המחברים מבקשים להודות לד&quot;ר ברנט האריס למתן סקירה ביקורתית של כתב היד. מחקרים אלה נערכו בומברדי המקיף מרכז הסרטן histopathology והמשאבים משותפים רקמות אשר נתמך בחלקו על ידי P30-CA051008 מענק NIH / NCI. התוכן הוא באחריות בלעדית של הכותבים ולא בהכרח מייצג את הדעות הרשמיות של המכון הלאומי לסרטן או המכונים הלאומי לבריאות.

1. בנייה של המקום <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוסף 50 מ&quot;ג של סרום שור אלבומין (BSA) 1 צבע סימון מיליליטר רקמות בצינור 15 מיליליטר חרוטי או 2 מיליליטר צינור microfuge ומערבולת דקות 1 או עד שהיא נמסה לחלוטין. הערה: פרוטוקול זה, להשתמש ביוכימיים כיתה BSA. ואילו בכיתות וpurities אחרים לא נבדקו, צפוי כי בכיתה וטוהר לא היו השפעה משמעותית על ההצלחה של המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חום 9 ג&#39;ל מיליליטר hydroxyethyl עיבוד agarose בצינור חרוטי 15 מיליליטר במיקרוגל בעצמה של 30% במשך 10 שניות במרווחים עד הג&#39;ל נמס לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשלב ג&#39;ל העיבוד נמס ופתרון הצבע-BSA בצינור חרוטי 15 מיליליטר אחת ומערבבים היטב עם טפטפת. מערבולת הפתרון. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור חרוטי במקרר לכמה שעות או עד מוצק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש,, מרית מתכת דקה ארוכה או בדיקה בעדינות כדי לשחרר את תקע ג&#39;ל בצבע מצינור חרוטי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> השתמש בלהב סכין מנתחים או סכין גילוח למ&quot;קt ג&#39;ל לחבר רוחבי ל5 מ&quot;מ חלקים עבים. הסר את הקצוות מעוגלים ולהשליך לפח האשפה (איור 2 א). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את חלקי תקע ג&#39;ל שטוחים בקלטות היסטולוגיה ולהחזיק ב -70% אתנול עבור שעה 1. לשנות את פתרון אתנול 70% בכל שעות 2-4 לפחות 3 שינויים לאורך תקופה של 24 שעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ידני לעבד את חלקי ג&#39;ל באמצעות סדרת אתנול (1 שעה כל אחד: 70% אתנול, 80% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול (שינויי 3x), אז ברורים בניקוי 3x פתרון לשעה 1 כל אחד (לדוגמא, פחמימנים aliphatic ( xylenes תחליף)) היה בשימוש בפרוטוקול זה, xylenes גם מקובל), ולחדור עם פרפין המותך (3x עבור שעה 1 כל אחד), באופן ידני או בProcesser רקמה. הערה: לפני התייבשות מלאה ב 100% אתנול, הצבע עלול לדלוף מתקע ג&#39;ל שעלול להשפיע על רקמות אחרות וריאגנטים נוזליים במעבד רקמות אוטומטי. כהתייבשות כגון, הוראות מומלצת מאוד, עיבוד עם זאת אוטומטי הוא סוסיםברית יעילה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפים להטביע מרובים מעובד ג&#39;ל באמצעות פרפין הסטנדרטי הטבעת המתודולוגיה (איור 2). לאפשר בלוקים לקירור ולהקשיח ואז מגיעים לטמפרטורת חדר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש במחט אגרוף עורי של גודל רצוי להסיר ליבות נקודה מסעיפי ג&#39;ל מוטבעים עד הבלוק הוא מותש (איור 2 ג). בלוק אחד עשוי לספק עד 20 x 2 מ&quot;מ 2 ליבות. אחסן את הליבות באזור קריר. השתמש אגרוף עורי בפרוטוקול זה ראה איורים, 1.5 מ&quot;מ (1D דמויות, ו2D) או 2 מ&quot;מ (1B דמויות, 1C, 2C ו). </li></ol> 2. שימוש כתמים ללוקים-ערוכים ללא אוריינט <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תרשים אוריינטצית רקמות כדי לציין את המקומות הרצויים וזהותם של כל חלקי הרקמה הבודדים להיות משובצים ביחד, ואת מיקומו של המקום. הערה: תרשים הנטייה הרקמה היא מפה מאוירת הכוללת את עמ &#39;מקומות hysical של כל חלקי הרקמה שכותרתו עם מזהים והמיקום של הנקודה. זה יכול להיות שנוצר באופן אלקטרוני או יכול להיות מצויר ביד. התרשים צריך להיות שנוצר באמצעות כל שיטה המתאימה ביותר לטכנאי וחוקר שימוש במוצר הסופי. מפה זו תשמש כמדריך לחוקר כך ניתן לזהות בקלות דגימות במהלך ניתוח מיקרוסקופי. מפת שימוש בפרוטוקול זה היה מצוירת ביד. הוא מתאר שקופיות מיקרוסקופ בלוק וזכוכית