받는 사람 블록 레이아웃에 커서를 놓습니다. </li><li> 다음으로, 조직 마이크로 어 (그림 5A)에 60 기증자 블록까지로드합니다. 각 블록에게 기증자의 ID를 부여 F. 각 행의 열 블록을 배치합니다. 조직 마이크로 어에 의해 자동적으로 취득 된 컴퓨터 화면에 각 공여 블록의 화상을 관찰한다. </li><li> 첫 번째 블록을 시작으로, &quot;슬라이드&quot;를 클릭하십시오. 디지털 슬라이드 뷰어를 사용하여 디지털 슬라이드 관리 센터에 (또는 외부 드라이브에) 저장 주석 디지털 슬라이드를 관찰한다. 공여 블록의 이미지와 디지털 슬라이드 나란히보기. </li><li> 블록 이미지를 선택 기준점은 디지털 슬라이드 기증자 블록 이미지를 중첩합니다 </li><li> &quot;다음&quot;을 클릭 한 후, 블록의 큰 이미지에 주석을 관찰합니다. (그림 5B &lt;/ strong&gt;에서)​​. 확인하고 &quot;시작&quot;을 클릭하여 주석의 상단을 클릭합니다. 참고 :이 선택한 시작 지점에서받는 사람 블록에 직경 0.6 mm의 구멍을 드릴 시작하는 조직 마이크로 어를 묻는 메시지가 나타납니다. 이어서 제 2 단계에서, 펀칭 공구를 이용하면, 기기는 정확한 주석 및 확인 영역에서 도너 선택된 블록으로부터 조직에 구멍을 펀치. 코어는 다음받는 사람 블록에 기증자로부터 전송됩니다. </li><li> 약 500 코어 후, 자일 렌의 면봉을 사용하여 드릴 구멍을 뚫는 도구를 청소합니다. </li><li> 조직 코어가 (오히려 ngTMA에 펀치보다) 원하는 경우, 블록에 대한 &quot;PCR&quot;도구를 클릭 4 주석까지 확인하고 공격 &quot;시작&quot;. 이 펀치와 0.2 ML 튜브에 코어를 전송합니다. </li><li> 반복 포인트 제 공여 블록 4.9-4.11 등. </li><li> 모든 기증자의 블록을 사용한 후, 조직 마이크로 어레이에 공여 블록의 두 번째 라운드 (61-120)을 입력어 및 단계 4.11에 4.8을 계속합니다. </li><li> 프로젝트 진행 드릴링 및 펀칭 (그림 5C)를 발생하는 동안 동안 기증자와받는 사람 블록 이미지를 새로 고칩니다. </li><li> 프로젝트를 완료 한 후 &quot;내보내기&quot;를 수행합니다. 기증자와받는 사람 차단 ID로 .xslx 파일을 찾아 내 보낸 폴더에있는 TMA 내의 모든 펀치뿐만 아니라 TMA 레이아웃 / 디자인의 현지화. 내 보낸 폴더 (그림 5D)에서 JPG 이미지로 모든 중첩 주석 모든 기증자 블록 이미지를 저장합니다. 마지막 TMA 블록은 준비가되어 있습니다. </li></ol>

