אנו להכיר הנג לין לחלומות כריס פטון, פטרינה ג'ונסון, קלייר Doig על תרומתם לפיתוח שיטות התחזוקה שלנו המושבה, שלושה אנונימיים בודקים עבור שלהם הצעות אשר עזר לשפר את כתב היד. המחקר שלנו נתמך על-ידי תוכנית גרנט מלגת אל תסמכו עלי הבריאות הלאומי, מועצת המחקר הרפואי ותרגום מענק של טרסט. סעיף זה נמען של הכשרה מחקר הממשלה האוסטרלית תוכנית מלגה.

דם האכלה של יתושים בנושאים האנושית אושרה על ידי אוניברסיטת מלבורן ועדת האתיקה האנושית (אישור #: 0723847). כולם מתנדבים בתנאי הודיע הסכמה בכתב.
1. זחל לגידול
הערה: יתושים נערכים 26 ± 0.5 ° C ו- 50-70% לחות יחסית, עם photoperiod h (בהירה: כהה) 12:12 עבור פרוטוקול תחזוקה זה המושבה. תנאים אלה דומים הממוצע לתנאי האקלים באוסטרליה, קיירנס, בטווח תרמי מיטבי עבור Ae. aegypti הישרדות, פיתוח44,45,46. טמפרטורות גבוהות יכול לגרום לאובדן של זיהומים Wolbachia מן המושבות נגד יתושים, נמנעה47. אנו מקפידים על יחידים לפחות 500 לכל האוכלוסייה כדי למזער את נישואי קרובים; שמירה על מושבות של גודל קטן יותר יכולות להיות השלכות כושר [רוס. et al. לא פורסם]. תחת תנאים אלו בהנחה תזונה נאותה, הזמן הדור הממוצע הוא 28 ימים (ראה טבלה 1).
<ol><li>להטביע את הביצים על המצע במגשים (איור 1 א') המכיל 3 לליטר מים (מים אוסמוזה הפוכה או מי ברז בגילאי, שנוצר על ידי השארת ברז במגשים עבור 24 שעות לפני השימוש), ~ 300 מ"ג מזון דגים (אחד כתוש לוח, ראה טבלה של חומרים) ו- a כמה גרגרי שמרים יבשים פעילים לזירוז הבקיעה48.</li>
	<li>יום אחד לאחר הבקיעה, להשתמש פיפטה מזכוכית כדי להעביר כ 500 הזחלים המגשים המכילים 4 ליטרים של מים (איור 1B), נחשב באמצעות מונה השלט. להוסיף שתי טבליות מזון דגים כתוש בכל מגש. אם יש צורך, להשתמש מיכלים בגדלים שונים לגידול הזחלים (איור 1 א'), אך לשמור על צפיפות זחל מתחת הזחלים 0.5/mL כדי למנוע צפיפות יתר.</li>
	<li>בדוק את המגשים מדי יום כדי לוודא הזחלים אין די מזון; להוסיף כ שתי טבליות מזון המגשים בכל יומיים. לספק מזון ad libitum אך להבטיח 0.5 מ"ג ליום/זחל הינו זמין במהלך תקופה זו כדי להבטיח פיתוח באופן סינכרוני ועל גוף בגודל מתאים, אחרת עלול להיות מבולבל את התוצאות של הניסויים (ראה תוצאות נציג).</li>
	<li>לטפל כדי למנוע את overfeeding של הזחלים, במיוחד בתוך מכולות גידול קטן יותר עם פחות מים פני השטח והנפח. אם המים נראה מעונן או אם יש תמותה זחל משמעותית, להחליף אותו עם מים מתוקים; התמותה צריך להיות זניחה אם הזחלים ניזונים בצורה אופטימלית.</li>
</ol>2. הבוגרים
הערה: הזחלים יתחיל pupate של חמישה ימים לאחר הבקיעה אם שתאכל היטב, הרוב צריך pupate על ידי שבעה ימים לאחר הבקיעה. מבוגרים יתחיל המתעוררים כ יומיים לאחר להתגלמות אם מתוחזק בצורה אופטימלית בטמפרטורה 26 ° C (ראה תוצאות נציג). התפתחות הזחל אינו מושפע בדרך כלל על ידי זיהומים Wolbachia כאשר מזון מסופק39,23,49.
<ol><li>שבעה ימים לאחר הבקיעה שופכים את כל התוכן של המגש דרך רשת קנס (נקבוביות בגודל 0.4 מ מ). לשמור את הזחל מים מסוננים לשימוש מאוחר יותר ovicups (ראו סעיף "דם האכלה, הטלה"). להפוך את רשת השינוי וטובל לתוך מיכל פלסטיק עם 200 מ של מים כדי להעביר את הגלמים. לספק מזון נוסף אם יישארו כל הזחלים.</li>
	<li>הכינו את הכלובים הבוגרים (איור 1C) על ידי מתן שתי כוסות 10% סוכרוז הפתרון (איור 1F) שתי כוסות צמר גפן לחה כדי למנוע לייבוש (איור 1E).</li>
	<li>אם הגלמים אין צורך למיין לפי מין, למקם את המכולות מכסה של הגלמים לתוך הכלוב ולא להשאיר את המכסה במקצת כדי לאפשר המבוגרים להסתמן לתוך הכלוב. לחלופין, הצב של משפך מהופך מעל המיכל כדי למזער את טובעת. ודא שכולנו מבוגרים הופיעו לפני הסרת הגורם המכיל מן הכלוב כדי למנוע בחירה נגד המפתחים איטי.</li>
