Name: screening foodstuffs for class 1 integrons and gene cassettes
Uploaded: 2015-06-19T13:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 37 s
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미카엘라 홀, 라리사 스포 및 기술 지원에 대한 구스타보 타바레스에게 감사드립니다.

원시 먹거나 가볍게 조리 식품은 인간의 건강에 가장 관심사이다. 예를 들면 샐러드 야채, 과일, 어패류와 갑각류를 포함한다. 1. 샘플 컬렉션 <ol><li> 오염을 최소화 조건에서 샘플을 수집 및 전송시 별도의 청소 가방에 저장된다. 수집되면, 샘플은 4 ℃에서 보관하고 24 시간 이내에 처리해야한다. </li></ol> 2. 농축 문화 준비 <ol><li> 과일과 야채 : <ol><li> 튼튼한 비닐 봉지에 재료의 약 10g을 놓습니다. 큰 재료를 처리하는 경우, 청과물의 피부에 집중한다. 30 초 동안 패들 블렌더에 90 ml의 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 및 프로세스를 추가한다. 패들 믹서를 사용할 수없는 경우, 대안 적으로, 재료는 수동으로 교반 할 수있다. </li><li> 이 50 ㎖ 팔콘 튜브에 액체를 수집합니다. 펠렛 박테리아에 7 분 동안 4,000 XG에 원심 분리기 튜브. </lI&gt; <li> 조심스럽게 멸균 루리아 베르 타니 (LB) 배지 30 ml의 펠렛 박테리아를 뜨는을 제거하고 일시 중지합니다. </li><li> 37 ° C에서 다른 25 ° C에서 하나의 튜브를 잡고, 통 O / N에 품어. 문화는 분당 200 진동 (OPM)에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다. </li></ol></li><li> 해산물 : <ol><li> 멸균 된 핀셋 및 핀셋을 사용하여 위장 (굴) 또는 소화관 (새우)를 해부하고 0.1 M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0의 200 μl를 함유하는 멸균 된 1.5 ㎖의 튜브에 배치했다. 균질를 만들 수있는 샘플을 담가서 부드럽게. </li><li> 이 멸균을 5 ml 튜브에 LB 배지 5 mL를 분배하고, 해산물 균질 각각 접종. </li><li> 25 ° C와 다른 37 ° C에서 하나의 튜브를 들고, 셰이커 O / N에 품어. 문화는 200 OPM에서 동요한다. 4 ℃에서 보관 배양 될 때까지이 필요합니다. </li></ol></li></ol> Integrons 3. 선별 문화 2. 필요한 경우, 로렌스 (2011) (24)는이 저널의 이전 문제에 PCR 최적화 및 문제 해결 방법을 설명하고있다. <ol><li> 삶은 DNA 준비 : <ol><li> 멸균 0.5 ㎖의 PCR 튜브에 풍부한 문화의 100 μl를 분배. 수욕 또는 열차 단을 사용하여, 10 분간 99 ° C로 샘플을 가열한다. 2 분 동안 얼음에 진정을 스냅. </li><li> 5 분 14,000 XG에 마이크로 원심은 세포 파편 펠렛합니다. 얼음으로 돌아갑니다. DNA 샘플은 요구 될 때까지 -20 ℃에서 냉동 될 수 있지만, 얼음 위에서 해동되어야한다. </li></ol></li><li> PCR을 사용하여 클래스 1 integrons 선별 : 참고 : O / N 배양에서 혼합 문화가 HS463a / HS464 PCR 프로토콜 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integrons 상영된다. <ol><li> 잠재적 SOU에서 멀리, 얼음에 모든 PCR 시약을 녹여DNA를 오염의 경우 RCEs. 음성 대조군 (표 2)를 포함하여, 샘플 당 48 μL의 PCR mastermix을 확인합니다. 배리어 팁을 사용하여, 각각의 튜브에 PCR 마스터 믹스의 48 μl를 분배. </li><li> 장벽 팁을 사용하여 개별 PCR 튜브에 해동 DNA의 2 μl를 추가합니다. PCR의 열 순환기에 적절한 프로그램을 실행합니다. </li><li> 증폭의 결과를 평가하기 붓고 TBE 완충액 (90 mM 트리스 - 보레이트, 2 mM의 EDTA)에서 실행되는 2 % 아가 로즈 겔상에서 PCR 생성물 7 μl를 electrophorese. 100 bp의 사다리 같은 분자량 마커를 포함한다. </li><li> 포스트 DNA 얼룩 겔을 염색하고, UV 트랜스 일루미네이터를 이용하여 시각화. 음성 대조군에서 더 증폭이 없었다 있는지 확인합니다. 특정 샘플에 대한 약 470 BP에 강한 밴드가 혼합 된 문화 클래스 1 integron을 가지고 박테리아가 포함되어 있음을 나타냅니다. 