Name: a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies
Uploaded: 2014-09-23T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 32 s
Description: Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

Yazarlar Translational Araştırma Birimi teknik personeli teşekkür etmek istiyorum; Mary Economou José Galván, Caroline Hammer, Dominique Müller, Liliane Schöni ve Patoloji Enstitüsünde Bilişim Ekibi, Bern Üniversitesi.

NOT: Bu çalışma Insel Hastanesi, Bern, İsviçre (07-10-13) yerel etik kurul tarafından onaylandı. Dokular Tümör bankanın Patoloji Bern, Enstitüsü, Bern Üniversitesi elde edilmiştir. 1. Planlama ve Tasarım (Danışmanlık) <ol><li> Araştırma sorusu düşünmek cevaplanması gereken. Doku tipleri üzerinde karar projeye dahil edilecek. Histolojik yapıları soruyu cevaplamak için önemli olan ne belirleyin. </li><li> En yararlı çekirdek çapı ve proje için hasta başına çekirdeklerinin sayısını teyit edin. Biyomarkerların miktarına göre nesil Doku Mikro Array (ngTMA) kopya sayısına karar araştırılmalıdır. </li><li> Doku mikrotertip (TMA) inşa edildikten sonra örnek büyüklüğü ve analizi gibi istatistiksel yönlerini düşünün. Çalışmaya dahil hastaların sayısını belirlemek için bir dizi kontrol dokuların oluşturulması. </li><li> Histolojik Al (veyadiyagnostik) Hematoksilen ve Eosin (H &amp; E), her bir hastanın kayar. Kısaca slaytları inceleyin ve proje için ilgili bilgi ve histoloji içeren olanları belirlemek. NOT: özel leke veya immünohistokimya slayt slayt tarama ve açıklama için istenirse yerine H &amp; E slaytlar, parafin blok yeni bölümler olun </li></ol> 2. Slayt Tarama <ol><li> PC ve slayt tarayıcı ve açık tarama yazılımı açın. Önizleme ekranından parlak bir alan tarama için &quot;Otomatik modu&quot; seçeneğini seçin. </li><li> Slayt kalite parametrelerini ayarlamak için &quot;tarama seçenekleri&quot; üzerine tıklayın. Bu anda, slaytlar doğrudan web tarafından veya yerel bir sürücü (sürücü veya harici) erişilebilir dijital platforma taranacak olup olmadığını seçin ve tarama ve odak noktalarının sayısı türlerini ayarlayabilirsiniz. </li><li> &quot;Vaka merkezi&quot; tarama &quot;Server Parametreleri&quot; üzerine tıklayın. Bu aşamada, daha dergiler eklediğiniz tüm slaytlar etiket ve setslaytlar saklanmalıdır Vaka Merkezi&#39;nde klasör. Her dergi 25 slaytlar kadar tutar. </li><li> Giriş kalite / tarama için gerçek histolojik slaytlar temizlik. % 70 etanol ile gerekli temiz, slaytlar halinde. </li><li> Etiketler içe bakan ile dergi başına 25 slaytlar kadar yükleyin (Şekil 3A) </li><li> Tarayıcıya dergi yerleştirin. Birden fazla dergisi için, birbirinin üzerine koyun. </li><li> Yeşil ok (Şekil 3B) tıklayarak slayt taramaya başlayın. Tüm slaytlar tarandığında, dergi kaldırma ve programı PC ve slayt tarayıcı kapatın. </li></ol> 3. Dijital Slayt Açıklamalar <ol><li> Dijital slayt yönetimi merkezi için tarayıcı adresini girin ve ücretsiz dijital slayt görüntüleyici yazılımı indirmek. </li><li> Dijital slayt görüntüleyici yazılımı açın ve dijital slaytlar (Şekil 4A) içeren klasörü seçin. </li><li> , Notlar ekleyebilir yeniden düzenlemek ve yönetmek Digital slayt klasör veya meslektaşlarına kullanıcı hakları atamak veya klasöre ekleri ekleyin. </li><li> Dijital slayt görüntüleyicide istediğiniz dijital slayt tıklayın. </li><li> Büyütme aracını kullanarak, slayt değerlendirmek ve ngTMA entegrasyon için ilgi alanları bulabilirsiniz. </li><li> &#39;TMA açıklama aracını&#39; kullanarak, istenen çekirdeğin büyüklüğü ve şerhinin rengi seçin. (Şekil 4B) üzerine tıklayarak, dijital slayt üzerinde şerhi. </li><li> NgTMA (Şekil 4C) içine dahil etmek için arzu edilen histolojik yapılarla açıklama getirin. </li><li> Bir çekirdek boyutu ve istenen bir açıklama rengi, açıklama aracını kullanarak seçerek tekrar şerhinin bu işlemi tekrarlayın. Klasördeki tüm slaytlar üzerinde slayt görüntüleme ve açıklama tekrarlayın. </li><li> Alternatif olarak, TTB içine 0.2 ml tüpler yerine entegrasyon içine PCR için doku çekirdeği yerleştirin. Tanımlamak için farklı bir renk kullanarak slaytlar AnnotateDaha fazla moleküler analiz için bu noktalar. </li><li> Bunlara karşılık gelen açıklamalarla ve renkleri ile tüm olguların bir listesini oluşturun. </li></ol> 4. Doku Mikroarray İnşaat <ol><li> Doku microarraying için istenen amacıyla blokların sıralayın, tüm açıklamalı dijital slaytlar için gelen parafin doku blokları alın. </li><li> Doku blokları 4 mm kalınlığında, en az olduğundan emin olun. Aksi takdirde, bir doku reembedding gereklidir. </li><li> Ve otomatik doku mikro-dizici aracı &quot;AÇIK&quot; Turn PC. Doku mikro-dizici yazılımını açın ve projeye bir ad </li><li> Bir &quot;Aracı Değiştir&quot; gerçekleştirin ve proje için gerekli alet çapı seçin (örneğin, 0.6, 1.0, 1.5 veya 2.0 mm). </li><li> Makinenin içine 12 &#39;alıcı&#39; TMA blokları yükleyin. 12 blokların her biri bir numarası </li><li> Her alıcı blok için bir TMA düzeni oluşturun. Satır, sütun, ve gidilmeyeceği sayısı ile bir TMA tasarım gözlemlemeky hatları gibi çekirdek arasında mesafe. Her alıcı blok için yeni bir düzen yaratmak, art arda veya aynı düzeni kullanmak. </li><li> İlk çekirdek almak için alıcı blok düzeninde imleci yerleştirin. </li><li> Sonraki, doku mikro dizicinin (Şekil 5A) içine 60 donör kadar blok yük. Her bloğu bir donör numarası F&#39;ye her satır A on blok yerleştirin. Doku mikro dizicinin tarafından otomatik olarak elde bilgisayar ekranında her donör bloğun görüntüleri gözlemleyin. </li><li> Ilk blok ile başlayarak, &quot;Slide&quot; üzerine tıklayın. Dijital slayt görüntüleyici kullanarak dijital slayt yönetim merkezi (veya harici sürücüde) saklanan açıklamalı dijital slayt gözlemleyin. Donör blok görüntü ve dijital slayt yan yandan görünüşüdür. </li><li> Blok görüntü üzerinde seçin referans noktaları dijital slayt ile donör blok görüntü bindirmek için </li><li> &quot;Next&quot; tıkladıktan sonra, bloğun bir büyük resim üzerine açıklamaları gözlemlemek. (Şekil 5B &lt;/ Strong&gt;). Onaylamak ve &quot;Başlat&quot; tıklayın açıklamaları üstüne tıklayın. Not: Bu, seçilen başlangıç ​​noktasında alıcı blok çapı 0.6 mm bir delik başlatmak için doku mikro-dizici ister. Daha sonra, bir ikinci aşamada, delme aleti ile, cihaz tam açıklamalı ve teyit bölgesinde seçilen donör bloktan dokuda delik açar. Çekirdekler daha sonra alıcı blok vericiden aktarılır. </li><li> Yaklaşık 500 çekirdek sonra, ksilen bir bez kullanılarak matkap ve delme aracı temizleyin. </li><li> Doku çekirdekleri (yerine bir ngTMA içine yumruklar daha) istenirse, blok için &quot;PCR&quot; aracını tıklayın 4 işaretlere kadar teyit ve vurmak &quot;Başlat&quot;. Bu yumruk ve 0.2 ml tüp içine çekirdeği transfer olacak. </li><li> Tekrar nokta, ikinci verici bloğu ile 4,9-4,11, vb. </li><li> Tüm donör blokları kullandıktan sonra, doku mikrodizisinden donör blok ikinci turda (61-120) giriner ve adımları 4,8-4,11 devam ediyor. </li><li> Proje ilerleme delme ve delme (Şekil 5C) yapılırken ise donör ve alıcı blok görüntüleri yenileyin. </li><li> Proje tamamlandıktan sonra, bir &quot;Export&quot; gerçekleştirin. Donör ve alıcı blok kimlikleri ile .xslx dosyasını bulun, ihraç klasöründe TMA içindeki tüm yumruklar yanı sıra TMA düzen / tasarım lokalizasyonu. Ihraç klasör (Şekil 5D) jpg görüntü olarak tüm bindirilmiş açıklama ile tüm donör blok görüntüleri kaydedin. Nihai TMA Blok daha sonra hazır hale gelir. </li></ol>