</ol>3. הגולמי סקסיייי עבור Outcrossing
<ol><li>אם הגלמים צריך להיות ממוין לפי מין (למשל, עבור outcrossing), pipette הגלמים מ מגשים זחל ולהפריד בין המינים (איור 2) לתוך מיכלי פלסטיק (איור 1 א') עם 200 מ של מים בכל 24 שעות עד המספר הרצוי מכל מין הגיעה. במקום המכסים על המכולות ולהשאיר אותן סגורות.</li>
	<li>מבוגרים יתעוררו לתוך המכולות; לאשר את מינם לפני שחרור לתוך הכלובים (איור 2C). הסר מבוגרים למינים באופן שגוי עם העצמות בתוך 24 שעות של הופעתה לפני שהם מגיעים לבגרות מינית. ברגע המינים אושרו, שחרור המבוגרים לתוך הכלובים כל 24 שעות.</li>
	<li>
להשיג Wolbachia-נגועים מושבות רקע גנטי דומה לאוכלוסייה הטבעית, outcross על-ידי הוספת Wolbachia-נגוע הנקבות מן המושבות מעבדה לכלובים של הזכרים נגוע נגזר מן הביצים שנאספו על ידי ovitraps ב שדה39, שמירה על הצפיפות שנקבעה של יחידים 500 לכל האוכלוסייה.
	<ol>
<li>חזור על outcrossing לפחות שלושה דורות רצופים לייצר מושבות דומה גנטית האוכלוסייה שדה39לפחות 87.5%. קריטית: להבטיח כי המינים נכונים בשלב זה (ראה שלב 3.1).</li>
	</ol>
</li>
	<li>נקבה aegypti Ae. הם בדרך כלל דברים מעוותים הזרעה נוספת בטווח של הזדווגות50שעות. כאשר outcrossing מושבות, מאפשרים את נקבות וזכרים בוגרים בכלובים נפרדים במשך יומיים, ואז האחות הנקבות לתוך הכלוב זכר לספק הזדמנות שווה כל הזכרים.</li>
</ol>4. דם האכלה, ההטלה
<ol><li>
המתן לפחות שלושה ימים לאחר שהנקבה האחרונה התפתחה לפני דם האכלה כדי לאפשר מספיק זמן להבשיל. דם להאכיל הנקבות תוך שבועיים של הופעתה כדי למנוע תמותת יתר, במיוחד עבור יתושים עם זיהומים Wolbachia המשפיעים לרעה על אריכות ימים22,24,49. הסר את כוסות סוכר ביום שלפני האכלה כדי לשפר את שיעורי האכלה.
	<ol>
<li>בקש מתנדבים כדי להוסיף את האמה שלהם לתוך הכלוב כדי לאפשר את היתושים הנשי להאכיל. רוב הנקבות צריך להאכיל כסיגנל בתוך 5 דקות, אבל כדי לצמצם את הבחירה נגד מזיני איטי, להשאיר האמה בכלוב במשך 15 דקות, או עד כל הנשים מתפקעים בעליל; כפפת לייטקס על היד מפני עקיצות הוא אופציונלי אך מומלץ.</li>
		<li>יומיים לאחר דם האכלה, מניחים שתי כוסות פלסטיק המכיל הזחל מים לגידול והעמידו עם רצועת נייר זכוכית (איור 1 ג'י) (או נייר סינון (איור 1 H)) לתוך הכלוב לנקבות להטיל ביצים. חלקית להטביע את רצועת נייר זכוכית במים כדי לשמור על לחות. הסר את מקורות אחרים של מים כדי למנוע הנקבות הנחת את ביציהן בחוץ בגביע ההטלה. הערה: ניתן להשתמש במי ברז בגביע, אבל חינוך הזחל מים מעודדת ההטלה51,52 , הנקבות להטיל את ביציהם יותר באופן סינכרוני.</li>
	</ol>
</li>
</ol>5. ביצה אוסף, מיזוג
<ol><li>הנקבות להטיל ביצים על מה בדיוק מעל קו המים; לאסוף ולהחליף את הרצועות של נייר זכוכית מדי יום עד אין יותר הביצים מוטלות. הערה שהטלה הזה עשוי להמשך עד שבוע.</li>
	<li>סביר להניח שאני חלקית יבש רצועות על ידי בעדינות סופג אותן על מגבת נייר ל 30 s, מטפל לא להוציא את הביצים. לאחר מכן, לעטוף את הרצועות בסדין של מגבת נייר יבש ומניחים אותו לתוך שקית ניילון sealable (איור 1I).</li>
	<li>בדוק את המצב של הביצים במיקרוסקופ ויבתר (איור 3). אם רצועות נייר זכוכית הם רטובים מדי, ייתכן בוקעות לפני להיות שקוע בתוך המים (איור 3B), אבל אם מיובש בקשיחות, ביצים עשויה לקרוס (איור 3C).</li>
	<li>הביצים ניתן לתכנון בכל עת מעבר אוסף שלאחר שלושה ימים; יבקעו כל הביצים מהמושבה לכל, שנאספו לרוחב כל הימים, באותה אריזה של מים על מנת להבטיח כי הדור הבא נדגמים מתוך מאגר גדול, אקראית של אנשים.</li>
	<li>לאחסון לטווח ארוך, לשמור את הביצים בתוך מיכל חתום על לחות גבוהה (> 80 אחוז) בסביבות 20 מעלות צלזיוס. בתנאים אלה, ניתן לאחסן ביצים ללא Wolbachia במשך מספר חודשים תוך שמירה על הפתח גבוהה המחירים53,54.</li>