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	<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li><li>Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray+technology:+principles,+pitfalls+and+perspectives--lessons+learned+from+hematological+malignancies.">Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies.</a> Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).</li><li>Barlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activation+of+ribosomal+protein+S6+kinase+by+complementary+DNA+and+tissue+microarray+analysis.">Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis.</a> J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).</li><li>Bubendorf, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+gene+amplifications+during+prostate+cancer+progression+by+high-throughout+fluorescence+in+situ+hybridization+on+tissue+microarrays.">Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays.</a> Cancer Res. 59, 803-806 (1999).</li><li>Garcia-Caballero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-colour+CISH+is+a+reliable+alternative+to+FISH+for+assessment+of+topoisomerase+2-alpha+amplification+in+breast+carcinomas.">Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas.</a> Breast Cancer Res Treat. , 81-89 (2014).</li><li>Schraml, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+gene+amplification+surveys+in+many+different+tumor+types.">Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types.</a> Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).</li><li>Zlobec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RHAMM+within+the+hierarchy+of+well-established+prognostic+factors+in+colorectal+cancer.">Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer.</a> Gut. 57, 1413-1419 (2008).</li><li>Hsu, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+are+an+effective+quality+assurance+tool+for+diagnostic+immunohistochemistry.">Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).</li><li>Marin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+BRAF+p.V600E+Mutations+in+Melanoma+by+Immunohistochemistry+Has+a+Good+Interobserver+Reproducibility.">Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility.</a> Arch Pathol Lab Med. , 71-75 (2014).</li><li>Polley, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+International+Ki67+Reproducibility+Study.">An International Ki67 Reproducibility Study.</a> J Natl Cancer Inst. , 1897-1906 (2013).</li><li>Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+staining+intensity+in+the+interpretation+of+immunohistochemistry+for+tumor+markers+in+colorectal+cancer.">Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer.</a> Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).</li><li>Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+tissue+microarray+(ngTMA)+increases+the+quality+of+biomarker+studies:+an+example+using+CD3,+CD8,+and+CD45RO+in+the+tumor+microenvironment+of+six+different+solid+tumor+types.">Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types.</a> J Transl Med. 11, 104 (2013).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+ROS1+is+useful+for+identifying+ROS1+rearrangements+in+lung+cancers.">Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers.</a> Mod Pathol. , 711-720 (2014).</li><li>Droeser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+pattern+and+prognostic+significance+of+CD4+,+FOXP3++and+IL-17++tumor+infiltrating+lymphocytes+in+ductal+and+lobular+breast+cancers.">Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers.</a> BMC Cancer. 12, 134 (2012).</li><li>Fleischmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+are+differentially+expressed+in+Gleason+patterns+of+prostate+cancer+and+down-regulated+in+matched+lymph+node+metastases.">Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases.</a> Prostate. 71, 453-460 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+breast+cancer+susceptibility+gene+1+expression+is+a+potential+prognostic+biomarker+in+resectable+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pancreas. 42, 977-982 (2013).</li><li>Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her2+amplification+is+significantly+more+frequent+in+lymph+node+metastases+from+urothelial+bladder+cancer+than+in+the+primary+tumours.">Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours.</a> Eur Urol. 60, 350-357 (2011).</li><li>Zhang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Annexin+A1+protein+expression+in+human+gastric+adenocarcinoma+using+proteomics+and+tissue+microarray.">Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray.</a> World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).</li><li>Chaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+is+frequently+overexpressed+in+penile+squamous+cell+carcinomas:+a+tissue+microarray+and+digital+image+analysis+study+of+112+cases.">The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases.</a> Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).</li><li>McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+breast+tissue+microarray+images+using+contextual+classifiers.">Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers.</a> J Pathol Inform. 4, S13 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells,+early+metastasis,+and+survival+in+colorectal+cancer.">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).</li><li>Komiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+technique,+spiral+tissue+microarrays+constructed+using+needle+biopsy+specimens,+to+prostate+cancer+research.">Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research.</a> Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).</li><li>Quintayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+tissue+microarrays:+A+novel+and+viable+approach+to+optimising+tissue+micro-arrays+for+biomarker+research+applied+to+Ductal+Carcinoma+in+Situ+(DCIS).">Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS).</a> Histopathology. , 2-8 (2014).</li><li>Torata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tablet+method:+an+efficient+tissue+banking+procedure+applicable+to+both+molecular+analysis+and+frozen+tissue+microarray.">Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray.</a> Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).</li></ol>

