שיטה זו יכולה לענות על שאלות מפתח אודות הפנוטיפ של ערכות המשנה מבודדות T ו- B של העכבר Peyer. בפרט, עוזר T זקיקי ואוכלוסיות תא B מרכז נביטה. היתרון העיקרי של טכניקה זו הוא שהיא מוותרת על מספר צעדי הכנה עבודה כגון עיכול מבוסס קולגן שפוגע באיכות ובזהות של הלימפוציטים המבודדים.
התחל על ידי הצבת עכבר בתמונת supine ועיקור הבטן עם 70% אתנול. בצע חתך בבטן קו האמצע דרך העור ואת הצייטונום מן הערווה לכלוב הצלעות כדי לפתוח את חלל הצלע ולאתר את cecum ואת צומת ileocecal. בצע דיסטלי ככל האפשר לחתוך בצומת כדי להפריד את המעי הדק מן cecum.
חותכים את mesentery עם מספריים כדי להסיר בזהירות את המעי הדק כולו עד הסוגר pyloric. לחטוף את הצומת בין pylorus ואת התריסיון כדי לנתק לחלוטין את המעי הדק מן חלל הבטן ולמקם את המעי הדק מבודד לתוך באר אחת של צלחת 6 באר המכיל מדיום RPMI קר בתוספת 10% נסיוב בקר עוברי, או FBS, על קרח. לאחר מכן, בעדינות להתסיס את הרקמות באופן ידני עד שכל המקטעים שקועים במדיום הקר.
כאשר כל המעיים נקצרו, להשתמש בממטרים כדי לתפוס את השומן mesenteric של קצה אחד של המעי ומניחים את המדגם, צד mesenteric למטה, על מגבת נייר. הרדימו את כל קטע המעי עם RPMI 10% FBS כדי למנוע התייבשות ודביקות ברקמות ולאתר את כתמי ה-Peyer, המופיעים כאגרגטים לבנים מרובי צלעות עם צורה דמוית כרובית בצד האנטי-מסנטרי של דופן המעי. כדי לקצור את טלאי ה-Peyer, השתמשו במספריים כירורגיים מעוקלים כשהעיקול פונה כלפי מעלה כדי להוציא בעדינות כל חלקה מגבולותיה הדיסטליים והאקסימיים, דאגו להוציא את רקמת המעי שמסביב, והמקמו את טלאי הפייר בארות בודדות של צלחת בת 12 בארות המכילה RPMI קר כקרח 10%FBS על הקרח בזמן איסוףם.
כאשר כל המדבקות נרכשו, השתמש במספריים כדי לחתוך את הקצה של קצה פיפטה מיקרו 1 מילימטר, כך הקוטר גדול מספיק כדי לשאפת את המדבקות של Peyer בודדים ולהעביר את מדבקות של הפייר לתוך צינורות חרוט 150 מילימטר לכל עכבר המכיל 25 מיליליטר של 37 מעלות צלזיוס RPMI 10% FBS. לאחר מכן מניחים את הצינור בשייקר מסלולי ב 37 מעלות צלזיוס עם תסיסה רציפה ב 125-150 סל"ד במשך 10 דקות. בסוף התסיסה, מעבירים את מדבקות ה-Peyer ל-140 מסנני תאים מיקרומטר לכל עכבר, ולהשתמש בקצה הגומי של בוכנה אחת של מזרק 10 מיליליטר לכל חיה כדי לשבש בעדינות את מדבקות ה-Peyer דרך רשת ה-50 מיליליטר בודדים.
לשטוף את מסנני עם 15-20 מיליליטר של RPMI קר 10% FBS ולאסוף את התאים על ידי צנטריפוגה. לאחר השלכת בזהירות את supernatant, resuspend התאים בערך 1 פעמים 10 לתאים 7 למיליליטר של ריכוז RPMI 10%FBS לספירה. לאחר מכן להעביר 2-2.5 פעמים 10 לתאים 6 לכל 200 microliters של בינוני לכל באר של צלחת תחתונה עגולה 96 היטב גלולה התאים על ידי צנטריפוגה.
