Gli autori desiderano ringraziare il personale tecnico dell&#39;Unità di Ricerca Traslazionale; Maria Economou, José Galván, Caroline Martello, Dominique Müller, Liliane Schöni e il Team Informatica presso l&#39;Istituto di Patologia, Università di Berna.

NOTA: Questo studio è stato approvato dal comitato etico locale dell&#39;Ospedale Insel, Berna, Svizzera (07-10-13). I tessuti sono stati ottenuti dalla banca Tumori di Berna, Istituto di Patologia, Università di Berna. 1 Pianificazione e progettazione (Consulting) <ol><li> Pensate alla domanda di ricerca a cui rispondere. Decidere i tipi di tessuto da inserire nel progetto. Determinare quali strutture istologiche sono importanti per rispondere alla domanda. </li><li> Accertare il diametro del nucleo più utile e il numero di core per paziente per il progetto. Decidere il numero di copie della nuova generazione Tissue Micro Array (ngTMA) in base alla quantità di biomarcatori da indagare. </li><li> Considerare aspetti statistici come la dimensione del campione e l&#39;analisi dopo il microarray tissutale (TMA) è costruito. Determinare il numero di pazienti per l&#39;inclusione nello studio e stabilire i tessuti di controllo per l&#39;array. </li><li> Recuperare il istologica (odiagnostica) Ematossilina e Eosina (H &amp; E) slides di ogni paziente. Brevemente rivedere le diapositive e identificare quelli contenenti informazioni e istologia rilevanti per il progetto. NOTA: Fare nuove sezioni dei blocchi di paraffina, se macchia speciale o immunoistochimica scivolo è desiderato per la scansione di diapositive e annotazione, invece di H &amp; E diapositive </li></ol> Scansione 2 Far scorrere <ol><li> Accendere il PC e scanner per diapositive e software di scansione aperto. Selezionare &quot;modalità automatica&quot; per la scansione campo chiaro dalla schermata di anteprima. </li><li> Clicca su &quot;Opzioni di scansione&quot; per regolare i parametri di qualità di scorrimento. A questo punto, selezionare se vetrini devono essere sottoposti a scansione direttamente alla piattaforma digitale accessibile via web o su un&#39;unità locale (o disco esterno) e impostare il tipo di scansione e il numero di punti di messa a fuoco. </li><li> Clicca su &quot;Parametri server&quot; per eseguire la scansione al &quot;centro Caso&quot;. A questo punto, aggiungere più riviste, etichettare tutte le diapositive e impostarela cartella nella causa Center, dove devono essere conservati gli scivoli. Ogni scomparto può contenere fino a 25 diapositive. </li><li> Verifica qualità / pulizia dei vetrini istologici effettivi per la scansione. Se necessario, i vetrini puliti con etanolo al 70%. </li><li> Caricare fino a 25 diapositive per la rivista con le etichette che punta verso l&#39;interno (figura 3A) </li><li> Posizionare la rivista nello scanner. Per più di una rivista, metterli uno sopra l&#39;altro. </li><li> Avviare la scansione di diapositive facendo clic sulla freccia verde (Figura 3B). Quando tutte le diapositive scansione, scaricare riviste e spegnere lo scanner programma, PC e scivolo. </li></ol> 3 Far scorrere Digital Annotazione <ol><li> Inserire l&#39;indirizzo del browser per il digitale centro di gestione di diapositive e scaricare il software visualizzatore diapositiva digitale gratuito. </li><li> Aprire il software visualizzatore diapositiva digitale e selezionare la cartella contenente i vetrini digitali (Figura 4A). </li><li> Aggiungere note, riordinare e gestire la digitacartella di diapositive l o assegnare diritti utente ai colleghi o aggiungere allegati alla cartella. </li><li> Clicca su desiderata diapositiva digitale che appare nel visualizzatore di diapositive digitale. </li><li> Utilizzando lo strumento di ingrandimento, di valutare la diapositiva e trovare le aree di interesse per l&#39;integrazione nel ngTMA. </li><li> Utilizzando il &#39;strumento di annotazione TMA&#39;, selezionare la dimensione del nucleo desiderato e il colore dell&#39;annotazione. Posizionare l&#39;annotazione sulla diapositiva digitale facendo clic su di esso (Figura 4B). </li><li> Spostare l&#39;annotazione alle strutture istologiche desiderati per incorporazione nella ngTMA (Figura 4C). </li><li> Ripetere questo processo di annotazione di nuovo utilizzando lo strumento di annotazione, selezionare una dimensione di base ed un colore di annotazione desiderato. Ripetere la visione di diapositive e annotazione su tutte le diapositive nella cartella. </li><li> In alternativa, inserire nuclei di tessuto per PCR in provette da 0,2 ml, piuttosto che l&#39;integrazione nella TMA. Annotare le diapositive utilizzando un colore diverso per identificarequesti punti per ulteriori analisi molecolare. </li><li> Creare un elenco di tutti i casi con le loro annotazioni e colori corrispondenti. </li></ol> 4. Tissue Microarray Costruzione <ol><li> Recuperare i corrispondenti blocchi di tessuto paraffina per tutte le diapositive digitali annotati, ordinare i blocchi nell&#39;ordine desiderato per microarraying tessuto. </li><li> Assicurarsi che i blocchi di tessuto hanno un minimo di spessore 4 mm. Se no, reembedding di tessuto è necessario. </li><li> Accendere il PC &quot;ON&quot; e strumento microarrayer tessuti automatizzato. Aprire il software microarrayer tessuti e fornire un nome al progetto </li><li> Eseguire un &quot;Cambio utensile&quot; e selezionare il diametro utensile necessario per il progetto (ad esempio, 0.6, 1.0, 1.5, o 2.0 mm). </li><li> Caricare fino a 12 blocchi &#39;destinatario&#39; TMA nella macchina. Dare un ID a ciascuno dei 12 blocchi </li><li> Creare un layout TMA per ogni blocco destinatario. Osservare un design TMA con il numero di righe, colonne, e appropriarsi prioritariamenteLinee y così come la distanza tra i core. Creare un nuovo layout per ogni blocco destinatario o utilizzare lo stesso layout ripetutamente. </li><li> Posizionare il cursore sul blocco di layout destinatario di prendere il primo nucleo. </li><li> Avanti, caricare fino a 60 blocchi di donatori nel microarrayer tessuto (Figura 5A). Mettere dieci blocchi in ogni riga da A a F. Dare ad ogni blocco un ID donatore. Osservare le immagini di ogni blocco donatore sullo schermo del computer acquisita automaticamente dal microarrayer tessuti. </li><li> Partendo con il primo blocco, cliccare su &quot;scorrere&quot;. Osservare la diapositiva digitale annotato memorizzato nel centro di gestione diapositiva digitale (o sul disco esterno) utilizzando il visualizzatore di diapositive digitale. Mostra l&#39;immagine del blocco donatore e il lato side-by-diapositiva digitale. </li><li> Selezionare i punti di riferimento l&#39;immagine sul blocco per sovrapporre l&#39;immagine del blocco donatore con la slitta digitale </li><li> Dopo aver cliccato su &quot;Avanti&quot;, osservare le annotazioni su una più grande immagine del blocco. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Clicca sopra le annotazioni per confermare e fare clic su &quot;Start&quot;. NOTA: Ciò induce la microarrayer tessuti per avviare un foro di 0,6 mm di diametro nel blocco destinatario al punto di partenza selezionato. Poi, in una seconda fase, usando l&#39;utensile di punzonatura, lo strumento punzoni foro nel tessuto dal blocco donatore selezionato l&#39;esatto regione annotata e confermata. Nuclei vengono poi trasferiti dal donatore al blocco destinatario. </li><li> Dopo circa 500 anime, pulire lo strumento trapano e punzonatura con un tampone di xilene. </li><li> Se nuclei di tessuto si desiderano (invece di pugni in un ngTMA), fare clic sullo strumento &quot;PCR&quot; per il blocco, confermare fino a 4 annotazioni e premere &quot;Start&quot;. Questo pugno e trasferire i nuclei in una provetta 0,2 ml. </li><li> Ripetere punto 4,9-4,11 con il secondo blocco donatore, e così via. </li><li> Dopo aver utilizzato tutti i blocchi donatori, inserire una seconda tornata di blocchi donatori (61-120) nel microarray tissutaleer e continuano passaggi 4,8-4,11. </li><li> Aggiornare donatori e destinatari bloccati, mentre lo stato di avanzamento del progetto, mentre la foratura e punzonatura è in corso (Figura 5C). </li><li> Eseguire un &quot;Export&quot; dopo che il progetto è completo. Individuare il file xslx con gli ID dei donatori e dei destinatari bloccati, la localizzazione di tutti i punzoni all&#39;interno della TMA, nonché il layout TMA / design, nella cartella esportata. Salvare tutte le immagini di blocco donatore con tutte annotazioni sovrapposto come immagini jpg nella cartella esportata (Figura 5D). Il blocco finale TMA è pronto. </li></ol>

