This work was supported by NIH grant F32DK091998 to CNK; NIH grant RO1DK041071 and Harvard Stem Cell Institute grant D001229 to IAD. The authors thank Neil Hukriede for the lhx1ain situ probe.

참고 : 윤리 문 : 모든 실험 연구에서 동물 사용에 대한 매사 추세 츠 종합 병원의 지침에 따라 실시 하였다. 1. 사전 준비 <ol><li> 얼마나 많은 성인 제브라 피쉬 6-12개월 이전을 다치게 결정합니다. 계획은 필요한 것보다 10 내지 20 %의 더 많은 물고기를 손상한다. 변동성을 최소화하기 위해, 사용 연령은 대략 동일한 크기 및 작은 유전 적 다양성을 갖도록 동일한 탱크에서 함께 자란 형제 물고기 유사한. 여성 물고기 인해 복부의 더 큰 용량, 남성 물고기에 비해 주입하는 것이 훨씬 쉽다. 그러나 남성과 여성이 비슷한 결과를 제공합니다. </li><li> 처음 실험을 수행 할 때, 고기의 특정 균주에 적절한 겐타 마이신 투여를 결정 도즈 곡선을 플롯. 겐타 마이신의 순도가 일괄 배치에 따라 다릅니다 때문에 실험에 사용하기 전에 겐타 마이신의 각각의 새로운 배치를 테스트합니다. 적절한 투여 량은 expressi을 평가하여 결정되어야한다같은 lhx1a으로 부상 마커에. (- D 그림 1A 참조). </li><li> 겐타 마이신 솔루션을 준비합니다. 젠타 마이신 스톡 용액을 -20 ° C에 저장되고 나중에 사용하기 위해 해동 될 수있다. 예를 들어, 0.5 g의 무게 물고기 80 ㎎ / ㎏ 용량 (체중의 80 mg을 겐타 마이신이 / ㎏)을 위해, 편리한 작업 솔루션으로 인산 완충 식염수에 겐타 마이신의 2 ㎎ / ㎖을 준비합니다. 이 물고기에 복강 내 주사에 대한 겐타 마이신의 20 μl를 제공합니다. 주 : 일반적으로 80 ~ 120 ㎎ / ㎏ 적절할 수 40 밀리그램 / kg 정도로 낮은 양호한 결과이지만 용량을 달성한다. 겐타 마이신은 실험실 직원에게 위험 노출을 최소화하기 위해 솔루션에서 구입하실 수 있습니다. 참고 : 고용량의 겐타 마이신 독성이 될 수 있습니다. 장갑을 착용하고 분말을 계량 할 때 마스크. </li><li> 물고기를 마취에 대해 0.016 %의 tricaine의 물 100ml를 준비합니다. 사용까지 4 ℃에서 pH를 7 점으로 조정 멸균 한 MilliQ 물에 용해 tricaine (4g / 1 리터)의 25 배 재고를 준비합니다. 4m를 희석0.016 %의 작업 농도 물고기 물 100ml에 L. 참고 : 처리 할 때 Tricaine는 마취 및 피부 자극성, 장갑을 착용하십시오. </li><li> 물고기는 국자 모양으로 전구를 절단 물을 배수하기 위해 바닥에 2 슬롯을 절단 플라스틱 전송 피펫에서 특종합니다. 준비된 겐타 마이신 용액 (10 μL 계조와) 부하 1 ㎖ 주사기와는 30½ G 바늘을 연결합니다. 공기 방울을 제거합니다. 바늘의 각도 팁 멀리 직면하고 주사기 표시 앞으로 읽을 직면하고 있는지 확인하기 위해 주사기 바늘을 트위스트. 제어 주사를 들어, 멸균 PBS로 주사기와 바늘을 준비합니다. </li><li> 깨끗한 표면에 스케일을 준비하거나 물고기를 건조 및 사출을위한 물고기를 잡고위한 보트뿐만 아니라 종이 타월 무게. </li><li> 관찰 하룻밤 후 주입 물고기를 잡고위한 뚜껑 개인의 작은 반 리터의 용기를 준비합니다. 