The authors are funded by the Wellcome Trust through the Edinburgh Clinical Academic Track (C.J.C.J.) and Programme Grant (Y.H., and R.M.M.) and Fellowship (J.R.G) funding, the BBSRC (G.C.), the American Asthma Foundation (E.R., H.J.McS. and R.M.M.), Asthma UK (H.J.McS.) and the Rainin Foundation (D.J.S. and R.M.M.).

הערה: כל הנהלים בפרוטוקול זה מבוצעת בהתאם להנחיות שנקבעו על ידי משרד בית אנגליה ואוניברסיטת השירותים הווטרינריים אדינבורו. 1. זיהום של עכברים על ידי Gavage <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> חנות זחלי Heligmosomoides polygyrus L3 במים מזוקקים עד שישה חודשים על 4 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לפני השימוש, לשטוף זחלי L3 שלוש פעמים במים מזוקקים: צנטריפוגה XG ב 300 במשך 10 דקות (עם בלם), להסיר את כל אבל 500 μl של מים (כדי למנוע זחלי L3 טבליות מטרידים) וresuspend גלולה בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטיפה השלישית, מוסיף מים עד לנפח מדויק (בדרך כלל 40 מיליליטר) ולשאוב 20 μl עם חתך טיפ 200 μl להרחיב צמצמה. מניחים שתי 20 דגימות μl על פני השטח של צלחת תרבות 60 מ&quot;מ ולספור את זחלי L3 (בדרך כלל ניידת, ונראה במיטבו תחת 50X הגדלה עם מיקרוסקופ לנתח). Resuspend גלולה הסופיים במים מזוקקים לconcentration של 2,000 זחלי L3 לכל מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לייצור מעגל חיים, להדביק (C57BL / 6xCBA) עכברים 8 שבועות בן F1 עם 400 H. זחלי polygyrus L3 ב 200 μl של מים מזוקקים על ידי gavage האוראלי (לרסן את העכברים במצב הזקוף בעורף ובעדינות להעביר את מחט gavage הבוטה דרך הפה והוושט לקיבה). להתסיס ביסודיות לפני כל זיהום (זחלים ליישב במהירות במים) ולשאוב 200 μl במזרק 1 מיליליטר; להשתמש במחט gavage ייעודית עם קצה מעוגל. לזיהום ניסיון של עכברים צעירים (6-8 שבועות), או זנים טהורים אחרים (למשל C57BL / 6 או BALBc), להדביק עכברים עם 200 זחלי L3. </li></ol> 2. רביה ותחזוקה של H. polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח פחם במרכז אמבטיה פלסטיק גדול ומאפשר למים ברז קרים לדרוס אותו למינימום של 30 דקות (לא רחוץ פחם פעיל הוא רעיל לזחלי L3). מסננים את המים מהאמבטיה ולמקם את הפחם על tוו שכבות של נייר סופג, והשאירו אותו חשוף לאוויר חדר עד יבש לחלוטין. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם ביצים נדרשות, לגרד צואה הראשונה מתוך המעי הגס עם מלקחיים (ומספריים במידת צורך). אם יש צורך במספר גדול של זחלי L3, מקום עכברים על רשת תיל ולאסוף כדורי צואה על פני כמה ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מערבבים את הצואה עם פחם מגורען ביחס של לפחות 1: 1, כדי להשיג עקביות פשוט רטוב מספיק כדי לדבוק לסנן נייר. למרוח שכבה דקה על המרכז של כמה נייר סינון לח בצלחת פטרי ומניח את זה בתיבה לחה (להוסיף קצת נייר מגבת לחה וקערת מים) בחושך במשך 12-14 ימים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר זחלי L3 מיום 7 ואילך, ולאסוף אותם, לפחות בשתי הזדמנויות לפני שהנייר שהושלך. הזחלים יוצרים טבעת מסביב לקצה של נייר הסינון; הרם את נייר הסינון מצלחת פטרי ולשטוף את הזחלים שנשארו מהצלחת (בעזרת פיפטה ו -5 מיליליטר של מים סטריליים לכל צלחת) לתוך צינור 50 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Liftאת נייר הסינון ולאסוף את הזחלים שנותרו נשארו בצלחת עם מים מזוקקים לתוך צינור 50 מיליליטר. צנטריפוגה פתרון השפכים ב XG 300 עבור 10 דקות. שטוף את הזחלים שלוש פעמים במים מזוקקים ולאחר מכן לאחסן על 4 מעלות צלזיוס בעד 50 מיליליטר של מים מזוקקים עד נדרשת. הערה: הזחלים להישאר קיימא ומזהם במשך לפחות 6 חודשים. </li></ol> 3. אוסף של H. מבוגרים התולעים polygyrus <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן את מכשירי Baermann שונה מראש, כפי שמוצג באיור 1. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עכברים ללקט ארבע עשרה ימים לאחר ההדבקה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לשטוף את הבטן עם אתנול 70%. חותך את העור מעל הבטן ולמשוך בחזרה כדי לחשוף את דופן הבטן הקדמית. לעשות חתך קו האמצע כדי להיכנס לחלל הצפק. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את המעי כולו קטן וגדול (מתריסריון הפרוקסימלי לרקטום דיסטלי). הנח לצלחת פטרי יבשה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יישר את הבטן לכל אורכו; בלו מעי גס צואה המכיל; את המקום הזה לצלחת נפרדת להכנות ביצה מאוחר יותר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בלו 20 סנטימטרים הפרוקסימלי של מעי דק שמכיל את התולעים בוגרות -identified על ידי הקיר העבה יחסית של התריסריון, ולעתים קרובות מראה אדום בשל תולעי התוך luminal. הנח לתוך צלחת פטרי (100 מ&quot;מ קוטר) עם 5 מיליליטר של הפתרון &#39;הנקס, חימם עד 37 ° C (שתי דגימות לכל צלחת). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את חלק מעי הפרוקסימלי מלא תולעת longitudinally עם מספריים (מספריים הסתיימו עגולים הם הטובים ביותר לכך), ולגרד את החלק הפנימי של מעי בטנה עם שתי שקופיות זכוכית כדי להסיר את התולעים. ואז להשליך את קיר הבטן הנקי. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי טיפ לשקיות מוסלין קטנים, מצרך סגור ובטוח עם מהדקים מסביב לקצה של משפך הזכוכית (איור 1). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מלא משפך עם הפתרון &#39;הנקס ולהוסיף כ 4 צלחות פטרי של תולעים לכל משפך. