We thank Dr. John Risinger and Memorial Health University Medical Center, Inc. for generously providing the ACI-23 cell line. The authors acknowledge financial support through the Postdoctoral Research Training (PRAT) Award to C. House from The National Institute for General Medical Sciences.

<ol>
	<li>Coleman, R. L., Monk, B. J., Sood, A. K., Herzog, T. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Latest+research+and+treatment+of+advanced-stage+epithelial+ovarian+cancer.">Latest research and treatment of advanced-stage epithelial ovarian cancer.</a> Nat Rev Clin Oncol. 10, 211-224 (2013).</li><li>Ushijima, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Treatment+for+recurrent+ovarian+cancer-at+first+relapse.">Treatment for recurrent ovarian cancer-at first relapse.</a> J Oncol. 2010, 497429 (2010).</li><li>Erickson, B. K., Conner, M. G., Landen, C. N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+the+fallopian+tube+in+the+origin+of+ovarian+cancer.">The role of the fallopian tube in the origin of ovarian cancer.</a> Am J Obstet Gynecol. 209, 409-414 (2013).</li><li>King, S. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+impact+of+ovulation+on+fallopian+tube+epithelial+cells:+evaluating+three+hypotheses+connecting+ovulation+and+serous+ovarian+cancer.">The impact of ovulation on fallopian tube epithelial cells: evaluating three hypotheses connecting ovulation and serous ovarian cancer.</a> Endocr Relat Cancer. 18, 627-642 (2011).</li><li>Flesken-Nikitin, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+surface+epithelium+at+the+junction+area+contains+a+cancer-prone+stem+cell+niche.">Ovarian surface epithelium at the junction area contains a cancer-prone stem cell niche.</a> Nature. 495, 241-245 (2013).</li><li>Paik, D. Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem-like+epithelial+cells+are+concentrated+in+the+distal+end+of+the+fallopian+tube:+a+site+for+injury+and+serous+cancer+initiation.">Stem-like epithelial cells are concentrated in the distal end of the fallopian tube: a site for injury and serous cancer initiation.</a> Stem Cells. 30, 2487-2497 (2012).</li><li>Connor, M. L., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Cancer+stem+cells:+A+contentious+hypothesis+now+moving+forward.">Cancer stem cells: A contentious hypothesis now moving forward.</a> Cancer Lett. 344, 180-187 (2014).</li><li>Dean, M., Fojo, T., Bates, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour+stem+cells+and+drug+resistance.">Tumour stem cells and drug resistance.</a> Nat Rev Cancer. 5, 275-284 (2005).</li><li>Bapat, S. A., Mali, A. M., Koppikar, C. B., Kurrey, N. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Stem+and+progenitor-like+cells+contribute+to+the+aggressive+behavior+of+human+epithelial+ovarian+cancer.">Stem and progenitor-like cells contribute to the aggressive behavior of human epithelial ovarian cancer.</a> Cancer Res. 65, 3025-3029 (2005).</li><li>Szotek, P. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+side+population+defines+cells+with+stem+cell-like+characteristics+and+Mullerian+Inhibiting+Substance+responsiveness.">Ovarian cancer side population defines cells with stem cell-like characteristics and Mullerian Inhibiting Substance responsiveness.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 103, 11154-11159 (2006).</li><li>Zhang, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Identification+and+characterization+of+ovarian+cancer-initiating+cells+from+primary+human+tumors.">Identification and characterization of ovarian cancer-initiating cells from primary human tumors.</a> Cancer Res. 68, 4311-4320 (2008).</li><li>Wang, L., Mezencev, R., Bowen, N. J., Matyunina, L. V., McDonald, J. F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+stem-like+cells+from+a+human+ovarian+cancer+cell+line.">Isolation and characterization of stem-like cells from a human ovarian cancer cell line.</a> Mol Cell Biochem. 363, 257-268 (2012).</li><li>Kryczek, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Expression+of+aldehyde+dehydrogenase+and+CD133+defines+ovarian+cancer+stem+cells.">Expression of aldehyde dehydrogenase and CD133 defines ovarian cancer stem cells.</a> Int J Cancer. 130, 29-39 (2012).</li><li>Meng, E., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD44+/CD24-+ovarian+cancer+cells+demonstrate+cancer+stem+cell+properties+and+correlate+to+survival.">CD44+/CD24- ovarian cancer cells demonstrate cancer stem cell properties and correlate to survival.</a> Clin Exp Metastasis. 29, 939-948 (2012).</li><li>Alvero, A. B., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Molecular+phenotyping+of+human+ovarian+cancer+stem+cells+unravels+the+mechanisms+for+repair+and+chemoresistance.">Molecular phenotyping of human ovarian cancer stem cells unravels the mechanisms for repair and chemoresistance.</a> Cell Cycle. 8, 158-166 (2009).</li><li>Chen, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Evaluation+of+characteristics+of+CD44+CD117++ovarian+cancer+stem+cells+in+three+dimensional+basement+membrane+extract+scaffold+versus+two+dimensional+monocultures.">Evaluation of characteristics of CD44+CD117+ ovarian cancer stem cells in three dimensional basement membrane extract scaffold versus two dimensional monocultures.</a> BMC Cell Biol. 14, 7 (2013).</li><li>Guo, R., Wu, Q., Liu, F., Wang, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Description+of+the+CD133++subpopulation+of+the+human+ovarian+cancer+cell+line+OVCAR3.">Description of the CD133+ subpopulation of the human ovarian cancer cell line OVCAR3.</a> Oncol Rep. 25, 141-146 (2011).