<ol>
	<li>Kononen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+high-throughput+molecular+profiling+of+tumor+specimens.">Tissue microarrays for high-throughput molecular profiling of tumor specimens.</a> Nat Med. 4, 844-847 (1998).</li><li>Tzankov, A., Went, P., Zimpfer, A., Dirnhofer, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray+technology:+principles,+pitfalls+and+perspectives--lessons+learned+from+hematological+malignancies.">Tissue microarray technology: principles, pitfalls and perspectives--lessons learned from hematological malignancies.</a> Exp Gerontol. 40, 737-744 (2005).</li><li>Barlund, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detecting+activation+of+ribosomal+protein+S6+kinase+by+complementary+DNA+and+tissue+microarray+analysis.">Detecting activation of ribosomal protein S6 kinase by complementary DNA and tissue microarray analysis.</a> J Natl Cancer Inst. 92, 1252-1259 (2000).</li><li>Bubendorf, L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Survey+of+gene+amplifications+during+prostate+cancer+progression+by+high-throughout+fluorescence+in+situ+hybridization+on+tissue+microarrays.">Survey of gene amplifications during prostate cancer progression by high-throughout fluorescence in situ hybridization on tissue microarrays.</a> Cancer Res. 59, 803-806 (1999).</li><li>Garcia-Caballero, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Dual-colour+CISH+is+a+reliable+alternative+to+FISH+for+assessment+of+topoisomerase+2-alpha+amplification+in+breast+carcinomas.">Dual-colour CISH is a reliable alternative to FISH for assessment of topoisomerase 2-alpha amplification in breast carcinomas.</a> Breast Cancer Res Treat. , 81-89 (2014).</li><li>Schraml, P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+for+gene+amplification+surveys+in+many+different+tumor+types.">Tissue microarrays for gene amplification surveys in many different tumor types.</a> Clin Cancer Res. 5, 1966-1975 (1999).</li><li>Zlobec, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Role+of+RHAMM+within+the+hierarchy+of+well-established+prognostic+factors+in+colorectal+cancer.">Role of RHAMM within the hierarchy of well-established prognostic factors in colorectal cancer.</a> Gut. 57, 1413-1419 (2008).</li><li>Hsu, F. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+are+an+effective+quality+assurance+tool+for+diagnostic+immunohistochemistry.">Tissue microarrays are an effective quality assurance tool for diagnostic immunohistochemistry.</a> Mod Pathol. 15, 1374-1380 (2002).</li><li>Marin, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Detection+of+BRAF+p.V600E+Mutations+in+Melanoma+by+Immunohistochemistry+Has+a+Good+Interobserver+Reproducibility.">Detection of BRAF p.V600E Mutations in Melanoma by Immunohistochemistry Has a Good Interobserver Reproducibility.</a> Arch Pathol Lab Med. , 71-75 (2014).</li><li>Polley, M. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=An+International+Ki67+Reproducibility+Study.">An International Ki67 Reproducibility Study.</a> J Natl Cancer Inst. , 1897-1906 (2013).</li><li>Zlobec, I., Terracciano, L., Jass, J. R., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Value+of+staining+intensity+in+the+interpretation+of+immunohistochemistry+for+tumor+markers+in+colorectal+cancer.">Value of staining intensity in the interpretation of immunohistochemistry for tumor markers in colorectal cancer.</a> Virchows Arch. 451, 763-769 (2007).</li><li>Zlobec, I., Koelzer, V. H., Dawson, H., Perren, A., Lugli, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Next-generation+tissue+microarray+(ngTMA)+increases+the+quality+of+biomarker+studies:+an+example+using+CD3,+CD8,+and+CD45RO+in+the+tumor+microenvironment+of+six+different+solid+tumor+types.">Next-generation tissue microarray (ngTMA) increases the quality of biomarker studies: an example using CD3, CD8, and CD45RO in the tumor microenvironment of six different solid tumor types.</a> J Transl Med. 11, 104 (2013).</li><li>Yoshida, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+detection+of+ROS1+is+useful+for+identifying+ROS1+rearrangements+in+lung+cancers.">Immunohistochemical detection of ROS1 is useful for identifying ROS1 rearrangements in lung cancers.</a> Mod Pathol. , 711-720 (2014).</li><li>Droeser, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Differential+pattern+and+prognostic+significance+of+CD4+,+FOXP3++and+IL-17++tumor+infiltrating+lymphocytes+in+ductal+and+lobular+breast+cancers.">Differential pattern and prognostic significance of CD4+, FOXP3+ and IL-17+ tumor infiltrating lymphocytes in ductal and lobular breast cancers.</a> BMC Cancer. 12, 134 (2012).</li><li>Fleischmann, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Androgen+receptors+are+differentially+expressed+in+Gleason+patterns+of+prostate+cancer+and+down-regulated+in+matched+lymph+node+metastases.">Androgen receptors are differentially expressed in Gleason patterns of prostate cancer and down-regulated in matched lymph node metastases.</a> Prostate. 71, 453-460 (2011).</li><li>Wang, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Pattern+of+breast+cancer+susceptibility+gene+1+expression+is+a+potential+prognostic+biomarker+in+resectable+pancreatic+ductal+adenocarcinoma.">Pattern of breast cancer susceptibility gene 1 expression is a potential prognostic biomarker in resectable pancreatic ductal adenocarcinoma.</a> Pancreas. 42, 977-982 (2013).</li><li>Fleischmann, A., Rotzer, D., Seiler, R., Studer, U. E., Thalmann, G. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Her2+amplification+is+significantly+more+frequent+in+lymph+node+metastases+from+urothelial+bladder+cancer+than+in+the+primary+tumours.">Her2 amplification is significantly more frequent in lymph node metastases from urothelial bladder cancer than in the primary tumours.</a> Eur Urol. 60, 350-357 (2011).</li><li>Zhang, Z. Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+Annexin+A1+protein+expression+in+human+gastric+adenocarcinoma+using+proteomics+and+tissue+microarray.">Identification of Annexin A1 protein expression in human gastric adenocarcinoma using proteomics and tissue microarray.</a> World J Gastroenterol. 19, 7795-7803 (2013).</li><li>Chaux, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+epidermal+growth+factor+receptor+is+frequently+overexpressed+in+penile+squamous+cell+carcinomas:+a+tissue+microarray+and+digital+image+analysis+study+of+112+cases.">The epidermal growth factor receptor is frequently overexpressed in penile squamous cell carcinomas: a tissue microarray and digital image analysis study of 112 cases.</a> Hum Pathol. 44, 2690-2695 (2013).</li><li>McKenna, S. J., Amaral, T., Akbar, S., Jordan, L., Thompson, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Immunohistochemical+analysis+of+breast+tissue+microarray+images+using+contextual+classifiers.">Immunohistochemical analysis of breast tissue microarray images using contextual classifiers.</a> J Pathol Inform. 4, S13 (2013).</li><li>Pages, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effector+memory+T+cells,+early+metastasis,+and+survival+in+colorectal+cancer.">Effector memory T cells, early metastasis, and survival in colorectal cancer.</a> N Engl J Med. 353, 2654-2666 (2005).</li><li>Komiya, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Application+of+a+new+technique,+spiral+tissue+microarrays+constructed+using+needle+biopsy+specimens,+to+prostate+cancer+research.">Application of a new technique, spiral tissue microarrays constructed using needle biopsy specimens, to prostate cancer research.</a> Int J Oncol. 44, 195-202 (2014).</li><li>Quintayo, M. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Virtual+tissue+microarrays:+A+novel+and+viable+approach+to+optimising+tissue+micro-arrays+for+biomarker+research+applied+to+Ductal+Carcinoma+in+Situ+(DCIS).">Virtual tissue microarrays: A novel and viable approach to optimising tissue micro-arrays for biomarker research applied to Ductal Carcinoma in Situ (DCIS).</a> Histopathology. , 2-8 (2014).</li><li>Torata, N., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+tablet+method:+an+efficient+tissue+banking+procedure+applicable+to+both+molecular+analysis+and+frozen+tissue+microarray.">Tissue tablet method: an efficient tissue banking procedure applicable to both molecular analysis and frozen tissue microarray.</a> Hum Pathol. 45, 143-152 (2014).</li></ol>