순수한 식민지 이제 긍정적 인 PCR을 반환 된 혼합 된 문화에서 고립 될 것이다. </li></ol></li></ol><ol><li> 직렬 희석 및 확산 판 : 주 : PCR 양성 혼합 배양 물로부터 단일 콜로니를 분리는, 혼합 배양 직렬 인산 나트륨 완충액에서 10 배 희석 한 후 단일 콜로니를 복구하기 위해 도금된다. <ol><li> 0.1M 인산 나트륨 완충액, pH가 7.0 9 ml의 혼합 문화의 한 ML을 추가하고 반전에 의해 혼합. 10-8의 일련의 희석 될 때까지 인산염 버퍼의 또 9 ml의 희석 1 mL를 넣어 반복하는 것은 도달한다. </li><li> 중복, LB 한천 상 10-4 -8 10 희석액 100 ㎕를 확산. 초기의 혼합 배양에 사용 된 동일 온도에서 플레이트 O / N을 부화. 플레이트는 그러나 그것은 매우 신속하게 단일 콜로니를 처리하는 것이 가장 좋습니다, 필요한 때까지 4 ° C에 저장할 수 있습니다. </li></ol></li><li> 단일 콜로니 선택과 삶은 DNA 준비 : <ol><li> 자체 직렬 희석 판에서 하나의 식민지를 선택이러한 콜로니의 크기, 모양, 색 등의 기준을 사용하여 가능한 한 많은 다른 유형의 콜로니 lecting. 확산 판에서 하나의 식민지를 선택 멸균 이쑤시개를 사용합니다. </li><li> 식민지에 이쑤시개를 터치 한 다음 멸균 물 100 μl를 포함하는 PCR 튜브에 전송할 수 있습니다. 콜로니 다수가 상영되어야하는 경우, 콜로니에서 마이크로 타이 터 트레이를 제조 할 수있다. 물에 일부 셀을 제거하는 손가락 사이 이쑤시개 스핀. </li><li> 동일한 이쑤시개를 이용하여 콜로니의 연속로 LB 플레이트에 접종. 각 연속 약 1cm 길면 큰 콜로니 번호 표지 플레이트 상에 저장 될 수있다. 당신이 분리의 적절한 수를 선택할 때까지 3 단계 1을 반복합니다. </li><li> 초기의 농축 된 배양에 사용 된 것과 동일 온도에서, LB 플레이트 O / N을 부화. 필요한까지 배양 후 4 ℃에서 저장 될 수있다. </li><li> 세균 현탁액에서 DNA를 제조, OU 등의 단계를 따릅니다3.1 절에 tlined. 3.2 절에 설명 된대로 순수 배양 용 해물의 심사를 들어, HS463a / HS464 PCR을 수행합니다. 즉 양성 PCR은 게놈 DNA (5 장)의 제조에 사용하고, 또한 분석을 위해 복귀한다 분리합니다. </li></ol></li></ol> 구슬이 25 잔 사용 (5)의 게놈 DNA를 추출 Integron 양성 단일 콜로니 <ol><li> 4.2 절에 고립 된 순수 문화의 샘플 LB 배지 5 mL를 접종한다. 초기 농축 배양에 사용 된 동일한 온도에서 떨고, O / N을 품어. </li><li> 펠렛 세포는 7 분 동안 4,000 XG에서, 다음 상층 액을 제거합니다. 용균 매트릭스 E 빨리 준비 튜브에서 1 mL의 CLS-TC 용액 중에 펠렛 세포를 재현 탁. 비드 박동 기계를 사용하여, 30 초 동안 5.5 m / sec의 샘플을 처리합니다. </li><li> 원심 분리기 5 분 14,000 XG에 튜브 및 멸균 1.5 ML 튜브에 뜨는 70​​0 μl를 복구 할 수 있습니다. </li><li> 6 M의 구안과 5 : 1로 희석 결합 매트릭스의 700 μl를 추가idinium 티오 시아 네이트는 5 분 동안 실온에서 혼합한다. 1 분, 폐기 뜨는 14,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 펠렛을 완전히 재현 탁 될 때까지 800 ㎕의 염수 세척 에탄올 (70 % 에탄올, 0.1 M 아세트산 나트륨) 및 소용돌이를 추가한다. 1 분 동안 14,000 XG에 실온에서 5 분, 원심 분리기에 대한 세척하고 상층 액을 버린다. 다음 5 분 동안 공기 건조하도록 허용 필요한 경우 마이크로 피펫을 사용하여, 모든 상층 액이 제거 된 확인합니다. </li><li> 로 pipetting 아래 200 ㎕의 TE (10 mM 트리스 - 염산, 1mM의 EDTA, pH를 7.6)의 펠렛 행렬을 재현 탁. 3 분 동안 실온에서 품어. 3 분 및 멸균 튜브에 전송 용출 된 DNA의 160 μl를 14,000 XG에 원심 분리기. DNA 추출 수율 및 무결성을 확인하는 2 % w / v를 아가 로스 겔에서 게놈 DNA 추출의 분취 량을 실행. 정제 된 게놈 DNA는 -20 ° C에서 저장 및 PCR 시험을 위해 필요할 때 얼음에 해동된다. </li></ol> 6. 진단의 PCR 및 DNA 시퀀싱 참고 :섹션 5에서 제조 게놈 DNA는 모든 진단의 PCR에 사용되며, 클래스 1 integrons에 대한 양성 반응을 확인합니다. <ol><li> 간단히 20 초 동안 14,000 XG에서 DNA 샘플 및 펄스 스핀 와동, 얼음에 게놈 DNA를 녹여. 