רקמה עם כל פיסת הרקמה והמקום נמשך ושהכותרת באותה התנוחה כמו בלוק הרקמה בפועל ושקופיות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את פיסות הרקמה בדרך כלל, על מנת להבטיח שהם יישארו מזוהים כראוי לאורך כל שלבי גילום ועיבוד. לפרוטוקול זה, לעבד את הרקמות לשעה 1 בכל: אתנול 70%, 80% אתנול, 95% אתנול, 100% אתנול (שינויי x3), פחמימנים aliphatic (תחליף xylenes) (שינויי x3), ופרפין חדירת רקמה המותך ב 60 ° C (שינויי x3). הערה:צריכים להיות מעובד רקמות ll הבא נהלי מעבדה היסטולוגיה סטנדרטית. זה עשוי להיות משתנה בשל הליך מעבדה בודד, גודל וסוג רקמה, אבל זה לא ישפיע על היכולת להשתמש במקום ככלי אורינטציה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לארגן פיסות רקמה בתחנת ההטבעה במקומות שהוקצו הנכונים על פי תרשים הנטייה רקמה. השתמש בתרשים התמצאות הרקמה כנקודת התייחסות כדי להנחות את הטכנאי על איך לסדר את חתיכות נקודה ורקמות בכל בלוק. הערה: בפרוטוקול זה טכנאי ההטבעה לשים מפת ההתמצאות המצוירת ביד ליד תחנת ההטבעה וסידרה את חתיכות הרקמה בתחנת ההטבעה בדיוק באותו הסדר כפי שצייר בתרשים. הדבר מבטיח כי כל חלקי הרקמה יישארו בצורה נכונה לזיהוי במוצר הסופי. זה קריטי לשימוש המוצלח של בלוקים רב-רקמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא ליבת הנקודה היא גבוהה יותר מכל חלקי הרקמה להיות מוטבעים בגוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להטביע את פיסות רקמה ולאחר מכן את המקום בסופו של דבר (רוחבי) במקומות הנכונים על פי תרשים אוריינטצית רקמות באמצעות מתודולוגיה הטבעה סטנדרטית. בהתאם לצורך, להחזיק את המקום (ים) זקוף עם מלקחיים עד פרפין בסס מספיק שהמקום (ים) לא ייפול על (1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> סעיפי סעיף ופרפין הכתם עם המקום באמצעות מתודולוגיה סטנדרטית. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאפשר הסעיפים לצוף על אמבט מים ב 40 ° C ודבקו שקופיות זכוכית טעונות חיובי (שקופיות בלתי טעונות לא נבדקו). ייבש את השקופיות בתנור ייבוש ב 60 מעלות צלזיוס במשך לפחות 20 דקות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את השקופיות בstainer אוטומטית ומעובד באמצעות חומרים כימיים הבאים: xylenes (xylenes 1-5 דקות, xylenes 2 ו3-2 דקות, כל אחד), 100% אתנול (2 דקות), 95% אתנול (1 דקות), 80 % אתנול (30 שניות), 70% אתנול (30 שניות), במים ברז זורמים (2 דקות), hematoxylin (1.5 דקות), במים ברז זורמים (3 דקות), אלכוהול חומצה (1 דקות), במים ברז זורמים (2 דק &#39; ), BLמגיב uing (1 דקות), מים זורמים (2 דקות), 80% אתנול (30 שניות), eosin (1 דקות), מים זורמים (10 שניות), 80% אתנול (1 דקות), 100% אתנול (3 שינויים, 2 דקות כל אחד), xylenes (3 שינויים, 30 שניות כל אחד). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לכסות את השקופיות עם coverslips זכוכית, רכוב עם ההרכבה בינונית. הערה: בפרוטוקול זה, histotechnician מחולק בלוקים פרפין על microtome ב5 מיקרומטר סעיפים. לפרוטוקול זה השתמשנו stainer אוטומטי, אך ניתן להשיג תוצאות שווים באמצעות צביעה ידנית. </li></ol></li></ol> 3. מקום בTMAs (ערכת TMA ידנית) <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צור תרשים נטייה רקמה, כפי שתואר ב2.1 ולהקצות את המיקום הרצוי (ים) של המקום. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ממלא את תבנית TMA עם פרפין נמס בתחנת הטבעה. כעובש קירור, להטביע את המקום (ים) בסופו של דבר בשולי תבנית TMA במקומות הרצויים שצוינו על ידי תרשים הנטייה רקמה. בהתאם לצורך, להחזיק את המקום (ים) זקוף עם מלקחיים עד חה פרפיןים הגדילו מספיק שהמקום (ים) לא ייפול על (1-2 דקות). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרכיב את ליבות TMA פי הוראות יצרן ובנוגע למיקומו של המקום (ים) בשולי המערך (איור 2 ד), ואחרי פרוטוקולי חתך וצביעה סטנדרטיים. הערה: אנא ראה שלב 2.6 לראות את שיטות חתך והכתים שימוש בפרוטוקול זה. </li></ol>

