Graças a Michaela Hall, Larissa Bispo e Gustavo Tavares de Assistência Técnica.

Os géneros alimentícios que são comidos crus ou levemente cozidos são de maior preocupação para a saúde humana. Exemplos incluem hortaliças, frutas, mariscos e crustáceos. Coleção 1. Amostra <ol><li> Recolha de amostras sob condições que minimizam a contaminação, e armazenadas em sacos separados, limpas durante o transporte. Uma vez recolhidas, as amostras devem ser armazenadas a 4 ° C e processados ​​dentro de 24 horas. </li></ol> 2. Enriquecido Cultura Preparação <ol><li> Frutas e vegetais: <ol><li> Colocar aproximadamente 10 g de material em um saco de plástico durável. Se a transformação de matérias maior, concentrar-se na pele do fruto ou legume. Adicionar 90 ml de tampão 0,1 M de fosfato de sódio, pH 7,0 e processo num misturador de pás durante 30 s. Em alternativa, o material pode ser agitada manualmente, se um misturador de pás não está disponível. </li><li> Recolhe-se o líquido em dois tubos Falcon de 50 ml. Tubos de centrifugação a 4.000 xg por 7 min de bactérias de pelotização. </li&gt; <li> Remova cuidadosamente o sobrenadante e suspender as bactérias peletizadas em 30 ml de Luria estéril Bertani (LB). </li><li> Incubar num agitador de O / N, que prende um tubo a 25 ° C e o outro a 37 ° C. As culturas deverão ser agitados a 200 oscilações por minuto (OPM). Armazenar as culturas a 4 ° C até serem necessárias. </li></ol></li><li> Seafood: <ol><li> Dissecar o estômago (ostras) ou do tracto digestivo (camarão), utilizando fórceps e pinças estéreis e colocar num tubo de 1,5 ml esterilizado, contendo 200 ul de tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0. Macerar o exemplo para criar um homogeneizado. </li><li> Pipetar 5 ml de caldo LB estéril em dois tubos de 5 ml, e inocular cada um com o homogeneizado de marisco. </li><li> Incubar num agitador de O / N, que prende um tubo a 25 ° C e o outro a 37 ° C. As culturas deverão ser agitados a 200 opm. Armazenar as culturas a 4 ° C até serem necessárias. </li></ol></li></ol> 3. As culturas de rastreio para integrons MgCl2 de 2,5 mM. Se necessário, Lorenz (2011) 24 delineou PCR otimização e solução de problemas métodos em uma edição anterior desta revista. <ol><li> Preparação de ADN fervido: <ol><li> Dispensar 100 l de cultura enriquecido em um estéril 0,5 ml tubo de PCR. Aquece-se a amostra a 99 ° C durante 10 min, utilizando um banho-maria ou bloco de aquecimento. Encaixe frio em gelo durante 2 min. </li><li> Microcentrífuga a 14000 xg durante 5 min para sedimentar os detritos celulares. Retornar ao gelo. As amostras de ADN podem ser congeladas a -20 ° C até serem necessárias, mas deve ser descongelada em gelo. </li></ol></li><li> Rastreio de classe 1 integrons usando PCR: NOTA: culturas mistas do O / N incubação são selecionados para a classe 1 integrons usando o protocolo HS463a / HS464 PCR (Tabela 1). <ol><li> Descongelar todos os reagentes de PCR em gelo, longe de qualquer potencial de souRCEs de ADN contaminante. Compõem 48 ul PCR mastermix por amostra, incluindo controlos negativos (Tabela 2). Dispense 48 ul de PCR master mix para cada tubo, usando dicas de barreira. </li><li> Adicionar 2 mL de ADN descongeladas para tubos de PCR individuais, utilizando pontas de barreira. Executar programa adequado no termociclador de PCR. </li><li> Para avaliar os resultados da amplificação, electroforese 7 uL de produto de PCR num gel de agarose a 2% e executar vertida em tampão TBE (90 mM Tris-borato, 2 mM de EDTA). Incluem um marcador de peso molecular, tais como uma escada de 100 pb. </li><li> Adicione mancha do gel com um corante de ADN, e visualizar utilizando um transiluminador de UV. Verificar que não houve nenhuma amplificação no controlo negativo. A banda forte em torno de 470 pb para qualquer determinada amostra indica que a cultura mista contém bactérias que carregam uma classe 1 integron. Colónias puras vai agora ser isolado a partir de qualquer cultura mista que devolvido um PCR positivo. </li></ol></li></ol><ol><li> Diluições em série e placas espalhadas: NOTA: Para isolar colónias simples a partir das culturas mistas de PCR-positivas, a cultura mista é diluída em série de 10 vezes em tampão de fosfato de sódio, e depois plaqueadas para recuperar as colónias individuais. <ol><li> Adicionar 1 ml de cultura mista a 9 ml de tampão de fosfato de sódio 0,1 M, pH 7,0 e misturar por inversão. Adicionar 1 ml da diluição para uma mais 9 ml de tampão de fosfato, e repetir até uma diluição em série de 10 -8 é atingido. </li><li> Espalhe 100 ul dos 10 -4 a 10 -8 diluições em agar LB, em duplicado. Incubar as placas de O / N à mesma temperatura utilizada para a cultura mista inicial. As placas podem então ser armazenadas a 4 ° C até ser necessário, no entanto, é melhor para processar as colónias individuais relativamente prontamente. </li></ol></li><li> Selecção de colónias únicas e o ADN fervido preparação: <ol><li> Escolha colónias individuais das placas de diluição em série, SElecting como muitos tipos diferentes de colónias possível, usando critérios como tamanho da colônia, forma e cor. Use palitos esterilizados para selecionar colônias individuais da placa propagação. </li><li> Toque no palito para a colônia, e depois transferir para um tubo de PCR contendo 100 ml de água estéril. Se um grande número de colónias estão a ser pesquisadas, em seguida, as colónias podem ser preparados num tabuleiro de microtitulação. Girar o palito entre os dedos para deslocar algumas das células na água. </li><li> Usando o mesmo palito, inocular uma placa de LB com uma raia da colônia. Um grande número de colónias pode ser armazenada em placas marcadas se cada raia é de cerca de 1 cm de comprimento. Repita os passos 1 a 3 até que você tenha selecionado um número apropriado de isolados. </li><li> Incubar a placas LB O / N, à mesma temperatura que o utilizado para a cultura enriquecido inicial. As culturas podem depois ser armazenado a 4 ° C até serem necessárias. </li><li> Para a preparação de DNA a partir das suspensões bacterianas, siga os passos como UOtlined na secção 3.1. Para o rastreio de lisados ​​de cultura pura, execute o HS463a / HS464 PCR, conforme descrito no ponto 3.2. Os isolados que retornar um PCR positivo será utilizado para a preparação de ADN genómico (seção 5), e para análises posteriores. </li></ol></li></ol> 5. As colónias individuais Genomic DNA Extração de Integron-positivos Usando Bead Batendo 25 <ol><li> Inocular 5 ml de caldo de LB com uma amostra de cultura pura isolada na secção 4.2. Incubar S / N, agitando