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The authors have no disclosures

In questo lavoro, un protocollo per ngTMA è delineato. ngTMA è un concetto di nuova costituzione per microarraying tessuto che coinvolge pianificazione e progettazione, patologia digitale e presentazione di annotazione nonché automatizzata dei tessuti microarraying 12. Rispetto alla microarraying tessuto convenzionale, ngTMA offre molti vantaggi. In una prima fase, la fase di programmazione e progettazione è critica. L&#39;obiettivo è quello di rispondere a una domanda di ricerca mirata. Questo dovrebbe prendere in considerazione le questioni istologiche (per esempio, che le regioni e quanti punti posso desidera includere?), La pianificazione statistica (ad esempio, la dimensione del campione? Come analizzo i miei campioni più tardi?) E le considerazioni logistiche (ad esempio, come molti biomarcatori e quindi il numero di copie ngTMA?). Una specifica ngTMA è fatto per specifiche esigenze, sia che si tratti per lo screening biomarker e high-throughput o destinato a studiare specifici aspetti istologici su pochi cas ben selezionataes. Uno, se non il, più importante svantaggio di microarraying tessuto tradizionale è la bassa precisione con cui sono fatte le marcature sui vetrini istologici. Lo studio di specifiche strutture istologiche, cellule o regioni è fatto quasi impossibile. ngTMA permette per alta precisione, perché le annotazioni vengono inseriti direttamente nelle diapositive digitali. Questo permette al ricercatore di selezionare con precisione le regioni da pugni, comprese le cellule specifiche. In questo esempio, varie zone all&#39;interno dello stesso blocco di tessuto vengono perforati per arraying, come il centro del tumore, l&#39;invasione anteriore e aree di interazione tumore / stroma evidenziato dalla presenza di piccoli gruppi di cellule tumorali o anche singole cellule. Questa precisione può essere raggiunto solo utilizzando ngTMA. In terzo luogo, perché le diapositive vengono sottoposti a scansione su una piattaforma digitale basata sul web, far scorrere la visualizzazione e l&#39;annotazione può essere fatta attraverso il computer, piuttosto che con il microscopio. Il software arraying tessuto fornisce un facile da usareInterfaccia con un elevato grado di flessibilità, layout dunque diversi e design ngTMA può essere raggiunto. Poiché TMA costruzione viene eseguita automaticamente da perforazione, c&#39;è poca necessità di hands-on manovra e la quantità di tempo per la costruzione è notevolmente ridotto. Il tempo per TMA costruzione in questo esempio è tra 24 ore. Utilizzando un approccio convenzionale TMA e la stima di 15 punzoni per ora, questo progetto avrebbe preso circa 304 ore. ngTMA può essere applicato per studiare l&#39;espressione della proteina, DNA o mRNA così come combinazioni di questi. Figura 9 illustra alcune di queste applicazioni potenziali biomarker. Immunoistochimica standard può essere applicato per determinare l&#39;indice di proliferazione dei tumori mediante Ki-67. Un approccio combinato di indagare l&#39;espressione proteica e l&#39;amplificazione del DNA per i geni, come HER2 può essere utilizzato. I tessuti possono essere riuniti in un unico ngTMA per ridurre i costi, l&#39;utilizzo dei tessuti e di altre risorses. Inoltre, mRNA ibridazione in situ per HER2 e altri geni può essere eseguita per identificare singoli mRNA trascritti in un gran numero di casi utilizzando un numero minimo di vetrini di tessuto. L&#39;immunoistochimica di marcatori immunitari quali CD8 possono essere visualizzati nel contesto del microambiente tumorale. Doppia immunoistochimica può essere utilizzato anche per evidenziare particolari regioni di interesse come le interazioni tra cellule immunitarie (marcata in rosso) e le cellule tumorali marcate (in marrone) nella parte anteriore all&#39;invasione dei tumori. Tale regione di interesse non avrebbe potuto essere catturato utilizzando microarraying tessuti convenzionali. Tuttavia, questo protocollo contiene alcune limitazioni. La sfida più importante è la sovrapposizione tra il blocco donatore e diapositiva digitale. Diversi fattori possono influenzare questo passo. In primo luogo, l&#39;ultima sezione dal blocco deve essere utilizzato per la scansione di diapositive. In molti casi, la H &amp; E non è l&#39;ultima sezione del blocco donatore, Rather è un immunoistochimica o altro macchia. In questo caso, anche un vetrino colorato può essere utilizzato fino a quando l&#39;ultima macchia viene sottoposto a scansione e annotato o un nuovo H &amp; E dovrebbe essere fatto. Si deve anche essere presa quando sezioni di tessuto sono stati fatti come i tessuti possono espandersi in bagno d&#39;acqua che conduce alla corrispondenza impegnativo di scorrimento e blocco. In secondo luogo, al momento i progetti sono limitati a 12 destinatari TMA blocchi elaborati in una sola volta. Progetti più grandi che superano 12 TMA devono essere assegnati a un secondo nome di progetto. In terzo luogo, i blocchi donatori devono essere realizzati con stampi standard e cassette come lo strumento non si può regolare di varie dimensioni. Infine, blocchi donatori devono superare l&#39;altezza minima (4 mm) per ottenere la foratura ottimale. In alcuni casi, questo richiede reembedding di tessuti. Centinaia di pubblicazioni nel corso degli ultimi anni evidenziano la TMA come uno strumento prezioso per la ricerca di biomarcatori. TMA sono stati utilizzati per lo studio del polmone 13, del colon-retto 7, breast 14, 15 della prostata, del pancreas 16, della vescica 17, e 18 tumori gastrici, per citarne alcuni. Un numero crescente di autori ha combinato l&#39;uso di TMA con analisi di immagine e significativi passi in avanti sono stati fatti in questa direzione 