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מנגנון מקום 37 ° C חממה במשך 1-2 שעות, בעדינות להסעיר חצי דרך כדי לסלקפסולת ממעי ההכנה שעשויה לחסום את מסנן המוסלין. תשמור על עצמך, כדי למנוע דליפה של פסולת מחוץ לשקית המוסלין - זה יגרום זיהום של הכנת הס הסופית. צריכה היגרו תולעים בוגרות באיטיות דרך בד המוסלין והתיישבו בחלק התחתון של מבחנת זכוכית. לנתק בזהירות את המבחנה מצינור גומי חיבור מעל הכיור (טיפול כדי למנוע אובדן של תולעים בשלב זה). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בעזרת פיפטה פלסטיק, להעביר את התולעים לתוך צינור 50 מ&quot;ל ולשטוף שש פעמים עם הנקס &#39;פתרון (לאפשר תולעים להתיישב עם כוח הכבידה, להסיר תקשורת עם stripette, להוסיף 40 מיליליטר של הנקס&#39; הפתרון וחזור חמש פעמים). הערה: תרבות תולעת חייבת להישמר סטרילי מנקודה זו ואילך. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור לזרימה למינרית ולשטוף עוד שש פעמים בפתרון &#39;הנקס סטרילי בתוספת 100 U / ml פניצילין ושל 100 מק&quot;ג / מיליליטר סטרפטומיצין, מוכן לתרבות במבחנה. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> רוזןתולעים בוגרות התאוששו על ידי לקיחת שתי דגימות של 20 μl נלקח עם קיצוץ קצה צהוב להרחיב צמצמה; מצפה כ -50% מהכמות של זחלים מחוסן. </li></ol> 4. הגדרת תרבויות להס: הכנה בינונית, כביסה תולעים בוגרות <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> משרים את התולעים מ3.11 בכ 10 מיליליטר של RPMI בתוספת 10% gentamycin במשך 20 דקות, והשאיר את מנוחת הצינור בזווית כדי להבטיח תולעים מכוסים במלואן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לבצע את זה בזרימה למינרית: לשטוף שוב שש פעמים עם הפתרון &quot;הנקס (בתוספת 5 U / ml פניצילין ו5 מיקרוגרם / מיליליטר סטרפטומיצין). </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הכן H. תקשורת polygrus. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שמירה על סטריליות בזרימה למינרית מכסה המנוע, 500 מיליליטר של RPMI1640, להוסיף 11.1 מיליליטר של 45% גלוקוז (ריכוז סופי 1.2% כRPMI1640 מכיל גלוקוז 0.2%), 5 מיליליטר של 100x Peniclllin סטרפטומיצין (ריכוז סופי 5 U / ml פניצילין, 5 מיקרוגרם / סטרפטומיצין מיליליטר), 5 מיליליטר של L-גלוטמין (ריכוז סופי 2 מ&quot;מ), ו5 מיליליטר של gentamycin (ריכוז סופי 1%). אל תוסיף FCS. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תולעי Aliquot לתוך צלוחיות T25 פרקו, כ. 1,000 תולעים בH. 15 מיליליטר תקשורת polygyrus לכל בקבוק, ומקום זקוף ב -37 חממת ° C (5% CO 2) במשך 3 שבועות. </li></ol> 5. הכנת הס <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף הס המכיל תקשורת ותרבות מתרבויות במרווחים של לא יותר מפעמיים בשבוע, להניח בצד את האוסף הראשון לאחר 24 שעות של התרבות (עקב רמות גבוהות של זיהום LPS וחלבוני מארח - יכול להיות מעובד בנפרד או שהושלך). שמור כל איסוף נפרד ומסומן עם מספר התאריך ויצווה בבירור. החלף עם נפח שווה של H. תקשורת polygyrus בכל פעם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צנטריפוגה הס המכיל תקשורת ב 400 x גרם במשך 5 דקות. אז לסנן לעקר באמצעות 0.2 מיקרומטר מסננים דל חלבון מחייב לצינורות 50 מיליליטר. חנות ב-20 ° C במקפיא שכותרתו עם תאריך של קציר תולעת ותאריך ג הס ברורollection. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאחר 21 ימים של אוסף הס מתרבות, להשליך תולעים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> 500-1,000 מיליליטר בריכה של supernatant הס (בדרך כלל ממניות קפוא, ולא כולל את אוסף שעות 24 הראשונים) ולהתרכז על מסנן 3,000 MWCO במכשיר אולטרה תחת לחץ חנקן. הערה: היה זהיר מאוד שלא לתת ליבש מסנן. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כדי להגדיר את מכשיר הסינון, ראשון לשטוף את הצד המבריק 3 קרום kDa למטה בכוס 1 ליטר עם מים מזוקקים במשך 3 x 20 דקות תוך בחישה. להרכיב את מכשיר אולטרה סינון לפי הוראות יצרן עם קרום מסנן צד מבריק למעלה. מקום בארון על 4 מעלות צלזיוס ולהעביר 50 מיליליטר של מים מזוקקים דרך לפני שמתחיל להתרכז הס נקווה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להוסיף צינור אחד של הס למכשיר הסינון כנדרש (100-140 מיליליטר ביום), עד הנפח מרוכז עד 2-5 מיליליטר. </li></ol></li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> על מנת להסיר מזהמים מכלי תקשורת התרבות הס המכיל, להוסיף 50 מיליליטר של PYRעוגן ללא PBS למכשיר הסינון ולאחר מכן להתרכז עד כ 2 מיליליטר. חזור על פעולה זו פעמיים (150 מיליליטר של PBS בסך הכל). העבר את הס לתוך צינור 15 מיליליטר, לעקר מסנן (עם מסנן 0.2 מיקרומטר) בזרימה למינרית ולמדוד ריכוז חלבון באמצעות ספקטרופוטומטר (E 280 = 10) או על ידי assay ברדפורד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> Aliquot, תווית עם מספר האצווה ותאריך, והקפאה ב -80 מעלות צלזיוס. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בצע assay LAL chromogenic על פי הפרוטוקולים של היצרן על כל אצווה של הס לפני השימוש. אם רמות LPS הן גדולות מ -1 U LPS חלבון 1 מיקרוגרם ל, לשקול לא באמצעות אצווה זה לin vivo ניסויים או בתרבויות חוץ גופית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבד את הס שנאסף ב 24 שעות בנפרד באותו אופן; הוא יכיל LPS וכמה חלבוני מארח ו, ואילו אינו מתאים לניסויים פונקציונליים, היא מהווה מקור שימושי של מולקולות בודדות שעשויים להיות מבודדת על ידי טיהור זיקת נוגדן חד שבטי. </li></ol&gt;

The authors have no conflicts of interest.

