Os autores gostariam de agradecer à equipe técnica da Unidade de Pesquisa translacional; Mary Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ea Equipe de Informática no Instituto de Patologia da Universidade de Berna.

NOTA: Este estudo foi aprovado pelo comitê de ética local do Hospital Insel, Berna, Suíça (07-10-13). Os tecidos foram obtidos a partir do banco de tumores Bern, Instituto de Patologia, Universidade de Berna. 1 Planejamento e Desenho (Consulting) <ol><li> Pense sobre a questão de pesquisa a ser respondida. Decidir sobre os tipos de tecidos a serem incluídos no projeto. Determine o que estruturas histológicas são importantes para responder a pergunta. </li><li> Determinar o diâmetro do núcleo mais útil e do número de núcleos por paciente para o projeto. Decidir sobre o número de cópias do tecido da próxima geração Micro Array (ngTMA) com base na quantidade de biomarcadores para ser investigado. </li><li> Considere aspectos estatísticos, tais como o tamanho da amostra e análise após o tissue microarray (TMA) é construído. Determinar o número de pacientes de inclusão no estudo e controlo de estabelecimento de tecidos para a matriz. </li><li> Recuperar o histológico (oudiagnóstico) Hematoxilina e Eosina (H &amp; E) lâminas de cada paciente. Faça uma breve revisão das lâminas e identificar aqueles que contêm informações e histologia relevantes para o projeto. NOTA: Faça novas seções dos blocos de parafina, se corante especial ou imunohistoquímica slide é pretendido para a digitalização de slides e anotações, em vez de H &amp; E diapositivos </li></ol> 2 Deslize Scanning <ol><li> Ligue o PC e scanner de slides e software de digitalização aberta. Selecione &quot;modo automático&quot; para a digitalização de campo claro da tela de visualização. </li><li> Clique em &quot;Opções de verificação&quot; para ajustar os parâmetros de qualidade de slides. Neste momento, selecione se os slides devem ser digitalizados diretamente para a plataforma digital acessível por web ou em uma unidade local (ou disco rígido externo) e definir os tipos de varredura eo número de pontos de focagem. </li><li> Clique em &quot;Parâmetros do Servidor&quot; para digitalizar para o &quot;centro de Caso&quot;. Nesta etapa, adicionar mais revistas, rotular todos os slides e definira pasta no processo Center, onde os slides devem ser armazenados. Cada revista tem capacidade para até 25 slides. </li><li> Verifique a qualidade / limpeza de lâminas histológicas reais para a digitalização. Se necessário, as lâminas limpas com etanol 70%. </li><li> Carregue até 25 lâminas por revista com os rótulos virados para dentro (Figura 3A) </li><li> Coloque a revista no scanner. Para mais do que um compartimento, colocá-los uns em cima dos outros. </li><li> Comece a digitalizar slides, clicando na seta verde (Figura 3B). Quando todos os slides são digitalizados, descarregar as revistas e desligue o scanner de programa, PC e slide. </li></ol> 3 Deslize Digital Anotação <ol><li> Digite o endereço do navegador para o centro de gestão de slides digital e baixar o software visualizador de slides digital gratuito. </li><li> Abra o software visualizador de slides digitais e selecione a pasta que contém os slides digitais (Figura 4A). </li><li> Adicionar notas, reorganizar e administrar a digitapasta de slides l ou atribuir direitos de usuário para os colegas ou adicionar anexos à pasta. </li><li> Clique no slide digital desejado que aparece no visualizador de slides digital. </li><li> Usando a ferramenta de ampliação, avaliar o slide e encontrar as áreas de interesse para a integração no ngTMA. </li><li> Usando a &#39;ferramenta de anotação TMA &quot;, selecione o tamanho do núcleo desejado ea cor da anotação. Coloque a anotação no slide digitais, clicando sobre ela (Figura 4B). </li><li> Mover a anotação das estruturas histológicas desejados para incorporação no ngTMA (Figura 4C). </li><li> Repita esse processo de anotação novamente usando a ferramenta de anotação, selecionar