작은 투명 플라스틱 결합 케이지는이 목적을 위해 유용하다. 이들용기는 흰색해서는 안 - 물고기 창고 흰색 상피 캐스트 검은 벤치 위에 관찰 할 수 있도록 이상적으로 그들이 명확해야한다. 물고기가 편안하게 수영을 충분히 물고기 물 각 컨테이너를 채 웁니다. </li></ol> 겐타 마이신 2. 복강 내 주사 <ol><li> 물고기 물에 0.016 %의 tricaine 용액 물고기 마취. 느리게하는 아가미 환기율에 대해 더 이상 터치 응답하지 물고기를 기다립니다. </li><li> 아가미 또는 지느러미 부상을 방지하기 위해 꼬리를 향해 머리에서 이동, 물고기 국자를 사용하여 물고기를 특종. 옆으로 부드럽게 물고기를 돌려 과잉의 물을 흡수하고 특종 여분의 물을 흔들어 종이 타월에 물고기를 놓습니다. </li><li> 다시 물고기를 특종 및 제로화 규모에 무게 보트에 배치하고, 물고기의 무게. 가장 가까운 0.25 g의 라운드, 그리고 주입하는 겐타 마이신의 적절한 양을 계산합니다. 참고 : 0.5 g의 물고기 8에서 20 μL 주입을 사용0 ㎎ / ㎏ 투여. </li><li> 다시 물고기를 특종 마른 접힌 종이 타월에 놓습니다. 오른손을 사용하여 주입하는 경우, 왼쪽 손에 종이 타월을 잡고 배를 쉽게 접근 할 수와 생선의 머리는 왼쪽을 가리키는 놓습니다. </li><li> 배설강에 배의 피부, 전방에 45 ° 각도로 바늘과 주사기를 잡습니다. 피부 바로 아래에 바늘을 밀어 다음 각도를 줄이고 내부 장기를 피하고, 피부 아래 앞으로 바늘을 밀어 넣습니다. 다음 바늘을 철회, 어떤 액체가 바늘 주위에 배출되지 않는 확인하기 위해 일시​​ 정지, 플런저에게 적절한 양의 우울. 물고기가 지속적으로 유지하는 것은 문제가있는 경우, 몸통에 대한 중괄호 팔꿈치를 안정. 참고 : 겐타 마이신 솔루션을 취급 할 때는 장갑을 착용 할 것. </li><li> 개별 용기에 각각의 물고기를 삭제합니다. 물고기를 관찰하고 마취로부터의 회복을 보장합니다. 28.5 ° C에서 물고기를 밤새 보관하십시오. 주 : 생선 즉시 회복되지 않는 경우, 트랜스의 플라스틱을 사용그 아가미 그것을 부활을 통해 FER 피펫 물을 관개한다. </li><li> 겐타 마이신의 동일 투여 여러 물고기를 주입 할 때 같은 주사기와 바늘을 사용합니다. 적절한 생물 학적 날카로운 물건 용기에 사용 된 주사기와 바늘 폐기하십시오. </li></ol> 상해 3. 포스트 사출 관측 <ol><li> 다음 날 (1 일 게시물 부상), 어두운 화면에서의 용기에 주입 된 물고기를 놓습니다. 부상당한 물고기 배설 죽은 상피 조직의 화이트 캐스트는 볼 수 있어야합니다. (- H 그림 1E 참조). 더 캐스트,이 없으면 어느 물고기 겐타 마이신 주입 부상되지 않았다 (도즈 하나 너무 낮은, 또는 사출 과정에서 유출 젠타 마이신의 일부) 또는 물고기가 심하게 요관 배설강의 완전한 폐색을 초래 부상 괴사 된 조직으로. 참고 : 물고기는 보통 2-3일 내에 죽을 몸에서 캐스트를 취소 할 수 없습니다와 이상에 대한 따라서 사용할 수없는 경우분석. 어떤 캐스트를 볼 수없는 경우, 아가미의 움직임이 정지 된 후 적어도 10 분 동안 침지 tricaine 물에 물고기를 안락사. </li><li> 흰색 조직 캐스트를 볼 수있는 경우를 제외하고 물고기를 설정하고 다른 물고기를 계속 검사. 