The authors have no disclosures

Bu yazıda, ngTMA için bir protokol özetlenmiştir. ngTMA planlama ve tasarım, dijital patoloji ve slayt şerh içeren doku microarraying yanı sıra otomatik doku microarraying 12 için yeni kurulan bir kavramdır. Geleneksel ince microarraying ile karşılaştırıldığında, ngTMA birçok avantaj sunmaktadır. Bir ilk adımda, planlama ve tasarım aşamasında kritiktir. Odak hedeflenen araştırma sorusunu yanıtlayan üzerinde. Bu dikkate almalı histolojik konular (örneğin, kaç noktalar Ben istiyorum ki bölgeler ve dahil?), Istatistiksel planlama (örneğin, örneklem büyüklüğü? Sonra benim örnekleri analiz Nasıl?) Ve lojistik hususlar (örneğin, nasıl Birçok biyolojik belirteçler ve bu nedenle kaç kopya ngTMA?). Belirli bir ngTMA bu biyomarkör tarama ve yüksek verimlilik için olup olmadığını, özel ihtiyaçları için veya sadece birkaç iyi seçilmiş cas belirli histolojik yönlerini incelemek için tasarlanmıştıres. Bir değil ise, geleneksel ince kağıttan microarraying en önemli dezavantajı, histolojik slaytlar üzerinde işaretler imal edildiği düşük doğruluğudur. Spesifik histolojik yapıları, hücreler veya bölgelerde çalışma neredeyse imkansız hale gelmektedir. açıklamalar dijital slaytlar üzerinde doğrudan yerleştirilen çünkü ngTMA yüksek doğruluk sağlar. Bu tam olarak bölgelerini seçmek için araştırmacı spesifik hücreler de dahil olmak üzere, delikli sağlar. Bu örnekte, aynı doku bloğu içinde farklı alanları gibi küçük tümör hücre kümeleri ya da tek hücrelerin varlığı ile vurgulanan tümör merkezinde, istilası ve tümör ön / stroma etkileşim sahaları, düzenlenmesiyle dışarı delinir. Bu doğruluğu, ngTMA kullanılarak elde edilebilir. Slaytlar web-tabanlı dijital platform üzerine taranır, çünkü Üçüncüsü, görüntüleme slayt ve not bilgisayar aracılığıyla yerine mikroskop ile yapılabilir. Doku arraying yazılımı kullanıcı dostu sağlarBir yüksek esneklik derecesi, bu nedenle de farklı düzenleri ve ngTMA tasarımı ile arayüz elde edilebilir. TMA inşaat delme tarafından otomatik olarak yapılır bu yana, eller manevra ve inşaat için zamanın miktarı önemli ölçüde azalır az ihtiyaç vardır. Burada, bu örnekte TMA yapımı için süre 24 saat arasındadır. Geleneksel TMA yaklaşımı kullanarak ve saat başına 15 yumruklar tahmin, bu proje yaklaşık 304 saat alacaktı. ngTMA protein ifadesi, mRNA veya DNA yanı sıra, bu kombinasyonları incelemek için de uygulanabilir. 9 potansiyel biyolojik belirteçler bu uygulamaların birçok göstermektedir Şekil. Standart immünohistokimyasal Ki-67 ile kanserlerin çoğalma endeksi belirlemek için uygulanabilir. Bu gibi genler için HER2 protein ekspresyonu ve DNA amplifikasyon araştırmak için kombine olarak kullanılabilir. Dokular maliyetleri, doku kullanımı ve diğer kaynağın azaltılması için tek bir ngTMA üzerinde bir araya getirilebilirs. Buna ek olarak, HER2 ve diğer genler için in situ melezleme, kromojenik mRNA&#39;nın doku örneklerinin minimal numarasını kullanarak vakaların büyük sayıda tek mRNA belirlemek için gerçekleştirilebilir. CD8 gibi bağışıklık belirteçlerin İmmünohistokimya tümörün mikro-ortamı bağlamında görüntülenmiştir. Çift immünohistokimya, aynı zamanda, kanserlerin istila ön (kahverengi etiketlenmiştir), immün (kırmızı etiketli) hücreleri ve tümör hücreleri arasındaki etkileşim gibi ilgi konusu belirli bölgelerini vurgulamak için kullanılabilir. Ilgi Böyle bir bölge, geleneksel doku microarraying kullanılarak yakalanan olamazdı. Bununla birlikte, bu protokolü, bazı sınırlamalar içermektedir. En önemli zorluk donör blok ve dijital slayt arasındaki örtüşme olduğunu. Çeşitli faktörler bu adımı etkileyebilir. İlk olarak, blok en son bölümünde kayma tarama için kullanılmalıdır. Bir çok durumda, H &amp; E donör blok -Rathe son bölümü değilr bir immünohistokimyasal ya da diğer leke olduğunu. Son leke taranmış ve not ya da yeni bir H &amp; E ile yapılmalıdır olduğu üzere, bu durumda, aynı zamanda, bir boyanmış lam sürece kullanılabilir. Dokular slayt ve blok eşleme zorlu yol açan su banyosunda genişleyebilir olarak doku kesitleri yapıldığı zaman da bakımını alınmalıdır. İkincisi, şu anda projelerin tek seferde işlenen 12 alıcı TMA blokları ile sınırlıdır. 12 TMAlar aşan büyük projeler ikinci bir proje adı atanmalıdır. Üçüncü olarak, donör bloklar çeşitli boyutlarda kendini ayarlayamaz aracı olarak, standart kalıp ve kasetleri kullanılarak yapılmalıdır. Son olarak, donör bloklar optimum delme ulaşmak için minimum yüksekliği (4 mm) aşmamalıdır. Bazı durumlarda, bu dokuların reembedding gerektirir. Son birkaç yıldır yayınların Yüzlerce biyomarkör araştırma için değerli bir araç olarak TMA vurgulayın. TMAlar akciğer 13, kolorektal 7, bre incelemek için kullanılmıştırast 14, prostat 15, pankreas 16, mesane 17, ve mide 18 kanserleri, birkaç isim. Yazarların giderek artan sayıda görüntü analizi ve önemli adımlar bu yönde 19-21 yapılıyor ile TMAlar kullanımını birleştirdik. Ancak, yenilikçi TMA fikirleri 22-24 yayınlanmış araştırma grupları bir avuç yanında, biraz dikkat TMA tekniği kendisini optimize verildi. Böyle ATA-27 Estigen / Beecher&#39;la tarafından gibi otomatik doku microarrayers, düzeni tasarım ve uygun ve otomatik doku delme sağlarlar. Ancak bu ngTMA kavramı sadece 1 yönünü temsil eder. ngTMA geleneksel ince microarraying tekniklere kıyasla büyük bir gelişme görülür. Bu dijital patoloji esneklik ve hız ve otomatik TMA inşaat güvenilirliği dijital ek açıklamaları hassasiyetle histoloji ve TMA tasarım uzmanlığı içermektedir. NgTM kombinasyonuProtein ve moleküler belirteçlerin değerlendirilmesi için bir görüntü analizi ve gelecekte daha da klinik ve translasyonel araştırma kalitesini geliştirmek için güçlü bir araç olacaktır.