</li><li>Curley, M. D., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133+expression+defines+a+tumor+initiating+cell+population+in+primary+human+ovarian+cancer.">CD133 expression defines a tumor initiating cell population in primary human ovarian cancer.</a> Stem Cells. 27, 2875-2883 (2009).</li><li>Baba, T., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Epigenetic+regulation+of+CD133+and+tumorigenicity+of+CD133++ovarian+cancer+cells.">Epigenetic regulation of CD133 and tumorigenicity of CD133+ ovarian cancer cells.</a> Oncogene. 28, 209-218 (2009).</li><li>Liao, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ovarian+cancer+spheroid+cells+with+stem+cell-like+properties+contribute+to+tumor+generation,+metastasis+and+chemotherapy+resistance+through+hypoxia-resistant+metabolism.">Ovarian cancer spheroid cells with stem cell-like properties contribute to tumor generation, metastasis and chemotherapy resistance through hypoxia-resistant metabolism.</a> PLoS One. 9, e84941 (2014).</li><li>Silva, I. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Aldehyde+dehydrogenase+in+combination+with+CD133+defines+angiogenic+ovarian+cancer+stem+cells+that+portend+poor+patient+survival.">Aldehyde dehydrogenase in combination with CD133 defines angiogenic ovarian cancer stem cells that portend poor patient survival.</a> Cancer Res. 71, 3991-4001 (2011).</li><li>Jaggupilli, A., Elkord, E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Significance+of+CD44+and+CD24+as+cancer+stem+cell+markers:+an+enduring+ambiguity.">Significance of CD44 and CD24 as cancer stem cell markers: an enduring ambiguity.</a> Clin Dev Immunol. 2012, 708036 (2012).</li><li>Irollo, E., Pirozzi, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=CD133:+to+be+or+not+to+be,+is+this+the+real+question.">CD133: to be or not to be, is this the real question.</a> Am J Transl Res. 5, 563-581 (2013).</li><li>Ma, I., Allan, A. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+role+of+human+aldehyde+dehydrogenase+in+normal+and+cancer+stem+cells.">The role of human aldehyde dehydrogenase in normal and cancer stem cells.</a> Stem Cell Rev. 7, 292-306 (2011).</li><li>McLean, K., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Human+ovarian+carcinoma&#8211;associated+mesenchymal+stem+cells+regulate+cancer+stem+cells+and+tumorigenesis+via+altered+BMP+production.">Human ovarian carcinoma&#8211;associated mesenchymal stem cells regulate cancer stem cells and tumorigenesis via altered BMP production.</a> J Clin Invest. 121, 3206-3219 (2011).</li><li>Amara, I., Touati, W., Beaune, P., de Waziers, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Mesenchymal+stem+cells+as+cellular+vehicles+for+prodrug+gene+therapy+against+tumors.">Mesenchymal stem cells as cellular vehicles for prodrug gene therapy against tumors.</a> Biochimie. , (2014).</li><li>Brabletz, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=EMT+and+MET+in+metastasis:+where+are+the+cancer+stem+cells.">EMT and MET in metastasis: where are the cancer stem cells.</a> Cancer Cell. 22, 699-701 (2012).</li><li>Latifi, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Isolation+and+characterization+of+tumor+cells+from+the+ascites+of+ovarian+cancer+patients:+molecular+phenotype+of+chemoresistant+ovarian+tumors.">Isolation and characterization of tumor cells from the ascites of ovarian cancer patients: molecular phenotype of chemoresistant ovarian tumors.</a> PLoS One. 7, e46858 (2012).</li><li>Liu, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Breast+Cancer+Stem+Cells+Transition+between+Epithelial+and+Mesenchymal+States+Reflective+of+their+Normal+Counterparts.">Breast Cancer Stem Cells Transition between Epithelial and Mesenchymal States Reflective of their Normal Counterparts.</a> Stem Cell Reports. 2, 78-91 (2014).</li><li>Malecki, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=TRA-1-60(+),+SSEA-4(+),+Oct4A(+),+Nanog(+)+Clones+of+Pluripotent+Stem+Cells+in+the+Embryonal+Carcinomas+of+the+Ovaries.">TRA-1-60(+), SSEA-4(+), Oct4A(+), Nanog(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Ovaries.</a> J Stem Cell Res Ther. 2, (2012).</li><li>Malecki, M., Tombokan, X., Anderson, M., Malecki, R., Beauchaine, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=.">.</a> TRA-1-60(+), SSEA-4(+), POU5F1(+), SOX2(+), NANOG(+) Clones of Pluripotent Stem Cells in the Embryonal Carcinomas of the Testes. J Stem Cell Res Ther. 3, 10-4172 (2013).</li><li>Rajasekhar, V. K., Studer, L., Gerald, W., Socci, N. D., Scher, H. I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Tumour-initiating+stem-like+cells+in+human+prostate+cancer+exhibit+increased+NF-&#954;B+signalling.">Tumour-initiating stem-like cells in human prostate cancer exhibit increased NF-&#954;B signalling.</a> Nat Commun. 2, 162 (2011).</li><li>Loh, Y. H., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+Oct4+and+Nanog+transcription+network+regulates+pluripotency+in+mouse+embryonic+stem+cells.">The Oct4 and Nanog transcription network regulates pluripotency in mouse embryonic stem cells.</a> Nat Genet. 38, 431-440 (2006).</li><li>Tay, Y., Zhang, J., Thomson, A. M., Lim, B., Rigoutsos, I. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=MicroRNAs+to+Nanog,+Oct4+and+Sox2+coding+regions+modulate+embryonic+stem+cell+differentiation.">MicroRNAs to Nanog, Oct4 and Sox2 coding regions modulate embryonic stem cell differentiation.</a> Nature. 455, 1124-1128 (2008).</li><li>Lee, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Prognostic+impact+of+the+cancer+stem+cell-related+marker+NANOG+in+ovarian+serous+carcinoma.">Prognostic impact of the cancer stem cell-related marker NANOG in ovarian serous carcinoma.</a> Int J Gynecol Cancer. 22, 1489-1496 (2012).</li></ol>

The authors have nothing to disclose.