um tamanho de núcleo e uma cor anotação desejada. Repita a visualização de slides e anotações em todos os slides na pasta. </li><li> Alternativamente, coloque núcleos de tecido para PCR em tubos de 0,2 ml em vez de integração no TMA. Anotar os slides usando uma cor diferente para identificarestes pontos para análise molecular. </li><li> Criar uma lista de todos os casos com suas anotações e cores correspondentes. </li></ol> 4. Tissue Microarray Construção <ol><li> Recupere os blocos de tecido parafina correspondentes para todos os slides digitais anotados, classificar os blocos na ordem desejada para microarraying tecido. </li><li> Certifique-se de que os blocos de tecido ter um mínimo de espessura de 4 mm. Se não, reencaixe de tecido é necessário. </li><li> Ligue o PC &quot;ON&quot; e de tecido automático instrumento microarrayer. Abra o software microarrayer tecido e fornecer um nome para o projeto </li><li> Executar uma &quot;ferramenta Change&quot; e selecione o diâmetro da ferramenta necessária para o projeto (ou seja, 0,6, 1,0, 1,5 ou 2,0 mm). </li><li> Carregue até 12 blocos de &quot;destinatário&quot; do TMA na máquina. Dê um ID para cada um dos 12 blocos </li><li> Criar um layout TMA para cada bloco receptor. Observar um projeto TMA com número de linhas, colunas e emptlinhas de y, assim como a distância entre os núcleos. Criar um novo layout para cada bloco receptor ou usar o mesmo layout repetidamente. </li><li> Coloque o cursor sobre o layout bloco receptor para dar o primeiro núcleo. </li><li> Em seguida, carrega-se para 60 blocos dadores na microarrayer tecido (Figura 5A). Coloque dez blocos em cada linha de A a F. Dar a cada bloco de uma identificação dos doadores. Observar imagens de cada bloco doador na tela do computador adquirido automaticamente pelo microarrayer tecido. </li><li> Começando com o primeiro bloco, clique em &quot;Slide&quot;. Observe o slide digitais anotada armazenadas no centro de gestão de slides digital (ou na unidade externa) usando o visualizador de slides digital. Ver a imagem do bloco dador e lado-a-lado da corrediça digital. </li><li> Selecione os pontos de referência na imagem do bloco de sobrepor a imagem do bloco de doadores com o slide digitais </li><li> Após clicar em &quot;Next&quot;, observe as anotações em uma imagem maior do bloco. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Clique em cima das anotações para confirmar e clique em &quot;Start&quot;. NOTA: Este pede ao microarrayer tecido para iniciar a perfuração de um buraco de 0,6 mm de diâmetro no bloco receptor no ponto de partida selecionado. Em seguida, num segundo passo, utilizando-se a ferramenta de perfuração, o instrumento perfura buraco no tecido do bloco dador seleccionado na região exacta anotada e confirmado. Cores são, então, transferidos do doador para o bloco receptor. </li><li> Após cerca de 500 núcleos, limpe a ferramenta de perfuração e perfuração com um cotonete de xileno. </li><li> Se núcleos de tecido são desejados (em vez de socos em um ngTMA), clique na ferramenta &quot;PCR&quot; para o bloco, confirmar até 4 anotações e clique em &quot;Iniciar&quot;. Isto vai perfurar e transferir os núcleos dentro de um tubo de 0,2 ml. </li><li> Repita ponto 4,9-4,11 com o segundo bloco dador, e assim por diante. </li><li> Depois de usar todos os blocos doadores, insira uma segunda rodada de blocos doadores (61-120) no tissue microarrayer e continuar passos 4,8-4,11. </li><li> Atualizar doadores e bloco receptor de imagens, enquanto o progresso do projeto durante a perfuração e perfuração está ocorrendo (Figura 5C). </li><li> Executar uma &quot;Export&quot;, após a conclusão do projeto. Localize o arquivo .xslx com os IDs dos doadores e bloco receptor, a localização de todos os socos dentro da TMA, bem como o layout TMA / design, na pasta exportada. Salvar todas as imagens do bloco de doadores com todo anotação sobreposta como imagens jpg na pasta exportado (Figura 5D). O bloco final TMA está então pronto. </li></ol>