	<li>כמו כמה זיהומים Wolbachia לצמצם במידה ניכרת את הכדאיות של ביצים עם גיל49,55, לדגור על הביצים מפני Wolbachia-נגוע קווים בתוך שבוע אחד של אוסף כדי למנוע תמותה מופרז עבור הרלוונטי זנים. דם להאכיל הנקבות שוב אחרי שבוע אם ביצים יותר יש צורך.</li>
</ol><table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>היום</td>
			<td colspan="3">שלב</td>
		</tr>
<tr>
<td>0</td>
			<td colspan="3">הפתח ביצים</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td colspan="3">ספירת הזחלים במגשים</td>
		</tr>
<tr>
<td>7</td>
			<td colspan="3">להעביר את הזחלים, גלמי המושבה בכלובים</td>
		</tr>
<tr>
<td>17</td>
			<td colspan="3">דם להאכיל בוגרות</td>
		</tr>
<tr>
<td>21</td>
			<td colspan="3">בגין איסוף ביצים</td>
		</tr>
<tr>
<td>25</td>
			<td colspan="3">סיום איסוף ביצים</td>
		</tr>
<tr>
<td>28</td>
			<td colspan="3">הפתח ביצים</td>
		</tr>
</tbody></table>טבלה 1: סקירה של לוח הזמנים תחזוקה של המושבה Ae. aegypti בגיל 26 מעלות צלזיוס העיתוי של הדם-ההזנה הנשי, את הבקיעה ביצים הוא גמיש, אבל המשכים ארוכים בשלבים אלה יש להימנע, במיוחד עבור יתושים נגועים Wolbachia, על מנת לצמצם את התמותה. בעקבות לוח זמנים זה ממזער את הבחירה נגד יתושים המהווים מהירה או איטית לפתח או בוגר בכל שלבי החיים, ובלבד הזחלים ניזונים בצורה אופטימלית.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig1.jpg"> איור 1: ציוד המשמש לגידול Ae. aegypti במעבדה. מיכלי פלסטיק (א), המשמש עבור ביצים או לגידול הזחלים עם אמצעי אחסון של 500, 750 ו- 5,000 mL (משמאל לימין). מגשים (B) המשמש לגידול הזחלים על צפיפות מבוקרת, בדרך כלל 500 הזחלים ב- 4 ליטרים של מים. (ג) 19.7 L ו- (D) 3 L כלובים המשמש עבור דיור למבוגרים. צפיפות של מבוגרים 25 או פחות לליטר צריך להישמר לספק מספיק שטח פנוי. (E) 35 מ ל כוס עם צמר גפן לח סיפק כמקור מים למבוגרים. (F) 35 מ ל גביע עם סוכרוז פתרון מסופקים באמצעות כבל או הפתיל שיניים כמקור של סוכר. (HG–) כוסות מלאות מים לגידול זחל, הרצוף המצע ההטלה של נייר זכוכית או נייר סינון (G ו- H, בהתאמה). (אני) Zip-lock תיק לאחסון של רצועות נייר זכוכית או נייר סינון כתמים שחורים על נייר זכוכית הם יתושים ביצים. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig2.jpg"> איור 2: לרוחב (א) ו הגבי (ב) נופים של הגלמים למבוגרים Ae. aegypti (ג) הממחיש את דו-צורתיות. זכרים ממוקמות בצד ימין וגם נקבות מצד ימין של כל לוח. כאשר מוזן באופן מיטבי, גלמי זכרים ונקבות נבדלים על ידי גודל; הנקבות גדולות מן הזכרים (A) ויש cephalothorax בולבוסי יחסית לעומת גברים אשר יש צדדים להחמיא (B). גברים מבוגרים הם בקלות להבחין בין הנקבות בתנאים rearing כל, בעיקר על ידי שלהם אנטנה plumose, קאלאמרי ארוך. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56124/56124fig3.jpg"> איור 3. בן יום ארבע ביצים Ae. aegypti בתנאים שונים. (א) Intact משפיעה על רצועות נייר זכוכית לשמור על לחות גבוהה (> 80 אחוז) אך ללא לחות לעין. המחירים הפתח צריך להיות מעל 90% עבור פראי-סוג Ae. aegypti אם יתוחזק כראוי. ביצים (B) שבוקעים לפני להיות שקוע במים (הבקיעה מפותחת) נבדלים על ידי קאפ מנותקת ביצה זחל גלוי. אפשרות זו מציינת כי רצועת נייר זכוכית נשמר לח מדי. ביצים (C) עוברות ייבוש תלגמי עלול לקרוס, הם נראים בבירור על ידי מראה קעורה שלהם. אם סביר להניח שאני הופכת נוקשה זה גם מציין כי הביצים עשוי להיות יבש מדי. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56124/56124fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי להציג גירסה גדולה יותר של הדמות הזאת.</a>