à mesma temperatura que foi utilizado para a cultura enriquecido inicial. </li><li> Células de pelotas em 4000 g durante 7 min, em seguida, remover o sobrenadante. Volte a suspender as células sedimentadas em 1 ml de solução CLS-TC em um Lysing Matrix E tubo de preparação rápida. Usando uma máquina de talão de espancamento, processar a amostra em 5,5 m / s por 30 s. </li><li> Tubo de centrifugação a 14000 xg durante 5 min e recuperar 700 ul de sobrenadante para um tubo esterilizado de 1,5 mL. </li><li> Adicionar 700 ul de matriz obrigatório diluído 1: 5 com 6 M guanidinium tiocianato e misturar à temperatura ambiente durante 5 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 1 min, o sobrenadante de descarte. </li><li> Adicionar 800 ul de lavagem com etanol sal (etanol a 70%, acetato de sódio 0,1 M) e agitar com vortex até que o sedimento é ressuspenso completamente. Lavar durante 5 min à temperatura ambiente, centrifugar a 14.000 xg durante 1 min e descartar o sobrenadante. Assegurar-se que o sobrenadante foi removido, utilizando uma micropipeta, se necessário, em seguida deixar secar ao ar durante 5 min. </li><li> Ressuspender o sedimento em matriz de 200 ul de TE (10 mM Tris-HCl, 1 mM de EDTA, pH 7,6), pipetando para cima e para baixo. Incubar à temperatura ambiente durante 3 min. Centrifugar a 14.000 xg durante 3 min e a transferência de 160 uL do ADN eluído em um tubo estéril. Executar uma alíquota da extracção do ADN genómico em um 2% w / v de gel de agarose para verificar a integridade e rendimento da extracção do ADN. O ADN genómico purificado é armazenado a -20 ° C e descongelados em gelo, quando necessário para o teste de PCR. </li></ol> 6. PCRs de Diagnóstico e seqüenciamento de DNA NOTA: ODNA genómico preparado na seção 5 será usado para todos os PCRs de diagnóstico, e para confirmar o teste positivo para a classe 1 integrons. <ol><li> Descongele DNA genômico em gelo, vortex brevemente a amostra de DNA e pulso rotação a 14.000 xg por 20 s. Repetir a PCR para o gene da integrase íntegron-classe 1 usando HS463a / HS464 (Tabela 1), confirmando que o isolado é positivo para o amplicão 471 pb (Secção 3.2). </li><li> Identificação de culturas positivas ao nível de espécie é conseguida por análise da pequena subunidade do gene de rRNA (16S ADNr). Amplificar o gene 16S utilizando os iniciadores F27 / r1492 (Tabela 1). Confira os produtos de PCR utilizando eletroforese. Todos os alvos bacterianos deve gerar um 16S amplicon de cerca de 1450 pb. </li><li> Sequência do amplicão do gene 16S rRNA para determinar a identidade das espécies, mas uma vez que não é provável que sejam múltiplos PCR positivos a partir do passo 6.2, e muitos destes positivos serão as mesmas espécies bacterianas, vamos primeiro distinguir as diferentes espécies using digestão de restrição do produto de PCR 16S. <ol><li> Digerir uma aliquota do PCR 16S com a enzima de restrição Hinf 1. Qualquer enzima que reconhece sítios de clivagem 4 pb vai fazer, mas Hinf 1 gera boa diversidade de alvos 16S, e é uma enzima confiável e barata. </li></ol></li><li> Configurar uma restrição de 30 ul digerir mastermix (Tabela 2) em um tubo estéril e adicionar 20 l de produto de PCR 16S purfied-un. Incubar em um banho de água a 37 ° C O / N. Verificar o produto da digestão num gel de agarose a 2%. </li><li> Pontuação dos padrões de digestão produzidos por Hinf 1. Os isolados com o mesmo perfil de restrição 16S são susceptíveis de ser da mesma espécie. Em vez de seqüenciar todos os produtos de PCR 16S, seqüência, no máximo, três representantes de cada padrão de restrição Hinf 1. </li><li> Purifica-se os produtos de PCR 16S utilizando um kit comercial. Um único conjunto de exonuclease de cadeia pode ser usado, mas com base em coluna ou métodos de precipitação também funciona bem para remover unincprimers orporated e ADN de cadeia simples. Sequência os amplicons 16S usando R910 iniciador (Tabela 1), que estabelecem as reações como especificado pelo serviço de sequenciação. </li><li> Use a sequência de DNA resultante para interrogar o banco de dados de DNA NCBI com a função blastn ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). Mais do que 97% de identidade de nucleótidos geralmente é tomado como a identidade das espécies. </li></ol> 7. Mapeamento e Caracterização de integrons e cassete Arrays NOTA: Classe 1 integrons que emanam de ecossistemas dominados pelo homem tendem a ser os integrons mais comuns em todas as suas amostras. Estes integrons todos têm uma origem única recente e, portanto, têm uma sequência de DNA altamente conservado 5. <ol><li> Diferenciar entre uma classe 1 integrões que emanam a partir de fontes humanas e as que ocorrem naturalmente em amostras ambientais através da realização de umPCR com iniciadores definido intI1F165 / intI1R476 10 (Tabela 1). NOTA: Classe 1 integrons de bactérias comensais clínicos ou irá gerar um produto de ~ 300 pb, enquanto classe ambiental 1 integrons não irá gerar qualquer produto. </li><li> Caracterizar os integrons clínicos, amplificando a matriz cassete com conjunto de primers HS458 / HS459. Esta PCR amplifica a região entre intI1 e segmento conservado a 3 &#39;no terminal da maior parte das matrizes de cassetes. Uma vez que o número e identidade de cassetes é variável, o tamanho do produto de PCR também irá variar. </li><li> Purifica-se produtos de amplificação e a sequência de ADN utilizando cada um dos iniciadores de amplificação. Use seqüências para interrogar bases de dados de ADN utilizando a função blastn ( <a href="http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi" target="_blank">http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi</a> ). </li><li> Certifique-se de nomear de cassetes siga nomenclatura padronizada 9, uma vez que muitos depoimentos dados para cassete gene integrons usar nomes inconsistentes ou ambíguas. Dê especial atenção às cassetes de genes novos, uma vez que estes podem codificar novos fenótipos, incluindo genes que conferem aumento transmissibilidade, patogenicidade ou virulência 8,21. NOTA: pré-clínica formas da classe 1 integron ainda circulam em ambientes naturais. Em particular, aqueles que estão ligados a ativos Tn 402 transposons são de maior interesse 26. As matrizes de cassetes dessas integrons não vai amplificar com conjunto de primers HS458 / HS459, mas pode ser amplificado com o MRG284 / MRG285 primário conjunto (Tabela 1), gerando amplicons de tamanho variável dependente conteúdo cassete. Os produtos de PCR deve ser purificado e o ADN sequenciado conforme descrito em 7.2. </li></ol>