הפרוטוקול המתואר כאן מציג שיטה יעילה ועקבית להעשרת תרבויות לתאים עם תכונות של תאי גזע משורות תאי סרטן השחלות הוקמו וישים לדגימות חולים עיקריות. שיטה זו מעשירה בהצלחה לטיקים על פני מגוון רחב של שורות תאים. היא מאפשרת בזמן זיהוי של תנאים המעשירים לTIC ו / או הפנוטיפ סרטני, מבלי לקחת זמן כדי למיין את הטיקים מהלא-טיקים באוכלוסייה מבחינה פיזית. באופן זה, רמות היחסית של מסלולי איתות שונים ניתן להעריך על תרומתם לפנוטיפ TIC ידי השוואת תרבויות חסיד מסורתיות לTic תרבויות תוך שימוש במגוון של מבחני תפקודיים. אם אוכלוסיית TIC טהורה היא רצויה, בידוד יכול להיות מושגת בקלות על ידי שילוב צעד מיון בסיוע הקרינה או מגנטית בזרימת cytometry פרוטוקול. חשוב לזכור, עם זאת, כי הביטוי של סמן TICים, כגון CD133, CD44, או ALDH, עשוי להשתנות בין שורות תאים או דגימות חולים אפילו מאותו סוג הגידול. לדוגמא מצאנו כי יש לי OVCAR-5 התאים ביטוי גבוה יותר של CD44 ביחס לCD133, ואילו ההפוך הוא נכון עבור ACI-23. לכן זה רלוונטי להסתמך על התחלה של גידול בעכברים וזרימת cytometry ניתוח כמוחלט של נוכחות TIC. בעקבות פרוטוקול זה, פעילות הגבוהה ALDH נצפתה באופן עקבי כאשר תאי סרטן השחלות גדלו בתנאים בתאי גזע. מעניין, ביטוי CD133 הוא גבוה באופן עקבי בACI-23 תאים שגודלו בתנאי תרבות TIC מסורתיים, ואילו ALDH הוא גבוהה ביותר בתנאי TIC מצוף. בניגוד TGS-3 תאי מיימת העיקריים להציג עלייה קטנה בחיוביות CD133 בתנאי TIC מצוף, אבל גידול מרשים בפעילות ALDH בתנאי TIC מסורתיים. ממצאים אלו מדגישים את ההטרוגניות של תאי סרטן השחלות והפלסטיות נפוצים הקשורים טיקים. כדי לתמוך בCLA נוסףim כי שיטות אלה לשפר את הטיקים, העשרת TRA-1-60 תאים חיוביים נצפתה גם. TRA-1-60 הוא סמן pluripotency ונעשה שימוש כדי לזהות קרצינומה עוברית של השחלה ואשכים, כמו גם סרטן ערמונית TICS 30-32. למרות שהשיטות שלנו היו מוצלחות עם שורות תאים רבות, זה אפשרי, כי תנאי TIC סטנדרטיים עשויים להיות מתאימים יותר לחלק מתאי סרטן השחלות, ואילו תנאי המצוף שונה טובים יותר להעשיר לטיקים באוכלוסיות תאי סרטן השחלות אחרות. זה מדגיש שוב את ההטרוגניות הצפויה בתוך שני שורות תאי סרטן השחלות-המטופל נגזרות והקימו. בנוסף לסמנים פני תא יש כמה גורמי תעתיק שהוכחו לאפיין טיקים סרטן השחלות כוללים Nanog, Sox2, אוקטובר -4 11, אם כי סמנים אלה אינם ספציפיים לטיקי סרטן השחלות ולא מייצגים גורמים חשובים לpluripotency בתאי גזע העוברי וDIFferentiation 33,34. בחנו את השינויים ברמות חלבון של גורמים אלה ומצאנו כי רמות Nanog להגדיל בתנאי תרבות TIC, בהסכם עם אחרים 13,35 כמו גם CD133, TRA-1-60, וCD117. מערך cDNA סמן תאי גזע אנושי נוסף הראה עלייה בגנים CD133, Nanog, מלק, וPODXL בתנאי TIC בהשוואה לתנאים חסיד מסורתיים. חשוב לציין, יש לציין כי, כעם סמנים פני תא, גורמי תעתיק הקשורים לטיקי השחלות עשויים להשתנות בין שורות תאים ודגימות מטופל. ראינו כי תאים סרטניים עשויים להיות יותר ולהביע את הרמות גבוהות יותר של סמנים בתאי גזע אם הם מטבעם לא חסיד במבחנה (כלומר, צף תאים שאינם מוכן לצרף לצלחת חסיד). בתרבות, יש לי שורות תאים כגון ACI-23 בדרך כלל רבים תאי קיימא צפים ו / או תאים שגדלים בצורה אנכית באופן לערום תחת קונדיט התרבות המסורתייונים. למרות העשרה מוצלחת של טיקים מהתאים ואגרגטים צף יכולה להיות שורות תאים החלים על מעטים יחסית כולל אלה שבמחקר הנוכחי וOVCAR-3 12, הממצאים שלנו מציעים זה עשוי לייצג אוכלוסיית tumorigenic יותר. לכן, קציר האוכלוסייה &quot;צף&quot; של תאים שגודלו בצלחות תרבית רקמה סטנדרטית ותקשורת יכול לשמש כדרך חלופית להעשרת TIC, לתאים שיתאימו בצורה גרועה לתקשורת בתאי גזע המסחרית. שימוש בשיטות התרבות השונות שהוצגו בכתב היד הזה יאפשר העשרה מהירה של אוכלוסיות TIC והבנה טובה יותר של גורמים שתומכים בפנוטיפ זה בתאים שונים. יישומים הנוכחיים של שיטה זו כוללים אפיון שמסלולי איתות חיוניים לתמיכה בריבוי של אוכלוסייה ייחודית זו של תאים. תוצאות ממחקרים אלה יסייעו להבהיר את המנגנונים של התקדמות גידול ולהרע.