המחברים מצהירים כי יש להם אינטרסים כלכליים אין מתחרים.

בעקבות פרוטוקול המובאת כאן לשם קיום Wolbachia-נגועים aegypti Ae. עליך לוודא כי יתושים בריא איכות עקבית מיוצרים לניסויים, פתח שדה לעיתונות. בניגוד פרוטוקולים אחרים זה סדר עדיפויות בייצור המוני כמויות היתושים (ראה התייחסות57), השיטות הם התמקדו למקסם את הכושר שלהם, הן בתוך דורות ?...

Aedes aegypti יתושים אחראים להעברת חלק arboviruses החשוב ביותר בעולם, לרבות קדחת דנגה, Zika ו- chikungunya1. וירוסים אלה הופכים איום גובר על הבריאות העולמי ההתפלגות הנפוצה של Ae. aegypti באזורים הטרופיים ממשיך להרחיב את2,3,4. נקבה Ae. aegypti מעדיפים ניזונים דם אנושי5 , ולכן נוטים בקרבה לבני אדם, במיוחד באזורים עירוניים איפה אוכלוסיות הצפופים ביותר. באמצעות הקשר הזה קרוב עם בני אדם הם הסתגלו גם להתרבות בבתי גידול מלאכותיים, כולל צמיגים, סירים, מרזבים מים טנקים6,7. Aegypti Ae. גם ברצון להתאים לסביבות מעבדה שבה הם יכול להישמר ללא כל דרישות מיוחדות לאחר איסוף ישירות מהשדה, בניגוד כמה מינים אחרים סוג אאדס 8, 9,10. שלהם קלות התחזוקה ראה אותם למד נרחב במעבדה במגוון רחב של תחומים, בסופו של דבר במטרה לשלוט היתושים מחלות יכולה לשדר.
באופן מסורתי, arboviral שליטה מתבסס בעיקר על שימוש חומרי הדברה כדי להפחית אוכלוסיות יתוש. עם זאת, יש עניין גובר על גישות בהם יתושים ששונה גדלו במעבדה, ואז שוחרר לאוכלוסיות טבעי. היתושים שפורסמו עשוי להיות שונה גנטית11,12,13, ביולוגית14,15, דרך הקרנה16, טיפול כימי17,18, או עם בשילוב טכניקות19 לדכא אוכלוסיות של יתושים או להחליף אותם עם יתושים כי הם דברים מעוותים שידור arboviral20.
Wolbachia הם חיידקים כיום בשימוש כסוכן הדברה ביולוגית של arboviruses. זנים שונים של Wolbachia שהוכנסו לאחרונה Ae. aegypti השפעול באמצעות עובריים microinjection21,22,23,24. זנים אלו להפחית את היכולת של arboviruses להפיץ, לשכפל, היתוש, הולכת ופוחתת שלהם שידור פוטנציאליים23,25,26,27,28 . זיהומים Wolbachia מועברים מאמא לצאצאים, אולם זנים מסוימים לגרום עקרות כאשר נגוע זכרים להזדווג עם נקבות נגוע22. Wolbachia-זכרים הנגוע ולכן יכול להיות משוחרר בכמויות גדולות כדי לדכא אוכלוסיות יתושים טבעי, הפגין לאחרונה15,מינים אחרים אאדס 29. עם זאת, מאז Wolbachia לעכב גם שידור arboviral ב Ae. aegypti, יתושים יכולים גם להשתחרר כדי להחליף את אוכלוסיות מקומיות וקטורים עניים. Ae. aegypti השפעול נגוע Wolbachia עכשיו שוחררו בתוך השדה במספר מדינות באמצעות זה הצגנו14,30,31.
Wolbachia-גישות מבוססות עבור פקד arboviral להסתמך על הבנה צליל של האינטראקציות בין Wolbachia, היתוש ואיכות הסביבה. Wolbachia להתרחש באופן טבעי במגוון רחב של חרקים, זנים מוחדרים יתושים מגוונים ב שלהם אפקטים32. כמו סוגים חדשים של זיהום Wolbachia הם מוחדרים Ae. aegypti24, זה הכרחי לאפיין כל אסנן והשפעותיהם על כושר יתושים, רבייה, הפרעה arboviral תחת מגוון תנאים. ניסויים קפדניות במעבדה ולכן נדרש להעריך את פוטנציאל Wolbachia זנים להצליח בתחום.
שדה פתוח מהדורות של Ae. aegypti עם זיהומים Wolbachia יכול לעיתים קרובות דורשים אלפי עד עשרות אלפי יתושים לפי אזור שחרור להיות גדלו כל שבוע14,30,31. ניתן לשפר את ההצלחה של מהדורות הראשונית על ידי שחרור יתושים בגודל גדול להגדיל את פוריות33 ,34,הצלחה35ההזדווגות שלהם. היתושים צריך גם להתאים את התנאים שהם יחוו בשטח, אולם לטווח ארוך מעבדה לגידול עלולה לגרום לשינויים בהתנהגות, פיזיולוגיה אשר יכול להשפיע על שדה ביצועים36,37, 38.
אנו מתארים פרוטוקול פשוט לגידול Ae. aegypti במעבדה בעזרת ציוד בסיסי. פרוטוקול זה מתאים הן פראי-סוג של Wolbachia-נגוע היתושים, שהאחרון שבהם תוכל לדרוש תשומת לב מיוחדת כמו כמה זנים Wolbachia יש השפעות משמעותי על יתושים חיים-היסטוריה תכונות39, 40. התנאים rearing למנוע צפיפות יתר ותחרות לאוכל לייצר יתושים בגודל אחיד, אשר הוא קריטי עבור וקטור כשירות וניסויים כושר, והוא מבטיח היתושים יהיו בריאים לשחרור שדה41 . אנחנו גם לוקחים אמצעי הזהירות האפשריים כדי למזער את עיבוד מעבדה ואת נישואי קרובים על-ידי הפחתת לחצים בררניים, להבטיח כי הדור הבא נדגמים מתוך מאגר גדול, אקראי. עם זאת, סביבות מעבדה הן שונה במובהק מתנאי שדה, תחזוקה לטווח הארוך בתנאים רגועים יכול להפחית את הכושר של יתושים עם שחרורם לתוך שדה37,42,43 . לכן נחצה נקבות משורות מעבדה זכרים שנאספו שדה מעת לעת, וכתוצאה מכך המושבות אשר דומים גנטי להשוואות ניסיוני, שהם להתאים יעד אוכלוסייה של שדה39. השיטות אינן דורשות שום ציוד מיוחד, וניתן לשנותם האחורי עשרות אלפים של אנשים בכל שבוע עבור שדה לעיתונות. הפרוטוקול קובע סדר עדיפויות של גם בחדר הכושר של יתושים בתוך ועל -פני דורות, שיקול חשוב עבור חרקים המיועדים הממסד באוכלוסיות טבעיות. הפרוטוקול מתאים ברוב מעבדות הדורשים תחזוקה של Ae. aegypti, במיוחד להשוואות ניסיוני איפה חשובים איכות עקבית של יתושים, relatability לשדה.