מחזור החיים של H. תמורת polygyrus באופן מהימן ועקבי. בעקבות בליעה טבעית או gavage פה של זחלי L3 ביום 0, ציסטות מתחילות להיווצר מתחת לserosa התריסריון ביום 5, התקדמו לmoults זחל ולאחר מכן מתעוררות כמו תולעים בוגרות לתוך לום הבטן מיום 10, ניתן לראות ביצים בצואה מ יום 14 וגרנולומות גלויים על פני השטח serosal התריסריון מיום 21. הפרוטוקול שתואר לעיל (ומסוכם באיור 6) מאפשר לייצור תפוקה גבוהה של ח מוצרי polygyrus הפרשה-הפרשה (הס), בנוסף להתאוששות אמינה של זחלי L3 קיימא לזיהומי מחזור ניסיוניים וחיים בעתיד. זיהום polygyrus H. הוכח להיות מגן במודלים של אסתמה תלויות בOVA או Der p 1 (אלרגן קרדית אבק הבית) 14. יתר על כן, דיכוי הדלקת בדרכי אוויר יכול להיות מועבר עם CD4 + CD25 + </sup&gt; תאי T רגולטורים 14 או CD19 + CD23 תאי B רגולציה היי 24 מאינם רגישים, ח &#39; polygyrus -infected עכברים. במודלים של אוטואימוניות, ח &#39; זיהום polygyrus הוכח להיות מדכא במודל הניסויי Encephalomyelitis אוטואימוניות (EAE) של טרשת נפוצה 9, ודיכוי ניתן להעביר גם עם תאי CD4 + T או CD19 + B תאים מעכברים נגועים 24. חומרי ההפרשה-הפרשה polygyrus Heligmosomoides (הס) לווסת את התגובה החיסונית המארחת ולדכא דלקת בתיווך Th2 על ידי מספר המנגנונים (שמתוארים באיור 7), ובם: א) עיכוב של היענות תאים דנדריטים לגירוי 25, ב ​​אינדוקציה) של CD4 תאים + Foxp3 + רגולציה T 18. וג) מצור של IL-33 ייצור 20. הס הוכח להיות מגן כאשר מנוהלרגישות t או אתגר במודל OVA-אלום של אסטמה 19 וגם כאשר מנוהל intranasally עם האלרגן תמצית Alternaria 20, דרך דיכוי של IL-33 שחרור מוקדם. הימנעות מזיהום LPS של הס היא לעתים קרובות חיונית להצלחה של ניסויים חיסוניים עתיד. בפרוטוקול שתואר כאן, השלבים הקריטיים בהשגת מטרה זו הם להבטיח כי פסולת הכלול בתוך שקיות המוסלין של מכשירי Baermann לא נכנס להכנת הס הסופית (ראו 2.10) ולהניח בצד את פתרון ES מהשעה 24 הראשונה של תרבות (ראה 5.1). בשנים האחרונות, הס התאפיין ביסודיות ברמת proteomic עם מעל 370 חלבונים שונים זיהו 26,27. בנוסף, ES מזחלי שלב 4 כבר נתון לניתוח proteomic 28. עבודה שוטפת כוללת אפיון הרכיבים העיקריים של סוכרי הס, ידועים להיות מאוד חיסוני 3, ומופרשת מיקרו-RNשכגלומים 50-100 ננומטר שלפוחית ​​או exosomes (Buck et al., הוגשה לפרסום). עם הקמתה של פרוטוקולים לשחזור לאיסוף ES מטפיל המערכת החיסונית הזה מאוד, ועם נתונים proteomic נרחבים זיהוי הרכיבים המולקולריים של הס, השלב מוגדר כעת לזיהוי והבדיקה רפואית של מולקולות בודדות מH. polygyrus שיכול לתווך השפעות מרכזיות על המערכת החיסונית המארח.

polygyrus Heligmosomoides הוא helminth עיכול עכברי טבעי הקשור באופן הדוק לטפילי נמטודות אדם מאוד-נפוצים 1. בניגוד לדגמים אחרים, כגון נמטודות Nippostrongylus brasiliensis, ח &#39; polygyrus קובע באופן עקבי זיהום כרוני בעכברים כתוצאה ישירה של מנגנוני המערכת החיסונית חזקה מרובים היא מעסיקה כדי לדכא את התגובה חיסונית המארח 2. יש polygyrus H. מחזור חיים ישיר: זחלי L3 מזהמים הם מעובדים על ידי העברת feco-שבעל-פה (או מנוהלים על ידי gavage האוראלי במעבדת ההגדרה), ואז הם נודדים לשכבת subserosal של התריסריון וencyst לפני ההחזרה ללומן המעי כ תולעים בוגרות שמונה כ ימים לאחר הדבקה ראשונית. ייצור הזדווגות והביצה מתרחש ביום 10 ואפשר לקצור תולעים בוגרות לתרבות ואוסף של חומרי הפרשה-הפרשה מday 14 3. ואילך H. polygyrus גם אינטראקציה עם מיקרופלורת commensal, עם לקטובצילוס המוגבר הנוכחית בעכברים נגועים רגישים 4-6, ורמות גבוהות של ח זיהום polygyrus בעקבות החשיפה של עכברים ללקטובצילוס 6. זיהום פעיל עם ח &#39; polygyrus הוכח כדי להגן מפני immunopathology במודלים של בעלי חיים רבים של אוטואימוניות 7-10, קוליטיס 11,12 והאלרגיה 13-16. כתוצאה מכך חל עניין רב בפוטנציאל של מולקולות טרמינל-הפרשה מטפיל זה (&quot;הס&quot;) ללמטה לווסת פתולוגיה in vivo 17,18. ואכן, השפעות מגנות נראות לאחר טיפול של עכברים עם מוצרי הס 19 דרך מסלולים אשר כעת עוברות זיהו 18,20. כאן אנו מתארים פרוטוקול לייצור אמין של polygyrus Heligmosomoides וההתאוששות של מוצרים המופרשיםשיכול להיות מנוצל נוסף עבור מגוון רחב של חקירות ביוכימיים וחיסוניות תפקודיות.