Son iki yılda, doku mikroarray&#39;ler (TMAlar) biyomarkör soruşturma çalışmaları dikkate değer bir etkisi oldu. TMAlar parafine gömülü &#39;vericinin blok tek bir TMA&#39; alıcının blok içine, esas olarak (Şekil 1), tipik olarak çapı 0,6 ila 2,0 mm arasında değişen boyutu küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi, doku tarafından üretilen &quot;arşiv&quot; 1. Küçük bir çekirdek boyutu kullanarak, az ya da çok farklı hastadan yaklaşık 500 farklı doku noktalar tek TMA 2 içine dizilmiş olabilir. Prognostik veya prediktif biyomarkör çalışmalar için TMAlar kullanımı birçok avantajı vardır. Imünohistokimya ile bir protein biyobelirteci ifade 450 hasta üzerinde değerlendirilecek olan örneği ele alalım. Aksine blokların aynı sayıda kesitli 450 hasta slaytlar üzerinde 450 immünohistokimyasal lekeleri gerçekleştirmek yerine, her örnekten küçük çekirdekler tek bir T üzerine dizilmiş olabilirMA bloğu. Birden çok çekirdek her bir hastadan alınan bile, blok en az sayıda üretilir. Bu şekilde bu masrafları ve diğer bilgi azalan ve doku yıkımı azaltma önemli bir etkisi vardır. Dokuların çok sayıda kullanarak Ayrıca bu uygun güç sağlar çalışmalar aynı deneysel koşullar altında değerlendirilmelidir. TMAlar çeşitli kullanımlara sahiptir. Örneğin bunlar, morfolojisi, protein ekspresyonu RNA ekspresyonunu ve farklı boyalarla boyanması ile DNA sapmaları incelemek için kullanılabilir, ya da in situ hibridizasyon 3-7 immünohistokimya veya kromojenik ve daha sonra fluoresans. Son zamanlarda yapılan çalışmalar, aynı zamanda, boyama protokolleri içi ve laboratuar varyasyonlarını deneme özgünlük ve belirli gen mutasyon için antikorların oluşturulması duyarlılık ve uluslararası ortak olarak protein ifade gözlemciler tekrarlanabilirliği belirlenmesi için bir tmas kullandık <sus&gt; 8-11. Hasta-türetilmiş dokuları kullanılarak geleneksel TMAlar inşaat uzun bir çok aşamalı prosedür (Şekil 2). Bu alındıktan yerden bir patoloji enstitüsü veya diğer kurum, olası bir uygun durumlarda arama ve arşivlerden teşhis slaytlar seçimi ile başlar. Patolog vaka başına her slayt değerlendirir ve çalışmanın amaçları için en temsilcisi slayt seçer. Daha sonra, ilgi alanındaki bölgenin mikroskop altında doğrudan bir kalem ile işaretlenmiştir. Bu genellikle zorlu ve belirsiz ve sadece doku yumruklar alınmalıdır nerede bir &quot;tahmininde&quot; sonuçlanır. Sonra bu işaretlenmiş slaytlar karşılık parafin bloklar arşivden edilir. Blok ve kızak arasında hızlı bir karşılaştırma yapılır. Bir yarı otomatik veya ev yapımı doku dizici kullanarak, verici bloğu ilgi tahmini bölümünde dışarı doğru itilmekte ve bir alıcı blok içine aktarıldı TMA. Bu arraying tekniği kullanarak TMAlar İnşaat emek yoğun, zaman alıcı, kesin ve sert olduğunu. 3 nüsha olarak 475 noktalar bir TMA hazırlama çalışma yaklaşık 84 saat sürmesi tahmin ediliyor. Planlama ve tasarım (veya danışmanlık), histoloji uzmanlık ve otomatik TMA 12 arraying ile birlikte dijital patoloji: TMAlar inşası için yeni bir yaklaşım son zamanlarda Patoloji Enstitüsü, üç bileşenden dayanmaktadır Bern Üniversitesi tarafından tanıtıldı. Birlikte, bu kavram yeni nesil Doku Mikroarray (ngTMA) denir. Aşağıda, ngTMA için bir protokol metastatik kolorektal kanserli 134 hastanın bir örnek temelinde tarif edilmiştir. Burada primer tümörleri hem de lenf düğümü metastazı ve karaciğer metastazları sonraki analiz için biyomarker ngTMAs içine dizilmiştir edilecektir. Buna ek olarak, her bir hastaya küçük doku çekirdekleri gelecek nükleik asit ekstraksiyonu için arzu edilir.

<table><tbody><tr><td>Pannoramic 250 Flash II</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Slide scanner</td></tr><tr><td>TMA Grandmaster</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Tissue Microarrayer</td></tr><tr><td>Pannoramic Viewer</td><td>3DHistech</td><td>free</td><td>Slide viewing software</td></tr><tr><td>Case Center</td><td>3DHistech</td><td></td><td>Digital slide platform</td></tr></tbody></table>