분리가 471 bp의 증폭 물 (3.2 절)에 대한 긍정적 인 것을 확인한 HS463a / HS464 (표 1)를 사용하여 클래스 1 integron - 인테그라 유전자에 대한 PCR을 반복합니다. </li><li> 종 양성 문화 수준의 식별 작은 소단위 rRNA 유전자 (16S rDNA 염기)를 분석함으로써 달성된다. 프라이머 F27 / r1492 (표 1)를 사용하여 유전자를 증폭 16S. 전기를 사용하여 PCR 제품을 확인합니다. 모든 박테리아 타겟은 약 1,450 BP의 16S 증폭 물을 생성한다. </li><li> 시퀀스 16S rRNA 유전자 증폭 물은 종의 신분을 확인하는,하지만 같은 종의 박테리아 수 있습니다 단계 6.2에서 여러 긍정적 인 PCR들을 될 가능성, 이러한 긍정적 많은 있기 때문에, 우리는 먼저저기서 다른 종을 구별한다16S PCR 생성물 g 제한 소화. <ol><li> 제한 효소 Hinf 1 16S PCR의 분취 다이제스트. 상관 4 BP 절단 부위는 인식 할 것이다 효소하지만 Hinf 1 16S 타겟으로부터 양호한 다이버 시티를 생성하고, 신뢰성, 저렴 효소이다. </li></ol></li><li> 30 μL 제한은 멸균 튜브에 mastermix (표 2) 소화되지 않은 purfied 16S PCR 산물 20 μL를 추가 설정합니다. 37 ° C의 물을 욕조의 O / N에 품어. 2 % 아가 로스 겔에 다이제스트를 확인합니다. </li><li> Hinf 일 소화에 의해 생성 된 패턴 점수. 동일한 16S 제한 프로파일과 균주 같은 종 될 가능성이 높다. 오히려 각 Hinf 1 제한 패턴의 가장 세 대표에 모든 16S PCR 제품, 순서를 시퀀싱보다. </li><li> 상업용 키트를 사용하여 PCR (16S)의 제품을 정제. 단일 가닥 엑소 뉴 클레아 키트를 사용할 수 있지만, 열 기반 또는 석출 방법도 uninc 제거 잘 작동orporated 프라이머 및 단일 가닥 DNA를. 서열 프라이머 R910 (표 1)를 이용하여 시퀀싱 기능에 의해 지정된대로 반응을 설정 16S 증폭. </li><li> BLASTN 기능 (함께 NCBI의 DNA 데이터베이스를 심문 얻어진 DNA 서열을 사용 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). 보다 큰 97 %의 염기 ID는 보통 종의 신분으로한다. </li></ol> 7. 매핑 및 Integrons 및 카세트 배열의 특성 참고 : 인간이 지배하는 생태계에서 나오는 1 급 integrons은 모든 시료에서 가장 흔한 integrons 될 가능성이 있습니다. 이러한 integrons 모든 최근 단일 기점을 가지며, 따라서 고도로 보존 된 DNA 서열 (5)를 갖는다. <ol><li> 클래스 사이에 한 사람의 소스에서 나오는 integrons과를 수행하여 환경 시료에서 자연적으로 발생하는 것과 차별화프라이머와 PCR을 intI1F165 / intI1R476 10 (표 1)을 설정합니다. 참고 : 환경 클래스 1 integrons이 제품을 생성하지 않습니다 동안 임상 또는 공생 박테리아에서 1 등급 integrons는 ~ 300 bp의 제품을 생성합니다. </li><li> 프라이머 세트 HS458 / HS459와 카세트 배열을 증폭하여 임상 integrons을 특성화. 이 PCR은 가장 카세트 배열 intI1 말단과 3 &#39;보존 된 세그먼트 사이의 영역을 증폭한다. 카세트의 번호 및 ID가 가변이기 때문에, PCR 산물의 크기도 달라진다. </li><li> 증폭 산물을 정제하고 증폭 프라이머를 이용하여 각 DNA 시퀀싱. BLASTN 기능 (사용의 DNA 데이터베이스 심문 시퀀스를 사용 <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi을</a> ). </li><li> integron 유전자 카세트에 대한 많은 데이터 침착하기 때문에, 표준화 된 명칭 (9)에 따라 카세트의 이름을 확인합니다S는 일관성이 없거나 모호한 이름을 사용합니다. 이러한 전달률, 병원성 또는 독성 8,21 증가하는 유전자를 포함, 새로운 표현형을 인코딩 할 수 있기 때문에, 새로운 유전자 카세트에 특히주의를주십시오. 참고 : 클래스 1 integron의 전임상 형태는 여전히 자연 환경에 순환. 특히, 활성 테네시 (402) 트랜스포존에 링크 된 것을 가장 관심 (26)의이다. 이러한 integrons의 카세트 배열 프라이머 세트 HS458 / HS459으로 증폭되지 않지만 카세트 콘텐츠에 종속 변수 크기의 증폭 물을 생성 MRG284 / MRG285 프라이머 세트 (표 1)로 증폭 될 수있다. PCR 제품은 정제 및 7.2에 설명 된대로 DNA는 염기 서열을해야합니다. </li></ol>

