Los autores desean agradecer al personal técnico de la Unidad de Investigación Traslacional; María Economou, José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni y el Equipo de Informática en el Instituto de Patología de la Universidad de Berna.

NOTA: Este estudio ha sido aprobado por el comité de ética local del Hospital Insel, Berna, Suiza (07/10/13). Los tejidos se obtuvieron del Banco de Tumores Berna, Instituto de Patología de la Universidad de Berna. 1. Planificación y Diseño (Consulting) <ol><li> Piense acerca de la pregunta de investigación que hay que contestar. Decidir sobre los tipos de tejidos que se incluirán en el proyecto. Determine qué estructuras histológicas son importantes para responder a la pregunta. </li><li> Determinar el diámetro del núcleo más útil y el número de núcleos por paciente para el proyecto. Decidir sobre el número de copias del tejido de nueva generación Micro matriz (ngTMA) sobre la base de la cantidad de biomarcadores para ser investigado. </li><li> Considere los aspectos estadísticos, como el tamaño de la muestra y el análisis después de que se construyó el microarray tisular (TMA). Determinar el número de pacientes para su inclusión en el estudio y establecer tejidos de control para la matriz. </li><li> Recuperar el histológico (odiagnóstico) Hematoxilina y Eosina (H &amp; E) diapositivas de cada paciente. Repase brevemente las diapositivas e identificar las que contienen la información y la histología relevante para el proyecto. NOTA: Asegúrese de nuevas secciones de los bloques de parafina, si se desea una tinción especial o diapositiva inmunohistoquímica para el escaneo de diapositivas y anotación, en lugar de H &amp; E diapositivas </li></ol> Escaneo 2. Slide <ol><li> Encienda el PC y el escáner de diapositivas y software de exploración abierta. Seleccione &quot;modo automático&quot; para la exploración de campo claro de la pantalla de vista previa. </li><li> Haga clic en &quot;opciones de análisis&quot; para ajustar los parámetros de calidad de diapositivas. En este momento, seleccione si las diapositivas son a escanear directamente a la plataforma digital accesible en Internet, oa una unidad local (o disco duro externo) y establecen los tipos de análisis y el número de puntos de enfoque. </li><li> Haga clic en &quot;Parámetros del servidor&quot; para escanear al &quot;centro del caso&quot;. En este paso, añadir más revistas, etiquetar todas las diapositivas y establecerla carpeta en la sentencia de Centro, donde se deben guardar las diapositivas. Cada revista contiene hasta 25 diapositivas. </li><li> Compruebe la calidad / limpieza de placas histológicas reales para la exploración. Si es necesario, diapositivas limpias con etanol al 70%. </li><li> Cargue un máximo de 25 diapositivas por la revista con las etiquetas apuntando hacia adentro (Figura 3) </li><li> Coloque el cargador en el escáner. Por más de una revista, colocarlos en la parte superior de uno al otro. </li><li> Inicie la exploración de diapositivas haciendo clic en la flecha verde (Figura 3B). Cuando se escanean todas las diapositivas, descargar las revistas, y apague el escáner programa, PC y diapositivas. </li></ol> 3. Deslice digital Anotación <ol><li> Introduzca la dirección del navegador para el centro de gestión de diapositivas digitales y descargar el software gratuito visor de diapositivas digital. </li><li> Abra el software de visualización de diapositivas digitales y seleccione la carpeta que contiene las diapositivas digitales (Figura 4A). </li><li> Añadir notas, reordenar y gestionar la digital carpeta de diapositivas o asignar derechos de usuario a los colegas o agregar datos adjuntos a la carpeta. </li><li> Haga clic en la diapositiva digital deseado que aparece en el visor de diapositivas digital. </li><li> Uso de la herramienta de ampliación, evaluar la diapositiva y encontrar las áreas de interés para la integración en la ngTMA. </li><li> Uso de la &#39;herramienta de anotación TMA&#39;, seleccione el tamaño de la base deseada y el color de la anotación. Coloque la anotación en la preparación digital haciendo clic sobre ella (Figura 4B). </li><li> Mueva la anotación a las estructuras histológicas deseadas para su incorporación en el ngTMA (Figura 4C). </li><li> Repita este proceso de anotación de nuevo utilizando la herramienta de anotación, la selección de un tamaño de núcleo y un color de anotación deseada. Repetir la visualización de diapositivas y anotación en todas las diapositivas de la carpeta. </li><li> Como alternativa, coloque núcleos de tejido para PCR en tubos de 0,2 ml en lugar de la integración en el TMA. Anotar diapositivas utilizando un color diferente para identificarestos puntos para su posterior análisis molecular. </li><li> Crear una lista de todos los casos con sus correspondientes anotaciones y colores. </li></ol> 4. Tissue Microarray construcción <ol><li> Recuperar los correspondientes bloques de tejido de parafina para todas las diapositivas digitales anotadas, bloques Clasificar en el orden deseado para microarraying tejido. </li><li> Asegúrese de que los bloques de tejido tienen un mínimo de 4 mm de espesor. Si no, reembedding de tejido es necesaria. </li><li> Apague la PC &quot;ON&quot; y el instrumento microarrayer tejido automatizado. Abra el software microarrayer tejido y proporcionar un nombre al proyecto </li><li> Realizar un &quot;cambio de herramienta&quot; y seleccionar el diámetro de la herramienta necesaria para el proyecto (es decir, 0.6, 1.0, 1.5, o 2.0 mm). </li><li> Cargue un máximo de 12 &#39;destinatario&#39; bloques de TMA en la máquina. Dé un ID para cada uno de los 12 bloques </li><li> Crear un diseño de TMA para cada bloque receptor. Observar un diseño TMA con el número de filas, columnas y adelantarserectas y así como la distancia entre los núcleos. Crear un nuevo diseño para cada bloque receptor o utilizar el mismo diseño en varias ocasiones. </li><li> Coloque el cursor en el diseño de bloque receptor a dar el primer núcleo. </li><li> A continuación, cargar hasta 60 bloques donantes en el microarrayer tejido (Figura 5A). Coloque diez bloques en cada fila de A a F. Dé a cada bloque una identificación de donantes. Observar las imágenes de cada bloque de donantes en la pantalla del ordenador adquirido automáticamente por el microarrayer tejido. </li><li> Comenzando con el primer bloque, haga clic en &quot;Diapositiva&quot;. Observar la preparación digital anotada almacenado en el centro de gestión de diapositivas digitales (o en la unidad externa) usando el visor de diapositivas digital. Ver la imagen del bloque donante y el lado al lado de la diapositiva digital. </li><li> Seleccione los puntos de referencia en la imagen de bloque para superponer la imagen de bloque de donante con la preparación digital </li><li> Después de hacer clic en &quot;Siguiente&quot;, observar las anotaciones en una imagen más grande de la cuadra. (Figura 5B &lt;/ Strong&gt;). Haga clic en la parte superior de las anotaciones para confirmar y haga clic en &quot;Inicio&quot;. NOTA: Esta pregunta al microarrayer tejido para comenzar a perforar un agujero de 0,6 mm de diámetro en el bloque receptor en el punto de partida seleccionado. Luego, en un segundo paso, utilizando la herramienta de perforación, el instrumento golpea agujero en el tejido del bloque donante seleccionado en la región anotado y confirmado exacta. Los núcleos se transfieren desde el donante hasta el bloque receptor. </li><li> Después de aproximadamente 500 núcleos, limpiar la herramienta de perforación y perforación utilizando un hisopo de xileno. </li><li> Si se desean núcleos de tejido (en lugar de golpes en un ngTMA), haga clic en la herramienta &quot;PCR&quot; para el bloque, confirmar hasta 4 anotaciones y pulsa &quot;Inicio&quot;. Esto perforar y transferir los núcleos en un tubo de 0,2 ml. </li><li> Repita punto 4.9 a 4.11 con el segundo bloque de donantes, y así sucesivamente. </li><li> Después de usar todos los bloques donantes, introduzca una segunda ronda de bloques donantes (61-120) en el microarray de tejidoer y seguir los pasos 4.8 a 4.11. </li><li> Actualizar donantes y destinatarios bloqueados imágenes mientras que el avance del proyecto durante la perforación y la perforación se está produciendo (Figura 5C). </li><li> Realizar un &quot;Exportar&quot; después de que el proyecto esté terminado. Busque el archivo .xslx con los ID de los donantes y de bloque receptor, la localización de todos los golpes dentro de la TMA, así como el diseño TMA / diseño, en la carpeta exportada. Guardar todas las imágenes de bloques de donantes con toda anotación superpuesta como imágenes jpg en la carpeta exportada (Figura 5D). El bloque final TMA es entonces listo. </li></ol>