a next-generation tissue microarray (ngtma) protocol for biomarker studies

Biyomarker araştırma doku mikrodizilerinin (TMA) dayanır. TMAlar bir &quot;alıcı&quot; blok içine bir &quot;verici&quot; blok küçük doku çekirdeklerinin tekrar transferi ile üretilebilir ve daha sonra biyobelirteç çeşitli uygulamalar için kullanılır. Geleneksel tmas yapımı yoğun emek gerektirmekte, kesin ve zaman alıcıdır. İşte, yeni nesil Doku mikrodizileri kullanarak bir protokol (ngTMA) özetlenmiştir. ngTMA TMA planlama ve tasarım, dijital patoloji, ve otomatik doku microarraying dayanmaktadır. Protokol 134 metastatik kolorektal kanser hastalarının bir örneği ile. Histolojik istatistik ve lojistik yönleri gibi TMA, TMA kopya doku noktalar, örnek büyüklüğü, istatistiksel analiz sayısı ve numarası eklenmesi için doku tipi, spesifik histolojik bölgeler ve hücre türleri olarak, kabul edilir. Her hasta için histolojik slaytlar taranmış ve bir web-tabanlı dijital platform üzerine yüklenir. Orada, onlar inceledi ve ann edilirotated bir 0,6-2,0 mm çaplı aracı, doku alanları ayırt çeşitli renkleri kullanarak birden çok kez kullanarak (işaretli). Donör blok ve 12 &#39;alıcı&#39; blok alet içine yüklenir. Dijital slaytlar alınır ve donör blok görüntülere eşleştirilir. Açıklamalı bölgelerin tekrarlanan arraying otomatik olarak ngTMA sonuçlanan gerçekleştirilir. Bu örnekte, altı ngTMAs altı farklı doku türleri / histolojik bölgesi ile planlanmıştır. NgTMAs iki kopyası arzu edilir. Taranan her hasta için dört slaytlar üç; 3 tarama çalışır ve gerekli gecede gerçekleştirilmez. Tüm slaytlar açıklamalı; Farklı renkler, farklı dokular / bölgeleri, yani tümör merkezi, istila ön, tümör / dokudan lenf nodu metastazı, karaciğer metastazları, ve normal doku temsil etmek için kullanılır. 17 açıklamalar / vaka yapılır; açıklama için süresi 2-3 dk / durumdur. 12 ngTMAs 4,556 noktalarını içeren üretilmektedir. Zaman arraying 15-20 saattir. Nedeniyle hassas, esneklik ve hız, ngTMA güçlüayrıca tmas kalitesini artırmak için bir araç ve klinik araştırma translasyonel olarak kullanılır.