סרטן השחלות הוא הגידול ממאיר גינקולוגיות הקטלנית ביותר בארצות הברית עם הגורמים העיקריים לתחלואה ותמותה להיות תכונות של מחלה זו חוזרות ונשנות מאוד, chemoresistant. טיפול ראשוני מורכב לרוב מניתוח cytoreductive מקסימאלי וטיפול פלטינה לאחר מכן מבוסס, אם כי יש כמה עדויות לכך טיפול neoadjuvant עשוי להיות מועיל במקרים מסוימים 1. רוב המטופלים מגיבים בחיוב לטיפול ראשוני, אך למרבה הצער המחצית תהיה להרע בתוך 18 חודשים 2. רוב גידולים ממאירים בשחלות הם קרצינומה אפיתל ויכולים לנבוע epithelia של 3,4 צינור השחלה או השחלה לפני השטח. מספר מחקרים תומכים בקיומם של תאי גזע סומטיים במערכת הרבייה הנשית שככל הנראה לסייע בתיקון רקמות שצריך בעקבות ביוץ 5,6. פעילות שגשוג הגבוהה בשתי השחלות וחצוצרות במהלך ovulation עשוי להיות גורם חשוב בהתפתחות של סרטן השחלות (Gharwan, et al. כתב יד שהוגש). הגזירה של תאי יוצרי גידול לא ברורה אבל הם יכולים לנבוע מתאי נורמלים גזע, תאי אב, או תאים מובחנים באמצעות מוטציות ההופכות אותם לא הצליח להסדיר החלוקה או גורל. תאים אלה יש גם מכונים &quot;תאי גזע סרטני,&quot; או &quot;תאי סרטן-ייזום,&quot; ויכולים לגדול לתוך spheroids tumorigenic, רב-תאי בתנאי התקשרות נמוכים. למרות שהמודל ההיררכי של פיתוח TIC עשוי להיות דינמי, טיקים חולקים רבים של אותן התכונות כמו תאי גזע נורמלים כוללים quiescence, התנגדות לכימותרפיה, התחדשות עצמית לטווח ארוך ויכולת להתמיין שושלות תאים שונות 7,8. מספר מחקרים תומכים בקיומה של טיקים בסרטן השחלות ומאמצים הנוכחיים נמצאים בעיצומם כדי להבהיר את המנגנון (ים) שבו תאים אלה תומכים ביצירת גידולים 9-11. כמה סמנים הוצעו לזהות טיקים השחלות עם tumorigenicity המשופר כולל CD133, ALDH1A1, CD117, CD44, וMyD88, למרות שתרומתו של כל סמן המדויק אינה ברורה ויכולה להיות סוג התא ספציפי 11-16. בעוד סמן אוניברסלי או קבוצה של סמנים לא הוקם באופן חד משמעי לטיקי השחלות, קבוצות שונות הצליחו לבודד טיקים השחלות נפוצות יותר על ידי בחירה עבור CD44 +, CD133 + ו / או תאים עם dehydrogenase אלדהיד פעילות הגבוה (ALDH) 13,17-21. CD44 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני הפועל כקולטן לחומצה היאלורונית ומסדיר כמה תהליכים חשובים להתקדמות גידול, כוללים הדבקה, התפשטות, הגירה, אנגיוגנזה ובידול 22. CD133 הוא גליקופרוטאין הטרנסממברני שתפקידה עדיין לא ברור, אך מחקרים מראים שזה מארגן טופולוגיה קרום פלזמה 23. ALDH, אנזים תאיים שמזרז את החמצון של אלדהידים, עשוי להיות רוב היקוםסמן אל של טיקים כפעילות גבוהה זוהה בתאי גזע שבודדו ממגוון רחב של רקמות ותפקידים מרובים יוחסו לALDH בתמיכת תאי גזע נורמלים ו -24 טיקים. נכון לעכשיו, נראים CD133 וALDH1 להיות הסמנים לשחזור ביותר של טיקים השחלות 13,21. בנוסף להבנת המאפיינים של טיקים, יש גם מאמץ גדול כדי לזהות תרופות שמתמקדות תת-אוכלוסייה זו. שיעור ההישנות הגבוה הקשורים לסרטן השחלות יכול להיות בגלל הכישלון של טיפולי הכימותרפיה הנוכחיות למיגור הצלחת טיקים. למרות שחלק הארי של הגידול הוא רגיש לטיפולים קיימים, טיקים נחשבים לעמיד ובצפיפות בלתי ניתנת לגילוי על ידי שיטות סטנדרטית. מנגנוני הבהרה של התנגדות טיפול והישנות של גידול הם חיוניים כדי לשפר את התגובה ושיעורי הישרדות כוללת של חולים עם סרטן שחלות. כאן, טכניקות תרבות מתוארות הבלהעשיר לטיקים משורות תאי סרטן השחלות הוקמו ועיקריות. תנאי התרבות מתוארים כאן נעשו שימוש על ידי מספר קבוצות כדי לגרום להתפשטות של טיקים או תאי אליפטית עם איכויות תאי גזע 11,12,14,16,20. למרות שיש כמה במדיות תרבות תאי גזע ותוספים נפוצים להעשרת טיקים / spheroids השתמשנו נוסחת סרום ללא מדיה עם EGF וFGF, אך ללא תוספת של B27 או N-2 תוספים. תוספי מזון אלו, המשמשים בדרך כלל לתרבית תאים עצבית ומעשיר לתאי גזע, הוכחו לקדם פנוטיפ mesenchymal 25,26 ונותר אי ודאות בתחום, האם טיקים שיש mesenchymal או הפנוטיפ אפיתל הם tumorigenic יותר 27-29 . כדי למזער את חוסר ודאות ומשתנים אנו שבחרנו להשתמש בנוסחה הנפוצה ביותר, עם תאי סרטן השחלות אפיתל מאז אנו עוסקים. שמירה על תאים בסרום ללא מדיה בבקבוק מצורף נמוךמאפשר היווצרות אליפטית ותומך בהתפשטות של תאים עם ביטוי CD133 ופעילות ALDH גבוהה. העבודה שלנו הראתה עוד, כי תאים צפים בתנאים חסיד נורמלים גם יכולים לייצג אוכלוסיית TIC tumorigenic יותר. הזרקה של תאים שגודלו בתנאים אלו לעכברים בעירום athymic מובילה לפוטנציאל גבוה יותר בהשוואה לתאים סרטני גדלו בתנאים מצורפים בנוכחות הסרום. מידע רב בנוגע לתפקידו של טיקים בייזום סרטן השחלות, התקדמות, תגובה לטיפול, והישנות מחלה ניתן להשיג באמצעות השימוש בטכניקות אלה.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="1066">
	<tbody>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Name of Reagent/ Equipment</td>
			<td style="width:191px;">Company</td>
			<td style="width:104px;">Catalog Number</td>
			<td style="width:308px;">Comments/Description</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Ultra - Low Attachment Flask</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">3814</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">75 cm2 Tissue Culture Flask</td>
			<td style="width:191px;">Sarstedt</td>
			<td style="width:104px;">83.1813.002</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Aldefluor Kit</td>
			<td style="width:191px;">Stemcell Technologies</td>
			<td align="right" style="width:104px;">1700</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">CD133-APC</td>
			<td style="width:191px;">Miltenyi Biotec Inc.</td>
			<td style="width:104px;">130-090-826</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fibroblast Growth Factor - Basic human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">F0291</td>
			<td>Prepared according to manufacturer&#39;s instructions</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Epidermal Growth Factor - human recombinant</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">E9644</td>
			<td>Prepared by Dissolving 0.2 mg with 1 ml sterile PBS</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">DMEM:F12 (+L-Glutamine, +5 mM HEPES)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">11330-032</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">1X Dulbecco&#39;s Phosphate-Buffered Saline (Without Calcium and Magnesium)</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">21-031-CV</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">0.25% Trypsin-EDTA (1X)</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">25200-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Cellstripper Non-enzymatic Cell Dissociation Solution</td>
			<td style="width:191px;">Corning cellgro</td>
			<td style="width:104px;">25-056-CI</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Bovine Serum Albumin</td>
			<td style="width:191px;">Sigma-Aldrich</td>
			<td style="width:104px;">A9418-10G</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Insulin-Transferrin-Selenium</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">51500-056</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">KnockOut Serum Replacement</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td align="right" style="width:104px;">10828010</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Penicillin/Streptomycin</td>
			<td style="width:191px;">Gibco</td>
			<td style="width:104px;">15140-122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Fetal Bovine Serum (Heat Inactivated)</td>
			<td style="width:191px;">Gemini</td>
			<td style="width:104px;">100-106</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:464px;">Rapid-Flow Sterile Dsiposable Filter Units with CN Membrane (0.45 micron)</td>
			<td style="width:191px;">Nalgene</td>
			<td style="width:104px;">450-0045</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">15 ml Sterile Polypropylene Centrifuge Tube</td>
			<td style="width:191px;">Corning</td>
			<td align="right" style="width:104px;">430052</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">50 ml Sterile Polypropylene Conical Tube</td>
			<td style="width:191px;">Falcon</td>
			<td align="right" style="width:104px;">352098</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:464px;">Trypan Blue 0.4% solution in 0.85% NaCl</td>
			<td style="width:191px;">Lonza</td>
			<td style="width:104px;">17-942E</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