19-21. Tuttavia, accanto a una manciata di gruppi di ricerca che hanno pubblicato le idee innovative TMA 22-24, poca attenzione è stata data per ottimizzare la tecnica TMA stesso. Microarrayers tessuto automatizzati, come ad esempio l&#39;ATA-27 da Estigen / Beecher forniscono progettazione del layout e opportuno e automatizzato punzonatura dei tessuti. Questo rappresenta però solo 1 aspetto del concetto ngTMA. ngTMA è un sostanziale miglioramento rispetto alle tecniche microarraying tessuti convenzionali. Incorpora esperienza in istologia e design TMA con la flessibilità di patologia digitale e la precisione di annotazioni digitali con la velocità e l&#39;affidabilità di costruzione automatizzata TMA. La combinazione di ngTMA e analisi di immagine per la valutazione di proteine ​​e biomarcatori molecolari sarà un potente strumento per migliorare ulteriormente la qualità della ricerca clinica e traslazionale in futuro.

Negli ultimi due decenni, microarrays tissutali (TMA) hanno avuto un impatto notevole sugli studi di indagine biomarker. TMA sono essenzialmente di tessuto &quot;archivi&quot; prodotti dalla cessione ripetuta di piccoli nuclei di tessuto, di solito variano nel formato 0,6-2,0 mm di diametro, dalla paraffina blocchi &#39;donatori&#39; in un unico blocco TMA &#39;destinatario&#39; (Figura 1) 1. Utilizzando una piccola dimensione nucleo, circa 500 punti diversi di tessuto da pochi o molti pazienti diversi possono essere disposte in una TMA 2. L&#39;uso di TMA per gli studi di biomarcatori prognostici o predittivi ha molti vantaggi. Si consideri l&#39;esempio in cui l&#39;espressione di un biomarcatore della proteina mediante immunoistochimica deve essere valutata in 450 pazienti. Invece di eseguire 450 colorazioni immunoistochimiche su 450 diapositive paziente sezionati dallo stesso numero di blocchi, piccoli nuclei di ciascun campione possono essere disposte su un unico TBlocco MA. Anche se più core sono presi da ogni singolo paziente, un numero minimo di blocchi sono prodotti. Questo ha l&#39;effetto considerevole di diminuire drasticamente i costi e le altre risorse oltre a ridurre spreco di tessuto. Studi Inoltre questo permette opportunamente alimentato utilizzando un gran numero di tessuti da valutare nelle stesse condizioni sperimentali. TMA ha molte applicazioni diverse. Ad esempio, possono essere utilizzati per studiare la morfologia, l&#39;espressione della proteina, l&#39;espressione di RNA e DNA aberrazioni seguenti colorazione con diversi coloranti o dopo immunoistochimica o cromogenico e addirittura ibridazione in situ fluorescente 3-7. Recenti studi hanno utilizzato anche TMA per testare variazione intra e interlaboratorio in protocolli di colorazione, stabilire la specificità o la sensibilità degli anticorpi per mutazioni genetiche specifiche, e per determinare la riproducibilità inter di espressione della proteina in collaborazioni internazionali <sup&gt; 8-11. La costruzione del tradizionale TMA utilizzando tessuti di derivazione paziente è una lunga procedura in più fasi (Figura 2). Si inizia con la ricerca di possibili casi opportuni e selezione di diapositive diagnostici provenienti dagli archivi presso un istituto di patologia, o di altro istituto, da dove vengono recuperati. Il patologo valuta ogni diapositiva per caso e seleziona la diapositiva più rappresentativo ai fini dello studio. Successivamente, la regione di interesse è contrassegnato con una penna direttamente sotto il microscopio. Questo è spesso difficile e imprecisa e si traduce solo in una &quot;stima&quot; di cui punzoni di tessuto devono essere prelevati da. Successivamente, i blocchi di paraffina corrispondenti a queste diapositive contrassegnate vengono recuperati dall&#39;archivio. Un rapido confronto tra il blocco e la slitta è fatta. Utilizzando un Arrayer tessuto semi-automatico o fatti in casa, il blocco donatore è perforato nella regione stimata di interesse e trasferito in un blocco TMA destinatario. Costruzione di TMA utilizzando questa tecnica arraying è alta intensità di lavoro, che richiede tempo, impreciso, e inflessibile. Preparazione di una TMA di 475 punti in 3 copie è stimato a prendere circa 84 ore di lavoro. Un nuovo approccio alla costruzione di TMA è stato recentemente introdotto dall&#39;Istituto di Patologia, Università di Berna, che si basa su tre componenti: la pianificazione e la progettazione (o di consulenza), patologia digitale combinata con competenze in istologia e automatizzato TMA arraying 12. Insieme, questo concetto è chiamato prossima generazione di Tissue Microarray (ngTMA). Qui di seguito, un protocollo per ngTMA è descritto sulla base di un esempio di 134 pazienti con carcinoma colorettale metastatico. Qui, i tumori primari e metastasi linfonodali e metastasi epatiche devono essere schierati in ngTMAs per la successiva analisi dei biomarcatori. Inoltre, i piccoli nuclei di tessuto da ogni paziente si desiderano per il futuro estrazione degli acidi nucleici.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="612">
	<tbody>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic 250 Flash II</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;">Slide scanner</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">TMA Grandmaster</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Tissue Microarrayer</td>
		</tr>
		<tr height="22">
			<td height="22" style="height:22px;width:216px;">Pannoramic Viewer</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;">free</td>
			<td>Slide viewing software</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">Case Center</td>
			<td style="width:111px;">3DHistech</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Digital slide platform</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