<table><tbody><tr><td>Wild type &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Collected from field locations in Queensland, Australia, see Yeap and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;39&lt;/sup&gt; for details</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; Mel-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Walker and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;23&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; AlbB-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to Xi and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;21&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>&lt;em&gt;w&lt;/em&gt; MelPop-infected &lt;em&gt;Aedes aegypti&lt;/em&gt;</td><td></td><td></td><td>Provided by Monash University. Refer to McMeniman and others&lt;sup class=&quot;xref&quot;&gt;22&lt;/sup&gt; for information on the strain</td></tr><tr><td>Instant dried yeast</td><td>Lowan</td><td></td><td>Stimulates egg hatching. Found in general grocery stores. Other brands may be used</td></tr><tr><td>5 L plastic tub</td><td>Quadrant</td><td>Q110950</td><td>Used for hatching and rearing larvae. Other products may be used</td></tr><tr><td>Fish Food (Tetramin Tropical Tablets)</td><td>Tetra</td><td>16152</td><td>Provided to larvae as a source of food. Web address: https://www.amazon.com/Tetra-16152-TetraMin-Tropical-10-93-Ounce/dp/B00025Z6SE</td></tr><tr><td>Plastic containers</td><td></td><td></td><td>Used for rearing larvae. Any plastic container above 500 mL should be suitable</td></tr><tr><td>Glass pipette</td><td></td><td></td><td>Used for transferring larvae and pupae between containers. Web address: https://www.aliexpress.com/item/10Pcs-Durable-Long-Glass-Experiment-Medical-Pipette-Dropper-Transfer-Pipette-Lab-Supplies-With-Red-Rubber-Cap/32704471109.html?spm=2114.40010308.4.2.py4Kez</td></tr><tr><td>Clicker counter</td><td>RS Pro</td><td>710-5212</td><td>Used to assist in the counting of larvae, pupae and eggs. Web address: http://au.rs-online.com/web/p/products/7105212/?grossPrice=Y</td></tr><tr><td>Rearing trays</td><td>Gratnells</td><td></td><td>Used for rearing larvae. Web address: http://www.gratnells.com</td></tr><tr><td>Nylon mesh</td><td></td><td></td><td>Used to transfer larvae and pupae to containers of fresh water. Other brands may be used. Web address: https://www.spotlightstores.com/fabrics-yarn/specialty-apparel-fabrics/nettings-tulles/nylon-netting/p/BP80046941001-white</td></tr><tr><td>Cages</td><td>BugDorm</td><td>DP1000</td><td>Houses adult mosquitoes. Alternative products may be used. Web address: http://bugdorm.megaview.com.tw/bugdorm-1-insect-rearing-cage-30x30x30-cm-pack-of-one-p-29.html</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup</td><td>Huhtamaki</td><td>AA272225</td><td>Used to provide water or sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>35 mL plastic cup lid</td><td>Huhtamaki</td><td>GB030005</td><td>Used to provide sucrose to adult mosquitoes. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Cotton wool</td><td>Cutisoft</td><td>71841-13</td><td>Moist cotton wool is provided as a source of water to adults. Other brands may be used</td></tr><tr><td>White Sugar</td><td></td><td></td><td>Provided as a source of sugar to adult mosquitoes. Found in general grocery stores</td></tr><tr><td>Rope</td><td>M Recht Accessories</td><td>C323C/W</td><td>Used to provide sucrose solution to adults. Other brands may be used. Web address: https://mrecht.com.au/haberdashery/braids-cords-and-tapes/cords/plaited-cord/cotton/</td></tr><tr><td>Plastic cup (large)</td><td></td><td></td><td>Used as an oviposition container. Any plastic cup that holds 100 mL of water should be suitable</td></tr><tr><td>Sandpaper</td><td>Norton Master Painters</td><td>CE015962</td><td>Provided as an oviposition substrate. Alternative products may be used, but we use this brand because it is relatively odorless. Lighter colors are used for contrast with eggs. Web address: https://www.bolt.com.au/115mm-36m-master-painters-bulk-roll-p80-medium-p-9396.html</td></tr><tr><td>Filter paper</td><td>Whatman</td><td>1001-150</td><td>Used as an alternative oviposition substrate. Other brands may be used</td></tr><tr><td>Latex gloves</td><td>SemperGuard</td><td>Z560979</td><td>Prevents mosquito bites on hands when blood feeding. Other brands may be used. Web address: http://www.sempermed.com/en/products/detail/semperguardR_latex_puderfrei_innercoated/</td></tr></tbody></table>