<ol>
	<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li><li>Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray+technology:+principles,+pitfalls+and+perspectives--lessons+learned+from+hematological+malignancies.">Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies.</a> Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).</li><li>Barlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activation+of+ribosomal+protein+S6+kinase+by+complementary+DNA+and+tissue+microarray+analysis.">Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis.</a> J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).</li><li>Bubendorf, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+gene+amplifications+during+prostate+cancer+progression+by+high-throughout+fluorescence+in+situ+hybridization+on+tissue+microarrays.">Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays.</a> Cancer Res. 59, 803-806 (1999).</li><li>Garcia-Caballero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-colour+CISH+is+a+reliable+alternative+to+FISH+for+assessment+of+topoisomerase+2-alpha+amplification+in+breast+carcinomas.">Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas.</a> Breast Cancer Res Treat. , 81-89 (2014).</li><li>Schraml, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+gene+amplification+surveys+in+many+different+tumor+types.">Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types.</a> Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).</li><li>Zlobec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RHAMM+within+the+hierarchy+of+well-established+prognostic+factors+in+colorectal+cancer.">Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer.</a> Gut. 57, 1413-1419 (2008).</li><li>Hsu, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+are+an+effective+quality+assurance+tool+for+diagnostic+immunohistochemistry.">Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).</li><li>Marin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+BRAF+p.V600E+Mutations+in+Melanoma+by+Immunohistochemistry+Has+a+Good+Interobserver+Reproducibility.">Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility.</a> Arch Pathol Lab Med. , 71-75 (2014).</li><li>Polley, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+International+Ki67+Reproducibility+Study.">An International Ki67 Reproducibility Study.</a> J Natl Cancer Inst. , 1897-1906 (2013).</li><li>Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+staining+intensity+in+the+interpretation+of+immunohistochemistry+for+tumor+markers+in+colorectal+cancer.">Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer.</a> Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).</li><li>Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+tissue+microarray+(ngTMA)+increases+the+quality+of+biomarker+studies:+an+example+using+CD3,+CD8,+and+CD45RO+in+the+tumor+microenvironment+of+six+different+solid+tumor+types.">Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types.</a> J Transl Med. 11, 104 (2013).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+ROS1+is+useful+for+identifying+ROS1+rearrangements+in+lung+cancers.">Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers.</a> Mod Pathol. , 711-720 (2014).</li><li>Droeser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+pattern+and+prognostic+significance+of+CD4+,+FOXP3++and+IL-17++tumor+infiltrating+lymphocytes+in+ductal+and+lobular+breast+cancers.">Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers.</a> BMC Cancer. 12, 134 (2012).</li><li>Fleischmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+are+differentially+expressed+in+Gleason+patterns+of+prostate+cancer+and+down-regulated+in+matched+lymph+node+metastases.">Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases.</a> Prostate. 71, 453-460 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+breast+cancer+susceptibility+gene+1+expression+is+a+potential+prognostic+biomarker+in+resectable+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pancreas. 42, 977-982 (2013).</li><li>Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her2+amplification+is+significantly+more+frequent+in+lymph+node+metastases+from+urothelial+bladder+cancer+than+in+the+primary+tumours.">Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours.</a> Eur Urol. 60, 350-357 (2011).</li><li>Zhang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Annexin+A1+protein+expression+in+human+gastric+adenocarcinoma+using+proteomics+and+tissue+microarray.">Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray.</a> World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).</li><li>Chaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+is+frequently+overexpressed+in+penile+squamous+cell+carcinomas:+a+tissue+microarray+and+digital+image+analysis+study+of+112+cases.">The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases.</a> Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).</li><li>McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+breast+tissue+microarray+images+using+contextual+classifiers.">Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers.</a> J Pathol Inform. 4, S13 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells,+early+metastasis,+and+survival+in+colorectal+cancer.">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).</li><li>Komiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+technique,+spiral+tissue+microarrays+constructed+using+needle+biopsy+specimens,+to+prostate+cancer+research.">Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research.</a> Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).</li><li>Quintayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+tissue+microarrays:+A+novel+and+viable+approach+to+optimising+tissue+micro-arrays+for+biomarker+research+applied+to+Ductal+Carcinoma+in+Situ+(DCIS).">Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS).</a> Histopathology. , 2-8 (2014).</li><li>Torata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tablet+method:+an+efficient+tissue+banking+procedure+applicable+to+both+molecular+analysis+and+frozen+tissue+microarray.">Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray.</a> Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).</li></ol>