La ricerca di biomarker si basa su microarray tissutali (TMA). TMA sono prodotte da ripetute trasferimento di piccoli nuclei di tessuto da un blocco &#39;donatore&#39; in un blocco &#39;destinatario&#39; e poi utilizzato per una varietà di applicazioni biomarker. La costruzione di TMA convenzionale è alta intensità di manodopera, impreciso, e che richiede tempo. Qui, un protocollo utilizzando microarray di tessuti di nuova generazione (ngTMA) è delineato. ngTMA si basa su TMA pianificazione e progettazione, patologia digitale, e microarraying tessuti automatizzato. Il protocollo è illustrato con un esempio di 134 pazienti affetti da cancro colorettale metastatico. Aspetti istologici, statistici e logistiche sono considerati, ad esempio il tipo di tessuto, specifiche regioni istologiche, e tipi di cellule per l&#39;inclusione nella TMA, il numero di macchie di tessuto, dimensione del campione, analisi statistica, e il numero di copie TMA. Vetrini istologici per ogni paziente vengono scansionati e caricati su una piattaforma digitale basata sul web. Lì, vengono visualizzati e annotated (marcato) utilizzando uno strumento di diametro 0,6-2,0 mm, più volte utilizzando diversi colori per distinguere le zone di tessuto. Blocchi donatori e 12 blocchi &#39;beneficiarie vengono caricati nello strumento. Diapositive digitali sono recuperati e abbinati alle immagini di blocco donatore. Arraying ripetuta delle regioni annotati viene automaticamente eseguita traduce in un ngTMA. In questo esempio, sei ngTMAs sono previsti contenente sei differenti tipi di tessuto / zone istologici. Due copie dei ngTMAs sono desiderati. Da tre a quattro diapositive per ogni paziente vengono controllati; 3 piste di scansione sono necessari ed eseguito durante la notte. Tutti i vetrini sono annotati; diversi colori sono utilizzati per rappresentare i diversi tessuti / zone, vale a dire il centro del tumore, invasione anteriore, tumore / stroma, metastasi linfonodali, metastasi epatiche, e tessuto normale. 17 annotazioni / caso sono fatti; tempo per l&#39;annotazione è di 2-3 min / caso. 12 ngTMAs sono prodotti contenente 4556 punti. Tempo arraying è di 15-20 ore. Grazie alla sua precisione, flessibilità e velocità, ngTMA è un potentestrumento per migliorare ulteriormente la qualità del TMA utilizzato nella ricerca clinica e traslazionale.