maintaining aedes aegypti mosquitoes infected with wolbachia

Aedes aegypti יתושים נגועים השפעול Wolbachia מנוצל ב תוכניות כדי לשלוט על התפשטות arboviruses כגון קדחת דנגה, chikungunya Zika. Wolbachia-יתושים נגועים יכול להשתחרר לתוך השדה גם להפחית את אוכלוסיית גדלים באמצעות matings לא תואמת או להפוך אוכלוסיות עם יתושים המהווים עקשן וירוס שידור. אסטרטגיות אלו להצליח, היתושים שוחרר לתוך השדה מהמעבדה חייב להיות תחרותי עם יתושים מקורית. עם זאת, שמירה על יתושים במעבדה יכול לגרום נישואי קרובים, סחף גנטי, עיבוד מעבדה אשר יכול להפחית את הכושר שלהם בתחום עשויים לבלבל את התוצאות של ניסויים. כדי לבדוק את התאמתו של זיהומים שונים Wolbachia לפריסה בשטח, זה הכרחי לשמור על יתושים בסביבה מעבדתית מבוקרת על פני דורות רבים. אנו מתארים פרוטוקול פשוטים לשמירה על יתושים Ae. aegypti במעבדה, אשר מתאים הן Wolbachia-יתושים נגועים ופראי-סוג. השיטות למזער מעבדה הסתגלות וליישם outcrossing כדי להגביר את הרלוונטיות של ניסויים כדי שדה יתושים. בנוסף, מושבות נשמרים בתנאים אופטימליים כדי למקסם את הכושר שלהם עבור מהדורות בשטח פתוח.

איור 4 ממחישה את ההשפעות של תזונה שיוצרת על הפיתוח של Ae. aegypti הזחלים. מתי מכולות מסופקים עם 0.25 מ ג של מזון לכל זחל ליום או פחות, מגביר את קצב ההתפתחות עבור זכרים ונקבות, סינכרונית פחות מאשר במיכלים מסופק עם 0.5 מ ג של מזון. אם במזון הולם זה אינו מסופק בכל מש?...

Watch this Scientific Journal Video about Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia at JoVE.com

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

שמירה על Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia

Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia שוחררו לאוכלוסיות טבעי לדכא את השידור של arboviruses. אנו מתארים שיטות האחורי Ae. aegypti עם זיהומים Wolbachia במעבדה ניסויים ולשחרר שדה, נקיטת אמצעי זהירות כדי למזער את עיבוד מעבדה ובחירה.

Aedes aegypti mosquitoes experimentally infected with Wolbachia are being utilized in programs to control the spread of arboviruses such as dengue, ...

maintaining-aedes-aegypti-mosquitoes-infected-with-wolbachia

Research

JoVE Journal

Biology

Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

14.1K Views.  Bio21 Institute and University of Melbourne. Aedes aegypti יתושים נגועים Wolbachia שוחררו לאוכלוסיות טבעי לדכא את השידור של arboviruses. אנו מתארים שיטות האחורי Ae. aegypti עם זיהומים Wolbachia במעבדה ניסויים ולשחרר שדה, נקיטת אמצעי זהירות כדי למזער את עיבוד מעבדה ובחירה.

Video: Maintaining Aedes aegypti Mosquitoes Infected with Wolbachia

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the development of new and innovative methods of mosquito control based around the Sterile Insect Technique (SIT)1-3. A control method known as RIDL&#160;(Release of Insects carrying a Dominant Lethal)4, is based around SIT, but uses genetic methods to remove the need for radiation-sterilization5-8. A RIDL&#160;strain of Ae. aegypti was successfully tested in the field in Grand Cayman9,10; further field use is planned or in progress in other countries around the world.
Mass rearing of insects has been established in several insect species and to levels of billions a week. However, in mosquitoes, rearing has generally been performed on a much smaller scale, with most large scale rearing being performed in the 1970s and 80s. For a RIDL&#160;program it is desirable to release as few females as possible as they bite and transmit disease. In a mass rearing program&#160;there are several stages to produce the males to be released: egg production, rearing eggs until pupation, and then sorting males from females before release. These males are then used for a RIDL&#160;control program,&#160;released as either pupae or adults11,12.
To suppress a mosquito population using RIDL&#160;a large number of high quality male adults need to be reared13,14. The following describes the methods for the mass rearing of OX513A, a RIDL&#160;strain of Ae. aegypti 8, for release and covers the techniques required for the production of eggs and mass rearing RIDL&#160;males for a control program.

Mass Production of Genetically Modified Aedes aegypti for Field Releases in Brazil

To achieve population suppression of Aedes aegypti using the RIDL&#174; (Release of Insects carrying a Dominant Lethal) system, large numbers of male mosquitoes need to be released. This requires the use of mass rearing techniques and technology to provide reliable systems to obtain the maximum number of high quality male mosquitoes.

ייצור המוני של Aedes aegypti מהונדסים גנטית עבור מהדורות שדה בברזיל

New techniques and methods are being sought to try to win the battle against mosquitoes. Recent advances in molecular techniques have led to the ...

Environment

Maintaining Wolbachia in Cell-free Medium

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ascertain the viability of the purified Wolbachia and (3) maintain the now extracellular Wolbachia in cell-free medium.  Purified Wolbachia remain alive in the extracellular phase but do not replicate until re-inoculated into eukaryotic cells.  Extracellular Wolbachia purified in this manner will remain viable for at least a week at room temperature, and possibly longer.  Purified Wolbachia are suitable for micro-injection, DNA extraction and other applications. 


This video describes a method for purifying Wolbachia pipientis from an Anopheles gambiae cell line and then culturing the endosymbiont in cell-free medium. An assay for viability of the bacterium is demonstrated.

שמירה ב Wolbachia בינוני סלולרי חינם

In this video protocol, procedures are demonstrated to (1) purify Wolbachia symbionts out of cultured mosquito cells, (2) use a fluorescent assay to ...