The authors have no disclosures

En este trabajo, un protocolo para ngTMA se perfila. ngTMA es un concepto de reciente creación para microarraying tejido que comprende la planificación y el diseño, la patología digital y anotación de diapositivas, así como automatizado microarraying tejido 12. En comparación con microarraying tejido convencional, ngTMA ofrece muchas ventajas. En una primera fase, la fase de planificación y diseño es fundamental. La atención se centra en responder a una pregunta de investigación específica. Esto debe tomar en consideración las cuestiones histológicas (por ejemplo, que las regiones y el número de puntos es lo que quiero para incluir?), La planificación estadística (por ejemplo, tamaño de la muestra? ¿Cómo analizo mis muestras más tarde?) Y las consideraciones logísticas (por ejemplo, cómo muchos biomarcadores y, por tanto, el número de copias ngTMA?). A ngTMA específica se da con necesidades específicas, ya sea para la detección de biomarcadores y de alto rendimiento o la intención de estudiar los aspectos histológicos específicos en sólo unos pocos cas bien seleccionadaes. Uno, si no el más importante desventaja de microarraying tejido convencional es la baja precisión con la que se hacen marcas en los cortes histológicos. El estudio de las estructuras histológicas, células o regiones específicas se hace casi imposible. ngTMA permite una alta exactitud porque las anotaciones se colocan directamente en las diapositivas digitales. Esto permite que el investigador para seleccionar precisamente las regiones a punzonar, incluyendo las células específicas. En este ejemplo, varias áreas dentro del mismo bloque de tejido se troquelan para poner en orden, tales como el centro del tumor, el frente de invasión y áreas de interacción de tumor / estroma de relieve por la presencia de grupos de células tumorales pequeñas o incluso células individuales. Esta precisión sólo puede lograrse utilizando ngTMA. En tercer lugar, porque las diapositivas se escanean en una plataforma digital basada en la web, deslice la visualización y anotación puede hacerse a través de la computadora en lugar de con el microscopio. El software arraying tejido proporciona un fácil de usarinterfaz con un alto grado de flexibilidad, por lo tanto, diferentes diseños y diseño ngTMA se puede lograr. Desde la construcción TMA se realiza automáticamente por la perforación, hay poca necesidad de se reduce significativamente con manos de maniobra y la cantidad de tiempo para la construcción. El tiempo para la construcción TMA en este ejemplo aquí es entre 24 hr. El uso de un enfoque convencional TMA y la estimación de 15 golpes por hora, este proyecto tomaría aproximadamente 304 horas. ngTMA se puede aplicar para estudiar la expresión de proteína, ARNm o ADN, así como combinaciones de éstos. Figura 9 ilustra varias de estas aplicaciones a biomarcadores potenciales. Inmunohistoquímica estándar se puede aplicar para determinar el índice de proliferación de cánceres utilizando Ki-67. Un enfoque combinado para investigar la expresión de proteínas y la amplificación de ADN para los genes tales como HER2 puede ser utilizado. Los tejidos pueden ser reunidas en un solo ngTMA para reducir los costos, el uso de tejidos y otros recursoss. Además, el ARNm cromogénico hibridación in situ para HER2 y otros genes se puede realizar para identificar las transcripciones de ARNm individuales en un gran número de casos utilizando un número mínimo de diapositivas de tejidos. La inmunohistoquímica de los marcadores inmunes tales como CD8 puede ser visualizado en el contexto del microambiente del tumor. Doble inmunohistoquímica también se puede utilizar para resaltar regiones particulares de interés tales como las interacciones entre las células inmunes (marcados en rojo) y células tumorales (marcados en marrón) en el frente de invasión de los cánceres. Tal región de interés no podría haber sido capturado utilizando microarraying tejido convencional. No obstante, este protocolo contiene algunas limitaciones. El reto más importante es el solapamiento entre el bloque de los donantes y de diapositivas digitales. Hay varios factores que pueden influir en este paso. En primer lugar, la última sección del bloque se debe utilizar para el escaneado de diapositivas. En muchos casos, la H &amp; E no es la última sección del bloque donante, Rather es una tinción inmunohistoquímica u otro. En este caso, también un portaobjetos teñido puede ser utilizado siempre y cuando la última mancha se escanea y anotado o debe hacerse una nueva H &amp; E. También se debe tener cuidado cuando se hacen cortes de tejido como los tejidos pueden expandirse en el baño de agua que conduce a juego desafiante de diapositivas y el bloque. En segundo lugar, en este momento los proyectos se limitan a 12 receptores TMA bloques procesados ​​en una sola vez. Los proyectos más grandes de más de 12 TMA deben asignarse a un segundo nombre del proyecto. En tercer lugar, los bloques donantes deben hacerse usando moldes estándar y casetes como el instrumento no puede ajustarse a diferentes tamaños. Por último, los bloques donantes deben superar la altura mínima (4 mm) para lograr la perforación óptima. En algunos casos, esto requiere reembedding de los tejidos. Cientos de publicaciones en los últimos años ponen de manifiesto la TMA como una valiosa herramienta para la investigación de biomarcadores. TMA se han utilizado para estudiar pulmonar 13, colorrectal 7, breast 14, 15 de próstata, páncreas 16, la vejiga 17, y 18 cánceres gástricos, para nombrar unos pocos. Un creciente número de autores han combinado el uso de TMA con el análisis de imágenes y pasos importantes se están haciendo en esta dirección 19-21. Sin embargo, junto a un puñado de grupos de investigación que han publicado las ideas innovadoras TMA 22-24, se ha prestado poca atención a la optimización de la técnica de TMA en sí. Microarrayers tejido automatizados, como el ATA-27 por Estigen / Beecher proporcionan esquema de trazado y conveniente y automatizado de perforación del tejido. Sin embargo, esto representa sólo 1 aspecto del concepto ngTMA. ngTMA es una mejora sustancial respecto a las técnicas convencionales microarraying tejido. Incorpora experiencia en la histología y el diseño TMA con la flexibilidad de la patología digital y la precisión de las anotaciones digitales con la velocidad y la fiabilidad de la construcción automatizada de TMA. La combinación de ngTMA y análisis de imágenes para la evaluación de proteínas y biomarcadores moleculares será una herramienta poderosa para mejorar aún más la calidad de la investigación clínica y traslacional en el futuro.