겐타 마이신의 적절한 용량은 사용할 수있는 물고기 80 ~ 90 %가 발생합니다. 부상당한 물고기를 풀 한 다음 원하는 경우 다른 치료 그룹으로 분할합니다. </li></ol> 복구 물고기 4. 케어 <ol><li> 깨끗한 물과 한적한 환경에서 물고기를 유지합니다. 더러운 물과 밀집는 감염과 의도하지 않은 죽음으로 이어질 것입니다. 가능하면 매일 물을 더 이상 6보다 물고기 / 물고기 물 500㎖를 주기적으로 변경하려고합니다. 참고 :이 공간의 보존 또는 조사 비싼 약물 치료를 사용하여 실험을 수행하고자하는 경우 최소 볼륨입니다. </li><li> 삼일이 부상을 게시 할 때까지 물고기를 먹이를하지 마십시오. 복구 물고기는 처음에는 식사를하지 않으며, 탱크의 모든 음식은 분해 박테리아 GR을 촉진owth. 삼일에 부상을 게시 시작, 하루에 한 번 소량의 먹이를. </li></ol> 부상 신장 5. 분석 <ol><li> lhx1a의 mRNA 발현에 대한 현장 하이브리드의 경우, 신장이 원하는 시점들에서 물고기에서 수확 할 수있다. 아가미의 움직임이 멈출 때까지 얼음에 tricaine 물에 적어도 10 분 물고기를 안락사, 다음 면도날로 머리를 제거하고 뱃속을 열고 집게와 내부 장기를 제거합니다. </li><li> 장소 (지느러미 본체 벽에 부착 된 색소 기관)의 신장을두고 하룻밤 PBS에 4 % 파라 포름 알데히드에서 물고기를 수정합니다. 신장 (15)을 해부 및 현장 하이브리드 표준을 계속합니다. <ol><li> 간략하게, 실온에서 1 시간 동안 프로 테이나 제 K에 PBST (10 μg의 / ㎖)으로 투과성이 PBST (인산염 완충 식염수, 0.5 % 트윈 20)에서 신장 씻는다. 4 % 파라 포름 알데히드와 후 수정 및 PBST로 다시 세척 하였다. </li><li> 그런 다음 68에서 하룻밤 신장을 사전 하이브리드혼성화 완충액 (50 % 포름 아미드, 5 배 SSC, 50 μg의 / ㎖ 헤파린, 500 μg의 / ㎖ tRNA는 0.1 % 트윈 20, pH를 6.0)에서 C °. </li><li> 혼성화 완충액 제닌 표지 프로브와 샘플을 인큐베이션 한 후 68 ° C에서 100 %, 75 %, 50 %, 25 % 혼성화 완충액으로 5 내지 10 분 동안 각각 세척 한 다음, 실온으로 옮겨 30 분으로 두 번 씻어 배 0.1 % 트윈 20와 SSC, 0.1 % 트윈 20와 0.2 배씩 SSC와 30 분 동안 두 번 씻는다. </li><li> MAB의 샘플 3 배 5 분 (0.1 M 말레 산, 0.15 M의 NaCl, pH를 7.5) 10 % 염소 혈청과 MAB 4 ℃에서 하룻밤 차단 평형. 그리고 안티 - 디그 옥시 제닌 AP 팹 1에서 하룻밤 샘플을 품어 : 5,000 MAB에. </li><li> MAB 1 시간 동안 샘플 5 배를 세척하고, NTMT 15 분 (0.1 M 트리스 pH9.5, 0.05 M의 MgCl 2, 0.01 M의 NaCl, 50 μL 트윈 20)에 대해 3 배를 평형. </li><li> 그런 다음 신호를 감지하는 NBT / BCIP와 신장을 취급합니다. 4 % 파라 포름 알데히드와 신장을 수정하고 레모 디메틸 포름 아미드 배양탈 물에 하룻밤 표백 NBT / BCIP는, 초과했습니다. 신장을 세척 한 후 커버 슬립에서 50 % 글리세롤과 PBST에서 촬영. </li></ol></li></ol>