לאחר השלכת supernatant עם הבהוב עדין, צנטריפוגה לשטוף את התאים 200 microliters של חיץ עומד. סמן את התאים ב-100 מיקרוליטרים של צבע יכולת הקיום הניתן לתיקון, מדולל במאגר ללא חלבון למשך 30 דקות ב-4 מעלות צלזיוס, מוגן מפני אור, ואחריו 2 שטיפות ומאגר כתמים טרי. לאחר השלכת supernatant, resuspend את כדורי ב 20 microliters של בלוק FC עבור 15 דקות דגירה ב 4 מעלות צלזיוס, ואחריו תוספת של 80 microliters של קוקטייל נוגדנים משטח ראשוני של עניין, במשך 30 דקות על קרח, מוגן מפני אור.
בסוף דגירה נוגדנים פני השטח, צנטריפוגה לשטוף את התאים פעמיים בנפח עודף של חיץ כתמים, ו resuspend כדורי ב 100 microliters של פתרון כתמים משטח משני, בתוספת סטרפטבידין. לאחר 15 דקות על קרח מוגן מפני אור, צנטריפוגה לשטוף את התאים 2 פעמים במאגר כתמים טריים לשימוש חוזר כדורי ב 200 microliters של קיבעון, פתרון עבודה permeablization עבור לא יותר מ 20 דקות דגירה על קרח, מוגן מפני אור. בסוף הדגירה, צנטריפוגה הצלחת מיד, ואחריו צנטריפוגה היה 200 microliters של חיץ permeablization לכל באר.
לאחר מכן, יש למחזר את התאים ב-20 מיקרוליטרים של בלוק FC, מדוללים במאגר פרמבליזציה כפי שהוכח, ולאחר מכן תוספת של 80 מיקרוליטרים של קוקטייל הנוגדנים תאיים של עניין, במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר, מוגן מפני אור. לשטוף את התאים עם 100 microliters של חיץ permeablization, ואחריו לשטוף שני 200 microliters של חיץ permeablization. לאחר מכן, תן שימוש חוזר כדורי ב 200 microliters של חיץ מכתים, ולהעביר את התאים המתאימים 5 צינורות ניתוח ציטומטרי זרימה מיליליטר המתאים, בנפח סופי של 400 microliters של חיץ מכתים לכל צינור.
הטלאים של מאייר אינם מופצים באופן שווה לאורך המעי הדק, אך הם מקומיים בצפיפות רבה יותר לכיוון הקצוות הדיסטליים וה ופרוקסימליים של הרקמה. פרוטוקול זה מקל על הבידוד של אוכלוסיית לימפוציטים טלאי של מאייר המדגים התפלגות מפוזרת בצד הקדמי, דומה לזה שנצפה עבור טחול, עם יותר מ 95% הכדאיות התא. CD4 CD19 תאים חיוביים כפולים מהווים כ -1% מכלל אוכלוסיית הלימפוציטים של התיקון של מאייר.
אלה מבטאים רמות גבוהות של CXCR5 ו- GL7, אשר, כאשר לא נשלל, יכול להוביל לתוצאות חיוביות שגויות gating של תא Follicular ו נביטה מרכז B, בהתאמה. בהשוואה לאיברים משניים אחרים של הלימפה, המדבקות של מאייר מציגות יחס גבוה משמעותית של תאי B של מרכז נביטתי, בטווח של 2-10% מכלל אוכלוסיית תאי B בתנאי מצב יציבים. בדומה לתאי B של מרכז נביטתי, שבר התא הזקיקי T-helper משתנה גם בעכברים בודדים שאינם מחוסנים, עם טווח של 10-20% מכלל, אוכלוסיית הטלאים T-lymphocyte של CD4 Positive Peyer.
עיכול אנזימטי מבוסס קולגן מוביל להפחתה מסיבית של ביטוי התא הזקיקי CXCR5 T-helper, תוך השארת הביטוי של מולקולות משטח אחרות לא מושפע. לאחר התפתחות זו, טכניקה זו סללה את הדרך לזיהוי גורמים תאיים מרכזיים בתוך טלאי ה-Peyer המעורבים בחסינות ריר ודמה.