<table><tbody><tr><td>Amicon concentrator</td><td>Millipore</td><td>5112</td><td>Model 8050 50 ml&lt;br/&gt; http://www.emdmillipore.com/INTL/en/product/Stirred-Cell-Model-8050,-50%C2%A0mL,MM&lt;br/&gt; _NF-5122</td></tr><tr><td>Hanks&amp;rsquo; buffered salt solution</td><td>Sigma</td><td>H9394</td><td>500 ml&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/h9394?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Penicillin streptomycin</td><td>Invitrogen</td><td>15070-063</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15070063</td></tr><tr><td>L-glutamine</td><td>Invitrogen</td><td>25030-081</td><td>200 MM 100ml&lt;br/&gt; https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/25030081?ICID=search-25030081</td></tr><tr><td>Activated charcoal</td><td>Merck</td><td>1.09624.0500</td><td>18-35 mesh&lt;br/&gt; http://www.merckmillipore.com/GB/en/product/Charcoal-activated,MDA_CHEM-109624</td></tr><tr><td>Glucose solution</td><td>Sigma</td><td>G8769</td><td>100 ml 45% solution&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/g8769?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Falcon tubes</td><td>Sarstedt</td><td>62.547.254</td><td>50 ml&lt;br/&gt; http://www.scribd.com/doc/124320105/Sarstedt-Falcon</td></tr><tr><td>T25 Flasks</td><td>Sigma</td><td>CLS430639&amp;nbsp;</td><td>25cm vented flask&lt;br/&gt; http://www.sigmaaldrich.com/catalog/product/sigma/cls430639?lang=en&amp;amp;region=GB</td></tr><tr><td>Chromogenic LAL assay</td><td>Lonza</td><td>50-647U</td><td>QCL-1000 assay&lt;br/&gt; http://www.lonza.com/products-services/pharma-biotech/endotoxin-detection/endotoxin-detection-assays/endpoint-chromogenic-lal-assay.aspx</td></tr><tr><td>Gentamicin</td><td>Gibco</td><td>15710-049</td><td>100 ml&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15710072</td></tr><tr><td>Roswell Park Memorial Institute (RPMI) 1640</td><td>Gibco</td><td>11875093</td><td>500 ml; without L-glutamine&lt;br/&gt; http://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/11875093</td></tr></tbody></table>

cultivation of heligmosomoides polygyrus: an immunomodulatory nematode parasite and its secreted products

polygyrus Heligmosomoides (שנקרא בעבר dubius Nematospiroides, וגם מכונה על ידי כמה כH. bakeri) הוא helminth עיכול שמעסיק מנגנוני המערכת החיסונית מרובים להקים זיהום כרוני בעכברים ובקירבת זיהומי helminth אנושיים נפוצים. H. polygyrus נחקר בהרחבה בתחום הרגולציה חיסונית הנגזר helminth וכבר מצא לדכא בעצמה מודלים ניסיוניים של אלרגיה ואוטואימוניות (שניהם עם מוצרים מופרשים מבודדים זיהום ופעיל). הפרוטוקול המתואר במאמר זה מתאר ניהול H. מחזור החיים polygyrus לייצור עקבי של זחלי L3, התאוששות של טפילים בוגרים, ואוסף של המוצרים שלהם ההפרשה-הפרשה (הס).