in vitro enrichment of ovarian cancer tumor-initiating cells

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor initiation and/or relapse. Clarifying the mechanisms by which these tumor-initiating cells (TICs) support tumor formation and progression could lead to the development of clinically favorable therapies. Ovarian cancer is a heterogeneous and highly recurrent disease. Recent studies suggest TICs may play an important role in disease biology. We have identified culture conditions that enrich for TICs from ovarian cancer cell lines. Growing either adherent cells or non-adherent &#8216;floater&#8217; cells in a low attachment plate with serum free media in the presence of growth factors supports the propagation of ovarian cancer TICs with stem cell markers (CD133 and ALDH activity) and increased tumorigenicity without the need to physically separate the TICs from other cell types within the culture. Although the presence of floater cells is not common for all cell lines, this population of cells with innate low adherence may have high tumorigenic potential.Compared to adherent cells grown in the presence of serum, TICs readily form spheres, are significantly more tumorigenic in mice, and express putative stem cell markers. The conditions are easy to establish in a timely manner and can be used to study signaling pathways important for maintaining stem characteristics, and to identify drugs or combinations of drugs targeting TICs. The culture conditions described herein are applicable for a variety of ovarian cancer cells of epithelial origin and will be critical in providing new information about the role of TICs in tumor initiation, progression, and relapse.