The authors have no disclosures

본 논문에서는 ngTMA을위한 프로토콜이 설명되어 있습니다. ngTMA 계획 및 디자인, 디지털 병리 및 슬라이드 주석을 포함하는 조직 microarraying뿐만 아니라 자동화 된 조직 microarraying 12 새로 설립 된 개념이다. 기존의 조직 microarraying에 비해 ngTMA은 많은 이점을 제공한다. 제 1 단계에서, 계획 및 설계 상 매우 중요하다. 초점은 대상 연구 질문에 대답입니다. 이 고려해야 할 조직 학적 문제 (예를 들어, 얼마나 많은 관광 명소가 내가 원하는 않는 지역과 포함하는 방법?), 통계 계획 (예를 들어, 표본의 크기? 나중에 내 샘플을 분석하는 방법은?) 및 물류 고려 사항 (예를 들어, 어떻게 많은 바이오 마커 때문에 얼마나 많은 ngTMA 복사?). 특정 ngTMA는 바이오 마커 검사 및 높은 처리량에 대한 것인지, 특정 요구했다 또는 몇 잘 선택 CAS의 특정 조직 학적 측면을 연구하기위한 것입니다에스. 하나가 아닌 경우, 기존의 조직 microarraying의 가장 중요한 단점은 조직 학적 슬라이드의 표시가 만들어지는과 낮은 정확도이다. 특정 조직 학적 구조, 세포 또는 지역의 연구는 거의 불가능 이루어집니다. 주석이 디지털 슬라이드에 직접 배치되기 때문에 ngTMA 높은 정확성을 위해 수 있습니다. 이 정확하게 영역을 선택할 수있는 연구원이 특정 세포를 포함, 펀칭 할 수 있습니다. 이 예에서, 동일한 조직 블록 내의 다양한 영역들은 그러한 작은 종양 세포 클러스터 또는 단일 세포의 존재에 의해 강조 종양 센터, 내습 전면 및 종양 / 기질 상호 작용의 영역으로서,으로 배열 대해 펀칭된다. 이 정확도는 ngTMA을 사용하여 달성 될 수있다. 슬라이드를 웹 기반의 디지털 플랫폼으로 스캔하기 때문에 셋째, 볼을 밀어 주석이 컴퓨터를 통해이 아닌 현미경으로 할 수있다. 조직으로 배열 소프트웨어는 사용자 친화적 인 제공유연성의 고차 따라서 다른 레이아웃 및 디자인 ngTMA 인터페이스가 달성 될 수있다. TMA 건설 시추에 의해 자동으로 수행되어 있기 때문에, 손에 기동 및 건설 시간이 크게 줄어 듭니다 거의 필요가있다. 여기이 예에서 TMA 건설을위한 시간은 24 시간 사이입니다. 기존 TMA 접근 방식을 사용하고 시간 당 15 펀치를 추정하는이 프로젝트는 약 304 시간을 걸릴 것이다. ngTMA 단백질 발현의 mRNA 또는 DNA뿐 아니라 이들의 조합을 연구하기 위해 적용될 수있다. 9 잠재적 바이오 마커에 ​​이러한 애플리케이션의 몇몇 예시도. 표준 면역 조직 화학은 기-67을 이용하여 암의 증식 지수를 결정하기 위해 적용될 수있다. 이러한 HER2와 같은 유전자 단백질 발현과 DNA 증폭을 조사하기 위해 결합 방법이 사용될 수있다. 조직은 비용, 조직 및 다른 자원 사용량을 줄이기 위해 단일 ​​ngTMA 함께 수집 될 수있다의. 또한, HER2 유전자 및 기타 원위치 혼성화에서 발색은 mRNA의 조직 슬라이드의 최소 수를 사용하는 경우에는 많은 수의 단일의 mRNA 전 사체를 식별하기 위해 수행 될 수있다. 이러한 면역 CD8 마커의 면역는 종양 미세 환경의 컨텍스트에서 시각화 될 수있다. 이중 면역 조직 화학 염색은 또한 암의 침략 앞에 (갈색에 표시) 면역 (빨간색으로 표시) 세포와 종양 세포 사이의 상호 작용으로 관심의 특정 영역을 강조하는 데 사용할 수 있습니다. 관심의 이러한 영역은 기존의 조직 microarraying를 사용하여 캡처 한 수 없었다. 그럼에도 불구하고,이 프로토콜은 몇 가지 제한 사항이 포함되어 있습니다. 가장 중요한 과제는 공여 블록 및 디지털 슬라이드 사이의 중첩이다. 여러 가지 요인이 단계에 영향을 미칠 수있다. 먼저, 블록의 최신 섹션 슬라이드 스캐닝을 위해 사용되어야한다. 많은 경우에, H &amp; E는 공여 블록 rathe의 마지막 섹션 아니다연구는 면역 조직 화학 또는 다른 얼룩입니다. 마지막 얼룩이 스캔 주석 또는 새로운 H &amp; E가 이루어져야한다이 경우, 또한 염색 한 슬라이드는 이용 될 수있다. 조직 슬라이드 블록의 도전적인 일치에 이르게 물을 욕조에 확장 수 있으므로 조직 섹션이 만들어지고있는 경우주의가 또한주의해야한다. 둘째, 순간 프로젝트는 한 번에 처리 12받는 TMA 블록으로 제한된다. 12 TMAs를 초과하는 큰 프로젝트는 두 번째 프로젝트 이름에 할당해야합니다. 셋째, 기증자 블록은 다양한 크기 자체를 조정할 수 없습니다 기기 등의 표준 금형 및 카세트를 사용해야합니다. 마지막으로 공여 블록은 최적의 천공을 달성하기 최소 높이 (4mm)를 초과해야한다. 일부 경우에서, 이것은 조직 reembedding을 필요로한다. 지난 몇 년 동안 출판 수백명의 바이오 마커 연구를위한 귀중한 도구로 TMA를 강조 표시합니다. TMAs는 폐암 13, 대장 7, BRE를 연구하는 데 사용되었습니다AST (14), 전립선 암 (15), 췌장 (16), 방광 (17), 그리고 위 18 암, 몇 가지 이름을 지정합니다. 저자의 수가 증가하고 이미지 분석 상당한 진보가이 방향으로 19 ~ 21 절에서 이루어지고있다와 TMAs의 사용을 결합했다. 그러나, 혁신적인 TMA 아이디어 22-24을 게시 한 연구 그룹의 소수 옆에 작은 관심은 TMA 기술 자체를 최적화하기 위해 주어졌다. 같은 ATA-27 Estigen / 비처하는 등 자동화 된 조직 microarrayers는 레이아웃 설계 및 편법 및 자동화 된 조직 펀치를 제공 할. 그러나 이것은 ngTMA 개념의 단지 한 측면을 나타냅니다. ngTMA은 기존의 조직 microarraying 기술을 통해 상당한 개선이다. 그것은 디지털 병리의 유연성과 속도와 자동화 된 TMA 건설의 신뢰성 디지털 주석의 정밀도와 조직 학적 및 TMA 디자인에 대한 전문 지식을 통합합니다. ngTM의 조합단백질 분자 바이오 마커의 평가 용 화상 분석은 상기 미래 임상 연구 및 병진의 품질을 향상 할 수있는 강력한 도구가 될 것이다.