En las últimas dos décadas, microarrays de tejidos (TMA) han tenido un impacto notable en los estudios de investigación de biomarcadores. TMA son esencialmente de tejido &quot;archivos&quot; producidas por la transferencia repetida de pequeñas cuñas de tejido, por lo general varían en tamaño desde 0,6 hasta 2,0 mm de diámetro, desde embebidos en parafina bloques &quot;donantes&quot; en un solo bloque TMA &#39;receptor&#39; (Figura 1) 1. Con un pequeño tamaño del núcleo, aproximadamente 500 diferentes puntos de tejido de pocos o muchos pacientes diferentes pueden ser dispuestos en una TMA 2. El uso de la TMA para estudios de biomarcadores pronósticos o predictivos tiene muchas ventajas. Considere el ejemplo donde la expresión de un biomarcador de proteína por inmunohistoquímica se va a evaluar en 450 pacientes. En lugar de realizar 450 tinciones inmunohistoquímicas en 450 diapositivas paciente seccionadas desde el mismo número de bloques, pequeños núcleos de cada muestra pueden ser dispuestas en una sola TBloque MA. Aunque varios núcleos se toman de cada paciente, se produjo un número mínimo de bloques. Esto tiene el efecto considerable de disminuir drásticamente los costos y otros recursos, así como la reducción de pérdida de tejido. Además esto permite estudios powered apropiadamente utilizando un gran número de tejidos a ser evaluadas bajo las mismas condiciones experimentales. TMA tiene muchas aplicaciones diferentes. Por ejemplo, pueden ser utilizados para estudiar la morfología, expresión de proteínas, expresión de ARN y las aberraciones de ADN después de la tinción con colorantes diferentes, o después de inmunohistoquímica o cromogénico e incluso hibridación in situ fluorescente 3-7. Estudios recientes también han utilizado las TMA para probar la variación intra e interlaboratorios en los protocolos de tinción, establecer la especificidad o sensibilidad de los anticuerpos para las mutaciones de genes específicos, y para determinar la reproducibilidad entre observadores de la expresión de proteínas en las colaboraciones internacionales <sup&gt; 8-11. La construcción del tradicional TMA utilizando tejidos derivados del paciente es un largo proceso de múltiples fases (Figura 2). Se inicia con la búsqueda de posibles casos apropiados y selección de diapositivas de diagnóstico de los archivos en un instituto de patología, u otro instituto, desde donde se recuperan. El patólogo evalúa cada diapositiva por caso y selecciona la diapositiva más representativo para los propósitos del estudio. A continuación, la región de interés se marca con un lápiz directamente bajo el microscopio. Esto es a menudo difícil e imprecisa y da como resultado sólo en una &quot;estimación&quot; de dónde golpes de tejidos deben tomarse de. A continuación, los bloques de parafina correspondientes a estas diapositivas marcadas se recuperan del archivo. Se hace una comparación rápida entre el bloque y el tobogán. El uso de un arrayer semi-automatizado o tejido hecho en casa, el bloque donante se troquela en la región estimada de interés y se transfirió a un bloque de TMA destinatario. Construcción de TMA utilizando esta técnica de agrupación es un trabajo intensivo, consume tiempo, impreciso y poco flexible. Preparación de una TMA de 475 puntos en 3 copias se estima para tomar cerca de 84 horas de trabajo. Un nuevo enfoque para la construcción de las TMA fue presentado recientemente por el Instituto de Patología de la Universidad de Berna que se basa en tres componentes: la planificación y el diseño (o asesoría), la patología digital combinada con la experiencia en la histología y automatizado TMA arraying 12. En conjunto, este concepto se llama Tissue próxima generación de microarrays (ngTMA). A continuación, un protocolo para ngTMA se describe sobre la base de un ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Aquí, los tumores primarios, así como metástasis en los ganglios linfáticos y las metástasis hepáticas son que se vista en ngTMAs para el análisis de biomarcadores posterior. Además, los pequeños núcleos de tejido de cada paciente se desean para el futuro de la extracción de ácidos nucleicos.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>free</td><td>Slide viewing software</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Digital slide platform</td></tr></tbody></table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