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Os autores não têm nada de relevante a divulgar.

A identificação de integrons e suas cassetes de genes associados é potencialmente um passo fundamental para prever o surgimento de novos patógenos oportunistas, acompanhamento de percursos para patógenos na cadeia alimentar humana e identificando nova resistência e virulência determinantes 8,21,26. O objetivo deste trabalho foi descrever uma abordagem simplificada para a triagem de amostras para a classe 1 integrons, caracterizando suas matrizes cassete e identificar as espécies de bactérias em que residem. Etapas críticas do protocolo envolvem boa prática de microbiologia e prevenção da contaminação PCR que iria gerar falsos positivos. O protocolo descrito aqui pode ser facilmente modificado para detectar outros integrons clinicamente relevantes, incluindo a classe 2 e classe 3 integrons que também são encontrados em patógenos humanos. Ele também pode ser modificado para detectar integrões em comunidades microbianas a partir de água, os biofilmes, do solo ou de sedimento. Existem alguns limitations a esta técnica, que surgem a partir de uma dependência de cultura de células bacterianas. Muitas bactérias ambientais não são facilmente cultivável, e o protocolo descrito aqui não iria detectar estas espécies. A gama de espécies que são recuperados poderia ser expandida por meio de diferentes formulações de meios de bactérias e os tempos de incubação mais longos. No entanto, a maioria das espécies de interesse para a saúde humana são susceptíveis de crescer nas condições descritas aqui. Este protocolo tem algumas vantagens sobre as técnicas que utilizam plaqueamento em meios seletivos. Não precisam ser feitas suposições sobre a identidade de determinantes de resistência realizadas por isolados individuais, e genes de resistência a novos podem ser recuperados e caracterizados. Em termos mais gerais, o fluxo de trabalho também pode ser adaptado para detectar qualquer elemento do mobilome resistome 27 ou que possam ser de interesse 4. Tais ensaios são importantes para a compreensão da dinâmica dos vários elementos de DNA envolvidas em umtibiotic resistência e crítica para a conservação do arsenal cada vez menor de compostos antimicrobianos.

A descoberta dos antibióticos foi uma das maiores conquistas científicas do século 20. No entanto, o uso e abuso de antibióticos levou à rápida evolução de bactérias resistentes aos antibióticos, e estes agora representam uma séria ameaça para a saúde pública no século 21. O surgimento de cepas bacterianas resistentes à maioria das opções de tratamento levanta a possibilidade de que estamos entrando em uma era onde as drogas antimicrobianas não são mais eficazes 1,2. A maquinaria genética que confere resistência aos antibióticos é um sistema antigo, anterior a seres humanos e pressões de seleção de antibióticos por milhões de anos 3. Elementos genéticos móveis, tais como plasmídeos, transposões, ilhas genômicas, elementos conjugativos integrativas e integrons podem disseminar genes de resistência a antibióticos (ARG) tanto dentro como entre espécies bacterianas 4. Destes, integrões têm desempenhado um papel central na propagação de Arg, apesar dafato de que eles dependem de plasmídeos e transposons de mobilização e de inserção no genoma bacteriano 5. Integrons capturar cassetes de genes que utilizam um íntegron-integrase, e, em seguida, expressar as cassetes utilizando um promotor codificado íntegron 6,7 (Figura 1). Integron gene cassetes são pequenos elementos móveis consistindo de quadros individuais de leitura abertas (ORF), cujos produtos podem conferir resistência a antibióticos ou desinfectantes 8. Classe 1 integrons são os integrons mais comumente recuperados a partir de isolados clínicos 5, onde têm adquiriu coletivamente mais de 130 diferentes cassetes de genes de resistência a antibióticos 9. A propagação da classe 1 integrons em comensais e patogênicas de bactérias associadas a humanos gera fluxos de resíduos humanos que contêm um grande número destes elementos genéticos 10. Estima-se que 10 19 bactérias que contêm uma classe integrons são liberados via lodo de esgoto cada ano in o Reino Unido 11. Portanto, não é surpreendente que uma classe integrons conferem resistências a antibióticos estão agora a ser detectado em microbiota das aves selvagens, peixes e outros animais selvagens nativos 12-14. Soltar integrons volta para o ambiente constitui uma ameaça grave de saúde pública, desde a aquisição de novos cassetes de genes e rearranjos complexos com outros elementos móveis continua a ocorrer, particularmente em estações de tratamento de esgoto e outros corpos d&#39;água 15-18. O ambiente natural, em seguida, torna-se um terreno fértil para o recrutamento de novos determinantes de resistência e patógenos oportunistas 19,20. Bactéria contendo integron novos e novos ARGs pode circular de volta para a comunidade humana através de água e alimentos contaminados 21,22. Vigilância de ARGs ambientais é uma estratégia fundamental para a compreensão e manejo da resistência aos antibióticos no futuro 23. Em particular, deve ser dada atenção aos géneros alimentícios que são comidos crus oulevemente cozidos, uma vez que estes apresentam a maior ameaça para a transmissão de novos elementos celulares e patógenos. Neste protocolo, uma abordagem simplificada para a detecção, identificação e caracterização de classe 1 integrons e suas cassetes de genes associados nos alimentos são descritas (Figura 2). Usando uma combinação de reacção cultura e polimerase em cadeia (PCR), integrões pode ser rapidamente detectada em comunidades bacterianas e complexos isolados individuais. Métodos de identificação das espécies de bactérias e a conformação ea identidade das cassetes de genes associados a integron são dadas. O método é adequado para uma ampla variedade de alimentos de origem vegetal e animal, e exemplos de fluxos típicos são dados para cada um destes tipos de alimentos.