지난 20 년 동안 조직 마이크로 어레이 (TMAs)는 바이오 마커 조사 연구에 현저한 영향을 미치고있다. TMAs는 파라핀 &#39;기증자&#39;블록에서 단일 TMA &#39;받는 사람&#39;블록으로, 기본적으로 (그림 1) 일반적으로 직경 0.6 ~ 2.0 mm에서 크기에 이르기까지 작은 조직 코어의 반복 전송, 생산 조직 &quot;아카이브&quot;의 아르 한. 작은 크기의 코어를 사용하여, 몇 개의 또는 많은 다른 환자로부터 약 500 가지 조직 스팟은 한 TMA (2)에 배열 될 수있다. 예후 또는 예측 바이오 마커 연구 TMAs의 사용은 많은 장점을 가지고있다. 면역 조직 화학 염색에 의한 단백질 바이오 마커의 발현은 450 명에서 평가 될 예를 생각해 보자. 오히려 블록의 동일한 번호는 구획 (450), 환자 (450)에 슬라이드 면역 얼룩을 수행하는 것보다, 각 샘플에서 작은 코어는 단일 T 상에 배열 될 수있다MA 블록. 다수의 코어는 각각의 개별 환자에서 촬영하더라도, 블록의 최소 개수가 일어난다. 이것은 크게 비용 및 기타 리소스를 감소뿐만 아니라 조직의 낭비를 줄이는 상당한 효과가있다. 조직의 다수를 사용이 또한 적절히 구동있게 연구는 동일한 실험 조건 하에서 평가한다. TMAs는 다양한 응용 프로그램을 가지고있다. 예를 들어, 이들은 형태학, 단백질 발현, RNA 발현 및 다른 염료 염색 다음 DNA 수차를 연구하는 데 사용할 수 있거나, 동일계 하이브리드 화 3-7 또는 면역 형광 발색 심지어 후. 최근의 연구는 또한, 염색 프로토콜에 내 및 실험실 간 변동을 테스트 특이 또는 특정 유전자 돌연변이에 대한 항체의 감도를 설정하고 국제 협력에서의 단백질 발현의 관찰자 간 재현성을 결정하기 위해 TMAs를 사용했다 <sup&gt; 8-11. 환자 유래의 조직을 사용하여 기존의 TMAs의 건설은 긴 다중 단계 절차 (그림 2)입니다. 그것은 그들이이 검색되는 곳에서 병리학 연구소, 기타 연구소에서 가능한 적절한 경우에 대한 검색 및 아카이브에서 진단 슬라이드의 선택으로 시작된다. 병리학 경우 당 각 슬라이드를 평가하고 연구의 목적을 위해 가장 대표적인 슬라이드를 선택합니다. 다음으로, 관심 영역은 현미경 하에서 직접 펜을 사용하여 표시된다. 이것은 종종 도전과 부정확 만 조직 펀치가에서 촬영해야하는 위치의 &quot;추정&quot;가 발생합니다. 다음으로,이 표시된 슬라이드에 해당하는 파라핀 블록은 아카이브에서 검색됩니다. 블록과 슬라이드 사이의 빠른 비교가 이루어집니다. 반자동 또는 제 티슈 arrayer 사용 도너 블록은 예상 관심 영역에 펀칭하고 수신자 TMA 블록으로 전송. 이으로 배열 기술을 사용 TMAs의 건설 노동 집약적, 시간이 소요, 부정확하고, 유연성이다. 3 부에서 475 점의 TMA 준비는 일의 84 시간이 걸릴 것으로 추정된다. 계획 및 설계 (또는 컨설팅), 조직 학적 전문 지식 및 자동화 된 TMA 12으로 배열과 결합 된 디지털 병리 : TMAs의 건설에 대한 새로운 접근 방식은 최근 병리학 연구소, 세 가지 구성 요소에 의존 베른의 대학에 의해 소개되었다. 함께,이 개념은 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA)라고합니다. 이하, ngTMA위한 프로토콜은 전이성 직장 결장암 (134)와 환자의 예에 기초하여 설명한다. 여기서, 일차 종양뿐만 아니라 림프절 전이 및 간전 후속 바이오 마커 분석을위한 ngTMAs으로 배열하여야한다. 또한 각 환자의 작은 조직 코어는 향후 핵산 추출을 위해 요구된다.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>free</td><td>Slide viewing software</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Digital slide platform</td></tr></tbody></table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