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, Eastern equine encephalitis, lymphatic filariasis, and Saint Louis encephalitis. Notably, avian malaria has played a major role in the extinction of numerous endemic island bird species, while WNV has become an important vector-borne disease in the United States. To gain further insight into C. quinquefasciatus biology and expand their genetic control toolbox, we need to develop more efficient and affordable methods for genome engineering in this species. However, some biological traits unique to Culex mosquitoes, particularly their egg rafts, have made it difficult to perform microinjection procedures required for genome engineering. To address these challenges, we have developed an optimized embryo microinjection protocol that focuses on mitigating the technical obstacles associated with the unique characteristics of Culex mosquitoes. These procedures demonstrate optimized methods for egg collection, egg raft separation and other handling procedures essential for successful microinjection in C. quinquefasciatus. When coupled with the CRISPR/Cas9 genome editing technology, these procedures allow us to achieve site-specific, efficient and heritable germline mutations, which are required to perform advanced genome engineering and develop genetic control technologies in this important, but currently understudied, disease vector.

Embryo Microinjection Techniques for Efficient Site-Specific Mutagenesis in Culex quinquefasciatus

This protocol describes microinjection procedures for Culex quinquefasciatus embryos that are optimized to work with CRISPR/Cas9 gene editing tools. This technique can efficiently generate site-specific, heritable, germline mutations that can be used for building genetic technologies in this understudied disease vector.

אמבריו מיקרו-סינתזה טכניקות עבור מוטגנזה יעילה ספציפית לאתר בקולקס quinquefasciatus

Culex quinquefasciatus is a vector of a diverse range of vector-borne diseases such as avian malaria, West Nile virus (WNV), Japanese encephalitis, ...

Genetics

Small-Cage Laboratory Trials of Genetically-Engineered Anopheline Mosquitoes

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control strategies. CRISPR-based homing gene drive systems have made transgenic technologies more accessible within the scientific community. Evaluation of transgenic mosquito performance and comparisons with wild-type counterparts in small laboratory cage trials provide valuable data for the design of subsequent field cage experiments and experimental assessments to refine the strategies for disease prevention. Here, we present three different protocols used in laboratory settings to evaluate transgene spread in anopheline mosquito vectors of malaria. These include inundative releases (no gene-drive system), and gene-drive overlapping and non-overlapping generation trials. The three trials vary in a number of parameters and can be adapted to desired experimental settings. Moreover, insectary studies in small cages are part of the progressive transition of engineered insects from the laboratory to open field releases. Therefore, the protocols described here represent invaluable tools to provide empirical values that will ultimately aid field implementation of new technologies for malaria elimination.

The protocols reported here illustrate three alternative ways to assess the performance of genetically-engineered mosquitoes destined for vector control in laboratory-contained small cage trials. Each protocol is tailored to the specific modification the mosquito strain bears (gene drive or non-gene drive) and the types of parameters measured.

ניסויי מעבדה בכלוב קטן של יתושי אנופלין מהונדסים גנטית

Control of mosquito-borne pathogens using genetically-modified vectors has been proposed as a promising tool to complement conventional control ...

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation of RNA virus transmission using Wolbachia-transfected mosquitoes. Key strategies to control viruses include the manipulation of host reproduction via cytoplasmic incompatibility and the inhibition of viral transcripts via immune priming and competition for host-derived resources. However, the underlying mechanisms of the responses of Wolbachia-transfected mosquitoes to viral infection are poorly understood. This paper presents a protocol for the in vitro identification of Wolbachia infection at the nucleic acid and protein levels in Aedes albopictus (Diptera: Culicidae) Aa23 cells to enhance the understanding of the interactions between Wolbachia and its insect vectors. Through the combined use of polymerase chain reaction (PCR), quantitative PCR, western blot, and immunological analytical methods, a standard morphologic protocol has been described for the detection of Wolbachia-infected cells that is more accurate than the use of a single method. This approach may also be applied to the detection of Wolbachia infection in other insect taxa.

Detecting Wolbachia Strain wAlbB in Aedes albopictus Cell Lines

Four methods were used to detect intracellular Wolbachia, which complemented each other and improved the detection accuracy of Wolbachia infection of Aedes albopictus-derived Aa23 and Aa23-T&#160;cured of native Wolbachia infection using antibiotics.

זיהוי זן וולבצ'יה wAlbB ב Aedes albopictus קווי תאים

As a maternally harbored endosymbiont, Wolbachia infects large proportions of insect populations. Studies have recently reported the successful regulation ...

Immunology and Infection

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, most notably developmental arrest and reduced metabolism. Global gene expression profiling via RNA-Seq can provide important insights into the transcriptional mechanisms of photoperiodic diapause. The Asian tiger mosquito, Aedes albopictus, is an outstanding organism for studying the transcriptional bases of diapause due to its ease of rearing, easily induced diapause, and the genomic resources available. This manuscript presents a general experimental workflow for identifying diapause-induced transcriptional differences in A. albopictus. Rearing techniques, conditions necessary to induce diapause and non-diapause development, methods to estimate percent diapause in a population, and RNA extraction and integrity assessment for mosquitoes are documented. A workflow to process RNA-Seq data from Illumina sequencers culminates in a list of differentially expressed genes. The representative results demonstrate that this protocol can be used to effectively identify genes differentially regulated at the transcriptional level in A. albopictus due to photoperiodic differences. With modest adjustments, this workflow can be readily adapted to study the transcriptional bases of diapause or other important life history traits in other mosquitoes.

An Experimental and Bioinformatics Protocol for RNA-seq Analyses of Photoperiodic Diapause in the Asian Tiger Mosquito, Aedes albopictus

RNA-Seq analyses are becoming increasingly important for identifying the molecular underpinnings of adaptive traits in non-model organisms. Here, a protocol to identify differentially expressed genes between diapause and non-diapause Aedes albopictus mosquitoes is described, from mosquito rearing, to RNA sequencing and bioinformatics analyses of RNA-Seq data.