Pianificazione e progettazione Qui è stato utilizzato l&#39;esempio di 134 pazienti con carcinoma colorettale metastatico che vengono indagati per una particolare serie di biomarcatori. Non solo è un ngTMA previsto per questi pazienti, ma l&#39;estrazione del DNA seguita da analisi mutazionale per qualche gene specificato. Durante la fase di pianificazione e progettazione delle ngTMA, i seguenti aspetti sono stati decisi. Da ogni paziente, saranno studiati 6 diverse regioni istologiche: centro tumore, invasione tumorale anteriore, le aree di più densa tumore in erba (tumore / interazione stroma), tessuto normale, metastasi linfonodali e metastasi epatiche. Tre punti tumorali per area di tessuto tumorale e due macchie di tessuto normali devono essere inclusi nel progetto (n = 17 punti per paziente). Dal momento che si prevede che più di 50 biomarcatori essere studiati su questo materiale paziente, due copie del ngTMA finale sono desiderati. A causa delle piccole dimensioni possibili di linfonodi e distant metastasi, viene scelto un piccolo diametro di 0,6 mm per TMA di costruzione per tutti i tessuti. Inoltre, è previsto che ogni regione sia schierato separatamente, in modo che saranno prodotti 6 ngTMAs contenenti diverse aree istologiche: un ngTMA contenente tessuti dal centro tumore a), b) davanti all&#39;invasione, zone c) del tumore in erba, d) tessuto normale , e) metastasi linfonodali, e f), metastasi epatiche. Per la progettazione TMA utilizzando uno strumento di 0,6 millimetri, sarà selezionato una comoda distanza di 0,4 mm tra i pugni. Poiché la valutazione delle macchie di tessuto in lunghe righe e colonne è spesso noiosa, vengono selezionati due disegni differenti. Per le sezioni tumorali con 3 punzoni per area di tessuto, viene creato un disegno che contiene sei parti. Questo porta ad un numero totale di 402 punzoni tessuto. Per i pugni tessuti normali, 2 colpi al caso devono essere inclusi. È scelto un layout di montaggio 432 pugni in totale. Inoltre, per ogni caso, fino a 4core a 0,6 millimetri verranno inoltre essere perforato e collocati in provette da 0,2 ml. Saranno inoltre annotati Questi nuclei di tessuto. Per riassumere, saranno prodotti 6 ngTMAs di diversi tessuti (5 array tumorali x 3 punzoni x 134 pazienti; 1 dell&#39;array tessuto normale x 2 punzoni x 134 pazienti), oltre a 4 core per paziente per tubi. Nel loro insieme, saranno effettuati 2.814 annotazioni. Successivamente, i corrispondenti diapositive H &amp; E di pazienti selezionati vengono recuperati dall&#39;archivio diapositiva. Ogni caso è brevemente esaminato da un patologo e sono selezionati maggior diapositive rappresentative di ogni tipo di tessuto. Scansione Diapositive digitali di ogni sezione istologica sono fatte per il futuro annotazione. Per questo studio, 3-4 vetrini di tessuto da sottoporre a scansione ogni caso, vale a dire, cancro colorettale primario, con o senza i tessuti adiacenti normali, metastasi linfonodali e metastasi epatiche e possibilmente una truffa scivolo supplementarecontenenti mucosa normale. Fino a 10 riviste diverse possono essere completamente caricati nel scanner per diapositive; quindi 250 diapositive possono essere acquisiti in un unico passaggio. Il tempo per la scansione e la dimensione diapositiva digitale varia con le dimensioni del tessuto e il fattore di qualità desiderata. Le gamme di fattore di qualità da 0 a 100 Qui, viene selezionato un fattore di qualità di 60, in quanto produce un file di dimensioni più piccole di scansione senza alcuna perdita percepibile di qualità di scansione. Le piccole biopsie possono essere acquisiti in meno di 30 sec mentre sezioni di tessuto insieme, come quelli utilizzati in questo esempio può prendere fra 2 e 10 min. Formato diapositiva digitale può anche variare da 2 MB a 2 GB. Utilizzando un fattore di qualità di 60, esegue la scansione tra 600 MB e 1 GB sono prodotti. Tra 402 e 536 vetrini sono necessari per questo progetto per un totale di 3 piste di scansione. Ogni corsa viene eseguita durante la notte. Circa 500 GB di spazio di archiviazione è necessaria. I vetrini vengono sottoposti a scansione direttamente su una piattaforma digitale denominata Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center è accessibile da qualsiasi luogo con accesso web immettendo il nome utente e la password designato. Annotazione Per le annotazioni, due aspetti devono essere considerati: 1) aree di tessuto differenti devono essere somministrati diversi colori di annotazione e 2) il numero di annotazioni dovrebbero riflettere il numero di copie desiderate del finale ngTMA. In questo caso, sono state selezionate 3 punti per zona tumorale per una singola copia. Per 2 copie, ciascuna regione deve essere annotata con 6 punti. Utile sono di colore verde per il tessuto normale, blu per il centro tumori, giallo per il fronte invasione tumorale, rosso per le aree di tumore in erba (tumore / stroma) interazione, nero per le metastasi linfonodali, turchese di metastasi a distanza e, infine, bianco per le regioni siano utilizzato per i tubi. Annotazione di ciascun caso richiede 2-3 minuti. ngTMA Costruzione Questo studio richiede 6 ngTMA blocchi to essere costruito in 2 copie, con conseguente 12 blocchi finali. Il numero massimo di blocchi di destinatari che possono essere supportato dal Arrayer è 12 Ogni blocco tumore conterrà 402 posti tessuti e ogni blocco tessuto normale conterrà 268 punti, per un totale di 4.556 punti in tutto l&#39;intero progetto. Un layout TMA viene creato per ogni blocco destinatario e il progetto viene salvato (Figure 6A, 6B). 60 blocchi di tessuto possono essere caricati nel microarrayer tessuti in parallelo; l&#39;immagine di ogni blocco donatore è presa. Partendo con il primo blocco donatore, il corrispondente diapositiva digitale annotato viene recuperato da Case Center. Viene eseguita Scivolo corrispondenza, che può richiedere tra 1-3 min. Le annotazioni sono confermate e il Arrayer viene richiesto di avviare la punzonatura (Figura 7). Punzonatura e il tempo di trasferimento Core è di circa 12 sec. Perdita di nuclei durante questa procedura è minimo. Il tempo totale per arraying questo progetto è di circa 24 ore, compreso il tempo per slide / blocco corrispondente e ricarico dello strumento. Alcuni esempi di ngTMA sono illustrati nella Figura 8A. Cores per l&#39;analisi molecolare successive possono anche essere perforati in questo momento (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 A Un blocco) &#39;donatore&#39;. Core del blocco donatore vengono perforati e trasferiti in B) un blocco destinatario, o microarray tissutale (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 Il flusso di lavoro microarray tissutale convenzionale. A) vetrini istologici vengono recuperati dall&#39;archivio e B) dato al patologo F<html> o recensione. CD) annotazioni sono fatte sugli scivoli che indicano la regione &#39;stimato&#39; per il trasferimento. E) I blocchi di tessuto corrispondenti vengono recuperati. F) Blocco e scivolo sono confrontati per la corrispondenza, che possono G) a volte essere un compito impegnativo. HJ ) Tessuto microarraying poi prende posto. K) Cores vengono ripetutamente trasferiti e L) un TMA finale è costruito. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 A) Fino a 25 diapositive può essere posizionato in ogni rivista per la scansione. B) Rettifiche di fattore di qualità e formato può essere fatto. Avanzamento della scansione può essere monitorato. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 4 A) Scansione diapositive possono essere caricati sulla piattaforma web-based, causa Center. B) vetrini digitali possono essere visualizzati. Lo strumento di annotazione TMA consente all&#39;utente di selezionare la dimensione e il colore di base necessarie per l&#39;annotazione. C) Le annotazioni possono essere posizionati direttamente sul vetrino digitale. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 A) Fino a 60 blocchi può caricare nel microarrayer tessuti, vale a dire 10 blocchi donatori per fila e 12 destinatari blocchi pure. B) Un&#39;immagine di ogni blocco donatore è preso, l&#39;digital diapositiva viene recuperato. Corrispondenza di blocco e scorrevole è fatto e le annotazioni sono utilizzate per il blocco punzonatura. C) Il progresso della arraying può essere monitorato mentre lo strumento è punzonatura. D) Dopo l&#39;esecuzione di punzonatura, un&#39;esportazione della posizione di ogni punto nel layout, ma anche l&#39;immagine di ogni blocco donatore con annotazioni corrispondenti è fatta. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Questi layout TMA sono stati utilizzati per le arraying A) sezioni tumorali e B) tessuti normali. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Schermata del software microarrayer tessuto. Sulla sinistra, 12 riblocchi cipient possono essere posizionati nello strumento. Sul fondo, sono prese le immagini di ogni blocco donatore. Al centro, il layout TMA, si trova il progresso della punzonatura nonché immagini ingrandite di ogni blocco donatore con annotazioni. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8 A) Alcuni esempi di blocchi ngTMA appena creati. B) punzoni tessuti aggiuntivi possono essere prese per l&#39;analisi molecolare successive. Questi nuclei sono perforati e posti in provette da 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9 Esempi di applicazioni biomarker ngTMA. A) immunoistochimica colorazione Ki67 nel carcinoma del colon-retto. Doppio HER2 immunoistochimica / ibridazione in situ dosaggio mostra B) bassa espressione di proteine ​​(marrone) e nessuna amplificazione del gene HER2 (nero) rispetto al centromero (rosso); C) elevata espressione della proteina (marrone) e amplificazione del gene HER2 ( nero) rispetto al centromero (rosso). D) ibridazione in situ di Her2 mostrando trascritti di mRNA singoli nel cancro al seno ngTMA. E) Immunoistochimica per CD8 nel cancro del colon-retto. F) macchia doppia immunoistochimica per marcatore pan-citocheratina AE1 / AE3 (marrone; cellule tumorali) e CD68 (rosso;. Macrofagi) evidenziando microambiente tumorale nel carcinoma del colon-retto <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">Cliccate qui per vedere una versione più grande di questa figura.</a>