바이오 마커 연구는 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 의존한다. TMAs는 &#39;수신자 블록으로&#39;공여체 &#39;작은 블록으로부터 조직 코어의 반복 전송에 의해 제조 한 후 바이오 마커 다양한 애플리케이션에 사용된다. TMAs 종래의 구조는 노동 집약적 부정확하고 시간 소모적이다. 여기서, 차세대 조직 마이크로 어레이를 사용하여 프로토콜 (ngTMA)가 개설된다. ngTMA는 TMA 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 그리고 자동화 된 조직 microarraying을 기반으로합니다. 프로토콜은 134 전이성 직장 결장암 환자의 예를 사용하여 설명한다. 조직 학적 통계 및 물류 측면은 이러한 TMA, TMA 복사본 티슈 반점, 샘플 크기, 통계 분석 수, 및 번호에 포함 조직 유형, 특정 조직 학적 영역, 및 세포 유형으로 고려된다. 각 환자에 대한 조직 학적 슬라이드 스캔 및 웹 기반의 디지털 플랫폼에 업로드됩니다. 거기에, 그들은 볼 수 있으며 앤 아르otated 0.6-2.0 mm 직경 도구, 조직 영역을 구별하기 위해 다양한 색상을 사용하여 여러 번 사용하여 (표시). 기증자 블록 12 &#39;받는 사람&#39;블록은 악기에로드됩니다. 디지털 슬라이드를 검색 및 기증자 블록 이미지를 일치합니다. 주석 영역의 반복으로 배열 자동 ngTMA의 결과로 수행됩니다. 이 예에서, 여섯 ngTMAs은 여섯 가지 조직 유형 / 조직 학적 영역을 포함하는 계획이다. ngTMAs의 두 사본이 요구된다. 스캔 각 환자에 대한 사 슬라이드에 세; 3 스캔 실행이 필요 하룻밤을 수행합니다. 모든 슬라이드는 주석 아르; 다른 색상은 서로 다른 조직 / 영역, 즉 종양 센터, 침략 앞에, 종양 / 기질, 림프절 전이, 간 전이, 및 정상 조직을 나타내는 데 사용됩니다. 17 주석 ​​/ 케이스 통합됩니다 주석을위한 시간은 2-3 분 / 케이스입니다. 12 ngTMAs는 4,556 점을 포함하는 생산됩니다. 시간들을 배열하면 15 ~ 20 시간이다. 때문에 정밀도, 유연성, 속도, ngTMA은 강력하다상기 TMAs의 품질을 개선하는 도구 및 병진 임상 연구에 사용되는.