<ol>
	<li>Jawhar, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray:+a+rapidly+evolving+diagnostic+and+research+tool.">Tissue microarray: a rapidly evolving diagnostic and research tool.</a> Ann. Saudi. Med. 29 (2), 123-127 (2009).</li><li>Dhir, R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+an+overview.">Tissue microarrays: an overview.</a> Methods Mol. Bio. 441, 91-103 (2008).</li><li>Parsons, M., Grabsch, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=How+to+make+tissue+microarrays.">How to make tissue microarrays.</a> Diagn. Histopath. 15 (3), 142-150 (2009).</li><li>Saxena, R., Bade, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ch.+7+Tissue+Microarray+–+Construction+and+Quality+Assurance.">Ch. 7 Tissue Microarray – Construction and Quality Assurance.</a> Immunohistochemical Staining Methods 6th ed. , (2013).</li><li>Nocito, A., Kononen, J., Kallioniemi, O., Sauter, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays+(TMAs)+for+high-throughput+molecular+pathology+research.">Tissue microarrays (TMAs) for high-throughput molecular pathology research.</a> Int. J. Cancer. 94, 1-5 (2001).</li><li>Rangel, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+tissue+microarray:+helpful+hints.">The tissue microarray: helpful hints.</a> J.Histotech. 25 (2), 93-100 (2002).</li><li>Hammer, A., Williams, B., Dietz, H., Hamilton-Dutoit, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=High-throughput+immunophenotyping+of+43+ferret+lymphomas+using+tissue+microarray+technology.">High-throughput immunophenotyping of 43 ferret lymphomas using tissue microarray technology.</a> Vet. Path. 44, 196-203 (2007).</li><li>Eckel-Passow, J., Lohse, C., Sheinin, Y., Crispen, P., Krco, C., Kwon, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarrays:+one+size+does+not+fit+all.">Tissue microarrays: one size does not fit all.</a> Diagn Pathol. 5, 48-57 (2010).</li><li>Lin, Y., Hatem, J., Wang, J., Quinn, A., Hicks, D., Tang, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tissue+microarray-based+immunohistochemical+study+can+significantly+underestimate+the+expression+of+HER2+and+progesterone+receptor+in+ductal+carcinoma+in+situ+of+the+breast.">Tissue microarray-based immunohistochemical study can significantly underestimate the expression of HER2 and progesterone receptor in ductal carcinoma in situ of the breast.</a> Biotech. Histochem. 86 (5), 345-350 (2011).</li><li>Wampfler, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Determining+the+optimal+numbers+of+cores+based+on+tissue+microarray+antibody+assessment+in+non-small+cell+lung+cancer.">Determining the optimal numbers of cores based on tissue microarray antibody assessment in non-small cell lung cancer.</a> J Cancer Sci. Ther. 3, 120-124 (2011).</li><li>Quagliata, L., Schlageter, M., Quintavalle, C., Tornillo, L., Terracciano, L. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+new+players+in+hepatocarcinogenesis:+Limits+and+opportunities+of+using+tissue+microarray+(TMA).">Identification of new players in hepatocarcinogenesis: Limits and opportunities of using tissue microarray (TMA).</a> Microarray. 3, 91-102 (2014).</li><li>Miettinen, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+simple+method+for+generating+multitissue+blocks+without+special+equipment.">A simple method for generating multitissue blocks without special equipment.</a> Immunohistochem. Mol. Morphol. 20 (4), 410-412 (2012).</li><li>Jones, M., Calabresdi, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Agar-gelatin+for+embedding+tissues+prior+to+paraffin+processing.">Agar-gelatin for embedding tissues prior to paraffin processing.</a> BioTechniques. 42, 569-570 (2007).</li><li>Carson, F., Hladik, C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Histotechnology: A Self-Instructional Text. , (2009).</li><li>Suvarna, S., Layton, C., Bancroft, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Bancroft&#8217;s Theory and Practice of Histological Techniques. 7th ed. , (2013).</li></ol>

יש המחברים אין לחשוף.

הכנה וניצול מוצלחת של הכתמים דורשים דבקות מקפידה כמה צעדים טכניים. היתוך של agarose hydroxyethyl צריך להיעשות לאט ובחום נמוך. התכה במהירות בחום גבוה יכולה לגרום להתמוטטות של כמה agarose פחות מתוצאות אופטימליות. בעת חיתוך תקעי הצבע-לאדן לחתיכות לעיבוד, להבטיח כי העובי של כל חתיכה ?...