<table><tbody><tr><td>GoTaq Colourless Mastermix</td><td>Promega</td><td>M7132</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>RNAse (Ribonuclease A from bovine pancreas)</td><td>Sigma</td><td>R6513-10MG</td><td>Used in all PCRs</td></tr><tr><td>HinFI restriction enzyme</td><td>Promega</td><td>R6201</td><td>Used to digest 16S rDNA PCR poducts. Enzyme comes with optimal buffer and BSA</td></tr><tr><td>100 bp ladder</td><td>GE Healthcare</td><td>27400701</td><td>Used as a size standard on all agarose gels</td></tr><tr><td>GelRed DNA stain</td><td>Biotium</td><td>41003</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>Guanidinium thiocyanate</td><td>Life Technologies</td><td>AM9422</td><td>CAUTION: Personal protection must be worn when handling this material</td></tr><tr><td>CLS-TC Solution</td><td>MP Biomedicals</td><td>6540409</td><td>Resuspension solution used at the begining of the genomic DNA extraction</td></tr><tr><td>Lysing Matrix E FastPrep tubes</td><td>MP Biomedicals</td><td>116914500</td><td>Tube required for mechanical disruption of bacterial cell walls. This code is used for packs of 500 tubes, smaller quantities are available.</td></tr><tr><td>Binding matrix</td><td>MP Biomedicals</td><td>116540408</td><td>Diluted 1:5 with 6 M guanidinium thiocyanate and used in the genomic DNA extraction method.</td></tr><tr><td>Fast Prep machine</td><td>MP Biomedicals</td><td>Number of options available</td><td>MP Biomedicals has a number of FastPrep machines available to purchase. Visit &lt;a href=&quot;http://www.mpbio.com&quot; target=&quot;_blank&quot;&gt;http://www.mpbio.com&lt;/a&gt; for more information</td></tr></tbody></table>

screening foodstuffs for class 1 integrons and gene cassettes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major factor in the spread of diverse resistance mechanisms. Amongst the DNA elements facilitating lateral transfer, the class 1 integrons have largely been responsible for spreading antibiotic resistance determinants amongst Gram negative pathogens. In total, these integrons have acquired and disseminated over 130 different antibiotic resistance genes. With continued antibiotic use, class 1 integrons have become ubiquitous in commensals and pathogens of humans and their domesticated animals. As a consequence, they can now be found in all human waste streams, where they continue to acquire new genes, and have the potential to cycle back into humans via the food chain. This protocol details a streamlined approach for detecting class 1 integrons and their associated resistance gene cassettes in foodstuffs, using culturing and PCR. Using this protocol, researchers should be able to: collect and prepare samples to make enriched cultures and screen for class 1 integrons; isolate single bacterial colonies to identify integron-positive isolates; identify bacterial species that contain class 1 integrons; and characterize these integrons and their associated gene cassettes.