계획 및 설계 여기서는 생체의 특정 시리즈로 조사되는 전이성 대장 암 환자 134 예를 사용 하였다. 뿐만 아니라 ngTMA는 이러한 환자에 대한 계획,하지만 DNA 추출은 일부 특정 유전자 돌연변이 분석옵니다. ngTMA의 계획 및 설계 단계에서 다음과 같은 측면이 결정되었다. 각 환자에서 6 개의 다른 조직 학적 영역을 조사한다 : 종양 센터, 종양 침윤 앞, 밀도 종양의 영역 (종양 / 기질 상호 작용), 정상 조직, 림프절 전이 및 간 전이 신진. 종양 조직 면적 당 세 종양 반점이 정상 조직 스팟 프로젝트 (N = 환자 당 17 점)으로 포함되어야한다. 이 50 개 이상의 생체 물질이 환자에 조사하는 것이 예정되어 있기 때문에, 최종 ngTMA 두 복사본이 요구된다. 인해 림프절 및 distan의 가능한 작은 크기로t 전이는 모든 조직에 대한 TMA 건설을위한 0.6 mm의 작은 코어 직경이 선택됩니다. 또한, 서로 다른 조직 학적 영역을 포함하는 6 ngTMAs이 생산 될 수 있도록 각 지역이 개별적으로 배열하는 것이 계획되어있다 : ngTMA가) 종양 센터에서 조직을 포함, b)에 침입 앞, C) 종양 신진 지역, D) 정상 조직 , E) 림프절 전이, 및 F) 간전. 0.6 mm의 공구를 이용하여 TMA 디자인, 펀치 사이에 0.4 mm의 거리를 편안하게 선택 될 것이다. 긴 행과 열로 조직 스폿의 평가가 자주 무심이므로, 두 가지 디자인이 선택된다. 조직 면적 당 3 펀치 종양 블록의 경우, 여섯 부분을 포함하는 디자인이 만들어집니다. 이것은 402 티슈 펀치의 총 수에 이르게. 정상 조직 펀치를 들어, 경우 당이 펀치를 포함한다. 총 432 펀치를 맞는 레이아웃이 선택됩니다. 또한, 각각의 경우에, 최대 40.6 mm의 코어를 추가로 펀칭 및 0.2 ml의 튜브에 배치됩니다. 이러한 조직 코어는 또한 주석이됩니다. 튜브 환자 당 4 코어뿐만 아니라, 요약하면, 다른 조직의 6 ngTMAs가 생산 될 것이다 (일 정상 조직 배열 × 2 펀치 X 134 명 5 종양 배열 × 3 펀치는 134 명의 환자를 X). 이와 함께, 2814 주석이 될 것이다. 다음, 선택된 환자에서 해당 H &amp; E 슬라이드는 슬라이드 아카이브에서 검색됩니다. 각각의 경우 간단히 병리학 자에 의해 검토되며, 각 조직 유형의 가장 대표적인 슬라이드가 선택됩니다. 검색 각 조직 학적 섹션의 디지털 슬라이드는 미래의 주석을 위해 만들어집니다. 본 연구의 경우, 3-4 조직 슬라이드 가능성이 인접한 정상 조직, 림프절 전이 및 간 전이 및 추가 슬라이드 콘으로 사용하거나 사용하지 않고, 즉 경우, 기본 대장 암 당 스캔 할정상 점막 이닝. 최대 10 개의 서로 다른 잡지가 완전히 슬라이드 스캐너에로드 될 수 있습니다 따라서 250 슬라이드는 하나의 실행에 스캔 할 수 있습니다. 스캐닝 및 디지털 슬라이드 크기 시간 조직 및 원하는 품질 계수의 크기에 따라 달라진다. 이 스캔 품질의 두드러진 손실없이 모든 주사 작은 파일 크기를 생성 이후 0부터 100까지 여기서 품질 계수의 범위는, (60)의 품질 계수가 선택된다. 작은 생검은 30 초 아래로 스캔 할 수 있지만 2 내지 10 분 걸릴 수있다 본 실시 예에 사용 된 것과 같은 전체 조직 절편이. 디지털 슬라이드 크기도 2메가바이트에서 2 GB까지를 범위로 할 수 있습니다. (60) 품질 계수를 사용 6백메가바이트 및 1기가바이트 일어난다 사이 스캔한다. (402) 사이 및 536 슬라이드는 3 스캔 실행에 달하는이 프로젝트에 필요합니다. 각 실행 밤새 수행됩니다. 약의 저장 공간 5백기가바이트이​​ 필요합니다. 슬라이드 케이스 센터라는 디지털 플랫폼에 직접 스캔 (ngtma.unibe.pathcasecenter). 케이스 센터는 지정된 사용자 이름과 암호를 입력하여 어디서나 웹 액세스에서 액세스 할 수 있습니다. 주석 주석의 경우, 두 가지 측면이 고려되어야한다 : 1) 다양한 조직 영역을 다른 색 주석 주어져야한다, 2) 주석 번호가 최종 ngTMA의 원하는 매수를 반영해야한다. 이 경우, 하나의 카피에 대한 종양 면적당 3 스폿이 선택되었다. 이 사본의 경우, 각 영역은 6 점을 사용하여 주석을해야합니다. 유용한 원격 전이에 대한 림프절 전이, 청록색 검은 색 지역이 될에 마지막으로 흰색 (종양 / 기질)의 상호 작용, 신진 종양의 영역에 대한 레드, 종양의 침략 앞에 노란색, 종양 센터, 블루, 정상 조직에 대한 녹색 튜브에 사용됩니다. 각각의 경우의 주석 2-3 분을 필요로한다. ngTMA 건설 이 연구는 6 ngTMA 블록 t이 필요합니다O 12 마지막 블록의 결과로,이 사본으로 구성 될 수있다. 각 블록은 종양 조직 402 반점을 포함하고 각각의 정상 조직 블록은 전체 프로젝트에 걸쳐 4556 점의 합계 268 점을 포함 arrayer에 의해 지원 될 수있는 수신자 블록의 최대 수는 12이다. TMA 레이아웃은 각 수신자 블록에 대해 작성되고 프로젝트는 (그림 6A, 6B)에 저장됩니다. 60 조직 블록은 병렬로 조직 마이크로 어에로드 될 수있다; 각 기증자 블록의 이미지가 촬영됩니다. 첫 번째 기증자 블록을 시작으로, 해당 주석이 디지털 슬라이드 케이스 센터에서 검색됩니다. 