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A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l&#39;annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato.

Una nuova generazione Tissue Microarray (ngTMA) Protocollo per Biomarker Studi

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

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Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K Views.  University of Bern.  Il protocollo mira a ottimizzare la costruzione e la qualità del tissue microarrays per la ricerca biomarker. Esso comprende aspetti di pianificazione e progettazione, patologia digitale, l'annotazione diapositiva virtuale, e arraying tessuti automatizzato. 

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The Trier Social Stress Test Protocol for Inducing Psychological Stress

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting. Protocols that allow researchers to study the biological pathways of the stress response in health and disease are fundamental to the progress of research in stress and anxiety.1 Although numerous protocols exist for inducing stress response in the laboratory, many neglect to provide a naturalistic context or to incorporate aspects of social and psychological stress. Of psychological stress protocols, meta-analysis suggests that the Trier Social Stress Test (TSST) is the most useful and appropriate standardized protocol for studies of stress hormone reactivity.2 In the original description of the TSST, researchers sought to design and evaluate a procedure capable of inducing a reliable stress response in the majority of healthy volunteers.3 These researchers found elevations in heart rate, blood pressure and several endocrine stress markers in response to the TSST (a psychological stressor) compared to a saline injection (a physical stressor).3 Although the TSST has been modified to meet the needs of various research groups, it generally consists of a waiting period upon arrival, anticipatory speech preparation, speech performance, and verbal arithmetic performance periods, followed by one or more recovery periods. The TSST requires participants to prepare and deliver a speech, and verbally respond to a challenging arithmetic problem in the presence of a socially evaluative audience.3 Social evaluation and uncontrollability have been identified as key components of stress induction by the TSST.4 In use for over a decade, the goal of the TSST is to systematically induce a stress response in order to measure differences in reactivity, anxiety and activation of the hypothalamic-pituitary-adrenal (HPA) or sympathetic-adrenal-medullary (SAM) axis during the task.1 Researchers generally assess changes in self-reported anxiety, physiological measures (e.g. heart rate), and/or neuroendocrine indices (e.g. the stress hormone cortisol) in response to the TSST. Many investigators have adopted salivary sampling for stress markers such as cortisol and alpha-amylase (a marker of autonomic nervous system activation) as an alternative to blood sampling to reduce the confounding stress of blood-collection techniques. In addition to changes experienced by an individual completing the TSST, researchers can compare changes between different treatment groups (e.g. clinical versus healthy control samples) or the effectiveness of stress-reducing interventions.1

This article describes a protocol for inducing psychological stress in participants, which enables researchers to measure psychological, physiological and neuroendocrine responses to stress within single participants or between groups.

The Social Trier Protocollo di prova dello stress per indurre stress psicologico

This article demonstrates a psychological stress protocol for use in a laboratory setting.  Protocols that allow researchers to study the biological ...