Triagem de culturas mistas e isolados bacterianos para intI1 O conjunto iniciador HS463a / HS464 PCR pode ser usado para detectar a presença do gene da integrase íntegron-classe 1, intI1 (Figura 1). Este conjunto de iniciadores para a detecção trabalha bem intI1 em culturas mistas, e também é utilizado para rastrear colónias bacterianas colhidas a partir de placas de propagação (Figura 2). Isolados positivos devem gerar uma única banda forte em 471 pb usando este conjunto de primers (Figura 3A). A maioria dos isolados positivos vai levar intI1 que tem originado a partir de seres humanos ou os animais agrícolas e domésticas. Estes isolados também será positivo numa PCR utilizando os iniciadores F165 / R476, que deverá gerar um amplicão de 311 pb (Figura 1). Fontes ambientais de intI1 geralmente não será positivo neste segundo ensaio. Caracterização das matrizes cassete integron 402 Tn classe -associated um integrons pode ser amplificada utilizando iniciadores HS458 / HS459. Estes iniciadores alvo, respectivamente, o local de recombinação íntegron, e a extremidade 3 &#39;da cassete de matriz, que normalmente termina em fusão de genes a qacEΔ sul1 (Figura 1). O tamanho dos produtos de PCR gerados neste ensaio varia de acordo com o número e identidade dos cassetes na matriz (Figura 3B). Classe ambiental 1 integrões são frequentemente incorporados nos cromossomas bacterianos, e suas matrizes de cassete pode ser amplificado por iniciadores que têm como alvo as extremidades proximal e a maioria dos locais de recombinação distais (Figura 1). Os iniciadores MRG284 / 285 são concebidos para amplificar esta região, e de novo, porque o conteúdo cassete varia, o tamanho dos produtos de amplificação também varia (Figura 3C). A sequenciação do HS458 / 459 PCRprodutos serão normalmente recuperar conhecidos determinantes de resistência a antibióticos, enquanto sequenciação MRG284 / 285 produtos de PCR serão geralmente recuperar cassetes de genes que codificam polipéptidos de função desconhecida. Identificação de espécies bacterianas As bactérias são identificadas usando 16S rDNA e banco de dados comparações. O ADN genómico é utilizado como um molde para a amplificação dos genes de ARNr 16S subunidade pequena. Utilizando os iniciadores sugerido, este deve gerar um amplicão de cerca de 1450 pb. Porque um grande número de colónias pode ser exibido em qualquer momento, é empregue um método de rastreio hierárquica. 16S produtos de PCR amplificados foram digeridos com a enzima de restrição Hinf 1, e estas digestões são separados em géis de agarose. Espécies individuais vai gerar padrões distintos após digerir, de tal modo que os isolados da mesma espécie podem ser facilmente identificados (Figura 3D). A sequenciação dos produtos de PCR do gene de ARNr 16S a partir de um máximo de trêsisola representando qualquer padrão de uma restrição permite a identificação eficiente de todas as espécies susceptíveis em uma coleção de integron isolados positivos. <img alt="Figura 1" src="/files/ftp_upload/52889/52889fig1highres.jpg" width="700" /> Figura 1. Estrutura de classe 1 integrons. Diagramas esquemáticos de classe clínica e ambiental, mostrando uma integrons PCR locais de ligação primário que se refere o manuscrito. Classe 1 integrões consistir de um gene íntegron-integrase (intI1) que catalisa a captação e a expressão de cassetes de genes de modo a formar uma matriz de cassete. Antes do advento do uso de antibióticos, a maioria de classe 1 integrons foram cromossômica, e levou cassetes de genes cujas funções são ainda a ser determinado. Seleção forte via uso de antibióticos aumentou muito a abundância de uma variante de sequência de classe 1 integron associado ao Tn 402 transposon.Estes integrons &#39;clínicas&#39; adquiriram matrizes de cassetes que codificam a resistência aos antibióticos. É estes integrons que estão atualmente poluentes ambientes naturais e da cadeia de produção de alimentos. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52889/52889fig1highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 2" src="/files/ftp_upload/52889/52889fig2highres.jpg" width="700" /> Figura 2. fluxograma esquemático para a detecção de uma classe integrões em produtos alimentares. Exemplos de alimentos são usados ​​para inocular meios e gerar uma cultura bacteriana mista. Estas culturas mistas são rastreados quanto à presença de uma classe integrões, e culturas positivas utilizado para preparar placas recobertas. As colónias individuais das placas de propagação são novamente pesquisadas para integrons. As culturas positivas são purificados, o DNA extraído e caracterizado quanto ao teor de ADN por si só casseteQuencing. Seqüenciamento do gene 16S rRNA é usado para identificação de espécies. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52889/52889fig2highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <img alt="Figura 3" src="/files/ftp_upload/52889/52889fig3highres.jpg" width="700" /> Figura 3. análise electroforética representativas do processo de triagem. (A) Rastreio colónias individuais utilizando os iniciadores intI1 HS463a / 464. As colónias positivas gerar uma forte banda única em 471 pb. (B) Amplificação de matrizes de cassetes de Tn 402 integrons utilizando iniciadores HS458 / 459. Este produto de PCR gera tamanhos variável dependente da identidade e tamanho das cassetes de componentes da matriz. A identificação destas cassetes exige sequenciação de ADN. (C) Amplificação de matrizes de cassetes de classe ambiental 1 integrons utilizando iniciadores MRG284 / 285. Este produto de PCR também gera tamanhos variável dependente da identidade e tamanho das cassetes de componentes na matriz, no entanto cassetes em matrizes ambientais é improvável que codificam a resistência aos antibióticos. (D) Rastreio dos produtos de PCR 16S por digestão com Hinf 1. Os isolados com padrões de restrição idênticos é provável que sejam da mesma espécie. Se um grande número de um único tipo de restrição são recuperadas, apenas alguns deles precisam ser sequenciado. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52889/52889fig3highres.jpg" target="_blank">Por favor clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a> <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" fo:keep-together.within-page="always"><tbody><tr><td> PCR </td><td> Gene alvo </td><td fo:width="0.6in"> Nome do iniciador </td><td fo:width="0.5in"> Direção </td><td fo:width="2in"> Sequência de 5 &#39;- 3&#39; </td><td> Condições Ciclismo </td><td> REFERÊnce </td></tr><tr><td rowspan="2"> HS463a / HS464 </td><td rowspan="2"> Classe 1 Integron </td><td> HS464 </td><td> Para a frente </td><td> ACATGCGTGTAAATCATCGTCG </td><td rowspan="2"> 94 ° C 3 min; 35 ciclos 94 ° C 30 seg, 60 ° C 30 seg, 72 ° C 1 min 30 seg; 72 ° C 5 minutos </td><td rowspan="2"> Stokes et al., 2006 28 </td></tr><tr><td> HS463a </td><td> Reversa </td><td> CTGGATTTCGATCACGGCACG </td></tr><tr><td rowspan="2"> F27 / r1492 </td><td rowspan="2"> 16S rRNA </td><td> F27 </td><td> Para a frente </td><td> AGAGTTTGATCMTGGCTCAG </td><td rowspan="2"> 94 ° C 3 min; 35 ciclos 94 ° C 30 seg, 60 ° C 30 seg, 72 ° C 1 min 30 seg; 72 ° C 5 minutos </td><td rowspan="2"> Lane, 1991 29 </td></tr><tr><td> r1492 </td><td> Reversa </td><td> TACGGYTACCTTGTTACGACTT </td></tr><tr><td rowspan="2"> intI1F165 / IntI1R476 </td><td rowspan="2"> Classe clínica 1 integron </td><td> Inti1F165 </td><td> Para a frente </td><td> CGAACGAGTGGCGGAGGGTG </td><td rowspan="2"> 94 ° C 3 min; 35 ciclos 94 ° C 30 seg, 55 ° C 30 seg, 72 ° C 1 min 30 seg; 72 ° C 5 minutos </td><td rowspan="2"> Gillings de 2014 10 </td></tr><tr><td> intI1R476 </td><td> Reversa </td><td> TACCCGAGAGCTTGGCACCCA </td></tr><tr><td rowspan="2"> HS549 / HS550 </td><td rowspan="2"> 3&#39;CS Clínica Integron </td><td> HS549 </td><td> Para a frente </td><td> ACTAAGCTTGCCCCTTCCGC </td><td rowspan="2"> 94 ° C 3 min; 35 ciclos 94 ° C 30 seg, 65 ° C 30 seg, 72 ° C 1 min 30 seg; 72 ° C 5 minutos </td><td rowspan="2"> Stokes et al., 2006 28 </td></tr><tr><td> HS550 </td><td> Reversa </td><td> CTAGGCATGATCTAACCCTCGG </td></tr><tr><td rowspan="2"> HS458 / HS459 </td><td rowspan="2"> Cassete matriz clínica </td><td> HS458 </td><td> Para a frente </td><td> GCAAAAAGGCAGCAATTATGAGCC </td><td rowspan="2"> 946; C 3 min; 35 ciclos 94 ° C 30 seg, 55 ° C 30 seg, 72 ° C 1 min 30 seg; 72 ° C 5 minutos </td><td rowspan="2"> Holmes et al., 2003 30 </td></tr><tr><td> HS459 </td><td> Reversa </td><td> GTTTGATGTTATGGAGCAGCAACG </td></tr><tr><td rowspan="2"> MRG284 / MRG285 </td><td rowspan="2"> Cassete Ambiental </td><td> MRG284 </td><td> Para a frente </td><td> GTTACGCCGTGGGTCGATG </td><td rowspan="2"> 94 ° C 3 min; 35 ciclos 94 ° C 30 seg, 55 ° C 30 seg, 72 ° C 1 min 30 seg; 72 ° C 5 minutos </td><td rowspan="2"> Gillings et al., 2009 21 </td></tr><tr><td> MRG285 </td><td> Reversa </td><td> CCAGAGCAGCCGTAGAGC </td></tr></tbody></table> Tabela 1. As sequências dos iniciadores e condições de PCR utilizados para a identificação de uma classe integrões e as suas cassetes de genes associados. <table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0"><colgroup><col span="4" /></colgrupo&gt; <tbody><tr><td> Os reagentes de PCR </td><td> Volume (uL) </td><td> Restrição reagentes Digest </td><td> Volume (uL) </td></tr><tr><td> Água estéril </td><td> 21,5 </td><td> Água estéril </td><td> 23 </td></tr><tr><td> 10x GoTaq Branco </td><td> 25 </td><td> Tampão B </td><td> 5 </td></tr><tr><td> Com ARNase A [1 mg / ml] </td><td> 0,5 </td><td> Albumina de soro bovino [1 mg / ml] </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Adiante Primer [50? M] </td><td> 0,5 </td><td> HinfI [10 unidades / ul] </td><td> 1 </td></tr><tr><td> Reverter Primer [50 mM] </td><td> 0,5 </td><td colspan="2"></td></tr><tr><td> Volume de Mastermix </td><td> 48 </td><td> Volume de Mastermix </td><td> 30 </td></tr><tr><td> ADN molde </td><td> 2 </td><td> Template PCR </td><td> 20 </td></tr><tr><td> O volume final de PCR </td><td> 50 </td><td> Restrição último volume digest </td><td> 50 </td></tr></tbody&gt; </table> Tabela 2. PCR e restrição digerir Mastermix constituintes.