הוקם שורות תאי סרטן השחלות ושורת תאי מיימת עיקריות גדלה בתנאי תרבות חסיד מסורתיים בנוכחות סרום תכנית המצורפת, מורפולוגיה מרוצפת, ואילו אותם התאים שגודלו בתנאי תרבות TIC התצוגה צף מורפולוגיה אליפטית, נפוצה באוכלוסיות TIC. תמונות Brightfield מוצגות באיור 1 מראות בבירור את ההבדלים מורפולוגיים בתנאי התרבות. איור 1 מציגה את המורפולוגיות מובחנות הושגו לאחר replating ACI-23 וTGS-3 תרבויות TIC בתנאים חסיד מסורתיים. רק 24 שעות לאחר זריעה בחזרה בתנאים חסיד, רוב spheroids הרב-תאיים לנתק ולחבר אל פני השטח, שמזכירים תאים חסיד טיפוסיים. כדי לוודא שתנאי TIC להעשיר לתאים עם סמנים של תאי גזע cytometry זרימת הניתוח בוצע באמצעות שני סמנים משותפים של טיקים השחלות - expressio CD133n ופעילות ALDH. חלקות Dot שמוצגים באיור 2 מדגישות את אחוז המוגבר של CD133 + תאים בקובץ מצורף נמוך, ללא תנאים בסרום. בדומה לכך, הפעילות של אנזים ALDH היא גבוהה יותר בתנאים אלה בהשוואה לתנאי תרבות חסיד מסורתיים. למרות שהתרבויות חסיד המסורתיות מכילות CD133 + תאים, השיעור עולה בתנאים המשפרים את היווצרות אליפטית. ניתוח של סמן pluripotency, TRA-1-60, מעניק תמיכה נוספת לכך שתנאי TIC להעשיר לטיקים, איור 2 ב &#39;. כימות באיור 2 C מוכיח כי חיוביים כפול (CD133 + ALDH +) ACI-23 תאים מוגבלים במידה רבה לתרבויות גדלו בתנאי שיפור TIC. שינויים ברמות החלבון של גורמי תעתיק שונים המתרחשים בACI-23 התאים לאחר חמישה ימים של תרבות בתנאי TIC גם נבדקו. עלייה הדרגתית בכל אחד מהסמןים נראה ממסורתי למצוף תנאי TIC בהשוואה לרמות הנמוכה יחסית לראות בתרבות חסיד, איור 2 D. מעניין שורת תאי מיימת אנושית הגדלה בתנאים השונים מציגה את הפנוטיפ הסמן הגבוה ביותר בתנאי TIC המסורתיים עם לא מעט הווה צביעה בתנאי TIC המצוף, איור 2 E. Tumorigenicity של תנאי תרבות TIC קבל תוקף באמצעות זריקות תת עוריות של מספר שווה של תאי קיימא המתקבלים מכל התנאים לקבוצות של עכברים בעירום athymic. איור 3 מראה כי ACI-23 (A, B) וOVCAR-5 (ג) תאים מ תרבויות חסיד מסורתיות היו פחות tumorigenic מאלה מתרבויות TIC. שים לב שתרבויות TIC המצוף מיוצרות גידולים גדולים יותר בפרק זמן קצר יותר מאשר תרבויות TIC חסיד או מסורתיות המסורתיות. ד אלואתא מצביע על כך שאפילו עם עלייה מתונה בסמני TIC השחלות, יש שינוי פנוטיפי דרמטי. עם זאת בשורות תאים אחרות (לא מוצג) תרבויות TIC המסורתיות היו יותר tumorigenic מאשר תאי התרבות המסורתיים חסיד ומצוף TIC. <img alt="איור 1" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig1highres.jpg" /> שורות תאי סרטן השחלות איור 1. פיתוח ספרואיד בתנאי תרבות שונים. (א) הוקם (ACI-23, OVCAR-5 וCAOV3) ותאים ראשוניים המופקת מחולת מיימת (TGS-3) גדלו בצלוחיות מצורפים נמוכות עם סרום ללא תקשורת בתאי גזע בקלות ליצור spheroids רב-תאי. תמונות מראות תנאי תרבות חסיד מסורתיים לשמור על מורפולוגיה מרוצפת אפיתל בACI-23, OVCAR-5, CAOV3 וTGS-3 תאים, ואילו אותם תאים שנוצרו בתוך 96 שעות spheroids בתנאי TIC. בר סולם 100 מיקרומטר. (ב) עם חשיפת 24 שעותלתנאי תרבות חסיד מסורתיים, המורפולוגיות תרבות TIC להציג פנוטיפ מובחן המזכיר את המורפולוגיה חסיד המקורית. בר סולם 100 מיקרומטר. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig1large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> <img alt="איור 2" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig2highres.jpg" /> איור 2. נמוך מצורף, תנאי סרום ללא להעשיר לתאים עם סמני TIC. () Cytometry זרימת הניתוח של ACI-23 תאים באמצעות APC מצומדות נוגדן CD133 מדגים אחוז מוגבר של CD133 + תאים בצלוחיות מצורפים נמוכות עם גזע סרום ללא תא תקשורת. Cytometry זרימת הניתוח באמצעות מופעי assay Aldefluor פעילות מוגברת ALDH בתאים בתרבית בצלוחיות מצורפים נמוכות עם תקשורת בתאי גזע סרום ללא. ביקורת שלילית CD133 אינו מכילה נוגדנים וcon השלילי ALDH<html> trol הוא המצע מופעל בנוכחות מעכב ALDH (DEAB). (ב) ניתוח באמצעות נוגדן TRA-1-60 מצומדות FITC מדגים אחוז הגבוה ביותר של תאים + TRA-1-60 בתנאי TIC המצוף בACI-23 תאים. ביקורת שלילית לא מכילה נוגדן. CD133 (C) + ALDH + תאים הגבוהים ביותר הוא בTIC המסורתי ומצוף תנאי TIC בשורת תאי ACI-23. ברים שגיאה: SEM, N = 6, * p &lt;0.05. ניתוח כתם המערבי (ד &#39;) מראה עלייה ברמות חלבון של סמני תעתיק של תאי גזע בACI-23 התאים בתרבית בתנאי TIC במשך 5 ימים. lysates התא כולו (50 מיקרוגרם) נותח עם GAPDH כביקורת טעינה. (E) חלקות נקודת נציג של TGS-3 תאי מיימת עיקריים ניתחו כמו ב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig2large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a> ep-together.within-page = &quot;תמיד&quot;&gt; <img alt="איור 3" src="/files/ftp_upload/52446/52446fig3highres.jpg" /> איור 3. נמוך מצורף, תנאי סרום ללא להעשיר לתאים עם tumorigenicity המוגבר. (א) 5 x 10 5 ACI-23 תאי קיימא הוזרקו תת עורי לעכברים בעירום athymic בשלושה עותקים. עכברים נשקלו ונמדדו על ידי גידולי קליפר פעמיים בשבוע. = תרבות מסורתית חסיד, תרבות F = רחף TIC, תרבות S = המסורתי TIC. * P &lt;0.05. (ב) נציג תמונות של גידולים נוצרו מACI-23 לאחר 25 ימי שימוש בתאים שגודלו בתנאי תרבות שונים. (ג) 5 x 10 5 OVCAR-5 תאים קיימא הוזרקו תת עורי לעכברים בעירום athymic בשלושה עותקים ופיקוח כמו ב. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/52446/52446fig3large.jpg" target="_blank">אנא לחץ כאן כדי לצפות בגרסה גדולה יותר של דמות זו.</a>