Planlama ve Tasarım İşte biyobelirteçlerinin belirli bir dizi için araştırılmaktadır metastatik kolorektal kanserli 134 hasta örneği kullanılmıştır. Sadece bir ngTMA bu hastalar için planlanan, ancak DNA ekstraksiyon bazı belirtilen genin mutasyon analizi ile takip edilmektedir. NgTMA planlama ve tasarım aşamasında, aşağıdaki hususlar karar verilmiştir. Her hastanın, 6 farklı histolojik bölgeleri araştırılacak: tümör merkezi, tümör istilası ön, yoğun tümör alanları (tümör / stroma etkileşimi), normal doku, lenf nodu metastazı ve karaciğer metastazları tomurcuklanan. Tümör doku alanı başına üç tümör noktalar ve iki normal doku noktalar projesi (n = hasta başına 17 noktalar) dahil edilecek. 50&#39;den fazla biyo-malzeme üzerinde, bu hasta araştırılması planlanmaktadır için, son ngTMA iki kopyası arzu edilir. Bağlı lenf düğümü ve distan olası küçük boyutuT metastaz, bütün dokularda TTB yapımı için 0.6 mm çaplı küçük bir çekirdek tercih edilir. Buna ek olarak, farklı histolojik alanları ihtiva eden 6 ngTMAs üretilecek şekilde her bir bölge ayrı ayrı, dizilmiş edilmesi öngörülmektedir: bir ngTMA a) tümörle merkezi doku ihtiva b) ön istila, c) tümör alanları tomurcuklanma, d) normal doku e) lenf nodu metastazı, f) karaciğer metastazı. Bir 0.6 mm aracını kullanarak TMA tasarımı için, zımbalar arasındaki 0.4 mm rahat bir mesafe seçilecektir. Uzun sıralar ve sütunlar halinde doku noktalar değerlendirme genellikle yorucu olduğundan, iki değişik tasarım seçilir. Doku alanı başına 3 yumruklar ile tümör bloklar için, altı parça içeren bir tasarım oluşturulur. Bu 402 doku zımbalar toplam sayısına yol açmaktadır. Normal doku yumruklar için vaka başına 2 yumruklar dahil edilecektir. Toplam 432 yumruklar uydurma bir düzen seçilir. Ayrıca, her bir durumda, en fazla 40.6 mm iç kısımlar kesilerek çıkarıldı ve ek 0.2 ml&#39;lik tüplere yerleştirilir. Bu doku çekirdekleri de şerh edilecektir. Tüpler için hasta başına 4 çekirdek ek olarak, özetlemek, farklı dokuların 6 ngTMAs üretilecek (1 normal doku dizi x 2 yumruklar x 134 hasta 5 tümör diziler x 3 yumruklar 134 hasta x). Birlikte ele alındığında, 2814 ek açıklamalar yapılacaktır. Sonraki, seçilmiş hastalarda karşılık gelen H &amp; E slaytlar slayt arşivden edilir. Her vaka kısaca bir patolog tarafından incelenir ve her doku tipinin en temsilcisi slaytlar seçilir. Tarama Her histolojik bölümün dijital slaytlar gelecek açıklama için yapılır. Bu çalışma için, 3-4 doku slaytlar muhtemelen komşu normal dokulara, lenf nodu metastazı ve karaciğer metastazı ve ek slayt con olan veya olmayan, yani durumda, birincil kolorektal kanser başına taranacakNormal mukoza taining. Kadar 10 farklı dergi tam slayt tarayıcının içine yüklenebilir; Bu nedenle 250 slaytlar tek bir vadede taranabilir. Tarama ve dijital slayt boyutuna için zaman doku ve arzu edilen kalite faktörü boyutlarına göre değişir. Bu tarama kalitesi bir fark kaybı olmadan daha küçük tarama dosya boyutunu oluşturur beri 0&#39;dan Burada 100&#39;e kalite faktörü aralıkları, 60 bir kalite faktörü seçilir. Küçük biyopsiler 30 sn altında taranabilir ise 2 ile 10 dakika sürebilir Bu örnekte kullanılan olanlar gibi tam doku bölümleri. Dijital slayt boyutu da 2 MB ile 2 GB arasında olabilir. 60 kalite faktörü kullanarak, 600 MB ve 1 GB üretilmektedir arasındaki tarar. 402 ila 536 slaytlar 3 tarama çalışır bulan bu proje için gereklidir. Her bir işlem bir gece boyunca gerçekleştirilir. Yaklaşık depolama alanı 500 GB gereklidir. Slaytlar Olgu Merkezi adı verilen dijital platform üzerine doğrudan taranan (ngtma.unibe.pathcasecenter). Vaka Merkezi belirlenen kullanıcı adı ve şifrenizi girerek her yerden internet erişimi ile erişilebilir. Açıklamalar Açıklama için, iki yönü dikkate alınmalıdır: 1) Farklı doku alanları farklı açıklama renkler verilmeli ve 2) ek not sayısı son ngTMA istenen kopya sayısını yansıtmalıdır. Bu durumda, tek bir kopya tümör alanı başına 3 noktalar seçilmiştir. 2 kopyaları için, her bölgenin 6 noktalar kullanarak şerh edilmelidir. Faydalı uzak metastaz lenf nodu metastazı, turkuaz siyah ve bölgeler olması için nihayet beyaz (tümör / stroma) etkileşimi, tümör tomurcuklanması alanları için kırmızı, tümör yayılması ön için sarı, tümör merkezi için mavi, normal doku için yeşil borular için de kullanılır. Her davanın şerhi 2-3 dk gerektirir. ngTMA İnşaat Bu çalışma 6 ngTMA blok t gerektirirO 12 son blok ile sonuçlanır 2 nüsha olarak tertip edilebilmektedir. Her tümör blok 402 dokusu noktalar içerecektir ve her normal doku blok tüm proje genelinde 4,556 noktalar toplam 268 noktalar, içerecektir dizici tarafından desteklenen olabilir alıcı blok maksimum sayısı 12&#39;dir. Bir TMA düzeni her alıcı blok için oluşturulur ve proje (Şekil 6A, 6B) kaydedilir. 60 doku blokları paralel doku mikro dizicinin yüklenebilir; her bir vericinin blok bir görüntü alınır. İlk donör blok ile başlayarak, ilgili açıklamalı dijital slayt Vaka Merkezi&#39;nden alınır. Slayt uyan 1-3 dakika arasında sürebilir, yapılır. Açıklamalar teyit ve dizici (Şekil 7) delme başlatmak için istenir. Çekirdek delme ve transfer süresi yaklaşık 12 sn. Bu işlem sırasında çekirdek kaybı minimumdur. Bu projeyi arraying Toplam süre sli için zaman dahil, yaklaşık 24 saattirde / blok eşleştirme ve enstrümanın yeniden yükleme. NgTMA bazı örnekleri, Şekil 8A&#39;da gösterilmiştir. Sonraki moleküler analiz için Çekirdekler, gene bu zamanda (Şekil 8B) üzerinden açılabilir. <img alt="Şekil 1" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig1highres.jpg" width="500" /> Şekil 1. A) &#39;donör&#39; blok. Donör bloktan Çekirdekler zımbalandı ve B) bir alıcı blok, doku mikrodizisinin (TMA) aktarılır. <img alt="Şekil 2" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig2highres.jpg" width="500" /> Patolog f verilen Şekil 2. geleneksel doku mikroarray iş akışı. A) histolojik slaytlar arşiv ve B alınır)<html> veya yorum. CD&#39;si) Açıklamalar transferi için &#39;tahmin&#39; bölgesini gösteren slaytlar üzerinde yapılır. D) gelen doku blokları alınır. F) Blok ve slayt eşleştirme için karşılaştırıldığında, hangi G olabilir) bazen zor bir görev olabilir. HJ ) Doku microarraying sonra alır yer. K) Damarlar, art arda transfer edilir ve L) bir nihai TMA inşa edilmiştir. <img alt="Şekil 3," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig3highres.jpg" width="500" /> 25 slaytlar kadar Şekil 3. A) kalite faktörü Düzeltme) tarama. B her bir dergi yerleştirilebilir ve boyut yapılabilir. Tarama ilerleme izlenebilir. &quot;Src =&quot; / files / ftp_upload / 51893 / 51893fig4highres.jpg &quot;width =&quot; 600 &quot;/&gt; Şekil 4. A) Taranan slaytları web-tabanlı platform, Olgu Merkezi. B) Sayısal slaytlar izlenebilir üzerine yüklenebilir. TTB açıklama aracı kullanıcı Açıklamalar dijital slayt üzerine doğrudan konabilir) açıklama. C için gerekli çekirdek boyutu ve rengi seçmenize olanak verir. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig4highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a> <img alt="Şekil 5," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig5highres.jpg" width="500" /> 60 blok Yukarı Şekil 5. A) alınır doku mikro dizicinin, yani satır başına 10 donör blokları ve 12 alıcıları blok yanı. B) Her donör bloğun bir görüntü yüklenebilecek, digital slayt alınır. Blok ve sürgünün eşleştirme yapılır ve açıklamalar blok delme aracı delme sırasında düzenlenmesiyle ilerlemesi izlenebilir. ° C). D) için kullanılan delme gerçekleştirildikten sonra düzeninde her bir nokta konumunun bir ihracat ama Ayrıca gelen açıklamalarla her donör bloğun bir görüntü oluşur. <img alt="Şekil 6," fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig6highres.jpg" width="500" /> Şekil 6. Bunlar TTB düzenleri A) tümör blokları ve B), normal dokuları arraying için kullanılmıştır. <img alt="Şekil 7" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig7highres.jpg" width="500" /> Doku mikro-dizici yazılımın Şekil 7. Screenshot. Solda, 12 yenidencipient blok aracı yerleştirilebilir. Dibinde, her donör bloğun görüntüleri alınır. Merkezi, TMA düzeninde, delme ilerleme gibi açıklamaları ile her donör bloğun büyütülmüş görüntüleri bulundu. <img alt="Şekil 8" fo:content-width="5in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig8highres.jpg" width="500" /> Şekil 8. A) yeni oluşturulan ngTMA blokların bazı örnekler. B) Diğer doku yumruklar sonraki moleküler analiz için alınabilir. Bu çekirdekler kesilerek çıkarıldı ve 0.2 ml tüpler içine yerleştirilir. <img alt="Şekil 9," fo:content-width="6in" src="/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" width="600" /> Şekil ngTMA biyomarkır uygulamalar 9. örnekler. Kolorektal kanserde Ki67&#39;nin A) İmmünhistokimya boyama. Çift HER2, immünohistokimya / in situ) düşük protein (kahverengi salgılanması) ve sentromer (kırmızı) için Her2 geni (siyah) nisbetle herhangi bir amplifikasyon B gösteren hibridizasyonu deneyi, C) proteinin (kahverengi) ve Her2 gen amplifikasyonu yüksek ifade ( meme kanseri ngTMA tek mRNA gösteren Her2&#39;nin in situ hibridizasyon sentromer (kırmızı) d.) kromojenik siyah) göre belirlenmiştir. Kolorektal kanserde CD8 E) İmmünohistokimya. F) pan-sitokeratin işaretleyici AE1 / AE3 (kahverengi Çift immünohistokimyası leke; tümör hücreleri) ve CD68 (kırmızı;. Makrofajlar) kolorektal kanserde tümör mikro vurgulayarak <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/51893/51893fig9highres.jpg" target="_blank">, bu rakamın büyük bir versiyonunu görmek için lütfen buraya tıklayınız.</a>

Watch this Scientific Journal Video about A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies at JoVE.com

A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Protokol biyomarker araştırma için inşaat ve doku microarrays kalitesini optimize edilmesini amaçlamaktadır. Bu planlama ve tasarım, dijital patoloji, sanal slayt açıklama ve otomatik doku arraying yönlerini kapsamaktadır.

Biyomarker Çalışmaları için bir sonraki nesil Doku Mikrodizi (ngTMA) Protokol

Biomarker research relies on tissue microarrays (TMA). TMAs are produced by repeated transfer of small tissue cores from a &#8216;donor&#8217; block into ...

a-next-generation-tissue-microarray-ngtma-protocol-for-biomarker

Research

JoVE Journal

Medicine

A Next-generation Tissue Microarray (ngTMA) Protocol for Biomarker Studies

23.9K Görüntüleme.  University of Bern.  Protokol biyomarker araştırma için inşaat ve doku microarrays kalitesini optimize edilmesini amaçlamaktadır. Bu planlama ve tasarım, dijital patoloji, sanal slayt açıklama ve otomatik doku arraying yönlerini kapsamaktadır. 

Video: A Next-generation Tissue Microarray ngTMA Protocol for Biomarker Studies

Manual Construction of a Tissue Microarray using the Tape Method and a Handheld Microarrayer

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single paraffin block. This is achieved by using tissue cores extracted from the region of interest of different donor FFPE blocks and arranging them into a single TMA paraffin block. Once constructed, sections from the completed TMA can be used to perform immunohistochemistry, chromogenic, fluorescence in situ hybridization (FISH) and RNA ISH studies to assess protein expression as well as genomic and transcriptional alterations in many samples simultaneously, thus minimizing tissue usage and reducing reagent costs. There are several different TMA construction techniques. One of the most common construction methods is the recipient method, which works best with cores of the same length for which a minimum length of 4 mm is recommended. Unfortunately, tissue blocks can be heavily resected during the diagnostic process, frequently resulting in "non-ideal" donor block thicknesses of less than 4 mm. The current article and video focus on the double-sided adhesive tape method; an alternative manual, low cost, easy to use, and rapid method to construct low density (&lt;50 cores) TMAs that is highly compatible with these non-ideal donor blocks. This protocol provides a step-by-step guide on how to construct a TMA using this method, with a focus on the critical importance of pathological review and post construction validation.