La investigación de biomarcadores se basa en microarrays de tejidos (TMA). TMA se producen por transferencia repetida de pequeños núcleos de tejido de un bloque &quot;donante&quot; en un bloque de &quot;receptor&quot; y luego se usa para una variedad de aplicaciones de biomarcadores. La construcción de TMA convencional es de mano de obra, impreciso y requiere mucho tiempo. Aquí, un protocolo utilizando microarrays de tejidos de última generación (ngTMA) se resume. ngTMA se basa en la planificación y diseño de TMA, la patología digital, y microarraying tejido automatizado. El protocolo se ilustra utilizando un ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico. Se consideran aspectos histológicos, estadísticos y logísticos, como el tipo de tejido, las regiones histológicas específicas, y tipos de células para su inclusión en el TMA, el número de manchas de tejidos, tamaño de la muestra, el análisis estadístico, y el número de copias de TMA. El estudio histológico de cada paciente son escaneados y subidos a una plataforma digital basada en la web. Allí, ellos son vistos y annotated (marcado) utilizando una herramienta de diámetro 0,6-2,0 mm, varias veces utilizando diferentes colores para distinguir las áreas de tejido. Bloques donantes y 12 bloques &#39;receptores&#39; se cargan en el instrumento. Diapositivas digitales se recuperan y adaptan a las imágenes de bloque donante. Arraying repetido de regiones anotadas es automática, consiguiéndose en un ngTMA. En este ejemplo, se han previsto seis ngTMAs que contiene seis diferentes tipos de tejidos / zonas histológicas. Dos copias de los ngTMAs se desean. De tres a cuatro diapositivas para cada paciente son escaneados; 3 ejecuta el análisis son necesarios y realizado durante la noche. Todas las diapositivas son anotados; se utilizan diferentes colores para representar los diferentes tejidos / zonas, a saber, el centro del tumor, frente a la invasión, tumor / estroma, metástasis ganglionares, metástasis hepáticas, y el tejido normal. 17 anotaciones / caso se hacen; tiempo para la anotación es de 2-3 min / caja. 12 ngTMAs se producen contiene 4.556 puntos. Tiempo Arraying es de 15-20 horas. Debido a su precisión, flexibilidad y velocidad, ngTMA es un potenteherramienta para mejorar aún más la calidad de las TMA utiliza en la investigación clínica y traslacional.