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The authors have no disclosures

Neste trabalho, um protocolo para ngTMA está delineado. ngTMA é um conceito recém-criado para microarraying tecido que envolve planejamento e design, patologia digital e anotação de slides, bem como automatizado microarraying tecido 12. Comparado com microarraying tecido convencional, ngTMA oferece muitas vantagens. Em uma primeira etapa, a fase de planejamento e projeto é fundamental. O foco está em responder a uma pergunta de pesquisa orientada. Isso deve levar em consideração as questões histológicos (por exemplo, quais as regiões e quantos pontos eu quero incluir?), O planejamento estatístico (por exemplo, tamanho da amostra? Como posso analisar minhas amostras mais tarde?) E considerações logísticas (por exemplo, como muitos biomarcadores e, portanto, o número de cópias ngTMA?). A ngTMA específica é feita para as necessidades específicas, seja para a triagem de biomarcadores e de alto rendimento ou destinado a estudar os aspectos histológicos específicos em apenas alguns cas bem selecionadoses. Um deles, se não a, a desvantagem mais importante de microarraying tecido convencional é a baixa precisão com que marcas nas lâminas histológicas são feitas. O estudo das estruturas histológicas, células ou regiões específicas é feito quase impossível. ngTMA permite alta precisão porque as anotações são colocados diretamente nos slides digitais. Isso permite que o pesquisador para selecionar precisamente as regiões a serem perfurados, incluindo células específicas. Neste exemplo, várias áreas dentro do mesmo bloco de tecido são perfurados para fora para arraying, tais como o centro de tumor, frente à invasão e áreas de interação tumor / estroma com destaque para a presença de aglomerados de células tumorais pequenas ou até mesmo uma única célula. Esta precisão só pode ser conseguido usando ngTMA. Em terceiro lugar, porque as lâminas são digitalizadas em uma plataforma digital com base na Web, deslize visualização e anotações podem ser feitas através do computador, em vez de com o microscópio. O software arraying tecido proporciona uma fácil utilizaçãode interface com um elevado grau de flexibilidade, por conseguinte, diferentes disposições de concepção e ngTMA pode ser alcançado. Desde TMA construção é realizada automaticamente por perfuração, há pouca necessidade de se significativamente reduzida prática de manobra e a quantidade de tempo para a construção. O tempo para a construção do TMA, neste exemplo, é aqui entre 24 hr. Usando uma abordagem TMA convencional e estimativa de 15 golpes por hr, o projeto levaria cerca de 304 horas. ngTMA pode ser aplicado para estudar a expressão de proteínas, o ARNm ou o ADN, bem como combinações destes. Figura 9 ilustra várias destas aplicações para biomarcadores potenciais. Imunohistoquímica padrão podem ser aplicados para determinar o índice de proliferação de cancros utilizando Ki-67. Uma abordagem combinada para investigar a expressão da proteína e a amplificação do ADN por genes, tais como HER2 pode ser utilizado. Os tecidos podem ser reunidos em um único ngTMA para reduzir custos, uso de tecido e outros recursoss. Além disso, o ARNm cromogénico de hibridização in situ para HER2 e outros genes podem ser realizadas para identificar transcritos de mRNA individuais em um grande número de casos, utilizando um número mínimo de lâminas de tecido. A imuno-histoquímica de marcadores imunológicos, tais como CD8 pode ser visualizado no contexto do microambiente do tumor. Imunohistoquímica dupla também pode ser usado para realçar determinadas regiões de interesse, como as interações entre células do sistema imunológico (marcadas em vermelho) e células tumorais (marcadas em marrom) na frente de invasão de cânceres. Tal região de interesse não poderia ter sido capturado usando microarraying tecido convencional. No entanto, este protocolo contém algumas limitações. O desafio mais importante é a sobreposição entre o bloco de doadores e de slides digital. Vários fatores podem influenciar esta etapa. Em primeiro lugar, o mais tardar a partir da secção de bloqueio deve ser usado para a digitalização de slides. Em muitos casos, a H &amp; E não é a última parte do bloco dador, rather é uma coloração imuno-histoquímica ou outras. Neste caso, também uma lâmina corada pode ser usada, desde que a última mancha é digitalizado e anotada ou um novo H &amp; E deve ser feito. Cuidados também devem ser tomados quando se secções de tecido estão sendo feitas como tecidos podem expandir-se no banho de água que leva a correspondência de um desafio de slides e bloco. Em segundo lugar, no momento em que projectos estão limitados a 12 receptores de blocos TMA transformados em uma única vez. Projetos maiores superiores a 12 TMAs deve ser atribuído a um segundo nome do projeto. Em terceiro lugar, os blocos doadores devem ser feitas a partir de moldes padrão e cassetes como o instrumento não pode ajustar-se a vários tamanhos. Finalmente, blocos dadores deve exceder a altura mínima (4 mm) para conseguir a perfuração óptima. Em alguns casos, isto requer reencaixe dos tecidos. Centenas de publicações ao longo dos últimos anos destacam a TMA como uma ferramenta de valor inestimável para a pesquisa de biomarcadores. TMA foram usadas para estudar 13 pulmão, colo-rectal 7, breast 14, 15 próstata, pâncreas, 16, 17 da bexiga, e cancros gástricos 18, para citar alguns. Um número crescente de autores combinaram o uso do TMA com a análise de imagens e avanços significativos estão sendo feitos nessa direção 19-21. No entanto, ao lado de um punhado de grupos de pesquisa que tenham publicado idéias inovadoras TMA 22-24, tem sido dada pouca atenção para otimizar a técnica de TMA-se. Microarrayers tecido automatizadas, como o ATA-27 por Estigen / Beecher fornecem projeto de layout e socos tecido expediente e automatizado. Isto representa no entanto apenas um aspecto do conceito ngTMA. ngTMA é uma melhoria substancial em relação às técnicas convencionais microarraying tecido. Ele incorpora experiência em histologia e design TMA com a flexibilidade de patologia digital ea precisão de anotações digitais com a velocidade ea confiabilidade de construção automatizada TMA. A combinação de ngTMA análise da imagem e para a avaliação de proteína e moleculares biomarcadores será uma ferramenta poderosa para melhorar ainda mais a qualidade da investigação clínica e de translação no futuro.