רגישות לזיהום עם ה &#39; polygyrus נשלט במידה רבה על ידי הרקע הגנטי של זן העכבר (טבלת 1); עכברי C57BL / 6 וCBA רגישים 21,22 מאוד. לתחזוקה של מחזור החיים טפילים, ההיברידי F1 בין שני זנים אלה נבחר ליכולתו לעמוד נטל תולעת הרבה יותר גבוה ללא תחלואה (נזק אפיתל במעי מוגזם) בהשוואה לאו מתח הורי. האוראלי gavage של 400 זחלי L3 משמש כדי לשמור על מחזור החיים בעכברי F1 (וכתוצאה מכך נטל תולעת בוגר שמוצג באיור 2), בעוד במינון של 200 זחלי L3 משמש בדרך כלל לניסויים בזנים טהורים הומוזיגוטים (למשל, C57BL / 6 או BALBc). עם זאת, מינון זה ייתכן שיהיה הצורך מופחת בהתאם לשיתוף גורמים סביבתיים שעלולות להיות שונה בין מתקני בעלי חיים, כגון שינויים בפלורת מעיים. קבוצות של הס הוכיחו אפי לשעתקcacy במבחנים פונקציונליים ובהרכב חלבון; יתר על כן, כאשר supernatants מכל שבוע של התרבות רצוף נותח, עד לסך של 4 שבועות, פרופילי החלבון נמצאו דומה מאוד (איור 3). כאשר ריכוז הס נמדד על ידי assay ברדפורד (ראה 5.5), הכולל חלבון הוא בדרך כלל כ 1 / מ&quot;ג מיליליטר (איור 4). שיטה חלופית של ריכוז הס היא עם רכז צנטריפוגלי (למשל קרום חתוך 3-kDa Vivaspin), שבו דגימות הם הסתחררו במהירות של עד 4,000 גר &#39;בצנטריפוגה הרוטור את נדנדה, הסרת מלחי חיץ ורכיבי משקל מולקולריים נמוכים. ריכוז צנטריפוגלי הוא מתאים ביותר לנפחים קטנים עיבוד (1-10 מיליליטר) ומוגבלים לגורם ריכוז מרבי של כ 30x. בעת איסוף הס, הימנעות מזיהום היא קריטית. כדי למנוע זיהום עם מולקולות מארח, אנחנו זורקים את הס-המשךaining תקשורת ותרבות מ24 שעות הראשונות לאחר קציר תולעת בוגר מהמעי העכבר. אנחנו גם לכמת את רמת זיהום LPS בכל אצווה של הס עם assay Chromogenic LAL (ראה 5.7). 1 U של LPS משווה ל ~ 100 pg LPS והרמות מתחת זה נחשבות זניח 23. בידיים שלנו, רוב קבוצות של הס באופן משמעותי מתחת לגבול זה, הריכוז הממוצע של LPS בהס להיות 0.23 U / מיקרוגרם (איור 5). ההשפעות של LPS במודלי in vivo של פתולוגיה (למשל דיכוי תגובות אסתמה) דורשת לפחות 10 ng של LPS 23. מכאן בממשל vivo של 5 מיקרוגרם הס מיצווה עם 100 pg LPS / מיקרוגרם הס יכלול 500 pg LPS, הרבה מתחת לריכוז היעיל בי LPS הופך לבעיה. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig1highres.jpg" /> איור 1: מכשירי Baer Baermannהתקנת מכשירי מאן לאוסף של H. הבוגר polygyrus (כפי שתואר בסעיף 2). <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig2highres.jpg" /> איור 2: ממוצע נטל תולעת 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 תולעת L3 זחלי Mean מכביד 14 ימים לאחר הדבקה עם 400 זחלי L3. נקודות הנתונים המוצגות הן מ -19 סיבובים נפרדים של זיהום של עכברי C57BL / 6xCBA. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig3highres.jpg" /> איור 3: פרופילי חלבון של הס משבועות רצופים בפרופיל SDS-PAGE תרבות של חלבוני הס שנאספו בשבועות רצופים של התרבות. <img alt="איור 4" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig4highres.jpg" /> איור 4: </s<html> trong&gt; כמות סופית של הס מ -500 מדיה תשואה של חלבון הס מ -11 קבוצות שונות הנגזרות מכ -500 מיליליטר של supernatant התרבות המכיל ES מיליליטר. ממוצע ± SEM מוצג. <img alt="איור 5" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig5highres.jpg" /> איור 5: LPS זיהום של רמות הס של זיהום LPS ב 41 קבוצות של הס שנמדדו על ידי assay ameobocyte Limulus. ריכוז LPS חציון = 86 U למ&quot;ג של הס. <img alt="איור 6" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig6highres.jpg" /> איור 6: אנימציה סכמטי של H. סיכום polygyrus מחזור החיים של שלבי מחזור החיים של מפתח מgavage הפה של זחלי L3, דרך התאוששות של תולעי זחלים ומבוגרים לבידודה של הס. -together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 7" src="/files/ftp_upload/52412/52412fig7highres.jpg" /> איור 7: אנימציה סכמטי של הס ופונקציות ההשפעות החיסונית מפתח של מתווכים מסיסים וexosomes הכילו בתוך הס. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always" style=";text-align:right;direction:rtl"><tbody><tr><td> גנוטיפ (ומתח ברקע) </td><td> הפנוטיפ זיהום העיקרי </td><td> התייחסות </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td> זנים טהורים </td><td></td><td></td></tr><tr><td> / J, CBA, C3H </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22,29 </td></tr><tr><td> C57BL / 6 וC57BL / 10 </td><td> רגיש </td><td> 22,30 </td></tr><tr><td> BALB / ג, DBA / 2, 129 / J </td><td> ביניים </td><td> 22,31 </td></tr><tr><td> NIH, SJL, SWR </td&gt; <td> רגישות נמוכה </td><td> 22,32 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס לציטוקינים או קולטני ציטוקינים </td><td></td></tr><tr><td> IL-1β - / - </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td rowspan="2"> IL-1R - / - </td><td rowspan="2"> רגיש פחות (א); לא חל שינוי ברגישות אך גרנולומות המוגברת (ב) </td><td> (א) 33 </td></tr><tr><td> (ב) 34 </td></tr><tr><td> IL-2Rβ הטרנסגניים (C57BL / 6) </td><td> עמיד </td><td> 35 </td></tr><tr><td> IL-4 - / - </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 36 </td></tr><tr><td> IL-4R - / - (C57BL / 6 או BALB / ג) </td><td> מאוד רגיש </td><td> 22 </td></tr><tr><td> IL-6 - / - (BALB / c או C57BL / 6) </td><td> מאוד עמיד </td><td> 37 </td></tr><tr><td> IL-9 טרנסגניים(FVB) </td><td> עמיד </td><td> 38 </td></tr><tr><td> IL-21R - / - (C57BL / 6) </td><td> Th2 הלקוי, ירד gormation granuloma </td><td> 39,40 </td></tr><tr><td> IL-25 - / - (BALB / ג) </td><td> רגיש יותר </td><td> 33 </td></tr><tr><td> IL-33R (T1 / ST2) - / - (BALB / ג) </td><td> אין שינוי ברגישות </td><td> 33 </td></tr><tr><td> TGFβRIIdn (C57BL / 6) </td><td> Th1 הגבוה רגישות מוגברת, </td><td> 41,42 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס עבור סמני תא T </td><td></td></tr><tr><td> CD28 - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות שולית גבוהה יותר </td><td> 43 </td></tr><tr><td> CD86 (B7-2) - / - (BALB / ג) </td><td> פוריות גבוהה יותר </td><td> 44 </td></tr><tr><td> OX40L - / - (BALB / ג) </td><td> ופוריות גבוהה יותר160 #; </td><td> 45 </td></tr><tr><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td colspan="2"> מהונדס ללוקוסי חיסון מולדים </td><td></td></tr><tr><td> קולט מסוג 1 אינטרפרון (IFNAR) - / - (C57BL / 6) </td><td> פוריות גבוהה יותר, יותר גרנולומות </td><td> 34 </td></tr><tr><td> MyD88 - / - (C57BL / 6) </td><td> יותר גרנולומות עמידה יותר, </td><td> 34 </td></tr><tr><td> C-KitW / WV (WBB6) </td><td> רגיש יותר </td><td> 46,47 </td></tr></tbody></table> טבלת 1: זיהומים ראשוניים עם ח &#39; polygyrus בזנים שונים עכבר וגן-targetted גנטיים.