ניסיוני וביואינפורמטיקה פרוטוקול לניתוח RNA-seq של Photoperiodic דיאפאוזה באסיה טייגר נגד יתושים,<em&gt; אדס המפוספס</em

Photoperiodic diapause is an important adaptation that allows individuals to escape harsh seasonal environments via a series of physiological changes, ...

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates (EAgaL Plates)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness parameters, in particular egg production and hatch rates at the individual level, conventional methods have put a substantial burden on investigators due to high labor intensity and laboratory space requirements. Described is a simple method using 24 well tissue culture plate with agarose in each well and digital imaging of each well to determine egg numbers and hatch rates at an individual level with substantially reduced time and space requirements.

Improved Fecundity and Fertility Assay for Aedes aegypti using 24 Well Tissue Culture Plates EAgaL Plates

Described is a time and space-saving method to count eggs and determine hatch rates of individual mosquitoes using 24 well tissue culture plates, which can substantially increase the scale and speed of fecundity and fertility assays.

מבחני פוריות ופוריות משופרים עבור Aedes aegypti באמצעות 24 צלחות תרבית רקמה באר (צלחות EAgaL)

Mosquitoes represent a significant public health problem as vectors of various pathogens. For those studies that require an assessment of mosquito fitness ...

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no prevention. Control of mosquito vectors can rely on chemicals applied to the immature and adult stages, which can contribute to the mortality of non-targets and more importantly, lead to insecticide resistance in the vector. The sterile insect technique (SIT) is a method of controlling populations of pests through the release of sterilized adult males that mate with wild females to produce non-viable offspring. This paper describes the process of producing sterile males for use in an operational SIT program for the control of Aedes aegypti mosquitoes. Outlined here are the steps used in the program including rearing and maintaining a colony, separating male and female pupae, irradiating and marking adult males, and shipping Aedes aegypti males to the release site. Also discussed are procedural caveats, program limitations, and future objectives.

Preparing Irradiated and Marked Male Aedes aegypti Mosquitoes for Release in an Operational Sterile Insect Technique Program

The sterile insect technique (SIT) is used to control specific, medically important mosquito populations that may be resistant to chemical controls. Here, we describe a method of mass rearing and preparation of sterile male mosquitoes for release in an operational SIT program targeting the Aedes aegypti mosquito.

הכנת יתושי Aedes aegypti זכרים מוקרנים ומסומנים לשחרור בתוכנית טכניקת חרקים סטרילית מבצעית

The control of such human diseases as dengue, Zika, and chikungunya relies on the control of their vector, the Aedes aegypti mosquito, because there is no ...

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for wild-type females and induce sterility in the target population. Hence, laboratory assessment of male mating competitiveness is essential for evaluating the release strain&#8217;s fitness before field release. Conventionally, such an assay is performed by determining the proportion of viable eggs produced by the females after being simultaneously exposed to two sets of males (wild-type and release strains) for copulation. However, this process is time-consuming and laborious due to the need to first blood-feed the females for egg production and then hatch and enumerate the hatched eggs to determine egg viability.&#160;
Moreover, this method cannot discern the degree of competitiveness between two sterile or Wolbachia-infected mosquito lines as wild-type female mosquitoes will only produce non-viable eggs upon mating with both. To circumvent these limitations, this paper describes a more direct method of measuring male mosquito mating competitiveness in laboratory settings using the fluorescent dye, rhodamine B (RhB), which can be used to mark males by feeding them in sucrose solution containing RhB. After the mating assay, the presence of fluorescing sperms in the spermathecae of a female can be used to determine her mating partner. This method is cost-effective, reduces the experimental time by 90% and allows comparison of mating fitness between two sterile or Wolbachia-infected lines.&#160;

Using the Fluorescent Dye, Rhodamine B, to Study Mating Competitiveness in Male Aedes aegypti Mosquitoes

Here, we present a protocol for studying mating competitiveness of male Aedes aegypti using fluorescent dye as a marker. Female mosquitoes are exposed to both marked and unmarked males for copulation. Post mating, their spermathecae are examined under a fluorescence microscope to determine their mating partner.

באמצעות צבע פלואורסצנטי, רודמין B, כדי ללמוד תחרותיות הזדווגות יתושים Aedes aegypti זכר

The success of sterile or incompatible insect technique-based population suppression programs depends on the ability of released males to compete for ...

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life parameter data from genetically modified mosquitoes and comparing them to mosquitoes lacking transgenes from the same genetic background. This manuscript illustrates how to measure common life history traits in the mosquito Aedes aegypti, including fecundity, wing size and shape, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These parameters were chosen because they reflect reproductive success, are simple to measure, and are commonly reported in the literature. The representative results quantify fitness costs associated with either a gene knock-out or a single insertion of a gene drive element. Standardizing how life parameter data are collected is important because such data may be used to compare the health of transgenic mosquitoes generated across studies or to model the transgene fixation rate in a simulated wild-type mosquito population. Although this protocol is specific for transgenic Aedes aegypti, the protocol may also be used for other mosquito species or other experimental treatment conditions, with the caveat that certain biological contexts may require special adaptations.

Quantifying Fitness Costs in Transgenic Aedes aegypti Mosquitoes

The present protocol describes how to measure common life parameter data in Aedes aegypti mosquitoes, including fecundity, wing size, fertility, sex ratio, viability, development times, male contribution, and adult longevity. These measurements can be used to assess the fitness of transgenic mosquitoes.

כימות עלויות כושר ביתושים מהונדסים, Aedes aegypti

Transgenic mosquitoes often display fitness costs compared to their wild-type counterparts. In this regard, fitness cost studies involve collecting life ...