Planificación y Diseño Aquí se utilizó el ejemplo de 134 pacientes con cáncer colorrectal metastásico que están siendo investigados por una serie particular de biomarcadores. No sólo está previsto un ngTMA para estos pacientes, pero la extracción de ADN seguido por el análisis mutacional para algún gen especificado. Durante la fase de planificación y diseño de ngTMA, se han decidido los siguientes aspectos. De cada paciente, se investigarán 6 regiones histológicas diferentes: el centro del tumor, frente a la invasión tumoral, áreas de tumor más densa en ciernes (tumor / interacción estroma), el tejido normal, metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis hepáticas. Tres puntos tumorales por área de tejido tumoral y dos manchas de tejido normal se van a incluir en el proyecto (n = 17 puntos por paciente). Dado que se prevé que más de 50 biomarcadores ser investigadas en este material del paciente, se desean dos copias de la ngTMA final. Debido a la posible pequeño tamaño de los ganglios linfáticos y distant metástasis, se elige un pequeño diámetro de núcleo de 0,6 mm para la construcción TMA para todos los tejidos. Además, está previsto que cada región se vistió por separado, de manera que se producirán 6 ngTMAs contienen diferentes zonas histológicas: un ngTMA contiene tejidos del centro del tumor a), b) frente de invasión, zonas c) del tumor en ciernes, d) el tejido normal , e) metástasis en los ganglios linfáticos, y f) las metástasis hepáticas. Para el diseño TMA utilizando una herramienta de 0,6 mm, se seleccionará una distancia cómoda de 0,4 mm entre golpes. Debido a que la evaluación de los puntos de tejido en filas y columnas largas suele ser tedioso, se seleccionaron dos diseños diferentes. Para los bloques tumorales con 3 golpes por área de tejido, se crea un diseño que contiene seis partes. Esto conduce a un número total de 402 golpes de tejido. Para golpes normales de tejido, 2 golpes por caso se van a incluir. Se elige un diseño de montaje 432 golpes en total. Además, para cada caso, hasta 4núcleos a 0,6 mm serán, además, se perforaron y se colocaron en tubos de 0,2 ml. También se anotan Estos núcleos de tejido. En resumen, se producirán 6 ngTMAs de diferentes tejidos (5 matrices tumorales x 3 golpes x 134 pacientes; 1 matriz de tejido normal x 2 punzones x 134 pacientes), además de 4 núcleos por paciente para los tubos. En conjunto, se harán 2.814 anotaciones. A continuación, las correspondientes diapositivas H &amp; E de los pacientes seleccionados se recuperan del archivo de diapositivas. Cada caso es revisado brevemente por un patólogo y se seleccionan la mayoría de las diapositivas representativas de cada tipo de tejido. Escaneo Diapositivas digitales de cada corte histológico se hacen para la anotación del futuro. Para este estudio, 3-4 diapositivas de tejidos han de ser escaneados por caso, es decir, el cáncer colorrectal primario, con o sin los tejidos normales adyacentes, metástasis en los ganglios linfáticos y metástasis hepáticas y, posiblemente, una estafa carro adicionalque contiene mucosa normal. Hasta 10 revistas diferentes pueden ser totalmente cargado en el escáner de diapositivas; por lo tanto, 250 diapositivas se pueden escanear en una sola pasada. Tiempo para la digitalización y el tamaño de diapositivas digitales varía con las dimensiones del tejido y el factor de calidad deseado. Los rangos de los factores de calidad de 0 a 100 Aquí, se selecciona un factor de calidad de 60, ya que produce un tamaño de archivo más pequeño de exploración sin ninguna pérdida notable de calidad de escaneo. Biopsias pequeñas pueden ser escaneados en menos de 30 segundos, mientras que las secciones de tejido conjunto, como las que se utilizan en este ejemplo puede tardar entre 2 y 10 min. Tamaño de diapositiva digital también puede variar de 2 MB a 2 GB. El uso de un factor de calidad de 60, analiza entre 600 MB y 1 GB se producen. Se requieren entre 402 y 536 diapositivas para este proyecto un total de 3 carreras de escaneo. Cada ejecución se lleva a cabo durante la noche. Aproximadamente se necesita 500 GB de espacio de almacenamiento. Las diapositivas se escanean directamente sobre una plataforma digital llamado Caso Center (ngtma.unibe.pathcasecenter). Caso Center es accesible desde cualquier lugar con acceso a la web introduciendo el nombre de usuario y la contraseña designada. Anotación Para anotación, dos aspectos deben ser considerados: 1) diferentes áreas de tejido se debe dar diferentes colores de anotación y 2) el número de anotaciones deben reflejar el número de copias deseadas de la final ngTMA. En este caso, se han seleccionado 3 puntos por cada área del tumor para un solo ejemplar. Para 2 copias, cada región debe ser anotado utilizando 6 puntos. Útil son verdes para el tejido normal, azul para el centro del tumor, amarillo para el frente de invasión tumoral, rojo para las áreas de tumor en ciernes (tumor / estroma) interacción, negro de metástasis en los ganglios linfáticos, turquesa para metástasis a distancia y finalmente blanco para que las regiones sean utilizado para tubos. Anotación de cada caso requiere 2-3 min. ngTMA Construcción Este estudio requiere 6 ngTMA bloques to construirse en 2 copias, lo que resulta en 12 bloques finales. El número máximo de bloques de receptores que puede ser apoyado por el arrayer es 12. Cada bloque tumor contendrá 402 puntos de tejido y cada bloque de tejido normal contiene 268 puntos, por un total de 4.556 puntos en todo el proyecto entero. Se crea un diseño TMA para cada bloque receptor y el proyecto se guarda (Figuras 6A, 6B). 