Watch this Scientific Journal Video about In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells at JoVE.com

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Evidence suggests that small subpopulations of tumor cells maintain a unique self-renewing and differentiation capacity and may be responsible for tumor ...

in-vitro-enrichment-of-ovarian-cancer-tumor-initiating-cells

Research

JoVE Journal

Medicine

In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

13.7K Views.  National Cancer Institute. Tumor-initiating cells (TICs) may represent a viable therapeutic target for the treatment of ovarian cancer, a highly recurrent and fatal disease. We present a protocol for culture conditions that enrich for this highly tumorigenic population of cells.

Video: In vitro Enrichment of Ovarian Cancer Tumor-initiating Cells

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 percent of women with ovarian cancer develop new metastases, and the recurrence is often fatal2. It is, therefore, necessary to understand how secondary metastases arise in order to develop better treatments for intermediate and late stage ovarian cancer. Ovarian cancer metastasis occurs when malignant cells detach from the primary tumor site and disseminate throughout the peritoneal cavity. The disseminated cells can form multicellular clusters, or spheroids, that will either remain unattached, or implant onto organs within the peritoneal cavity3 (Figure 1, Movie 1). 
All of the organs within the peritoneal cavity are lined with a single, continuous, layer of mesothelial cells4-6 (Figure 2). However, mesothelial cells are absent from underneath peritoneal tumor masses, as revealed by electron micrograph studies of excised human tumor tissue sections3,5-7 (Figure 2). This suggests that mesothelial cells are excluded from underneath the tumor mass by an unknown process. 
Previous in vitro experiments demonstrated that primary ovarian cancer cells attach more efficiently to extracellular matrix than to mesothelial cells8, and more recent studies showed that primary peritoneal mesothelial cells actually provide a barrier to ovarian cancer cell adhesion and invasion (as compared to adhesion and invasion on substrates that were not covered with mesothelial cells)9,10. This would suggest that mesothelial cells act as a barrier against ovarian cancer metastasis. The cellular and molecular mechanisms by which ovarian cancer cells breach this barrier, and exclude the mesothelium have, until recently, remained unknown. 
Here we describe the methodology for an in vitro assay that models the interaction between ovarian cancer cell spheroids and mesothelial cells in vivo (Figure 3, Movie 2). Our protocol was adapted from previously described methods for analyzing ovarian tumor cell interactions with mesothelial monolayers8-16, and was first described in a report showing that ovarian tumor cells utilize an integrin &#x2013;dependent activation of myosin and traction force to promote the exclusion of the mesothelial cells from under a tumor spheroid17. This model takes advantage of time-lapse fluorescence microscopy to monitor the two cell populations in real time, providing spatial and temporal information on the interaction. The ovarian cancer cells express red fluorescent protein (RFP) while the mesothelial cells express green fluorescent protein (GFP). RFP-expressing ovarian cancer cell spheroids attach to the GFP-expressing mesothelial monolayer. The spheroids spread, invade, and force the mesothelial cells aside creating a hole in the monolayer. This hole is visualized as the negative space (black) in the GFP image. The area of the hole can then be measured to quantitatively analyze differences in clearance activity between control and experimental populations of ovarian cancer and/ or mesothelial cells. This assay requires only a small number of ovarian cancer cells (100 cells per spheroid X 20-30 spheroids per condition), so it is feasible to perform this assay using precious primary tumor cell samples. Furthermore, this assay can be easily adapted for high throughput screening.