היכולת להטביע דגימות רקמה מאנשים מרובים בבלוק פרפין יחיד מאפשרת השוואת Side-by-צד קל בין טיפולים ויחידים, מבטלת השתנות בין שקופיות, ומפחיתה את העלות ועומס עבודה של חתך ומכתים דגימות. בלוקים רבי רקמות אלה מיוצרים בדרך כלל כשני microarrays הרקמות (TMA) או בלוקים פרפין המכיל רקמות מאנשים רבים בפריסה הלא מערך. תחזוקה של זהות מדגם היא קריטית להצלחתו של כל ניתוח רב-רקמה. החוקרים השתמשו TMAs מאז פיתוחם כדי לשפר את היעילות של ניתוח, להפחית וריאציה בין שקופיות, לחסוך במשאבים יקרי ערך רקמה, ולהפחית את הזמן ועלות של ניסויי 1. כיוון נכון של TMAs יכול להיות מושלם תוך שימוש במגוון של שיטות, כולל רווחים, שורות או עמודות ריקות בין ליבות רקמת 2-4, הסדר סימטרי של קבוצות ליבה 3, 5 (למשל, ניהול עבודותl לעומת טיפול), ליבות &quot;מגדלור&quot; 6, וליבות אורינטציה מיועדות ממוקמות מחוץ למטריצת TMA 3. למרות ששיטות אלו עובדות היטב עבור TMAs, רוב לצרוך שטח יקר ליבת TMA וTMAs עם פערים וחללים כמזהים עלולים להיות מבלבלים כמו ליבות רקמה מותשות לאורך זמן. בנוסף, שיטות אלה אינן מתאימות לשימוש בבלוקים רב-רקמה בלי פורמט מערך כי הם מסתמכים על חריגות בדפוס הורה ההדוקה של ליבות microarray אחידות כמזהים. רוב לוקים רב-רקמה-ערוך שאינם חייבים להכיל רקמות לא אחידים ו, ​​מעצם הגדרתו, אינו מציגים את רשת המערך המובנה שגורמת סטיות אלה עומדות בתור ציוני דרך. למרות שיש יתרונות רבים לשימוש TMA, אחד החסרונות הגדולים ביותר הוא בגודל הקטן של הליבות וזה לא תמיד נציג של רקמה במידה רבה הטרוגנית 1. בלוקים רב-רקמה ערוכות שאינם מספקים רבים של tהוא היתרונות של TMA, אך מכיל דגימות רקמה גדולות יותר, או איברים שלמים ממחקרים בבעלי חיים. microarrays רקמות באמצעות ליבות יחידים ששונה התאמה עם חלקי רקמות שלמים המבוססים על החלבון של עניין ורב דורשים ליבות מרובות עבור התאמה מוגברת 7-11. בשל המורכבות והטבע הטרוגנית של כמה פנוטיפים סמן ביולוגי, TMAs באמצעות אפילו מספר גדול של ליבות (&gt; 10) עדיין יכול להיות מספק ועשויה לדרוש שיטות אחרות מאשר microarrays לניתוח 8. בנוסף, בניית TMA היא לצרוך זמן, תובעני מבחינה טכנית, ודורשת את העלות הראשונית והשקעה באו גישה לarrayer רקמה. בלוקים רב-רקמה ללא ערוכה יכולים להתבצע בכל מעבדה בסיסית עם פחות זמן ומאמץ והוא אלטרנטיבה חוקית ללימודים שדורשים יותר מאשר רקמת מערכים לאפשר או כאמצעי כדי לקצץ בעלויות ולפשט את הניתוח. בלוקים רב-רקמה-ערוך שאינו דומים דורשים אמין אוientation סמן כדי לעקוב אחר זיהוי מדגם, עם זאת, הפיתוח של סמנים אלה היה מוגבל. חלק גדול מהספרות המתארת ​​אוריינטצית רקמות מתמקד בנטייה פיזיולוגית נכונה להטבעת חתיכות רקמה בודדות, כגון קעקוע הרקמה עם דיו 12, טרום הטבעת רקמות באגרו-ג&#39;לטין לפני עיבוד 13, וסימון רקמות מסוימות עם חריצים 14 או 15 תפרים . למרות פונקציונלי, שיטות אלה אינן אידיאליים כסמנים בלוקים רבי רקמות בשל המגבלות שלהם. תפר יהיה מחולק במהירות ולא יכול להיות גלוי בכל סעיף. טרום הטבעת טכניקות באמצעות אגר-ג&#39;לטין עשוי לשמור על הרקמה בכיוון נכון בזמן עיבוד והטבעה, אך אינו מספק רמז חזותי להבחין בין דוגמאות רבות בבלוק פרפין ושקופיות. חריצים או צבע על הרקמה עלולים לסבך ניתוח או לחסום פרטים מורפולוגיים חשובים. לחלופין, זהות רקמהבגוש רב-רקמה-ערוך שאינו יכול להישמר באמצעות הטבעה של חתיכות רקמה בהסדר סימטרי, אבל זה דורש 3 או יותר חתיכות רקמה ועשוי שלא לאפשר להסדר אופטימלי של רקמות לצורך הניתוח. תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) פותח כשיטת קלה וזולה לזיהוי רקמות בלוקים רב רקמה באופן ברור ומציע יתרונות רבים על פני שיטות נטייה קיימות. הנקודה היא קטנה, צבעונית, מורכבת מליבת ג&#39;ל Hydroxyethyl agarose עיבוד וצבע סימון רקמה, והסתננה עם פרפין (איור 2 ג). ליבת המקום מוטבעת על קצה ליד רקמה יחידה בבלוק פרפין רב-רקמה ומופיעה כנקודה צבעונית בגוש ובכל סעיף (איור 1 א - ד), באופן ברור המעידה על הכיוון הנכון של הבלוק וחתכים לזיהוי רקמות קל.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0">
	<tbody>
		<tr>
			<td>HistogelTM Specimen Processing Gel</td>
			<td>Thermo Scientific</td>
			<td>HG-4000-012</td>
			<td><a href="http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html">http://www.thermoscientific.com/en/product/richard-allan-scientific-histogel-specimen-processing-gel.html&#160;</a></td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Tissue Marking Dye</td>
			<td>Triangle Biomedical Sciences, Inc.</td>
			<td>TMD-5</td>
			<td>Any tissue marking dye would most likely be sufficient.</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>Arraymold Kit A 2 mm (60 core)</td>
			<td>Arraymold</td>
			<td>20015A</td>
			<td>Any manual tissue arrayer would work similarly.</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