This protocol outlines the tape method on how to manually construct a tissue microarray using FFPE donor blocks of differing depths.

Bant Yöntemi ve El Tipi Mikrodizileyici Kullanılarak Doku Mikrodizisinin Manuel Yapımı

The tissue microarray (TMA) is an important research tool in which many formalin fixed paraffin embedded (FFPE) samples can be represented in a single ...

Kanser Araştırmaları

Digital Spatial Profiling for Characterization of the Microenvironment in Adult-Type Diffusely Infiltrating Glioma

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically complex tumors, with a high degree of proteomic variability across both the tumor itself and its heterogenous microenvironment. The malignant potential of these tumors is enhanced by the dysregulation of proteins involved in several key pathways, including processes that maintain cellular stability and preserve the structural integrity of the microenvironment. Although there have been numerous bulk and single-cell glioma analyses, there is a relative paucity of spatial stratification of these proteomic data. Understanding differences in spatial distribution of tumorigenic factors and immune cell populations between the intrinsic tumor, invasive edge, and microenvironment offers valuable insight into the mechanisms underlying tumor proliferation and propagation. Digital spatial profiling (DSP) represents a powerful technology that can form the foundation for these important multilayer analyses.
DSP is a method that efficiently quantifies protein expression within user-specified spatial regions in a tissue specimen. DSP is ideal for studying the differential expression of multiple proteins within and across regions of distinction, enabling multiple levels of quantitative and qualitative analysis. The DSP protocol is systematic and user-friendly, allowing for customized spatial analysis of proteomic data. In this experiment, tissue microarrays are constructed from archived glioblastoma core biopsies. Next, a panel of antibodies is selected, targeting proteins of interest within the sample. The antibodies, which are preconjugated to UV-photocleavable DNA oligonucleotides, are then incubated with the tissue sample overnight. Under fluorescence microscopy visualization of the antibodies, regions of interest (ROIs) within which to quantify protein expression are defined with the samples. UV light is then directed at each ROI, cleaving the DNA oligonucleotides. The oligonucleotides are microaspirated and counted within each ROI, quantifying the corresponding protein on a spatial basis.

Proteomic dysregulation plays an important role in the spread of diffusely infiltrating gliomas, but several relevant proteins remain unidentified. Digital spatial processing (DSP) offers an efficient, high-throughput approach for characterizing the differential expression of candidate proteins that may contribute to the invasion and migration of infiltrative gliomas.

Yetişkin Tipi Yaygın Olarak Sızan Gliomada Mikroçevrenin Karakterizasyonu için Dijital Uzamsal Profilleme

Diffusely infiltrating gliomas are associated with high morbidity and mortality due to the infiltrative nature of tumor spread. They are morphologically ...

3D Microtissues for Injectable Regenerative Therapy and High-throughput Drug Screening

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous microscale cryogels (microcryogels), which can be loaded with a variety of cell types to form 3D microtissues. Herein, we present the protocol to fabricate versatile 3D microtissues and their applications in regenerative therapy and drug screening. Size and shape-controllable microcryogels can be fabricated on an array chip, which can be harvested off-chip as individual cell-loaded carriers for injectable regenerative therapy or be further assembled on-chip into 3D microtissue arrays for high-throughput drug screening. Due to the high elastic nature of these microscale cryogels, the 3D microtissues exhibit great injectability for minimally invasive cell therapy by protecting cells from mechanical shear force during injection. This ensures enhanced cell survival and therapeutic effect in the mouse limb ischemia model. Meanwhile, assembly of 3D microtissue arrays in a standard 384-multi-well format facilitates the use of common laboratory facilities and equipment, enabling high-throughput drug screening on this versatile 3D cell culture platform.

This protocol describes the fabrication of elastic 3D macroporous microcryogels by integrating microfabrication with cryogelation technology. Upon loading with cells, 3D microtissues are generated, which can be readily injected in vivo to facilitate regenerative therapy or assembled into arrays for in vitro high-throughput drug screening.

Enjekte edilebilir rejeneratif terapi ve yüksek-den geçerek uyuşturucu tarama için 3D Microtissues

To upgrade traditional 2D cell culture to 3D cell culture, we have integrated microfabrication with cryogelation technology to produce macroporous ...

Biyomühendislik

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

Meme kanseri arşivleme malzeme kullanarak bir Multiplex RNA temel ifade tahlil duruma getirilmesi

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

Building Up a High-throughput Screening Platform to Assess the Heterogeneity of HER2 Gene Amplification in Breast Cancers

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast cancers. However, a minority of cases displays a heterogeneous distribution of HER2-positive cells, which generates major clinical challenges. To date, no reliable and standardized protocols for the characterization and quantification of HER2 heterogeneous gene amplification in large cohorts have been proposed. Here, we present a high-throughput methodology to simultaneously assess the HER2 status across different topographic areas of multiple breast cancers. In particular, we illustrate the laboratory procedure to construct enhanced tissue microarrays (TMAs) incorporating a targeted mapping of the tumors. All TMA parameters have been specifically optimized for the silver in situ hybridization (SISH) of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) breast tissues. Immunohistochemical analysis of the prognostic and predictive biomarkers (i.e., ER, PR, Ki67, and HER2) should be performed using automated procedures. A customized SISH protocol has been implemented to allow a high-quality molecular analysis across multiple tissues that underwent different fixation, processing, and storage procedures. In this study, we provide a proof-of-principle that specific DNA sequences could be localized simultaneously in distinct topographic areas of multiple and heterogeneously processed breast cancers using an efficient and cost-effective method.

Heterogeneous distribution of HER2-positive cells can be observed in a subset of breast cancers and generates clinical dilemmas. Here, we introduce a reliable and cost-effective protocol to define, quantify, and compare HER2 intra-tumor genetic heterogeneity in a large series of heterogeneously processed breast cancers.

HER2 Gene amplifikasyon meme kanserleri heterojen değerlendirmek için bir yüksek-den geçerek tarama Platform kurma

Targeted therapies against the human epidermal growth factor receptor 2 (HER2) have radically changed the outcome of patients with HER2-positive breast ...

İmmünoloji ve Enfeksiyon

Production of Tissue Microarrays, Immunohistochemistry Staining and Digitalization Within the Human Protein Atlas

The tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the Human Protein Atlas project for global analysis of protein expression patterns in normal human tissues, cancer and cell lines. Here we present the assembly of 1 mm cores, retrieved from microscopically selected representative tissues, into a single recipient TMA block. The number and size of cores in a TMA block can be varied from approximately forty 2 mm cores to hundreds of 0.6 mm cores. The advantage of using TMA technology is that large amount of data can rapidly be obtained using a single immunostaining protocol to avoid experimental variability. Importantly, only limited amount of scarce tissue is needed, which allows for the analysis of large patient cohorts 1 2. Approximately 250 consecutive sections (4 &mu;m thick) can be cut from a TMA block and used for immunohistochemical staining to determine specific protein expression patterns for 250 different antibodies. In the Human Protein Atlas project, antibodies are generated towards all human proteins and used to acquire corresponding protein profiles in both normal human tissues from 144 individuals and cancer tissues from 216 different patients, representing the 20 most common forms of human cancer. Immunohistochemically stained TMA sections on glass slides are scanned to create high-resolution images from which pathologists can interpret and annotate the outcome of immunohistochemistry. Images together with corresponding pathology-based annotation data are made publically available for the research community through the Human Protein Atlas portal (<a href="http://www.proteinatlas.org" target="_blank">www.proteinatlas.org</a>) (Figure 1) 3 4. The Human Protein Atlas provides a map showing the distribution and relative abundance of proteins in the human body. The current version contains over 11 million images with protein expression data for 12.238 unique proteins, corresponding to more than 61% of all proteins encoded by the human genome.