Watch this Scientific Journal Video about Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products at JoVE.com

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה &#39; מחזור החיים polygyrus.

טיפוח<em&gt; Heligmosomoides Polygyrus:</em&gt; נמטודות טפיל מערכת חיסונית ומוצרים המופרשים

Heligmosomoides polygyrus (formerly known as Nematospiroides dubius, and also referred to by some as H. bakeri) is a gastrointestinal helminth that ...

cultivation-heligmosomoides-polygyrus-an-immunomodulatory-nematode

Nanyang Technological University

Research

JoVE Journal

Immunology and Infection

Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

18.3K Views.  University of Edinburgh.  polygyrus Heligmosomoides הוא נמטודות עכבריות עם יכולות המערכת החיסונית חזקות שדומות לאלה של זיהום helminth אדם מאוד-שכיח. כאן אנו מתארים פרוטוקול לתחזוקה ארוך הטווח של ה ' מחזור החיים polygyrus. 

Video: Cultivation of Heligmosomoides Polygyrus: An Immunomodulatory Nematode Parasite and its Secreted Products

Unraveling Key Players of Humoral Immunity: Advanced and Optimized Lymphocyte Isolation Protocol from Murine Peyer's Patches

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense against pathogens. It is well established that Peyer&#39;s patches (PPs) have an essential role in the mucosal immune network by hosting several effector T and B cell subsets. A certain fraction of these effector cells, follicular T helper (TFH) and germinal center (GC) B cells are professionalized in the regulation of humoral immunity. Hence, the characterization of these cell subsets within PPs in terms of their differentiation program and functional properties can provide important information about mucosal immunity. To this end, an easily applicable, efficient and reproducible method of lymphocyte isolation from PPs would be valuable to researchers. In this study, we aimed to generate an effective method to isolate lymphocytes from mouse PPs with high cell yield. Our approach revealed that initial tissue processing such as the use of digestive reagents and tissue agitation, as well as cell staining conditions and selection of antibody panels, have great influence on the quality and identity of the isolated lymphocytes and on experimental outcomes.
Here, we describe a protocol enabling researchers to efficiently isolate lymphocyte populations from PPs allowing reproducible flow cytometry-based assessment of T and B cell subsets primarily focusing on&#160;TFH and GC B cell subsets.

In this study, we present a novel and effective protocol for the isolation of lymphocytes from Peyer&#39;s Patches (PPs), which can be subsequently used for in vivo and in vitro functional assays as well as flow cytometric studies of follicular T helper and germinal center B cells.

שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer

In the gut mucosa, immune cells constitute a unique immunological entity, which promotes immune tolerance while concurrently conferring immune defense ...

Cancer Research

New Tools to Expand Regulatory T Cells from HIV-1-infected Individuals

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to measurable increases in antigen-specific T cell responses in vaccine settings for cancer and infectious pathogens. However, their role in HIV-1 immuno-pathogenesis remains controversial, as they could either serve to suppress deleterious HIV-1-associated immune activation and thus slow HIV-1 disease progression or alternatively suppress HIV-1-specific immunity and thereby promote virus spread. Understanding and modulating Treg function in the context of HIV-1 could lead to potential new strategies for immunotherapy or HIV vaccines. However, important open questions remain on their role in the context of HIV-1 infection, which needs to be carefully studied.
Representing roughly 5% of human CD4+ T cells in the peripheral blood, studying the Treg population has proven to be difficult, especially in HIV-1 infected individuals where HIV-1-associated CD4 T cell and with that Treg depletion occurs. The characterization of regulatory T cells in individuals with advanced HIV-1 disease or tissue samples, for which only very small biological samples can be obtained, is therefore extremely challenging. We propose a technical solution to overcome these limitations using isolation and expansion of Tregs from HIV-1-positive individuals.
Here we describe an easy and robust method to successfully expand Tregs isolated from HIV-1-infected individuals in vitro. Flow-sorted CD3+CD4+CD25+CD127low Tregs were stimulated with anti-CD3/anti-CD28 coated beads and cultured in the presence of IL-2. The expanded Tregs expressed high levels of FOXP3, CTLA4 and HELIOS compared to conventional T cells and were shown to be highly suppressive. Easier access to large numbers of Tregs will allow researchers to address important questions concerning their role in HIV-1 immunopathogenesis. We believe answering these questions may provide useful insight for the development of an effective HIV-1 vaccine.

CD4+ Regulatory T cells are potent immune-modulators and serve important functions in immune homeostasis. The paucity of these cells in peripheral blood makes functional studies challenging, specifically in the context of HIV-1-infection. We here describe a method to isolate and expand functional CD4+ Tregs from peripheral blood from HIV-1-infected individuals.

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

CD4+ Regulatory T cells (Tregs) are potent immune modulators and serve an important function in human immune homeostasis. Depletion of Tregs has led to ...

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging from mild infections to life-threatening bronchiolitis. An important part of the pathogenesis of severe disease is an enhanced immune response leading to immunopathology.	Here, we describe a protocol used to investigate the immune response of human immune cells to an HRSV infection. First, we describe methods used for culturing, purification and quantification of HRSV. Subsequently, we describe a human in vitro model in which peripheral blood mononuclear cells (PBMCs) are stimulated with live HRSV. This model system can be used to study multiple parameters that may contribute to disease severity, including the innate and adaptive immune response. These responses can be measured at the transcriptional and translational level. Moreover, viral infection of cells can easily be measured using flow cytometry. Taken together, stimulation of PBMC with live HRSV provides a fast and reproducible model system to examine mechanisms involved in HRSV-induced disease.

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

Human respiratory syncytial virus (HRSV) can cause severe bronchiolitis in young infants. Part of the pathogenesis of severe HRSV disease is caused by the host immune response. Stimulation of primary human immune cells with HRSV provides a fast and reproducible model system to study activation of inflammatory pathways and infection.

Human respiratory syncytial  virus (HRSV) infections present a broad spectrum of disease severity, ranging  from mild infections to life-threatening ...