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Q., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+of+adult+nephron+progenitors+capable+of+kidney+regeneration+in+zebrafish.">Identification of adult nephron progenitors capable of kidney regeneration in zebrafish.</a> Nature. 470, 95-100 (2011).</li><li>Lopez-Novoa, J. M., Quiros, Y., Vicente, L., Morales, A. I., Lopez-Hernandez, F. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=New+insights+into+the+mechanism+of+aminoglycoside+nephrotoxicity:+an+integrative+point+of+view.">New insights into the mechanism of aminoglycoside nephrotoxicity: an integrative point of view.</a> Kidney Int. 79, 33-45 (2011).</li><li>Hentschel, D. 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The authors have no competing financial interests to disclose.

제브라 피쉬는 성인 mesonephric 신장 (6)를 포함하여 성인 장기의 재생을 공부에 이상적입니다. 최근의 연구는 더 나은 네프론 재생 과정에서 발생하는 단계의 특성을 분자 마커 및 새로운 유전자 변형 기자 라인의 장점을 촬영하고 7,12 책임 어떤 세포 수 있습니다. 비뇨기 캐스트 관찰 인간 16 신장 질환을 진단 세기 이상 동안 사용되어왔다. 여기에서 우리는 겐타 마이신 주?...

신장은 신체로부터 유체 항상성, 혈압 조절과 폐기물의 여과에 필수적이다. 포유 동물이 부상 차별화 된 상피 세포 1-4 사용 후 기존 네프론을 복구 할 수 있지만, 그들은 예약 된 줄기 세포 5의 풀을 결여하는 것, 새로운 네프론 드 노보를 형성 할 수 없습니다. 포유류 달리 성어 부상 6,7에 물고기의 성장 및 응답을 지원하는 성인 일생 동안 새로운 네프론을 형성 할 수있다. 제브라 피쉬, 다니오 레 리오 (rerio)는, 장기 재생 8-10의 연구를위한 귀중한 모델 생물과 인간의 신장의 수리 공학 응용 프로그램에 강력한 통찰력을 제공 할 수있는 잠재력을 가지고있다. Tg는 (Lhx1a : EGFP) 유전자 (11) 그러나, 성인 zebrafish의 신장 (12)에 부상에서 R + 세포 lhx1a의 응답을 제어하는 메커니즘을 네프론의 선조 세포의 풀 라벨을 도시 한분명이 메인. 아미노 글리코 사이드 겐타 마이신은 인간 13 알려진 신 독성 및 ototoxic 효과로 널리 사용되는 항생제이다. 겐타 마이신의 복강 내 주사는 물고기 6 급성 신장 손상을 유도 설립 방법이다. 물고기 모방에서이 부상 관 상피 세포와 과다 복용 14 젠타 마이신 후 인간에서 발생하는 사구체의 흉터의 손실. 겐타 마이신 주사 제브라 피쉬에 부상을 유도하는 것은 생산 된 많은 새로운 네프론으로, 강한, 동기 재생 반응을 유도하고 동시에 형성, 증식과 분화의 단계를 통해 진행하는 편리한 방법입니다. 이 프로토콜은 특이점을 최소화하기 위해 비 침습적 영상 심사 과정을 이용하여 성인 zebrafish의 신장에 강력하고 재현 부상에 대한 우리의 방법을 자세히 설명합니다. 우리는 겐타 마이신과 부상 상피 신장 조직과 형식의 죽음에 이르게한다는 사실을 활용다음 mesonephric 덕트 및 배설강에서 대중에 축적 신 세뇨관 캐스트의 이온. 이러한 어류로 전달되고 물에 육안으로 관찰 할 수있다. 이것은 우리가 다음 추가 실험을 위해 풀링 할 수 있습니다 강력한 치명적 부상, 생선을 선별 할 수 있습니다. 그들은 실험의 종점보다 균일하고 효율적으로 데이터를 수집 및 분석에 이르게 도달하기 전에 손상되지 않은 다이 물고기 또는 물고기의 숫자를 최소화한다. 또한, 특별한 장치 나 시약은 교육 또는 교육 환경에서 사용하기 위해이 방법을 비용 효율적이고 적절하게, 필요하지 않습니다. 우리의 방법을 사용하여, 여기에 우리가 신장 재생에 겐타 마이신 투여 량의 증가 효과뿐만 아니라 온도 상승의 효과를 보여줍니다.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="726">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">Name of Material/ Equipment</td>
			<td style="width:101px;">Company</td>
			<td style="width:119px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:291px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">gentamicin sodium sulfate</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">G1264</td>
			<td>TOXIC, purity varies from batch to batch</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:216px;">plastic transfer pipets</td>
			<td style="width:101px;">Fisher</td>
			<td style="width:119px;">13-711-7M</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">1 ml Norm-Ject syringes</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">72520</td>
			<td>green plastic syringes, ordinary 1ml syringes are OK, but harder to read accurately</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:216px;">30G1/2 needles</td>
			<td style="width:101px;">Becton Dickinson</td>
			<td align="right" style="width:119px;">305106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">ethyl 3-aminobenzoaate methanesulfonate salt (tricaine)</td>
			<td style="width:101px;">Sigma</td>
			<td style="width:119px;">A5040</td>
			<td>IRRITANT</td>
		</tr>
		<tr height="63">
			<td height="63" style="height:63px;width:216px;">16% paraformaldehyde</td>
			<td style="width:101px;">Electron Microscopy Sciences</td>
			<td align="right" style="width:119px;">15710</td>
			<td>Make 4% in 1xPBS for working solution</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