Ao longo das duas últimas décadas, tissue microarray (TMAs) tiveram um impacto notável sobre estudos de investigação de biomarcadores. TMA são essencialmente de tecido &quot;armazenamento&quot; produzidos pela transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido, tipicamente variando em tamanho de 0,6 a 2,0 mm de diâmetro, a partir de blocos de parafina &quot;dadores&quot; num único bloco de TMA &quot;receptor&quot; (Figura 1) 1. Usando um pequeno tamanho do núcleo, aproximadamente 500 diferentes pontos de tecido de poucos ou muitos pacientes diferentes podem ser dispostos em uma TMA 2. A utilização de TMA para estudos de biomarcadores preditivos de prognóstico ou tem muitas vantagens. Considere o exemplo em que a expressão de uma proteína biomarcador por imuno-histoquímica é para ser avaliada em 450 pacientes. Em vez de executar 450 imunohistoquímica em 450 pacientes lâminas seccionadas a partir do mesmo número de blocos, pequenos núcleos de cada uma das amostras pode ser dispostos em uma única TBloco MA. Mesmo que vários núcleos são retiradas de cada paciente individual, um número mínimo de blocos são produzidos. Isso tem o efeito de diminuir considerável drasticamente os custos e outros recursos, bem como reduzir o desperdício de tecido. Além disso, este estudo permite apropriadamente alimentado usando um grande número de tecidos, a ser avaliada sob as mesmas condições experimentais. TMAs ter muitas aplicações diferentes. Por exemplo, eles podem ser usados ​​para estudar a morfologia, a expressão da proteína, a expressão de ARN e as aberrações de DNA após coloração com corantes diferentes, ou após a imuno-histoquímica, ou mesmo cromogénico e hibridação in situ fluorescente 3-7. Estudos recentes também têm utilizado TMAs para testar a variação intra e interlaboratorial em protocolos de coloração, estabelecer especificidade ou sensibilidade de anticorpos para as mutações genéticas específicas, e para determinar a reprodutibilidade interobservador da expressão da proteína em colaborações internacionais <sup&gt; 8-11. A construção de TMAs tradicional usando tecidos derivados do paciente é um procedimento passo múltiplos de comprimento (Figura 2). Ele começa com uma busca de possíveis casos adequados e seleção de lâminas de diagnóstico dos arquivos em um instituto de patologia, ou outro instituto, de onde são recuperados. O patologista avalia cada slide por caso e seleciona o slide mais representativo para os objetivos do estudo. Em seguida, a região de interesse é marcado usando uma caneta directamente sob o microscópio. Isso é muitas vezes difícil e imprecisa e resulta apenas em uma &quot;estimativa&quot; de onde socos tecido deverão ser tomadas a partir. Em seguida, os blocos de parafina correspondentes a esses slides marcados são recuperadas a partir do arquivo. Uma rápida comparação entre o bloco e slide é feito. Usando um arrayer semi-automatizada ou caseiro tecido, o bloco dador é perfurado na região estimativa de interesse e transferido para um recipiente de blocos TMA. Construção de TMAs usando esta técnica arraying é trabalhoso, demorado e impreciso, e inflexível. Preparando uma TMA de 475 pontos em 3 exemplares é estimada em cerca de 84 horas de trabalho. Uma nova abordagem para a construção de TMA foi introduzido recentemente pelo Instituto de Patologia da Universidade de Berna, que se baseia em três componentes: planejamento e projeto (ou consultoria), patologia digitais combinados com experiência em histologia e TMA automatizado arraying 12. Juntos, este conceito é chamado de próxima geração Tissue Microarray (ngTMA). Abaixo, um protocolo para ngTMA é descrita com base em um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aqui, os tumores primários, bem como metástases de linfonodos e metástases hepáticas devem ser dispostas em ngTMAs para análise de biomarcadores subseqüente. Adicionalmente, pequenos núcleos de tecido de cada paciente são desejáveis ​​para a extracção de ácido nucleico futuro.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic 250 Flash II</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TMA Grandmaster</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tissue Microarrayer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic Viewer</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;">free</td>
			<td>Slide viewing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Case Center</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital slide platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