Tissue microarrays allows for an efficient method to gain concurrent information from a multitude of tissues. Representative parts of tissues are assembled into a single paraffin block. Sections from the block are used for immunohistochemistry and analysis of protein expression patterns. Digital scanning generates corresponding images for distribution of data.

İnsan Protein Atlas içinde Doku Mikroarray&#39;ler, İmmünohistokimya Boyama ve Sayısallaştırma Üretimi

The  tissue microarray (TMA) technology provides the means for high-throughput  analysis of multiple tissues and cells. The technique is used within the ...

Biyoloji

Predictive Immune Modeling of Solid Tumors

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment response challenging. The ability to resolve the relative populations of immune cells present in and around the tumor tissue has been shown to be clinically-relevant to understanding response, but is limited by traditional techniques such as flow cytometry and immunohistochemistry (IHC), due the large amount of tissue required, lack of accurate cell type markers, and many technical and logistical hurdles. One assay (e.g., the ImmunoPrism Immune Profiling Assay) overcomes these challenges by accommodating both small amounts of RNA and highly degraded RNA, common features of RNA extracted from clinically archived solid tumor tissue. The assay is accessed via a reagent kit and cloud-based informatics that provides an end-to-end quantitative, high-throughput immuno-profiling solution for Illumina sequencing platforms. Researchers start with as few as two sections of formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) tissue or 20-40 ng of total RNA (depending on sample quality), and the protocol generates an immune profile report quantifying eight immune cell types and ten immune escape genes, capturing a complete view of the tumor microenvironment. No additional bioinformatic analysis is required to make use of the resulting data. With the appropriate sample cohorts, the protocol may also be used to identify statistically significant biomarkers within a patient population of interest.

The use of an RNA-based approach to determine quantitative immune profiles of solid tumor tissues and leverage clinical cohorts for immune-oncology biomarker discovery is described through a molecular and informatics protocols.

Solid Tümörlerin Prediktif İmmün Modellemesi

Immunotherapies show promise in the treatment of oncology patients, but complex heterogeneity of the tumor microenvironment makes predicting treatment ...

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue microarrays make up the majority of multi-tissue paraffin blocks, but increasingly, researchers are using non-arrayed blocks containing larger tissues from multiple individuals which can provide many of the advantages of tissue microarrays without substantial investment in planning and equipment. A critical component of any multi-tissue analysis is the orientation method used to identify each individual tissue. Although methods exist to maintain proper orientation and identification of tissues in multi-tissue blocks, most are not well-suited to non-arrayed blocks, may consume valuable space within an array and/or are difficult to produce in the standard histology laboratory. The Specimen Orientation Tag (SpOT) is a simple, low cost orientation tool that is clearly visible in paraffin blocks and all tissue sections for reliable specimen identification in arrayed and non-arrayed layouts. The SpOT provides advantages over existing orientation methods for non-arrayed blocks as it does not require any direct modification to the tissue and allows for flexibility in the arrangement of tissue pieces.

The purpose of the Specimen Orientation Tag (SpOT) is to function as an orientation tool to aid in individual tissue identification in multi-tissue paraffin blocks. These protocols demonstrate how it is constructed easily from common, low-cost histology materials and serves as a reliable visual marker in paraffin blocks and sections.

Doğru DOKU Çok doku blokları her zaman nokta

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

Quantitation of Protein Expression and Co-localization Using Multiplexed Immuno-histochemical Staining and Multispectral Imaging

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within tissues. Many semi-quantitative systems have been developed for scoring expression using immunohistochemistry, but inherent subjectivity limits reproducibility and accuracy of results. Furthermore, the investigation of spatially overlapping biomarkers such as nuclear transcription factors is difficult with current immunohistochemistry techniques. We have developed and optimized a system for simultaneous investigation of multiple proteins using high throughput methods of multiplexed immunohistochemistry and multispectral imaging. Multiplexed immunohistochemistry is performed by sequential application of primary antibodies with secondary antibodies conjugated to horseradish peroxidase or alkaline phosphatase. Different chromogens are used to detect each protein of interest. Stained slides are loaded into an automated slide scanner and a protocol is created for automated image acquisition. A spectral library is created by staining a set of slides with a single chromogen on each. A subset of representative stained images are imported into multispectral imaging software and an algorithm for distinguishing tissue type is created by defining tissue compartments on images. Subcellular compartments are segmented by using hematoxylin counterstain and adjusting the intrinsic algorithm. Thresholding is applied to determine positivity and protein co-localization. The final algorithm is then applied to the entire set of tissues. Resulting data allows the user to evaluate protein expression based on tissue type (ex. epithelia vs. stroma) and subcellular compartment (nucleus vs. cytoplasm vs. plasma membrane). Co-localization analysis allows for investigation of double-positive, double-negative, and single-positive cell types. Combining multispectral imaging with multiplexed immunohistochemistry and automated image acquisition is an objective, high-throughput method for investigation of biomarkers within tissues.

Immunohistochemistry is a powerful lab technique for evaluating protein localization and expression within tissues. Current semi-automated methods for quantitation introduce subjectivity and often create irreproducible results. Herein, we describe methods for multiplexed immunohistochemistry and objective quantitation of protein expression and co-localization using multispectral imaging.

Çoklanmış Immuno-histokimyasal boyanması ve Multispektral Görüntüleme kullanma Protein Ekspresyonu ve Co-lokalizasyon Kantifikasyonu

Immunohistochemistry is a commonly used clinical and research lab detection technique for investigating protein expression and localization within ...

Preparation of Formalin-fixed Paraffin-embedded Tissue Cores for both RNA and DNA Extraction

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in molecular analysis is complicated both by heterogeneous tissue composition and low yields when extracting nucleic acids. A literature search revealed a paucity of protocols addressing these issues, and none that showed a validated method for simultaneous extraction of RNA and DNA from regions of interest in FFPET. This method addresses both issues. Tissue specificity was achieved by mapping cancer areas of interest on microscope slides and transferring annotations onto FFPET blocks. Tissue cores were harvested from areas of interest using 0.6 mm microarray punches. Nucleic acid extraction was performed using a commercial FFPET extraction system, with modifications to homogenization, deparaffinization, and Proteinase K digestion steps to improve tissue digestion and increase nucleic acid yields. The modified protocol yields sufficient quantity and quality of nucleic acids for use in a number of downstream analyses, including a multi-analyte gene expression platform, as well as reverse transcriptase coupled real time PCR analysis of mRNA expression, and methylation-specific PCR (MSP) analysis of DNA methylation.

This modified extraction protocol improves RNA and DNA yields from more precisely targeted regions of interest in histopathologic tissue blocks.

RNA ve DNA Ekstraksiyon hem Formalin sabit Parafin gömülü Doku Çekirdek hazırlanması

Formalin-fixed paraffin embedded tissue (FFPET) represents a valuable, well-annotated substrate for molecular investigations. The utility of FFPET in ...