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Screening Foodstuffs for Class 1 Integrons and Gene Cassettes

This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs.

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

Antibiotic resistance is one of the greatest threats to health in the 21st century. Acquisition of resistance genes via lateral gene transfer is a major ...

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Nanyang Technological University

Research

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Environment

9.0K visualizações.  Macquarie University. This protocol describes the detection of class 1 integrons and their associated gene cassettes in foodstuffs. 

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Site-specific Bacterial Chromosome Engineering: &#934;C31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as plasmid replication, plasmid stability, plasmid incompatibility, and plasmid copy number variance. This method uses the site-specific integrase from the Streptomyces phage (&Phi;) C312,3. The &Phi;C31 integrase catalyzes a direct recombination between two specific DNA sites: attB and attP (34 and 39 bp, respectively)4. This recombination is stable and does not revert5. A "landing pad" (LP) sequence consisting of a spectinomycin- resistance gene, aadA (SpR), and the E. coli &szlig;-glucuronidase gene (uidA) flanked by attP sites has been integrated into the chromosomes of Sinorhizobium meliloti, Ochrobactrum anthropi, and Agrobacterium tumefaciens in an intergenic region, the ampC locus, and the tetA locus, respectively. S. meliloti is used in this protocol. Mobilizable donor vectors containing attB sites flanking a stuffer red fluorescent protein (rfp) gene and an antibiotic resistance gene have also been constructed. In this example the gentamicin resistant plasmid pJH110 is used. The rfp gene6 may be replaced with a desired construct using SphI and PstI. Alternatively a synthetic construct flanked by attB sites may be sub-cloned into a mobilizable vector such as pK19mob7. The expression of the &Phi;C31 integrase gene (cloned from pHS628) is driven by the lac promoter, on a mobilizable broad host range plasmid pRK78139.
A tetraparental mating protocol is used to transfer the donor cassette into the LP strain thereby replacing the markers in the LP sequence with the donor cassette. These cells are trans-integrants. Trans-integrants are formed with a typical efficiency of 0.5%. Trans-integrants are typically found within the first 500-1,000 colonies screened by antibiotic sensitivity or blue-white screening using 5-bromo-4-chloro-3-indolyl-beta-D-glucuronic acid (X-gluc). This protocol contains the mating and selection procedures for creating and isolating trans-integrants.

A quick and efficient method to integrate foreign DNA of interest into pre-made acceptor strains, termed landing pad strains, is described. The method allows site-specific integration of a DNA cassette into the engineered landing pad locus of a given strain, through conjugation and expression of the &#934;C31 integrase.

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

The bacterial chromosome may be used to stably maintain foreign DNA in the mega-base range1. Integration into the chromosome circumvents issues such as ...

Bioengenharia

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol for transferring gene deletion mutations from one Escherichia coli strain to another by using generalized transduction with the bacteriophage P1. This method requires that the mutation be selectable (e.g., based on gene disruptions using antibiotic cassette insertions). Such antibiotic cassettes can be mobilized from a donor strain and introduced into a recipient strain of interest to quickly and easily generate a gene deletion mutant. The antibiotic cassette can be designed to include flippase recognition sites that allow the excision of the cassette by a site-specific recombinase to produce a clean knock-out with only a ~100-base-pair-long scar sequence in the genome. We demonstrate the protocol by knocking out the tamA gene encoding an assembly factor involved in autotransporter biogenesis and test the effect of this knock-out on the biogenesis and function of two trimeric autotransporter adhesins. Though gene deletion by P1 transduction has its limitations, the ease and speed of its implementation make it an attractive alternative to other methods of gene deletion.

Producing Gene Deletions in Escherichia coli by P1 Transduction with Excisable Antibiotic Resistance Cassettes

Here we present a protocol for the use of pre-existing antibiotic resistance-cassette deletion constructs as a basis for making deletion mutants in other E. coli strains. Such deletion mutations can be mobilized and inserted into the corresponding locus of a recipient strain using P1 bacteriophage transduction.