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D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Antibiotic+resistance+in+the+environment:+A+link+to+the+clinic.">Antibiotic resistance in the environment: A link to the clinic.</a> Curr. Opinion Microbiol. 13 (5), 589-594 (2010).</li><li>Stokes, H., Nesbo, C., Holley, M., Bahl, M., Gillings, M., Boucher, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Class+1+integrons+predating+the+association+with+Tn402.-like+transposition+genes+are+present+in+a+sediment+microbial+community.">Class 1 integrons predating the association with Tn402.-like transposition genes are present in a sediment microbial community.</a> Journal of Bacteriology. 188, 5722-5730 (2006).</li><li>Lane, D. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> Nucleic Acid Techniques in Bacterial Systematics. , 115-175 (1991).</li><li>Holmes, A. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Recombination+activity+of+a+distinctive+integron-gene+cassette+system+associated+with+stutzeri.+populations+in+soil.">Recombination activity of a distinctive integron-gene cassette system associated with stutzeri. populations in soil.</a> Journal of Bacteriology. 185, 918-928 (2003).</li></ol>

저자는 공개 관련 아무것도 없다.

integrons과 연관된 유전자 카세트의 식별은 잠재적으로 새로운 기회 병원체의 출현을 예측 인간 먹이 사슬에 병원체에 대한 경로를 추적 및 식별하는 새로운 저항에 중요한 단계이며 독성이 8,21,26를 결정. 이 논문의 목적은, 클래스 1 integrons에 대한 샘플을 선별 자신의 카세트 배열을 특성화하고 상주하는 세균의 종을 식별하기위한 효율적인 방법을 설명했다. 프로토콜의 중요한 단계는 좋...