슬라이드 매칭은 1-3 분 정도 소요될 수있는 수행됩니다. 주석이 확인되고 arrayer (그림 7)를 펀칭 시작하라는 메시지가 표시됩니다. 코어 펀칭 및 전송 시간은 약 12​​ 초이다. 이 절차를 수행하는 동안 코어의 손실을 최소화합니다. 이 프로젝트를으로 배열에 대한 총 시간은 SLI를위한 시간을 포함하여 약 24 시간이다드 / 블록 매칭 및 장비의 재로드. ngTMA의 몇 가지 예는도 8a에 도시되어있다. 이후 분자 분석을위한 코어는이 시간 (도 8b)에 펀칭 할 수 있습니다. <img alt="그림 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> 그림 1 A) A &#39;기증자&#39;블록. 기증자 블록에서 코어는 펀칭 및 B) 차단 된받는 사람, 또는 조직 마이크로 어레이 (TMA)로 전송됩니다. <img alt="그림이" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> 병리학 f를 부여 그림 2 기존의 조직 마이크로 어레이 워크 플로우.) 조직 학적 슬라이드가 아카이브와 B에서 검색됩니다)<html> 또는 검토. CD) 주석이 전송을위한 &#39;추정&#39;영역을 나타내는 슬라이드에 만들어집니다. E)을 해당 조직 블록이 검색됩니다. F) 블록 및 슬라이드 일치에 비교되고있는 G 할 수 있습니다) 때로는 어려운 작업이 될 수. HJ ) 조직 microarraying 다음에 일어난 일. K) 코어 반복적으로 전송 및 L) 최종 TMA가 구성되어있다. <img alt="그림 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> 슬라이드 (25)까지도 3)는 품질 계수에 대한 조정) 주사. B 각 잡지에 배치 될 수 있고, 크기는 제조 될 수있다. 스캔 진행 상황을 모니터링 할 수 있습니다. &quot;SRC =&quot;/ 파일 / ftp_upload / 51,893 / 51893fig4highres.jpg &quot;너비 =&quot;600 &quot;/&gt; 그림 4) 스캔 슬라이드는 웹 기반의 플랫폼, 케이스 센터. B) 디지털 슬라이드를 볼 수 있습니다에 업로드 할 수 있습니다. TMA 주석 도구는 사용자가 주석 디지털 슬라이드에 직접 배치 할 수 있습니다) 주석. C에 필요한 핵심 크기와 색상을 선택할 수 있습니다. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a> <img alt="그림 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> 60 블록까지도 5)가 수행되는 조직 마이크로 어, 즉 로우 당 10 공여 블록 (12)과 수신자 블록도. B) 각각의 도너의 이미지 블록에로드 할 수 DIGITA리터 슬라이드가 검색됩니다. 블록과 슬라이드의 매칭이 수행되며, 주석이 블록 펀칭 악기 펀칭 동안으로 배열의 진행 상황을 모니터링 할 수있다. C). D)에 사용되는 천공이 수행 된 후, 레이아웃의 각 스폿의 위치의 수출하지만 또한 해당 주석 각 도너 블록의 화상이 이루어진다. <img alt="그림 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> 도 6. 선택된 TMA 레이아웃 A) 종양 블록 및 B)으로 배열 정상 조직을 사용 하였다. <img alt="그림 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> 조직 마이크로 어 소프트웨어의 그림 7. 스크린 샷. 왼쪽의 12 재cipient 블록은 악기에 배치 할 수 있습니다. 아래에서 각 기증자 블록의 이미지를 가져옵니다. 센터, TMA 레이아웃에서는 펀칭 진행뿐만 아니라 주석 각 도너 블록의 확대 된 이미지가 발견된다. <img alt="그림 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> 그림 8) 새로 만든 ngTMA 블록의 몇 가지 예입니다. B) 추가 조직 펀치 후속 분자 분석을 수행 할 수 있습니다. 이 코어는 펀칭 및 0.2 ml의 튜브에 배치됩니다. <img alt="그림 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> 그림 ngTMA 바이오 마커 응용 프로그램 (9) 예. 대장 암에서 Ki67의 A) 면역 조직 화학 염색. 듀얼 HER2의 면역 조직 화학 / 현장에서) 저 단백질 (갈색의 표현) 및 센트로 (빨간색)에의 HER2 유전자 (검정) 상대없이 증폭 B를 보여주는 하이브리드 분석, C) 단백질 (갈색)과의 HER2 유전자 증폭의 고 발현을 ( 유방암 ngTMA 단일 mRNA의 성적을 보여주는의 HER2 현장 하이브리드의 중심 소체 (빨간색). D) 원체 검은 색) 상대. 대장 암의 CD8에 대한 E) 면역 조직 화학. F) 팬 아세포 마커 AE1 / AE3 (갈색 이중 면역 조직 화학 염색, 종양 세포) 및 CD68 (적색,. 대 식세포) 대장 암에서 종양 미세 환경을 강조은 <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">이 그림의 더 큰 버전을 보려면 여기를 클릭하십시오.</a>