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

A first approach to study the function of an unknown gene in bacteria is to create a knock-out of this gene. Here, we describe a robust and fast protocol ...

Genética

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized into five different toxinotypes, A through E, based on the carriage of four major toxin genes. The prevalence and distribution of these various toxinotypes is understudied, especially their pervasiveness in American retail food. Of particular interest to us are the type B and D strains, which produce epsilon toxin, an extremely lethal toxin suggested to be the environmental trigger of multiple sclerosis in humans. To evaluate the presence of different C. perfringens toxinotypes in various food samples, we developed an easy method to selectively culture these bacteria without the use of an anaerobic container system only involving three culturing steps. Food is purchased from local grocery stores and transported to the laboratory under ambient conditions. Samples are minced and inoculated into modified rapid perfringens media (RPM) and incubated overnight at 37 &#176;C in a sealed, airtight conical tube. Overnight cultures are inoculated onto a bottom layer of solid Tryptose Sulfite Cycloserine (TSC) agar, and then overlaid with a top layer of molten TSC agar, creating a &#34;sandwiched&#34;, anaerobic environment. Agar plates are incubated overnight at 37 &#176;C and then evaluated for appearance of black, sulfite-reducing colonies. C. perfringens-suspected colonies are removed from the TSC agar using sterile eye droppers, and inoculated into RPM and sub-cultured overnight at 37 &#176;C in an airtight conical tube. DNA is extracted from the RPM subculture, and then analyzed for the presence of C. perfringens toxin genes via polymerase chain reaction (PCR). Depending on the type of food sampled, typically 15&#8211;20% of samples test positive for C. perfringens.

Enrichment and Detection of Clostridium perfringens Toxinotypes in Retail Food Samples

The objective of this protocol is to detect different Clostridium perfringens toxinotypes in locally purchased foods, particularly epsilon toxin producing strain types B and D, without the use of anaerobic chambers.

Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo

Clostridium perfringens (C. perfringens) is a prolific toxin producer and causes a wide range of diseases in various hosts. C. perfringens is categorized ...

Ambiente

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and clonal strain relatedness of methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA), particularly with the emerging outbreaks of community-associated MRSA (CA-MRSA) occurring on a worldwide basis. Traditional PCR typing schemes classify SCCmec by targeting and identifying the individual mec and ccr gene complex types, but require the use of many primer sets and multiple individual PCR experiments. We designed and published a simple multiplex PCR assay for quick-screening of major SCCmec types and subtypes I to V, and later updated it as new sequence information became available. This simple assay targets individual SCCmec types in a single reaction, is easy to interpret and has been extensively used worldwide. However, due to the sophisticated nature of the assay and the large number of primers present in the reaction, there is the potential for difficulties while adapting this assay to individual laboratories. To facilitate the process of establishing a MRSA SCCmec assay, here we demonstrate how to set up our multiplex PCR assay, and discuss some of the vital steps and procedural nuances that make it successful.

Multiplex PCR Assay for Typing of Staphylococcal Cassette Chromosome Mec Types I to V in Methicillin-resistant Staphylococcus aureus

We demonstrate a simple multiplex PCR assay for quick-screening and typing of Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) types I-V for methicillin-resistant Staphylococcus aureus, and provide some of the vital steps and procedural nuances that make it successful for adapting this assay to individual laboratories.

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Staphylococcal Cassette Chromosome mec (SCCmec) typing  is a very important molecular tool for understanding the epidemiology and  clonal strain ...

Imunologia e Infecção

Site-Directed &#966;C31-Mediated Integration and Cassette Exchange in Anopheles Vectors of Malaria

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the genome of Anopheles mosquitoes. Amongst these methods, the &#966;C31 system allows precise and stable site-directed integration of transgenes, or the substitution of integrated transgenic cassettes via recombinase-mediated cassette exchange (RMCE). This method relies on the action of the Streptomyces &#966;C31 bacteriophage integrase to catalyze recombination between two specific attachment sites designated attP (derived from the phage) and attB (derived from the host bacterium). The system uses one or two attP sites that have been integrated previously into the mosquito genome and attB site(s) in the donor template DNA. Here we illustrate how to stably modify the genome of attP-bearing Anopheles docking lines using two plasmids: an attB-tagged donor carrying the integration or exchange template and a helper plasmid encoding the &#966;C31 integrase. We report two representative results of &#966;C31-mediated site-directed modification: the single integration of a transgenic cassette in An. stephensi and RMCE in An. gambiae mosquitoes. &#966;C31-mediated genome manipulation offers the advantage of reproducible transgene expression from validated, fitness neutral genomic sites, allowing comparative qualitative and quantitative analyses of phenotypes. The site-directed nature of the integration also substantially simplifies the validation of the single insertion site and the mating scheme to obtain a stable transgenic line. These and other characteristics make the &#966;C31 system an essential component of the genetic toolkit for the transgenic manipulation of malaria mosquitoes and other insect vectors.

The protocol describes how to achieve site-directed modifications in the genome of Anopheles malaria mosquitoes using the &#966;C31 system. Modifications described include both the integration and the exchange of transgenic cassettes in the genome of attP-bearing docking lines.

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Functional genomic analysis and related strategies for genetic control of malaria rely on validated and reproducible methods to accurately modify the ...

Screening and Isolation of C-Glycoside-Cleaving Intestinal Bacteria

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, anti-inflammatory, antiviral, antioxidant, and antineoplastic activities. In C-glycosides, the anomeric carbon of the sugar moiety is directly connected to an aglycone through carbon-carbon bonding. Compared with O-glycosides, C-glycosides are structurally stable and resistant to acids and enzymes. Consequently, they are typically unbreakable, resulting in poor absorbability and low bioavailability. Interestingly, some intestinal bacteria can cleave C-C glycosidic bonds, providing a specific and environmentally friendly biological approach to degrade C-glycosides. In this study, a set of standard operating procedures (SOPs) was developed for screening intestinal bacteria capable of cleaving C-C glycosidic bonds based on the biotransformation model of natural compounds. The SOPs include the preparation and enrichment of intestinal bacteria, activity-oriented screening, and activity validation in a low-carbon source medium. This methodology provides a foundational reference for researchers aiming to isolate and study these specialized functional bacteria.