항생제의 발견은 20 세기의 가장 위대한 과학적 업적 중 하나였다. 그러나, 항생제의 사용 및 남용 항생제 내성균의 급속한 발전을 주도하고 있으며, 이들은 지금 21 세기 공중 보건에 심각한 위협. 대부분의 치료 옵션에 대한 내성 균주의 증가는 우리가 항균 약물이 더 이상 1,2 효과적 시대를 입력 할 수있는 가능성을 제기한다. 항생제 내성을 부여 유전 기계 년 3 수백만의 인간과 항생제 선택 압력을 낳은, 고대 시스템입니다. 이러한 플라스미드, 트랜스포존, 게놈 섬, 통합 공역 요소와 integrons 모바일 유전 적 요소, 내 세균 종 4 사이에 모두 항생제 내성 유전자 (ARG)를 배포 할 수 있습니다. 이들 중에서는 integrons 불구 ARG의 확산에 중요한 역할을 해왔다그들은 박테리아 게놈 5에 플라스미드 및 동원 및 삽입 트랜스포존에 의존한다는 사실. Integrons는 integron-인테그라를 이용한 유전자 카세트를 캡처하고 인코딩 integron -6,7- 프로모터 (도 1)를 이용하여 카세트를 표현한다. 유전자 Integron 카세트는 누구의 제품 항생제 나 소독제 (8)에 대한 내성을 부여 할 수 있습니다 단일 오픈 리딩 프레임 (ORF)로 구성된 소형 모바일 요소입니다. 클래스 1 integrons은 가장 일반적으로 그들이 집단적으로 (130) 다른 항생제 내성 유전자 카세트 (9)을 통해 획득 한 임상 분리 5에서 회복 integrons 있습니다. 인간 관련된 공생과 병원성 세균에 클래스 1 integrons의 확산은 이러한 유전 적 요소 (10)의 큰 숫자를 포함하는 인간의 폐기물을 생성합니다. 클래스 1 integrons를 포함 약 10 (19) 박테리아는 하수 슬러지 매년 전을 통해 출시n은 영국 (11). 그것은 항생제 저항을 부여 클래스 1 integrons 지금은 야생 조류, 물고기, 그리고 다른 나라의 야생 동물 12-14의 미생물 검출되고 있다는 것을 따라서 놀라운 일이 아니다. 새로운 유전자 카세트 및 기타 모바일 요소와 복잡한 재 배열의 인수는 특히 하수 처리장 및 기타 수역 15-18에서 계속 발생 이후 다시 환경으로 integrons을 떼면, 중요한 공중 보건 위협. 자연 환경은 새로운 저항의 결정 요인과 기회 병원균 (19, 20)를위한 비옥 한 모집 땅이된다. 소설 integron 함유 세균과 새로운 인수는 오염 된 물과 음식 (21, 22)을 통해 인간 사회에 다시 동그라미를 할 수 있습니다. 환경 감시 인수의 이해와 미래 23 항생제 내성을 관리하는 키 전략이다. 특히,주의 원 먹거나되는 식품에 지불해야한다이러한 새로운 모바일 요소와 병원체의 전송을위한 가장 큰 위협이 있기 때문에 가볍게 요리. 이 프로토콜, 1 integrons 및 식품에 연관된 유전자 카세트, 탐지 식별하고 클래스의 특성에 대한 효율적인 접근 방법 (그림 2) 설명되어 있습니다. 배양 및 중합 효소 연쇄 반응 (PCR)의 조합을 사용하여, 신속 integrons 복잡한 세균 공동체 및 개별 분리 물에서 검출 될 수있다. 박테리아와 integron 관련 유전자 카세트의 형태와 정체성의 종류를 식별하기위한 방법이 제공됩니다. 방법은 식물과 동물 식품 광범위한 적합하고, 통상적 인 작업 흐름의 예는 이들 식품 유형마다 주어진다.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>HinFI restriction enzyme</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA</td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Used as a size standard on all agarose gels</td></tr><tr><td>GelRed DNA stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>CLS-TC Solution</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep tubes</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.</td></tr><tr><td>Binding matrix</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.</td></tr><tr><td>Fast Prep machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>Number of options available</td><td>MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit &lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.mpbio.com&lt;/a&gt; for more information</td></tr></tbody></table>

screening foodstuffs for class 1 integrons and gene cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

혼합 문화와 intI1에 대한 박테리아 균주의 선별 프라이머 세트 HS463a / HS464 PCR은 클래스 1 integron-인테그라 유전자 intI1 (도 1)의 존재를 검출하는데 사용될 수있다. 이 프라이머 세트는 혼합 된 문화에서 intI1을 검출 잘 작동하고, 또한 확산 판 (그림 2)에서 수확 박테리아 콜로니를 선별하는 데 사용됩니다. 긍정적 인 균주는이 프라이머 세트 ...