kidney regeneration in adult zebrafish by gentamicin induced injury

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is the nephron. Mammals are able to repair existing nephrons after injury, but lose the ability to form new nephrons soon after birth. In contrast to mammals, adult fish produce new nephrons (neonephrogenesis) throughout their lives in response to growth requirements or injury. Recently, lhx1a has been shown to mark nephron progenitor cells in the adult zebrafish kidney, however mechanisms controlling the formation of new nephrons after injury remain unknown. Here we show our method for robust and reproducible injury in the adult zebrafish kidney by intraperitoneal (i.p.) injection of gentamicin, which uses a noninvasive visual screening process to select for fish with strong but nonlethal injury. Using this method, we can determine optimal gentamicin dosages for injury and go on to demonstrate the effect of higher temperatures on kidney regeneration in zebrafish.

젠타 마이신 부상은 물에서 신장 상피 캐스트의 관찰 (도 1)에 의해 시각적으로 확인할 수있다. 겐타 마이신의 다른 용량은 재생 신장 lhx1a + 세포 집합체 (- D 그림 1A)의 수를 증가의 결과로, 성인 야생형 TuAB의 제브라 피쉬를 손상하는 데 사용되었다. 화이트 캐스트 쉽게 손상 후 물 일일 (- H도 1E)에서 볼 수있다. 고용량 물고기 갖는 캐스트 (그림 1I...

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Kidney Regeneration in Adult Zebrafish by Gentamicin Induced Injury

Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons.

겐타 마이신 유도 부상으로 성인 Zebrafish의에서 신장 재생

The kidney is essential for fluid homeostasis, blood pressure regulation and filtration of waste from the body. The fundamental unit of kidney function is ...

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

10.7K 조회수.  Massachusetts General Hospital. Here we present a reliable method to study adult kidney regeneration by inducing acute kidney injury by gentamicin injection. We show that injury is dependent on gentamicin dosage and environmental temperature using in situ hybridization to label lhx1a+ developing new nephrons. 