Ricerca

Medicina

Corneal Donor Tissue Preparation for Endothelial Keratoplasty

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full thickness corneal transplantation has been the treatment to restore sight in those limited by corneal disease. Some disadvantages to this approach include a high degree of post-operative astigmatism, lack of predictable refractive outcome, and disturbance to the ocular surface. The development of Descemet's stripping endothelial keratoplasty (DSEK), transplanting only the posterior corneal stroma, Descemet's membrane, and endothelium, has dramatically changed treatment of corneal endothelial disease. DSEK is performed through a smaller incision; this technique avoids 'open sky' surgery with its risk of hemorrhage or expulsion, decreases the incidence of postoperative wound dehiscence, reduces unpredictable refractive outcomes, and may decrease the rate of transplant rejection3-6.
Initially, cornea donor posterior lamellar dissection for DSEK was performed manually1 resulting in variable graft thickness and damage to the delicate corneal endothelial tissue during tissue processing. Automated lamellar dissection (Descemet's stripping automated endothelial keratoplasty, DSAEK) was developed to address these issues. Automated dissection utilizes the same technology as LASIK corneal flap creation with a mechanical microkeratome blade that helps to create uniform and thin tissue grafts for DSAEK surgery with minimal corneal endothelial cell loss in tissue processing.
Eye banks have been providing full thickness corneas for surgical transplantation for many years. In 2006, eye banks began to develop methodologies for supplying precut corneal tissue for endothelial keratoplasty. With the input of corneal surgeons, eye banks have developed thorough protocols to safely and effectively prepare posterior lamellar tissue for DSAEK surgery. This can be performed preoperatively at the eye bank. Research shows no significant difference in terms of the quality of the tissue7 or patient outcomes8,9 using eye bank precut tissue versus surgeon-prepared tissue for DSAEK surgery. For most corneal surgeons, the availability of precut DSAEK corneal tissue saves time and money10, and reduces the stress of performing the donor corneal dissection in the operating room. In part because of the ability of the eye banks to provide high quality posterior lamellar corneal in a timely manner, DSAEK has become the standard of care for surgical management of corneal endothelial disease.
The procedure that we are describing is the preparation of the posterior lamellar cornea at the eye bank for transplantation in DSAEK surgery (Figure 1).

Endothelial corneal transplantation is a surgical technique for treatment of posterior corneal diseases. Mechanical microkeratome dissection to prepare tissue results in thinner, more symmetric grafts with less endothelial cell loss and improved outcomes. Dissections can be performed at the eye bank prior to corneal transplantation surgery.

Preparazione del tessuto corneale dei donatori per Keratoplasty Endothelial

Over the past ten years, corneal transplantation surgical techniques have undergone revolutionary changes1,2. Since its inception, traditional full ...

Collection Protocol for Human Pancreas

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation of pancreas recovered from cadaveric organ donors. The pancreas is divided into 3 main regions (head, body, tail) followed by serial transverse sections throughout the medial to lateral axis. Alternating sections are used for fixed paraffin and fresh frozen blocks and remnant samples are minced for snap frozen sample preparations, either with or without RNAse inhibitors, for DNA, RNA, or protein isolation. The overall goal of the pancreas dissection procedure is to sample the entire pancreas while maintaining anatomical orientation.
Endocrine cell heterogeneity in terms of islet composition, size, and numbers is reported for human islets compared to rodent islets 1. The majority of human islets from the pancreas head, body and tail regions are composed of insulin-containing &beta;-cells followed by lower proportions of glucagon-containing &alpha;-cells and somatostatin-containing &delta;-cells. Pancreatic polypeptide-containing PP cells and ghrelin-containing epsilon cells are also present but in small numbers. In contrast, the uncinate region contains islets that are primarily composed of pancreatic polypeptide-containing PP cells 2. These regional islet variations arise from developmental differences. The pancreas develops from the ventral and dorsal pancreatic buds in the foregut and after rotation of the stomach and duodenum, the ventral lobe moves and fuses with the dorsal 3. The ventral lobe forms the posterior portion of the head including the uncinate process while the dorsal lobe gives rise to the rest of the organ. Regional pancreatic variation is also reported with the tail region having higher islet density compared to other regions and the dorsal lobe-derived components undergoing selective atrophy in type 1 diabetes4,5.
Additional organs and tissues are often recovered from the organ donors and include pancreatic lymph nodes, spleen and non-pancreatic lymph nodes. These samples are recovered with similar formats as for the pancreas with the addition of isolation of cryopreserved cells. When the proximal duodenum is included with the pancreas, duodenal mucosa may be collected for paraffin and frozen blocks and minced snap frozen preparations.

This video demonstrates a dissection procedure for processing human pancreas into multiple storage formats. Anatomical orientation is maintained throughout the pancreatic regions to allow definition of regional islet composition and density.

Protocollo di raccolta per pancreas umano

This dissection and sampling procedure was developed for the Network for Pancreatic Organ Donors with Diabetes (nPOD) program to standardize preparation ...

Parabiosis in Mice: A Detailed Protocol

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of microvasculature at the site of inflammation. Parabiotic partners share their circulating antigens and thus are free of adverse immune reaction. First described by Paul Bert in 18641, the parabiosis surgery was refined by Bunster and Meyer in 1933 to improve animal survival2. In the current protocol, two mice are surgically joined following a modification of the Bunster and Meyer technique. Animals are connected through the elbow and knee joints followed by attachment of the skin allowing firm support that prevents strain on the sutured skin. Herein, we describe in detail the parabiotic joining of a ubiquitous GFP expressing mouse to a wild type (WT) mouse. Two weeks after the procedure, the pair is separated and GFP positive cells can be detected by flow cytometric analysis in the blood circulation of the WT mouse. The blood chimerism allows one to examine the contribution of the circulating cells from one animal in the other.

Parabiotic joining of two organisms leads to the development of a shared circulatory system. In this protocol, we describe the surgical steps to form a parabiotic connection between a wild-type mouse and a constitutive GFP-expressing mouse.

Parabiosis in topi: un protocollo dettagliato

Parabiosis is a surgical union of two organisms allowing sharing of the blood circulation. Attaching the skin of two animals promotes formation of ...

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

Microarray identificazione dei singoli HERV Loci Expression: Domanda di Biomarker Discovery in Cancro alla prostata

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

Collection and Extraction of Saliva DNA for Next Generation Sequencing

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality DNA. However, DNA extraction from saliva can yield high quality DNA with little to no degradation/fragmentation that is suitable for a variety of DNA assays without the expense of a phlebotomist and can even be acquired through the mail. However, at present, no saliva DNA collection/extraction protocols for next generation sequencing have been presented in the literature. This protocol optimizes parameters of saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for DNA assays with the highest standards, including microarray genotyping and next generation sequencing.

DNA extraction from saliva can provide a readily available source of high molecular weight DNA, with little to no degradation/fragmentation. This protocol provides optimized parameters for saliva collection/storage and DNA extraction to be of sufficient quality and quantity for downstream DNA assays with high quality requirements.

Raccolta ed estrazione di Saliva DNA per il sequenziamento di nuova generazione

The preferred source of DNA in human genetics research is blood, or cell lines derived from blood, as these sources yield large quantities of high quality ...