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Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

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Research

JoVE Journal

Environment

9.0K 조회수.  Macquarie University. This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs. 

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Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

사이트 특정 박테리아 염색체 공학 : ΦC31 Integrase 중재 카세트 거래소 (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

연구

생체공학

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

유전학

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the study of the mobilization of naturally occurring conjugative plasmids, using two naturally-occurring plasmids as an example. These protocols rely on the differential presence of selectable markers in donor, recipient, and conjugative plasmid. Specifically, the methods described include 1) the identification of natural conjugative plasmids, 2) the quantification of conjugation rates in solid culture, and 3) the diagnostic detection of the antibiotic resistance genes and plasmid replicon types in transconjugant recipients by polymerase chain reaction (PCR). The protocols described here have been developed in the context of studying the evolutionary ecology of horizontal gene transfer, to screen for the presence of conjugative plasmids carrying antibiotic-resistance genes in bacteria found in the environment. The efficient transfer of conjugative plasmids observed in these experiments in culture highlights the biological relevance of conjugation as a mechanism promoting horizontal gene transfer in general and the spread of antibiotic resistance in particular.

Detection of Horizontal Gene Transfer Mediated by Natural Conjugative Plasmids in E. coli

Conjugation mediates horizontal gene transfer by mobilizing plasmid DNA across two different cells, facilitating the spread of beneficial genes. This work describes a widely-used method for the efficient detection of conjugative plasmid transfer, based on the use of differential markers in the conjugative plasmid, donor, and recipient to detect transconjugation.

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

Conjugation represents one of the main mechanisms facilitating horizontal gene transfer in Gram-negative bacteria. This work describes methods for the ...

Screening and Isolation of C-Glycoside-Cleaving Intestinal Bacteria

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, anti-inflammatory, antiviral, antioxidant, and antineoplastic activities. In C-glycosides, the anomeric carbon of the sugar moiety is directly connected to an aglycone through carbon-carbon bonding. Compared with O-glycosides, C-glycosides are structurally stable and resistant to acids and enzymes. Consequently, they are typically unbreakable, resulting in poor absorbability and low bioavailability. Interestingly, some intestinal bacteria can cleave C-C glycosidic bonds, providing a specific and environmentally friendly biological approach to degrade C-glycosides. In this study, a set of standard operating procedures (SOPs) was developed for screening intestinal bacteria capable of cleaving C-C glycosidic bonds based on the biotransformation model of natural compounds. The SOPs include the preparation and enrichment of intestinal bacteria, activity-oriented screening, and activity validation in a low-carbon source medium. This methodology provides a foundational reference for researchers aiming to isolate and study these specialized functional bacteria.

This study establishes a set of standard operating procedures (SOPs) for efficiently screening and isolating intestinal bacteria capable of cleaving C-glycosides.

C-배당체-절단 장내 세균의 스크리닝 및 분리

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, ...

생화학

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

면역학 및 감염병학

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

생물학

Multidrug Efflux 시스템 특성화를 위한 Single-copy 유전자 발현

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

저자 스포트라이트: Advancing Antibiotic Resistance Research Using an Efflux-Deficient Bacterial Strain and a Single-Copy Gene Expression System (유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 항생제 내성 연구 발전)

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

클래스 1 Integrons 유전자 카세트 식품을 선별

요약

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Excisable 항 생 저항 카세트와 P1 변환 하 여 대장균 에서 생산 유전자 삭제

말라리아의 아노필스 벡터에서 사이트 지향 φC31 중재 통합 및 카세트 교환

대장균에서 천연 접합 플라스미드에 의해 매개되는 수평 유전자 전달의 검출

C-배당체-절단 장내 세균의 스크리닝 및 분리

살 모 넬 라 종의 심사에 대 한 높은 처리 플랫폼 /Shigella 종

화학적 매개 종간의 상호 작용을 검출하는 공 배양을 사용하여

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석

유출 결핍 박테리아 균주 및 단일 복제 유전자 발현 시스템을 사용한 Acinetobacter baumannii 의 다제 유출 시스템 특성 분석