spot the correct tissue every time in multi-tissue blocks

בלוקים פרפין רב-רקמה לספק ניתוח תפוקה גבוה עם התייעלות, אחידות ניסיונית, וזמן מופחת ועלות. microarrays רקמות מרכיבים את רוב לוקי פרפין רב-רקמה, אבל יותר ויותר, חוקרים משתמשים בלוקים-ערוך שאינם מכילים רקמות גדולות יותר מאנשים רבים אשר יכול לספק רב של היתרונות של microarrays רקמות ללא השקעה משמעותית בתכנון ובציוד. מרכיב קריטי בכל ניתוח רב-רקמה הוא שיטת הנטייה משמשת לזיהוי כל רקמה בודדת. למרות ששיטות קיימות כדי לשמור על התמצאות וזיהוי של רקמות בלוקים רב-רקמה תקינה, רובם לא מתאימים היטב ללוקים-ערוך עישון, עשוי לצרוך שטח יקר בתוך מערך ו / או קשים לייצר במעבדה היסטולוגיה סטנדרטית. תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) הוא כלי פשוט, נמוך נטייה עלות שנראית בבירור בלוקים פרפין וכל סעיפי הרקמות FOr זיהוי דגימה אמין בפריסות ערוכות ולא ערוכים. המקום מספק יתרונות על פני שיטות נטייה קיימות בלוקים-ערוך שאינם כפי שהוא אינו דורש כל שינוי ישיר לרקמות ומאפשר גמישות בסידור של יצירות רקמה.

המקום נראה כמו סיבוב, נקודה צבעונית בבלוק פרפין (איור 1 א ו 2 ד), בכל סעיפי פרפין, ונשאר בשקופית הזכוכית בהליך צביעת H &amp; E או IHC (1B המספרים - 1D, ו2D). עזרים זה ברור חזותי קיו שני histotechnician והחוקר בזיהוי כל פיסת רקמה בודדת ומפשט תקשורת כhistotech...

Watch this Scientific Journal Video about SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks at JoVE.com

SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

המטרה של תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) היא לתפקד ככלי נטייה לסייע בזיהוי רקמה בודד בלוקים פרפין רב-רקמה. פרוטוקולים אלה מדגימים כיצד הוא נבנה בקלות מחומרי היסטולוגיה משותפות, עלות נמוכה ומשמש כסמן חזותי אמין בלוקים פרפין וחתכים.

נקודת רקמות נכונות בכל זמן בלוקים רב-רקמה

Multi-tissue paraffin blocks provide high throughput analysis with increased efficiency, experimental uniformity, and reduced time and cost. Tissue ...

spot-the-correct-tissue-every-time-in-multi-tissue-blocks

Research

JoVE Journal

Biology

11.6K Views.  Frederick National Laboratory for Cancer Research.  המטרה של תג אוריינטציה הדגימה (SPOT) היא לתפקד ככלי נטייה לסייע בזיהוי רקמה בודד בלוקים פרפין רב-רקמה. פרוטוקולים אלה מדגימים כיצד הוא נבנה בקלות מחומרי היסטולוגיה משותפות, עלות נמוכה ומשמש כסמן חזותי אמין בלוקים פרפין וחתכים. 

Video: SpOT the Correct Tissue Every Time in Multi-tissue Blocks

Actin Co-Sedimentation Assay; for the Analysis of Protein Binding to F-Actin

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates tension and helps maintains cellular shape.  Although the actin cytoskeleton is a rigid structure, it is a dynamic structure that is constantly remodeling.  A number of proteins can bind to the actin cytoskeleton.  The binding of a particular protein to F-actin is often desired to support cell biological observations or to further understand dynamic processes due to remodeling of the actin cytoskeleton. The actin co-sedimentation assay is an in vitro assay routinely used to analyze the binding of specific proteins or protein domains with F-actin.  The basic principles of the assay involve an incubation of the protein of interest (full length or domain of) with F-actin, ultracentrifugation step to pellet F-actin and analysis of the protein co-sedimenting with F-actin.  Actin co-sedimentation assays can be designed accordingly to measure actin binding affinities and in competition assays.

Proteins bind to filamentous actin (F-actin) through distinct actin binding modules. In this video we demonstrate the procedure of actin co-sedimentation, which is an in vitro assay routinely used to analyze proteins or specific domains that bind F-actin.