Utilizing Murine Inducible Telomerase Alleles in the Studies of Tissue Degeneration/Regeneration and Cancer

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that cause tissue degeneration during ageing. Cancer, with incidence rates greatly increasing with age, is characterized by short telomere lengths and high telomerase activity. To study the roles of telomere dysfunction and telomerase reactivation in ageing and cancer, the protocol shows how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles 4-Hydroxytamoxifen (4-OHT)-inducible TERT-Estrogen Receptor (mTERT-ER) and Lox-Stopper-LoxTERT (LSL-mTERT). The protocol describes the procedures to induce telomere dysfunction and reactivate telomerase activity in mTERT-ER and LSL-mTERT mice in vivo. The representative data show that reactivation of telomerase activity can ameliorate the tissue degenerative phenotypes induced by telomere dysfunction. In order to determine the impact of telomerase reactivation on tumorigenesis, we generated prostate tumor model G4 PB-Cre4 PtenL/L p53L/L LSL-mTERTL/L and thymic T-cell lymphoma model G4 Atm-/- mTERTER/ER. The representative data show that telomerase reactivation in the backdrop of genomic instability induced by telomere dysfunction can greatly enhance tumorigenesis. The protocol also describes the procedures used to isolate neural stem cells (NSCs) from mTERT-ER and LSL-mTERT mice and reactivate telomerase activity in NSCs in vitro. The representative data show that reactivation of telomerase can enhance the self-renewal capability and neurogenesis in vitro. Finally, the protocol describes the procedures for performing telomere FISH (Fluorescence In Situ Hybridization) on both mouse FFPE (Formalin Fixed and Paraffin Embedded) brain tissues and metaphase chromosomes of cultured cells.

Telomere and telomerase play essential roles in ageing and tumorigenesis. The goal of this protocol is to show how to generate two murine inducible telomerase knock-in alleles and how to utilize them in the studies of tissue degeneration/regeneration and cancer.

Utilizzando Murine inducibile telomerasi alleli in Studi di Tissue Degeneration / Regeneration e il cancro

Telomere dysfunction-induced loss of genome integrity and its associated DNA damage signaling and checkpoint responses are well-established drivers that ...

Clinical Protocol of Producing Adipose Tissue-Derived Stromal Vascular Fraction for Potential Cartilage Regeneration

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the knees by using different forms of mesenchymal stem cells (MSCs). In Korea, bone marrow concentrates and cord blood-derived stem cells have been approved by the Korean Food and Drug Administration (KFDA) for cartilage regeneration. In addition, an adipose tissue-derived stromal vascular fraction (SVF) has been allowed by the KFDA for joint injections in human patients. Autologous adipose tissue-derived SVF contains extracellular matrix (ECM) in addition to mesenchymal stem cells. ECM excretes various cytokines that, along with hyaluronic acid (HA) and platelet-rich plasma (PRP) activated by calcium chloride, may help MSCs to regenerate cartilage and improve knee functions. In this article, we presented a protocol to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with OA. The result of the protocol was first reported in 2011 followed by a few additional publications. The protocol involves liposuction to obtain autologous lipoaspirates that are mixed with collagenase. This lipoaspirates-collagenase mixture is then cut and homogenized to remove large fibrous tissue that may clog up the needle during the injection. Afterwards, the mixture is incubated to obtain adipose tissue-derived SVF. The resulting adipose tissue-derived SVF, containing both adipose tissue-derived MSCs and remnants of ECM, is injected into knees of patients, combined with HA and calcium chloride activated PRP. Included are three cases of patients who were treated with our protocol resulting in improvement of knee pain, swelling, and range of motion along with MRI evidence of hyaline cartilage-like tissue.

Here, we present a protocol to produce an adipose tissue-derived stromal vascular fraction and its application to improve knee functions by regenerating cartilage-like tissue in human patients with osteoarthritis.

Protocollo clinico di produrre tessuto adiposo-derivato Stromal frazione vascolare per potenziale rigenerazione della cartilagine

Osteoarthritis (OA) is one of the most common debilitating disorders.&#160;Recently, numerous attempts have been made to improve the functions of the ...

Observational Study Protocol for Repeated Clinical Examination and Critical Care Ultrasonography Within the Simple Intensive Care Studies

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) may detect adverse events of interventions such as fluid overload at an early stage. The Simple Intensive Care Studies (SICS) is a research line that focuses on the prognostic and diagnostic value of combinations of clinical variables.
The SICS-I specifically focused on the use of clinical variables obtained within 24 h of acute admission for prediction of cardiac output (CO) and mortality. Its sequel, SICS-II, focuses on repeated evaluations during ICU admission. The first clinical examination by trained researchers is performed within 3 h after admission consisting of physical examination and educated guessing. The second clinical examination is performed within 24 h after admission and includes physical examination and educated guessing, biochemical analysis and CCUS assessments of heart, lungs, inferior vena cava (IVC) and kidney. This evaluation is repeated at days 3 and 5 after admission. CCUS images are validated by an independent expert, and all data is registered in an online secured database. Follow-up at 90 days includes registration of complications and survival status according to patient&#39;s medical charts and the municipal person registry. The primary focus of SICS-II is the association between venous congestion and organ dysfunction.
The purpose of publishing this protocol is to provide details on the structure and methods of this on-going prospective observational cohort study allowing answering multiple research questions. The design of the data collection of combined clinical examination and CCUS assessments in critically ill patients are explicated. The SICS-II is open for other centers to participate and is open for other research questions that can be answered with our data.

<meta charset="utf8"></head><body>Protocollo di studio osservazionale per l'esame clinico ripetuto e l'ecografia in terapia intensiva all'interno di semplici studi di terapia intensiva

Structured protocols are necessary to provide answers on research questions in critically ill patients. The Simple Intensive Care Studies (SICS) provides an infrastructure for repeated measurements in critically ill patients including clinical examination, biochemical analysis and ultrasonography. SICS projects have specific focus but the structure is flexible to other investigations.

Protocollo di studio osservazionale per l'esame clinico ripetuto e l'ecografia in terapia intensiva all'interno di semplici studi di terapia intensiva

Longitudinal evaluations of critically ill patients by combinations of clinical examination, biochemical analysis and critical care ultrasonography (CCUS) ...