Pesquisa com biomarcadores depende de tissue microarray (TMA). TMA são produzidos por transferência repetida de pequenos fragmentos de tecido a partir de um bloco de &quot;dador&quot; em um bloco de &quot;destinatário&quot; e, em seguida, utilizados para uma variedade de aplicações de biomarcadores. A construção de TMA convencional é de trabalho intensivo, impreciso e demorado. Aqui, um protocolo utilizando tissue microarrays de próxima geração (ngTMA) é descrito. ngTMA é baseada em planejamento TMA e design, patologia digital e microarraying tecido automatizado. O protocolo é ilustrada com um exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático. Aspectos histológicos, estatísticos e logísticos são consideradas, tais como o tipo de tecido, as regiões histológicos específicos, e os tipos de células para a inclusão na TMA, o número de pontos de tecido, tamanho da amostra, a análise estatística, e número de cópias de TMA. Lâminas histológicas para cada paciente são digitalizados e enviados para uma plataforma digital com base na web. Lá, eles são vistos e annotated (marcado) usando uma ferramenta de diâmetro 0,6-2,0 mm, várias vezes usando várias cores para distinguir áreas de tecidos. Blocos doadores e 12 blocos de &quot;destinatário&quot; são carregados no instrumento. Diapositivos digitais são recuperadas e combinadas a imagens de blocos de doadores. Arraying repetida de regiões anotados é executada automaticamente, resultando em um ngTMA. Neste exemplo, seis ngTMAs são planejadas com seis diferentes tipos de tecidos / zonas histológicas. São desejados Dois exemplares dos ngTMAs. Três a quatro lâminas para cada paciente são verificados; 3 corridas de verificação são necessárias e realizado durante a noite. Todas as lâminas são anotadas; cores diferentes são usadas para representar os diferentes tecidos / zonas, ou seja, o centro do tumor, invasão frente, tumor / estroma, metástases em linfonodos, metástases hepáticas e tecido normal. 17 anotações / case são feitas; tempo para anotação é de 2-3 min / case. 12 ngTMAs são produzidos contendo 4.556 pontos. Tempo arraying é de 15-20 horas. Devido à sua precisão, flexibilidade e de velocidade, é um poderoso ngTMAFerramenta para melhorar ainda mais a qualidade de TMA utilizado na investigação clínica e de translação.