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A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

이 프로토콜은 바이오 마커 연구를위한 건설 및 조직 마이크로 어레이의 품질을 최적화하는 것을 목표로하고있다. 그것은 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 가상 슬라이드 주석 및 자동화 된 조직으로 배열의 측면을 포함한다.

바이오 마커 연구 차세대 조직 마이크로 어레이 (ngTMA) 프로토콜

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K 조회수.  University of Bern.  이 프로토콜은 바이오 마커 연구를위한 건설 및 조직 마이크로 어레이의 품질을 최적화하는 것을 목표로하고있다. 그것은 계획 및 디자인, 디지털 병리학, 가상 슬라이드 주석 및 자동화 된 조직으로 배열의 측면을 포함한다. 

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Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

테이프 방법 및 핸드헬드 마이크로어레이를 사용한 조직 마이크로어레이의 수동 구성

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

연구

암 연구학

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

성인형 미만성 침윤성 신경교종의 미세환경 특성화를 위한 디지털 공간 프로파일링

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

주 사용 재생 치료와 높은 처리량 마약 검사에 대 한 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

생체공학

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

유방암에서 HER2 유전자 증폭의이 질을 평가 하기 위해 높은 처리량 검열 플랫폼을 구축

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

면역학 및 감염병학

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

인간 단백질 아틀라스 이내 조직 Microarrays, Immunohistochemistry의 염색법과 디지털 제작

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

생물학

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

고형 종양의 예측 면역 모델링

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

올바른 조직에게 멀티 조직 블록마다 자리

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

멀티 플렉스 면역 조직 화학적 염색 및 멀티 스펙트럼 영상을 사용하여 단백질 발현 및 공동 현지화의 정량

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA 및 DNA 추출 모두 포르말린 고정 파라핀 - 임베디드 조직 코어의 제조

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...