60 bloques de tejido se pueden cargar en el tejido microarrayer en paralelo; se toma una imagen de cada bloque donante. Comenzando con el primer bloque de donantes, las correspondientes diapositivas digitales anotada se recupera de Case Center. Juego de diapositivas se realiza, lo que puede tardar entre 1-3 min. Las anotaciones se confirmaron y el arrayer se le solicitará que inicie la perforación (Figura 7). Punzonado y tiempo de transferencia del núcleo es de aproximadamente 12 segundos. Pérdida de núcleos durante este procedimiento es mínimo. Tiempo total para poner en orden este proyecto es de aproximadamente 24 horas, incluyendo el tiempo para slide / correspondencia de bloques y carga del instrumento. Algunos ejemplos de ngTMA se ilustran en la Figura 8A. Núcleos para posterior análisis molecular también pueden ser perforados en este tiempo (Figura 8B). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Figura 1 A) Un bloque de &quot;donante&quot;. Núcleos del bloque donante se perforaron y se transfieren a B) un bloque receptor o microarray tisular (TMA). <img alt="Figura 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Figura 2 El flujo de trabajo convencional de microarrays de tejidos. A) el estudio histológico se recuperan del archivo y B) dado que el patólogo f<html> u opinión. CD) Las anotaciones se hicieron en las diapositivas que indican la región &#39;estimado&#39; para la transferencia. E) Los bloques de tejido correspondientes se recuperan. F) Bloquear y diapositiva se comparan para la coincidencia, que pueden G) a veces ser una tarea difícil. HJ ) microarraying Tissue entonces se lleva a cabo. K) Núcleos son transferidos en varias ocasiones y L) un TMA definitiva se construye. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> Figura 3 A) Hasta 25 diapositivas se puede colocar en cada revista para la exploración. B) Ajustes para el factor de calidad y tamaño se puede hacer. Progreso de la exploración se puede controlar. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Figura 4 A) escaneada diapositivas se pueden subir a la plataforma basada en la web, la sentencia de Centro. B) diapositivas digitales se puede ver. La herramienta de anotación TMA permite al usuario seleccionar el tamaño del núcleo y color necesarios para la anotación. C) Las anotaciones se pueden colocar directamente en la diapositiva digital. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a> <img alt="Figura 5" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> Figura 5 A) Hasta 60 bloques se puede cargar en el microarrayer tejido, es decir, 10 bloques de donantes por fila y 12 receptores bloques así B) Una imagen de cada bloque donante. Consta a la digitase recupera l de diapositivas. Coincidencia de bloque y de diapositivas se realiza y las anotaciones se utilizan para la perforación de bloque. C) El progreso de la arraying se puede monitorizar mientras el instrumento es la perforación. D) Una vez realizada la perforación, una exportación de la ubicación de cada punto en el diseño, pero También se hace una imagen de cada bloque de donantes con las anotaciones correspondientes. <img alt="Figura 6" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Figura 6. Estos diseños TMA fueron utilizados para poner en orden los bloques A) y B) de tumores de tejidos normales. <img alt="Figura 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Figura 7. Captura de pantalla del software microarrayer tejido. A la izquierda, 12 reincipiente bloques se pueden colocar en el instrumento. En la parte inferior, se toman imágenes de cada bloque donante. En el centro, el diseño de TMA, el progreso de la perforación, así como imágenes ampliadas de cada bloque donante con anotaciones se encuentra. <img alt="Figura 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Figura 8 A) Algunos ejemplos de nueva creación ngTMA bloques. B) golpes adicionales de tejido se pueden tomar para el análisis molecular posterior. Estos núcleos se troquelan y se colocaron en tubos de 0,2 ml. <img alt="Figura 9" fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Figura 9. Ejemplos de aplicaciones de biomarcadores ngTMA. Tinción A) La inmunohistoquímica de Ki67 en el cáncer colorrectal. Dual HER2 inmunohistoquímica / in situ ensayo de hibridación que muestra B) baja expresión de la proteína (marrón) y sin la amplificación del gen Her2 (negro) con relación al centrómero (rojo); C) alta expresión de la proteína (marrón) y amplificación del gen HER2 ( negro) con relación al centrómero (rojo). D) cromogénico hibridación in situ de Her2 que muestra los transcritos de ARNm individuales en cáncer de mama ngTMA. E) Inmunohistoquímica para CD8 en el cáncer colorrectal. F) tinción inmunohistoquímica doble para marcador pan-citoqueratina AE1 / AE3 (marrón; las células tumorales) y CD68 (rojo;. Macrófagos) destacando microambiente tumoral en el cáncer colorrectal <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">Por favor haga clic aquí para ver una versión más grande de esta figura.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