Planejamento e Desenho Aqui foi utilizado o exemplo de 134 pacientes com câncer colorretal metastático que estão sendo investigados por uma série particular de biomarcadores. Não só é um ngTMA planejado para estes pacientes, mas a extração de DNA, seguida de análise mutacional por algum gene específico. Durante a fase de planejamento e projeto de ngTMA, os seguintes aspectos foram decididos. De cada paciente, 6 regiões histológicas diferentes serão investigadas: Centro de tumor, frente de invasão tumoral, as áreas de maior densidade tumor brotamento (interação tumor / estroma), o tecido normal, metástases linfáticas e metástases hepáticas. Três pontos de tumor por área de tecido tumoral e dois pontos de tecido normal devem ser incluídos no projeto (n = 17 pontos por paciente). Uma vez que está previsto que mais de 50 biomarcadores ser investigado neste material do paciente, são desejadas duas cópias do ngTMA final. Devido à possibilidade de pequeno tamanho de linfonodos e distanmetástases t, um pequeno diâmetro do núcleo de 0,6 mm para TMA construção para todos os tecidos é escolhido. Além disso, está previsto que cada região se vestisse separadamente, de modo que 6 ngTMAs contendo diferentes áreas histológicas serão produzidos: um ngTMA contendo tecidos do centro do tumor a), b) frente invasão, áreas c) tumor brotamento, d) o tecido normal , e) de metástases linfáticas, e f) metástases hepáticas. Para a concepção do TMA usando uma ferramenta de 0,6 milímetros, uma distância confortável de 0,4 milímetros entre perfuradores será seleccionado. Porque a avaliação de manchas de tecidos em linhas e colunas longas muitas vezes é cansativo, dois projetos diferentes são selecionados. Para os blocos tumorais com três socos por área de tecido, um projeto contendo seis partes é criado. Isto leva a um número total de 402 golpes de tecido. Para socos tecido normal, dois socos por caso devem ser incluídos. Um layout de montagem 432 socos no total é escolhida. Além disso, para cada caso, até 4núcleos de 0,6 milímetros, adicionalmente, ser perfurado e colocado em tubos de 0,2 ml. Estes núcleos de tecido também será anotada. Para resumir, 6 ngTMAs de diferentes tecidos serão produzidos (5 séries de tumores x 3 socos x 134 pacientes; uma matriz tecido normal x 2 socos x 134 pacientes), além de quatro núcleos por paciente para tubos. Tomados em conjunto, 2.814 anotações serão feitas. Em seguida, as lâminas correspondentes H &amp; E de pacientes selecionados serão recuperadas a partir do arquivo de slides. Cada caso é brevemente revisto por um patologista ea maioria das lâminas representativas de cada tipo de tecido são selecionados. Digitalização Lâminas digitais de cada corte histológico são feitas para anotação futuro. Para este estudo, 3-4 lâminas de tecido deverão ser digitalizados por caso, ou seja, o câncer colorretal primário, com ou sem os tecidos normais adjacentes, metástases em linfonodos e metástases hepáticas e, possivelmente, um slide de con adicionaltenção mucosa normal. Até 10 revistas diferentes pode ser totalmente carregada no scanner de slides; portanto, 250 slides podem ser digitalizados em um único prazo. Tempo para a digitalização e tamanho do diapositivo digitais varia de acordo com as dimensões do tecido e o factor de qualidade desejada. As faixas de fator de qualidade de 0 a 100 Aqui, um fator de qualidade de 60 é selecionado, uma vez que produz um tamanho de arquivo de digitalização menor sem perda perceptível de qualidade da digitalização. Pequenas biópsias podem ser digitalizados em menos de 30 segundos, enquanto cortes de tecido inteiro, como os usados ​​neste exemplo pode demorar entre 2 e 10 min. Tamanho do slide Digital também pode variar de 2 MB a 2 GB. Usando um fator de qualidade de 60, verifica entre 600 MB e 1 GB são produzidos. Entre 402 e 536 lâminas são necessários para este projeto, totalizando 3 séries de digitalização. Cada etapa é realizada durante a noite. Cerca de 500 GB de espaço de armazenamento é necessário. Slides são digitalizados diretamente para uma plataforma digital chamado Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center é acessível de qualquer lugar com acesso à web, inserindo o nome de usuário e senha designado. Anotação Para anotação, dois aspectos devem ser considerados: 1) diferentes áreas do tecido deve ser dada diferentes cores de anotação e 2) o número de anotações deve refletir o número de cópias desejadas do ngTMA final. Neste caso, três pontos por área de tumor para uma única cópia foram selecionados. Para 2 cópias, cada região deve ser anotada com 6 pontos. Útil é verde para o tecido normal, azul para o centro de tumor, amarelo para a frente de invasão tumoral, vermelho para as áreas de tumor de brotamento (tumor / estroma) interação, preto de metástases linfáticas, turquesa para metástases à distância e finalmente branco para regiões de ser utilizado para os tubos. Anotação de cada caso requer 2-3 min. Construção ngTMA Este estudo requer 6 ngTMA blocos to ser construída em duas cópias, resultando em 12 blocos finais. O número máximo de blocos receptores que pode ser suportado pela arrayer é 12 Cada bloco de tumor irá conter 402 pontos de tecido e cada bloco de tecido normal conterá 268 pontos, totalizando 4.556 pontos em todo o projeto. Um layout TMA é criada para cada bloco receptor eo projeto está salvo (Figuras 6A, 6B). 