אקטין Co-Assay שקיעה, כי ניתוח של חלבון מחייב את ה-F-אקטין

The actin cytoskeleton within the cell is a network of actin filaments that allows the movement of cells and cellular processes, and that generates ...

Implantation of Engineered Tissue in the Rat Heart

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in common laboratory rats or mice and these quite frequently serve as an intermediate step between bench-top experiments and large animal testing or human trials. Given that rodents provide an established, cost-effective, and physiologically-relevant model system in which to test novel combinations of scaffolding materials and cells, they are particularly well-suited for cardiovascular tissue engineering studies. Presently, we describe an open-heart surgical procedure to implant engineered tissue containing myogenic progenitor cells in the atrioventricular (AV) groove of a rat heart. These implants are intended to create an electrical conduit between the right atrium and right ventricle with the ultimate goal of providing an alternative treatment to conventional pacemaker implantation in pediatric patients with complete heart block[1]. The engineered tissue is implanted in the AV-groove by means of a thoracotomy. For our purposes, Lewis rats are anesthetized and invasively ventilated to maintain positive airway pressure during the sterile surgical procedure. The approach to the heart is performed by a right thoracotomy through an antero-lateral incision at the 5th intercostal space. The tissue construct is fixed in the AV groove using a single 7-0 Prolene suture and positioned between the right ventricle and atrium at the ventral portion of the heart. The epicardium is partially removed to allow direct contact between the recipient myocardial cells and those contained in the engineered tissue. Following implantation, the chest wall is closed in layers, any pneumothorax is evacuated, and the animal is extubated and treated with analgesic.

Here, we describe a cardiac surgical procedure to implant engineered tissue in the atrioventricular (AV)-groove of an adult Lewis rat.

השתלת רקמות מהונדסות בלב החולדה

Rodent surgery is often an important component in assessing the utility of engineered tissues. A wide variety of surgical procedures can be performed in ...

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis 

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), a plant cysteine protease, by real-time label-free analysis using Biacore X100. Several cystatin B variants with point mutations in areas of interaction with papain, are produced. For each cystatin B variant we determine its specific binding concentration using calibration-free concentration analysis (CFCA) and compare the values obtained with total protein concentration as determined by A280. After that, the kinetics of each cystatin B variant binding to papain is measured using single-cycle kinetics (SCK). We show that one of the four cystatin B variants we examine is only partially active for binding. This partial activity, revealed by CFCA, translates to a significant difference in the association rate constant (ka) and affinity (KD), compared to the values calculated using total protein concentration. Using CFCA in combination with kinetic analysis in a structure-function study contributes to obtaining reliable results, and helps to make the right interpretation of the interaction mechanism.

The Importance of Correct Protein Concentration for Kinetics and Affinity Determination in Structure-function Analysis

We apply label-free protein interaction analysis using Biacore X100 for structure-function analysis of the binding of several cystatin B mutants to papain through kinetic characterization. Calibration-free concentration analysis (CFCA) measures the concentration of protein with retained binding activity without the need for a standard curve. We show that confirmation of concentrations using CFCA increases the reliability of the kinetic analysis and that kinetic constants can reliably be determined even if the activity of a recombinant protein is reduced.

חשיבותה של ריכוז חלבון נכון עבור קינטיקס וקביעת זיקה בניתוח מבנה פונקציה

In this study, we explore the interaction between the bovine cysteine protease inhibitor cystatin B and a catalytically inactive form of papain (Fig. 1), ...

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer (Agrilus planipennis) Using Quantitative Real Time-PCR

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB continues to spread rapidly and attacks ash trees of different ages, from saplings to mature trees. However, to date very little or no molecular knowledge exists for EAB. We are interested in deciphering the molecular-based physiological processes at the tissue level that aid EAB in successful colonization of ash trees. In this report we show the effective use of quantitative real-time PCR (qRT-PCR) to ascertain mRNA levels in different larval tissues (including midgut, fat bodies and cuticle) and different developmental stages (including 1st-, 2nd-, 3rd-, 4th-instars, prepupae and adults) of EAB. As an example, a peritrophin gene (herein named, AP-PERI1) is exemplified as the gene of interest and a ribosomal protein (AP-RP1) as the internal control. Peritrophins are important components of the peritrophic membrane/matrix (PM), which is the lining of the insect gut. The PM has diverse functions including digestion and mechanical protection to the midgut epithelium.

Analysis of Gene Expression in Emerald Ash Borer Agrilus planipennis Using Quantitative Real Time-PCR

Quantitative real-time PCR (qRT-PCR) is an effective tool to diagnose mRNA levels in different insect tissues and developmental stages. In this report we show the use of qRT-PCR to ascertain mRNA levels in different larval tissues and developmental stages of the invasive insect species, emerald ash borer.

ניתוח של ביטוי גנים בורר אש אמרלד ( Agrilus planipennis) באמצעות Real Time-PCR כמותי

Emerald ash borer (EAB, Agrilus planipennis) is an exotic invasive pest, which has killed millions of ash trees (Fraxinus spp) in North America. EAB ...