El protocolo tiene como objetivo la optimización de la construcción y la calidad de los microarrays de tejidos para la investigación de biomarcadores. Incluye aspectos de la planificación y el diseño, la patología digital, la anotación de la diapositiva virtual, y arraying tejido automatizado.

Un microarray de tejido de nueva generación (ngTMA) Protocolo de Estudios de biomarcadores

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

a-next-generation-tissue-microarray-ngtma-protocol-for-biomarker

Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K vistas.  University of Bern.  El protocolo tiene como objetivo la optimización de la construcción y la calidad de los microarrays de tejidos para la investigación de biomarcadores. Incluye aspectos de la planificación y el diseño, la patología digital, la anotación de la diapositiva virtual, y arraying tejido automatizado. 

Video: A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

Construcción manual de un microarray de tejido utilizando el método de cinta y un microarrayer de mano

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Investigación

Investigación sobre el cáncer

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

Perfil espacial digital para la caracterización del microambiente en glioma infiltrante difuso de tipo adulto

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Microtissues 3D para la terapia regenerativa inyectable y drogas de alto rendimiento

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Bioingeniería

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Optimización de un análisis de la expresión Multiplex basados en ARN usando Material de archivo de cáncer de mama

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

Construcción de una plataforma de proyección de alto rendimiento para evaluar la heterogeneidad de la amplificación del gen HER2 en cáncer de mama

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

Inmunología e Infección

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

La producción de microarrays de tejidos, las técnicas de inmunohistoquímica y la digitalización En el Human Protein Atlas

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Biología

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

Modelado inmune predictivo de tumores sólidos

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Spot de Tejidos correcta cada vez que en los bloques de múltiples tejidos

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

La cuantificación de la expresión de la proteína y Co-localización Uso de multiplexado inmunohistoquímica y tinción de imágenes multiespectrales

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

Preparación de núcleos de tejido incluidas en parafina fijadas con formalina para ambos RNA y DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...