60 os blocos de tecido pode ser carregado no microarrayer tecido em paralelo; uma imagem de cada bloco dador é feita. Começando com o primeiro bloco de doadores, o slide digitais anotada correspondente é recuperada do processo Center. Correspondência de slides é realizada, o que pode demorar entre 1-3 min. As anotações são confirmadas ea arrayer é solicitado para iniciar perfuração (Figura 7). Perfuração e tempo de transferência de núcleo é de aproximadamente 12 segundos. Perda de núcleos durante este procedimento é mínimo. O tempo total para arraying este projeto é de aproximadamente 24 horas, incluindo o tempo para SLIde / bloco de correspondência e recarga do instrumento. Alguns exemplos de ngTMA estão ilustrados na Figura 8A. Núcleos para análise molecular subsequente também pode ser perfurado no momento (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 A) Um bloco &#39;doador&#39;. Cores do bloco doador são perfurados para fora e transferido para B) um bloco receptor, ou tissue microarray (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 O fluxo de trabalho de tissue microarray convencional. A) lâminas histológicas são recuperadas a partir do arquivo e B) dada ao patologista f<html> ou revisão. CD) As anotações são feitas nos slides que indicam a região estimada &#39;para transferência. E) Os blocos de tecido correspondentes são recuperadas. F) Block e slides são comparados para correspondência, o que pode G), por vezes, ser uma tarefa desafiadora. HJ ) microarraying Tissue toma então lugar. K) Cores são repetidamente transferidos e L) uma TMA final é construído. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 a) até 25 lâminas podem ser colocados em cada revista para digitalização. B) Ajustes para o fator de qualidade e tamanho pode ser feito. Progresso da digitalização pode ser monitorado. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 4 A) Digitalizado slides podem ser transferidos para a plataforma baseada em web, Caso Center. B) lâminas digitais podem ser vistos. A ferramenta de anotação TMA permite ao usuário selecionar o tamanho do núcleo e cor necessária para anotação. C) As anotações podem ser colocados diretamente sobre a lâmina digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 A) Até 60 blocos podem carregado no microarrayer tecido, ou seja, 10 blocos doadores por linha e 12 destinatários blocos também. B) Uma imagem de cada bloco doador é retirado, a digital slide é recuperado. Correspondência de bloco de corrediça e é feito e anotações são utilizadas para bloquear a perfuração. C) O progresso da arraying pode ser monitorizada, enquanto o instrumento está perfurando. D) Após a perfuração é executada, a exportação da localização de cada ponto no esquema mas também uma imagem de cada bloco dador com anotações correspondentes é feita. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Estes layouts TMA foram utilizados para predispor os blocos de tumor A) e B) os tecidos normais. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Tela do software microarrayer tecido. À esquerda, 12 recipient blocos pode ser colocada no instrumento. Na parte inferior, são tomadas as imagens de cada bloco dador. No centro, o layout do TMA, o progresso da perfuração, bem como as imagens ampliadas de cada bloco dador com anotações é encontrado. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8 A) Alguns exemplos de blocos ngTMA recém-criados. B) socos tecido adicionais podem ser tomadas para análise molecular subseqüente. Estes núcleos são perfurados e colocado em tubos de 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9 Exemplos de aplicações de biomarcadores ngTMA. A) Imunohistoquímica coloração de Ki67 em câncer colorretal. Dupla HER2 imunohistoquímica / hibridação in situ, ensaio mostrando B) a baixa expressão da proteína (castanho) e nenhuma amplificação do gene Her2 (preto) em relação ao centrómero (vermelho), C), de expressão elevada de proteína (castanho) e a amplificação do gene Her2 ( preto) em relação ao centrómero (vermelho). D) Hibridização in situ de Her2 que mostra transcritos de ARNm únicos no cancro da mama ngTMA. E) Imuno-histoquímica para CD8 no câncer colorretal. F) Duplo mancha imunohistoquímica para marcador pan-citoqueratina AE1 / AE3 (marrom; células tumorais) e CD68 (vermelho;. Macrófagos) destacando microambiente do tumor no câncer colorretal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">por favor, clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