Quantitation of &gamma;H2AX Foci in Tissue Samples

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) processes or by exogenous factors, particularly ionizing radiation and radiomimetic compounds. Phosphorylation of the H2A histone variant, H2AX, at the serine-139 residue, in the highly conserved C-terminal SQEY motif, forming &gamma;H2AX, is an early response to DNA double-strand breaks1. This phosphorylation event is mediated by the phosphatidyl-inosito 3-kinase (PI3K) family of proteins, ataxia telangiectasia mutated (ATM), DNA-protein kinase catalytic subunit and ATM and RAD3-related (ATR)2. Overall, DSB induction results in the formation of discrete nuclear &gamma;H2AX foci which can be easily detected and quantitated by immunofluorescence microscopy2. Given the unique specificity and sensitivity of this marker, analysis of &gamma;H2AX foci has led to a wide range of applications in biomedical research, particularly in radiation biology and nuclear medicine. The quantitation of &gamma;H2AX foci has been most widely investigated in cell culture systems in the context of ionizing radiation-induced DSBs. Apart from cellular radiosensitivity, immunofluorescence based assays have also been used to evaluate the efficacy of radiation-modifying compounds. In addition, &gamma;H2AX has been used as a molecular marker to examine the efficacy of various DSB-inducing compounds and is recently being heralded as important marker of ageing and disease, particularly cancer3. Further, immunofluorescence-based methods have been adapted to suit detection and quantitation of &gamma;H2AX foci ex vivo and in vivo4,5. Here, we demonstrate a typical immunofluorescence method for detection and quantitation of &gamma;H2AX foci in mouse tissues.

Quantitation of &amp;#947;H2AX Foci in Tissue Samples

Quantitation of DNA double-strand breaks on the basis of &gamma;H2AX foci has become an invaluable tool, particularly in radiation biology, for the evaluation of tissue radiosensitivity and effects of radiation modifying compounds. Here we demonstrate the use of an immunofluorescence assay for quantitation of &gamma;H2AX foci in tissue samples.

Quantitation של γH2AX מוקדים של דגימות רקמה

DNA double-strand breaks (DSBs) are particularly lethal and genotoxic lesions, that can arise either by endogenous (physiological or pathological) ...

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes. The transparency of the 
embryos, the genetic resources, and the relative ease of transformation are qualities that make C. elegans an excellent model for early embryogenesis. Laser-based 
confocal microscopy and fluorescently labeled tags allow researchers to follow specific cellular structures and proteins in the developing embryo. For example, 
one can follow specific organelles, such as lysosomes or mitochondria, using fluorescently labeled dyes. These dyes can be delivered to the early embryo by means 
of microinjection into the adult gonad. Also, the localization of specific proteins can be followed using fluorescent protein tags. Examples are presented here 
demonstrating the use of a fluorescent lysosomal dye as well as fluorescently tagged histone and ubiquitin proteins. The labeled histone is used to visualize 
the DNA and thus identify the stage of the cell cycle. GFP-tagged ubiquitin reveals the dynamics of ubiquitinated vesicles in the early embryo. Observations 
of labeled lysosomes and GFP:: ubiquitin can be used to determine if there is colocalization between ubiquitinated vesicles and lysosomes. A technique for 
the microinjection of the lysosomal dye is presented. Techniques for generating transgenenic strains are presented elsewhere (1, 2). For imaging, embryos 
are cut out of adult hermaphrodite nematodes and mounted onto 2% agarose pads followed by time-lapse microscopy on a standard laser scanning confocal 
microscope or a spinning disk confocal microscope. This methodology provides for the high resolution visualization of early embryogenesis.

Time-lapse Microscopy of Early Embryogenesis in Caenorhabditis elegans

This article describes a technique for the visualization of the early events of embryogenesis in the nematode Caenorhabditis elegans.

זמן לשגות מיקרוסקופית של העובר בשלב מוקדם Caenorhabditis elegans

Caenorhabditis elegans has often been used as a model system in studies of early developmental processes.  The transparency of the 
embryos, the genetic ...

Manipulating the Murine Lacrimal Gland

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for vision. In the human a single LG resides in the orbit above the lateral end of each eye delivering tears to the ocular surface through 3 - 5 ducts. The mouse has three pairs of major ocular glands, the most studied of which is the exorbital lacrimal gland (LG) located anterior and ventral to the ear. Similar to other glandular organs, the LG develops through the process of epithelial branching morphogenesis in which a single epithelial bud within a condensed mesenchyme undergoes multiple rounds of bud and duct formation to form an intricate interconnected network of secretory acini and ducts. This elaborate process has been well documented in many other epithelial organs such as the pancreas and salivary gland. However, the LG has been much less explored and the mechanisms controlling morphogenesis are poorly understood. We suspect that this under-representation as a model system is a consequence of the difficulties associated with finding, dissecting and culturing the LG. Thus, here we describe dissection techniques for harvesting embryonic and post-natal LG and methods for ex vivo culture of the tissue.

The lacrimal gland (LG) is a branching organ that produces the aqueous components of tears necessary for maintaining vision and ocular health. Here we describe murine LG dissection and ex vivo culture techniques to decipher signaling pathways involved in LG development.