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are upregulated upon this ongoing antigen exposure and contribute to loss of proliferation, reduced cytolytic function, and impaired cytokine production by CD4 and CD8 T cells. In the murine model of LCMV infection, administration of blocking antibodies against these two pathways augmented T cell responses. However, there is currently no in vitro assay to measure the impact of such blockade on cytokine secretion in cells from human samples. Our protocol and experimental approach enable us to accurately and efficiently quantify the restoration of cytokine production by HIV-specific CD4 T cells from HIV infected subjects.
Here, we depict an in vitro experimental design that enables measurements of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells and their impact on other cell subsets. CD8 T cells were depleted from whole blood and remaining PBMCs were isolated via Ficoll separation method. CD8-depleted PBMCs were then incubated with blocking antibodies against PD-L1 and/or IL-10R&#945; and, after stimulation with an HIV-1 Gag peptide pool, cells were incubated at 37 &#176;C, 5% CO2. After 48 hr, supernatant was collected for cytokine analysis by beads arrays and cell pellets were collected for either phenotypic analysis using flow cytometry or transcriptional analysis using qRT-PCR. For more detailed analysis, different cell populations were obtained by selective subset depletion from PBMCs or by sorting using flow cytometry before being assessed in the same assays. These methods provide a highly sensitive and specific approach to determine the modulation of cytokine production by antigen-specific T-helper cells and to determine functional interactions between different populations of immune cells.

In Vitro Assay to Evaluate the Impact of Immunoregulatory Pathways on HIV-specific CD4 T Cell Effector Function

We developed an in vitro assay to investigate the role of immunoregulatory pathways in the regulation of cytokine secretion by HIV-specific CD4 T cells.

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

T cell exhaustion is a major factor in failed pathogen clearance during chronic viral infections. Immunoregulatory pathways, such as PD-1 and IL-10, are ...

Humanized NOD/SCID/IL2r&#947;null (hu-NSG) Mouse Model for HIV Replication and Latency Studies

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in high demand. With a close genetic and behavioral resemblance to humans, small animals such as the mouse are good candidates for human disease models, through which human-like symptoms and responses can be recapitulated. Further, the mouse genetic background can be altered to accommodate diverse demands. The NOD/SCID/IL2r&#947;null (NSG) mouse is one of the most widely used immunocompromised mouse strains; it allows engraftment with human hematopoietic stem cells and/or human tissues and the subsequent development of a functional human immune system. This is a critical milestone in understanding the prognosis and pathophysiology of human-specific diseases such as HIV/AIDS and aiding the search for a cure. Herein, we report a detailed protocol for generating a humanized NSG mouse model (hu-NSG) by hematopoietic stem cell transplantation into a radiation-conditioned neonatal NSG mouse. The hu-NSG mouse model shows multi-lineage development of transplanted human stem cells and susceptibility to HIV-1 viral infection. It also recapitulates key biological characteristics in response to combinatorial antiretroviral therapy (cART).

This protocol provides a method to establish humanized mice (hu-NSG) via intrahepatic injection of human hematopoietic stem cells into radiation-conditioned neonatal NSG mice. The hu-NSG mouse is susceptible to HIV infection and combinatorial antiretroviral therapy (cART) and serves as a suitable pathophysiological model for HIV replication and latency investigations.

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγnull מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

Ethical regulations and technical challenges for research in human pathology, immunology, and therapeutic development have placed small animal models in ...

Optimized Interferon-gamma ELISpot Assay to Measure T Cell Responses in the Guinea Pig Model after Vaccination

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, influenza, diphtheria, and viral hemorrhagic fevers. We have demonstrated that plasmid-DNA (pDNA) vaccine delivery into the skin elicits robust humoral responses in the guinea pig. However, the use of this animal to model immune responses was somewhat limited in the past due to the lack of available reagents and protocols to study T cell responses. T cells play a pivotal role in both immunoprophylactic and immunotherapeutic mechanisms. Understanding T cell responses is crucial for the development of infectious disease and oncology vaccines and accommodating delivery devices. Here we describe an interferon-gamma (IFN-&#947;) enzyme-linked immunospot (ELISpot) assay for guinea pig peripheral blood mononuclear cells (PBMCs). The assay enables researchers to characterize vaccine-specific T-cell responses in this important rodent model. The ability to assay cells isolated from the peripheral blood provides the opportunity to track immunogenicity in individual animals.

The development of the interferon-gamma ELISpot assay for guinea pig PBMCs allows the characterization of T-cell responses in this highly relevant model for studying infectious diseases. We have applied the assay to measure T cell responses associated with intradermal delivery of DNA vaccines.

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

The guinea pig has played a pivotal role as a relevant small animal model in the development of vaccines for infectious diseases such as tuberculosis, ...

Use of Single Chain MHC Technology to Investigate Co-agonism in Human CD8+ T Cell Activation

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist pMHC, through a process termed co-agonism. This protocol describes an experimental system to investigate co-agonism during human CD8+ T cell activation by expressing human MHC class I molecules presenting pre-determined peptides as single polypeptides (single chain MHC) in a xenogeneic cell line. We expressed single chain MHCs under conditions where low levels of agonist single chain p-MHC complexes and high levels of non-stimulatory single chain p-MHC complexes were expressed. Use of this experimental system allowed us to compare CD8+ T cell responses to agonist pMHC in the presence or absence of non-stimulatory pMHC. The protocol describes cell line transfection with single chain MHC constructs, generation of stable cell lines, culture of hepatitis B virus-specific human CD8+ T cells and T cell activation experiments simultaneously quantifying cytokine production and degranulation. The presented methods can be used for research on different aspects of CD8+ T cell activation in human T cell systems with known peptide MHC specificity.

This protocol describes the use of single chain MHC class I complexes to investigate molecular interactions in human CD8+ T cell activation: generation of engineered antigen presenting cells expressing single chain constructs, culture of human CD8+ T cell clone and T cell activation experiments.

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

Non-stimulatory self peptide MHC (pMHC) complexes do not induce T cell activation and effector functions, but can enhance T cell responses to agonist ...