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A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado.

A próxima geração de tissue microarray (ngTMA) Protocolo de Estudos biomarcadores

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

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Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K visualizações.  University of Bern.  O protocolo visa à otimização da construção e qualidade de microarrays de tecido para pesquisa com biomarcadores. Ele inclui aspectos do planejamento e design, patologia digital anotação de slides virtual, e arraying tecido automatizado. 

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The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

O Trier Protocolo de teste de estresse social para induzir Estresse Psicológico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Medicina

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Preparação do tecido da córnea Doadores de ceratoplastia endotelial

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

Protocolo de Coleta para Pâncreas Humano

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

Parabiose em Ratos: Um protocolo detalhado

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Identificação baseada em Microarray de Individual HERV Loci Expressão: Aplicação a descoberta de biomarcadores em câncer de próstata

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Coleta e Extração de DNA de saliva para Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that cause tissue degeneration during ageing. Cancer, with incidence rates greatly increasing with age, is characterized by short telomere lengths and high telomerase activity. To study the roles of telomere dysfunction and telomerase reactivation in ageing and cancer, the protocol shows how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)-inducible TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) and Lox-Stopper-LoxTERT (LSL-mTERT). The protocol describes the procedures to induce telomere dysfunction and reactivate telomerase activity in mTERT-ER and LSL-mTERT mice in vivo. The representative data show that reactivation of telomerase activity can ameliorate the tissue degenerative phenotypes induced by telomere dysfunction. In order to determine the impact of telomerase reactivation on tumorigenesis, we generated prostate tumor model G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L and thymic T-cell lymphoma model G4 Atm-/- mTERTER/ER. The representative data show that telomerase reactivation in the backdrop of genomic instability induced by telomere dysfunction can greatly enhance tumorigenesis. The protocol also describes the procedures used to isolate neural stem cells (NSCs) from mTERT-ER and LSL-mTERT mice and reactivate telomerase activity in NSCs in vitro. The representative data show that reactivation of telomerase can enhance the self-renewal capability and neurogenesis in vitro. Finally, the protocol describes the procedures for performing telomere FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) on both mouse FFPE (Formalin Fixed and Paraffin Embedded) brain tissues and metaphase chromosomes of cultured cells.

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Utilizando Murino Inducible telomerase alelos nos Estudos de degeneração / regeneração tecidual e Câncer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the knees by using different forms of mesenchymal stem cells (MSCs). In Korea, bone marrow concentrates and cord blood-derived stem cells have been approved by the Korean Food and Drug Administration (KFDA) for cartilage regeneration. In addition, an adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) has been allowed by the KFDA for joint injections in human patients. Autologous adipose tissue-derived SVF contains extracellular matrix (ECM) in addition to mesenchymal stem cells. ECM excretes various cytokines that, along with hyaluronic acid (HA) and platelet-rich plasma (PRP) activated by calcium chloride, may help MSCs to regenerate cartilage and improve knee functions. In this article, we presented a protocol to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with OA. The result of the protocol was first reported in 2011 followed by a few additional publications. The protocol involves liposuction to obtain autologous lipoaspirates that are mixed with collagenase. This lipoaspirates-collagenase mixture is then cut and homogenized to remove large fibrous tissue that may clog up the needle during the injection. Afterwards, the mixture is incubated to obtain adipose tissue-derived SVF. The resulting adipose tissue-derived SVF, containing both adipose tissue-derived MSCs and remnants of ECM, is injected into knees of patients, combined with HA and calcium chloride activated PRP. Included are three cases of patients who were treated with our protocol resulting in improvement of knee pain, swelling, and range of motion along with MRI evidence of hyaline cartilage-like tissue.

Here, we present a protocol to produce an adipose tissue-derived stromal vascular fraction and its application to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with osteoarthritis.

Protocolo clínico de produzir tecido adiposo-derivado do estroma Vascular fração para a regeneração da cartilagem potenciais

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) may detect adverse events of interventions such as fluid overload at an early stage. The Simple Intensive Care Studies (SICS) is a research line that focuses on the prognostic and diagnostic value of combinations of clinical variables.
The SICS-I specifically focused on the use of clinical variables obtained within 24 h of acute admission for prediction of cardiac output (CO) and mortality. Its sequel, SICS-II, focuses on repeated evaluations during ICU admission. The first clinical examination by trained researchers is performed within 3 h after admission consisting of physical examination and educated guessing. The second clinical examination is performed within 24 h after admission and includes physical examination and educated guessing, biochemical analysis and CCUS assessments of heart, lungs, inferior vena cava (IVC) and kidney. This evaluation is repeated at days 3 and 5 after admission. CCUS images are validated by an independent expert, and all data is registered in an online secured database. Follow-up at 90 days includes registration of complications and survival status according to patient&#39;s medical charts and the municipal person registry. The primary focus of SICS-II is the association between venous congestion and organ dysfunction.
The purpose of publishing this protocol is to provide details on the structure and methods of this on-going prospective observational cohort study allowing answering multiple research questions. The design of the data collection of combined clinical examination and CCUS assessments in critically ill patients are explicated. The SICS-II is open for other centers to participate and is open for other research questions that can be answered with our data.

<meta charset="utf8"></head><body>Protocolo de Estudo Observacional para Exame Clínico Repetido e Ultrassonografia de Cuidados Intensivos nos Estudos de Terapia Intensiva Simples

Structured protocols are necessary to provide answers on research questions in critically ill patients. The Simple Intensive Care Studies (SICS) provides an infrastructure for repeated measurements in critically ill patients including clinical examination, biochemical analysis and ultrasonography. SICS projects have specific focus but the structure is flexible to other investigations.

Protocolo de Estudo Observacional para Exame Clínico Repetido e Ultrassonografia de Cuidados Intensivos nos Estudos de Terapia Intensiva Simples

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...