המניפולציה Murine דמעות בלוטת

The lacrimal gland (LG) secretes aqueous tears necessary for maintaining the structure and function of the cornea, a transparent tissue essential for ...

High-resolution Time-lapse Imaging and Automated Analysis of Microtubule Dynamics in Living Human Umbilical Vein Endothelial Cells

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes within individual endothelial cells (ECs). These processes are critical for homeostatic maintenance such as wound healing, and are also crucial in promoting tumor growth and metastasis. EC morphology is defined by the organization of the cytoskeleton, a tightly regulated system of actin and microtubule (MT) dynamics that is known to control EC branching, polarity and directional migration, essential components of angiogenesis. To study MT dynamics, we used high-resolution fluorescence microscopy coupled with computational image analysis of fluorescently-labeled MT plus-ends to investigate MT growth dynamics and the regulation of EC branching morphology and directional migration. Time-lapse imaging of living Human Umbilical Vein Endothelial Cells (HUVECs) was performed following transfection with fluorescently-labeled MT End Binding protein 3 (EB3) and Mitotic Centromere Associated Kinesin (MCAK)-specific cDNA constructs to evaluate effects on MT dynamics. PlusTipTracker software was used to track EB3-labeled MT plus ends in order to measure MT growth speeds and MT growth lifetimes in time-lapse images. This methodology allows for the study of MT dynamics and the identification of how localized regulation of MT dynamics within sub-cellular regions contributes to the angiogenic processes of EC branching and migration.

Protocols for Human Umbilical Vein Endothelial Cell (HUVEC) culture, transient transfection of fluorescently-labeled markers of microtubule growth, live-cell imaging and automated analysis of interphase microtubule growth dynamics are detailed.

זמן לשגות הדמיה ברזולוציה גבוהה וניתוח אוטומטי של Dynamics microtubule In Living האדם טבורי וריד לתאי אנדותל

The physiological process by which new vasculature forms from existing vasculature requires specific signaling events that trigger morphological changes ...

Dissection of the Auditory Bulla in Postnatal Mice: Isolation of the Middle Ear Bones and Histological Analysis

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called the auditory bulla houses the ossicles, whereas the auditory capsule encloses the inner ear, namely the cochlea and semicircular canals. Murine ossicles are essential for hearing and thus of great interest to researchers in the field of otolaryngology, but their metabolism, development, and evolution are highly relevant to other fields. Altered bone metabolism can affect hearing function in adult mice, and various gene-deficient mice show changes in morphogenesis of auditory ossicles in utero. Although murine auditory ossicles are tiny, their manipulation is feasible if one understands their anatomical orientation and 3D structure. Here, we describe how to dissect the auditory bulla and capsule of postnatal mice and then isolate individual ossicles by removing part of the bulla. We also discuss how to embed the bulla and capsule in different orientations to generate paraffin or frozen sections suitable for preparation of longitudinal, horizontal, or frontal sections of the malleus. Finally, we enumerate anatomical differences between mouse and human auditory ossicles. These methods would be useful in analyzing pathological, developmental and evolutionary aspects of auditory ossicles and the middle ear in mice.

We present a protocol to isolate the auditory bulla, capsule, and ossicles from postnatal mice for whole mount and histological analysis.

דיסקציה של בולה השמיעה של עכברים אחרי לידה: בידוד של עצמות באוזן התיכונה ניתוח היסטולוגית

In most mammals, auditory ossicles in the middle ear, including the malleus, incus and stapes, are the smallest bones. In mice, a bony structure called ...

Adipo-Clear: A Tissue Clearing Method for Three-Dimensional Imaging of Adipose Tissue

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte precursors, immune cells, fibroblasts, blood vessels, and nerve projections. Although the molecular control of cell type specification and how these cells interact have been increasingly delineated, a more comprehensive understanding of these adipose-resident cells can be achieved by visualizing their distribution and architecture throughout the whole tissue. Existing immunohistochemistry and immunofluorescence approaches to analyze adipose histology rely on thin paraffin-embedded sections. However, thin sections capture only a small portion of tissue; as a result, the conclusions can be biased by what portion of tissue is analyzed. We have therefore developed an adipose tissue clearing technique, Adipo-Clear, to permit comprehensive three-dimensional visualization of molecular and cellular patterns in whole adipose tissues. Adipo-Clear was adapted from iDISCO/iDISCO+, with specific modifications made to completely remove the lipid stored in the tissue while preserving native tissue morphology. In combination with light-sheet fluorescence microscopy, we demonstrate here the use of the Adipo-Clear method to obtain high-resolution volumetric images&#160;of an entire adipose tissue.

Due to the high lipid content, adipose tissue has been challenging to visualize using traditional histological methods. Adipo-Clear is a tissue clearing technique that allows robust labeling and high-resolution volumetric fluorescent imaging of adipose tissue. Here, we describe the methods for sample preparation, pretreatment, staining, clearing, and mounting for imaging.

Adipo-ברור: רקמה ניקוי שיטה עבור הדמיה תלת-ממדית של רקמת שומן

Adipose tissue plays a central role in energy homeostasis and thermoregulation. It is composed of different types of adipocytes, as well as adipocyte ...