This study establishes a set of standard operating procedures (SOPs) for efficiently screening and isolating intestinal bacteria capable of cleaving C-glycosides.

Triagem e isolamento de bactérias intestinais clivadas com glicosídeo C

C-glycosides are commonly found in medicinal plants and exhibit extensive structural diversity along with various bioactivities, including antibacterial, ...

Bioquímica

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella spp./Shigella spp. The gold standard method for the detection of Salmonella spp./Shigella spp. is direct culture but this is labor-intensive and time-consuming. Here, we describe a high-throughput platform for Salmonella spp./Shigella spp. screening, using real-time polymerase chain reaction (PCR) combined with guided culture. There are two major stages: real-time PCR and the guided culture. For the first stage (real-time PCR), we explain each step of the method: sample collection, pre-enrichment, DNA extraction and real-time PCR. If the real-time PCR result is positive, then the second stage (guided culture) is performed: selective culture, biochemical identification and serological characterization. We also illustrate representative results generated from it. The protocol described here would be a valuable platform for the rapid, specific, sensitive and high-throughput screening of Salmonella spp./Shigella spp.

A High-throughput Platform for the Screening of Salmonella spp./Shigella spp.

Salmonella spp./Shigella spp. are common pathogens attributed to diarrhea. Here, we describe a high-throughput platform for the screening of Salmonella spp./Shigella spp. using real-time PCR combined with guided culture.

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Fecal-oral transmission of acute gastroenteritis occurs from time to time, especially when people who handled food and water are infected by Salmonella ...

Using Coculture to Detect Chemically Mediated Interspecies Interactions

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by secreting metabolites. These metabolites have the potential to modulate the physiology and differentiation of their microbial neighbors and are likely important factors in the establishment and maintenance of complex microbial communities. We have developed a fluorescence-based coculture screen to identify such chemically mediated microbial interactions. The screen involves combining a fluorescent transcriptional reporter strain with environmental microbes on solid media and allowing the colonies to grow in coculture. The fluorescent transcriptional reporter is designed so that the chosen bacterial strain fluoresces when it is expressing a particular phenotype of interest (i.e. biofilm formation, sporulation, virulence factor production, etc.) Screening is performed under growth conditions where this phenotype is not expressed (and therefore the reporter strain is typically nonfluorescent). When an environmental microbe secretes a metabolite that activates this phenotype, it diffuses through the agar and activates the fluorescent reporter construct. This allows the inducing-metabolite-producing microbe to be detected: they are the nonfluorescent colonies most proximal to the fluorescent colonies. Thus, this screen allows the identification of environmental microbes that produce diffusible metabolites that activate a particular physiological response in a reporter strain. This publication discusses how to: a) select appropriate coculture screening conditions, b) prepare the reporter and environmental microbes for screening, c) perform the coculture screen, d) isolate putative inducing organisms, and e) confirm their activity in a secondary screen. We developed this method to screen for soil organisms that activate biofilm matrix-production in Bacillus subtilis; however, we also discuss considerations for applying this approach to other genetically tractable bacteria.

Bacteria produce secreted compounds that have the potential to affect the physiology of their microbial neighbors. Here we describe a coculture screen that allows detection of such chemically mediated interspecies interactions by mixing soil microbes with fluorescent transcriptional reporter strains of Bacillus subtilis on solid media.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

In nature, bacteria rarely exist in isolation; they are instead surrounded by a diverse array of other microorganisms that alter the local environment by ...

Biologia

Expressão gênica de cópia única para caracterização de sistemas de efluxo multidrogas

Characterizing Multidrug Efflux Systems in Acinetobacter baumannii Using an Efflux&#45;Deficient Bacterial Strain and a Single&#45;Copy Gene Expression System

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend the mechanisms behind this resistance to design new and effective therapeutic options. Unfortunately, our ability to investigate these mechanisms in A. baumannii is hindered by the paucity of suitable genetic manipulation tools. Here, we describe methods for utilizing a chromosomal mini-Tn7-based system to achieve single-copy gene expression in an A. baumannii strain that lacks functional RND-type efflux mechanisms. Single-copy insertion and inducible efflux pump expression are quite advantageous, as the presence of RND efflux operons on high-copy number plasmids is often poorly tolerated by bacterial cells. Moreover, incorporating recombinant mini-Tn7 expression vectors into the chromosome of a surrogate A. baumannii host with increased efflux sensitivity helps circumvent interference from other efflux pumps. This system is valuable not only for investigating uncharacterized bacterial efflux pumps but also for assessing the effectiveness of potential inhibitors targeting these pumps.

Autor em destaque: Avançando na pesquisa de resistência a antibióticos usando uma cepa bacteriana deficiente em efluxo e um sistema de expressão gênica de cópia única

We describe a facile procedure for the single-copy chromosomal complementation of an efflux pump gene using a mini-Tn7-based expression system into an engineered efflux-deficient strain of Acinetobacter baumannii. This precise genetic tool allows for controlled gene expression, which is key for the characterization of efflux pumps in multidrug resistant pathogens.

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

Acinetobacter baumannii is recognized as a challenging Gram-negative pathogen due to its widespread resistance to antibiotics. It is crucial to comprehend ...

Triagem géneros alimentícios destinados a uma classe integrons e Gene Cassetes

Resumo

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Capítulos neste vídeo

Site-specific Engenharia cromossomo bacteriano: ΦC31 Integrase Mediated Cassette Exchange (IMCE)

Produzindo a deleção do Gene na Escherichia coli por transdução P1 com fitas de resistência aos antibióticos sujeitos

Enriquecimento e detecção de toxinotipos de Clostridium perfringens em amostras de alimentos para varejo

Multiplex PCR Ensaio para a digita

Integração mediada pelo site φC31 e troca de em vetores anofelinos da malária

Triagem e isolamento de bactérias intestinais clivadas com glicosídeo C

Uma plataforma de alto rendimento para o rastreio de Salmonella spp. /Shigella spp.

Usando Coculture detectar quimicamente mediada interespécies Interações

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única

Caracterização de Sistemas de Efluxo Multidrogas em Acinetobacter baumannii Usando uma Cepa Bacteriana Deficiente em Efluxo e um Sistema de Expressão Gênica de Cópia Única