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal host-microbe interactions. It is well established that different commensals exhibit a different potential to stimulate the host intestinal immune system. Such investigations involve vertebrate animals, especially rodents. Since increasing ethical concerns are linked with experiments involving vertebrates, there is a high demand for invertebrate replacements models. 
Here, we provide a Galleria mellonella oral administration model using commensal non-pathogenic bacteria and the possible assessment of the immunogenic potential of commensals on the G. mellonella immune system. We demonstrate that G. mellonella is a useful alternative invertebrate replacement model that allows the analysis of commensals with different immunogenic potential such as Bacteroides vulgatus and Escherichia coli. Interestingly, the bacteria exhibited no killing effect on the larvae, which is similar to mammals. The immune responses of G. mellonella were comparable with vertebrate innate immune responses and involve recognition of the bacteria and production of antimicrobial molecules. We propose that G. mellonella was able to restore previous microbiota balance, which is well known from healthy mammalian individuals. Although providing comparable innate immune responses in both G. mellonella and vertebrates, G. mellonella does not harbor an adaptive immune system. Since the investigated components of the innate immune system are evolutionary conserved, the model allows a prescreening and first analysis of bacterial immunogenic properties.

A Galleria mellonella Oral Administration Model to Study Commensal-Induced Innate Immune Responses

Here, we provide a detailed protocol for an oral administration model using Galleria mellonella larvae and how to characterize induced innate immune responses. Using this protocol, researchers without practical experience will be able to use the G. mellonella force-feeding method.

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

The investigation of the immunogenic potential of commensal bacteria on the host immune system is one essential component when studying intestinal ...

In Vivo Augmentation of Gut-Homing Regulatory T Cell Induction

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 million IBD patients. It is generally accepted that a dysregulated immune response to gut bacteria initiates the disease and disrupts the mucosal epithelial barrier. We recently show that gut-homing regulatory T (Treg) cells are a promising therapy for IBD. Accordingly, this article presents a protocol for in vivo augmentation of gut-homing Treg cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to produce locally high concentrations of two molecules de novo, active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and active vitamin A (retinoic acid or RA). We chose 1,25(OH)2D and RA based on previous findings showing that 1,25(OH)2D can induce the expression of regulatory molecules (e.g., forkhead box P3 and interleukin-10) and that RA can stimulate the expression of gut-homing receptors in T cells. To generate such engineered dendritic cells, we use a lentiviral vector to transduce dendritic cells to overexpress two genes. One gene is the cytochrome P450 family 27 subfamily B member 1 that encodes 25-hydroxyvitamin D 1&#945;-hydroxylase, which physiologically catalyzes the synthesis of 1,25(OH)2D. The other gene is the aldehyde dehydrogenase 1 family member A2 that encodes retinaldehyde dehydrogenase 2, which physiologically catalyzes the synthesis of RA. This protocol can be used for future investigation of gut-homing Treg cells in vivo.

Here we present a protocol for in vivo augmentation of gut-homing regulatory T cell induction. In this protocol, dendritic cells are engineered to locally produce high concentrations of the active vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D or 1,25[OH]2D) and the active vitamin A (retinoic acid or RA) de novo.

ב Vivo הגדלת האינדוקציה תא T הרגולציה התקינה של הבטן

Inflammatory bowel disease (IBD) is an inflammatory chronic disease in the gastrointestinal tract (GUT). In the United States, there are approximately 1.4 ...

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response against helminth infections, where it plays an important role in the expulsion of the parasite. In a murine model of Nippostrongylus brasiliensis infection, IL-9 is produced mainly by CD4+ T lymphocytes and innate lymphoid cells found in the lung, small intestine, and draining lymph nodes. Given the technical difficulties involved in the intracellular staining of IL-9, as well as the complexity of isolating hematopoietic cells from the small intestine upon infection, there is a pressing need for a comprehensive but straightforward protocol to analyze the expression of IL-9 in different lymphoid and non-lymphoid tissues in this model. The protocol described here outlines the kinetics of IL-9 produced by CD4+ T cells and innate lymphoid cells in the lung and small intestine, the main organs targeted by N. brasiliensis, as well as in the mediastinal and mesenteric lymph nodes, throughout the infection. In addition, it details the number of larvae needed for infection, depending on the cell type and organ of interest. This protocol aims to assist in the standardization of assays to save time and resources by offering the opportunity to focus on the specific cells, organs, and disease stages of interest in the N. brasiliensis infection model.

A Strategy for the Study of IL-9-Producing Lymphoid Cells in the Nippostrongylus brasiliensis Infection Model

IL-9-expressing T and ILC2 cells are induced during N. brasiliensis infection, yet their characterization has been largely overlooked in the infected intestine due to their low frequency and differential kinetics. This protocol describes the isolation of these cells from different target organs and confirmation of their identity via flow cytometry at different infection stages.

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis

IL-9 is a pleiotropic cytokine associated with various processes, including antitumor immunity, induction of allergic pathologies, and the immune response ...

טיפוח

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video

שחקני המפתח unraveling Humoral חסינות: מתקדם וממוטב לימפוציט בידוד פרוטוקול טלאים מאתר של Peyer

כלים חדשים כדי להרחיב תאי T רגולטוריים מאנשים HIV-1 נגוע-

An In vitro Model to Study Immune Responses of Human Peripheral Blood Mononuclear Cells to Human Respiratory Syncytial Virus Infection

במבחנה Assay כדי להעריך את ההשפעה של immunoregulatory מסלולים על פונקצית Effector הנייד HIV-ספציפית T מסוג CD4

העכבר (hu-NSG) humanized הנד/SCID/IL2rγ^null מודל עבור שכפול HIV ולימודי השהיה

אופטימיזציה אינטרפרון-גמא ELISpot Assay מידה תגובות תא T במודל שפן לאחר החיסון

שימוש בטכנולוגיה MHC שרשרת אחת לחקור Co-agonism ב אנושי CD8 + T Cell הפעלה

גלרייה mellonella מודל הניהול אוראלי את תגובות מערכת החיסון מולדים Study Commensal-Induced

ב Vivo הגדלת האינדוקציה תא T הרגולציה התקינה של הבטן

אסטרטגיה לחקר תאי לימפה מייצרי IL-9 במודל זיהום Nippostrongylus brasiliensis