In vitro Mesothelial Clearance Assay that Models the Early Steps of Ovarian Cancer Metastasis

The mesothelial clearance assay described here takes advantage of fluorescently labeled cells and time-lapse video microscopy to visualize and quantitatively measure the interactions of ovarian cancer multicellular spheroids and mesothelial cell monolayers. This assay models the early steps of ovarian cancer metastasis.

ב Assay עמילות חוץ גופית mesothelial כי מודלים השלבים המוקדמים של גרורות סרטן השחלות

Ovarian cancer is the fifth leading cause of cancer related deaths in the United States1. Despite a positive initial response to therapies, 70 to 90 ...

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical treatments and improved platinum-based chemotherapies, there has been little improvement in EOC survival rates for more than four decades 1,2. Whilst stage I tumors have 5-year survival rates &gt;85%, survival rates for stage III/IV disease are &lt;40%. Thus, the high rates of mortality for EOC could be significantly decreased if tumors were detected at earlier, more treatable, stages 3-5. At present, the molecular genetic and biological basis of early stage disease development is poorly understood. More specifically, little is known about the role of the microenvironment during tumor initiation; but known risk factors for EOCs (e.g. age and parity) suggest that the microenvironment plays a key role in the early genesis of EOCs. We therefore developed three-dimensional heterotypic models of both the normal ovary and of early stage ovarian cancers. For the normal ovary, we co-cultured normal ovarian surface epithelial (IOSE) and normal stromal fibroblast (INOF)&nbsp;cells, immortalized by retrovrial transduction of the catalytic subunit of human telomerase holoenzyme (hTERT) to extend the lifespan of these cells in culture. To model the earliest stages of ovarian epithelial cell transformation, overexpression of the CMYC oncogene in IOSE cells, again co-cultured with INOF cells. These heterotypic models were used to investigate the effects of aging and senescence on the transformation and invasion of epithelial cells. Here we describe the methodological steps in development of these three-dimensional model; these methodologies aren't specific to the development of normal ovary and ovarian cancer tissues, and could be used to study other tissue types where stromal and epithelial cell interactions are a fundamental aspect of the tissue maintenance and disease development.

Heterotypic Three-dimensional In Vitro Modeling of Stromal-Epithelial Interactions During Ovarian Cancer Initiation and Progression

We describe methodologies for establishing in vitro heterotypic three-dimensional models comprising ovarian fibroblasts and normal ovarian surface or ovarian cancer epithelial cells. We discuss the use of these models to study stromal-epithelial interactions that occur during ovarian cancer development.

Heterotypic תלת ממדי<em&gt; במבחנה</em&gt; מידול של אינטראקציות stromal-אפיתל בייזום והתקדמות סרטן השחלות

Epithelial ovarian cancers (EOCs) are the leading cause of death from gynecological malignancy in Western societies. Despite advances in surgical ...

Label-free Isolation and Enrichment of Cells Through Contactless Dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to direct the motion of microparticles in a surface marker-independent manner. Traditionally, DEP devices include planar metallic electrodes patterned in the sample channel. This approach can be expensive and requires a specialized cleanroom environment. Recently, a contact-free approach called contactless dielectrophoresis (cDEP) has been developed. This method utilizes the classic principle of DEP while avoiding direct contact between electrodes and sample by patterning fluidic electrodes and a sample channel from a single polydimethylsiloxane (PDMS) substrate, and has application as a rapid microfluidic strategy designed to sort and enrich microparticles. Unique to this method is that the electric field is generated via fluidic electrode channels containing a highly conductive fluid, which are separated from the sample channel by a thin insulating barrier. Because metal electrodes do not directly contact the sample, electrolysis, electrode delamination, and sample contamination are avoided. Additionally, this enables an inexpensive and simple fabrication process.
cDEP is thus well-suited for manipulating sensitive biological particles. The dielectrophoretic force acting upon the particles depends not only upon spatial gradients of the electric field generated by customizable design of the device geometry, but the intrinsic biophysical properties of the cell. As such, cDEP is a label-free technique that avoids depending upon surface-expressed molecular biomarkers that may be variably expressed within a population, while still allowing characterization, enrichment, and sorting of bioparticles.
Here, we demonstrate the basics of fabrication and experimentation using cDEP. We explain the simple preparation of a cDEP chip using soft lithography techniques. We discuss the experimental procedure for characterizing crossover frequency of a particle or cell, the frequency at which the dielectrophoretic force is zero. Finally, we demonstrate the use of this technique for sorting a mixture of ovarian cancer cells and fluorescing microspheres (beads).

Contactless dielectrophoresis (cDEP) achieves sorting and enrichment of particles via their intrinsic dielectric properties. Fluidic electrode channels replace metallic electrodes traditional to DEP, suiting cDEP to non-damaging sterile characterization and sorting of biological particles. We demonstrate how to prepare a cDEP microdevice and conduct cell characterization and sorting experiments.

בידוד ללא תווית והעשרה של תאים דרך מגע dielectrophoresis

Dielectrophoresis (DEP) is the phenomenon by which polarized particles in a non-uniform electric field undergo translational motion, and can be used to ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

פרופיל של מיקרו RNA המוסדר אסטרוגן בתאי סרטן השד

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

Method for Obtaining Primary Ovarian Cancer Cells From Solid Specimens

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a valuable tool for understanding ovarian cancer, their use has many limitations. These include the lack of heterogeneity and the plethora of genetic alterations associated with extended in vitro passaging.&#160;Here we describe a method that allows for rapid establishment of primary ovarian cancer cells form solid clinical specimens collected at the time of surgery. The method consists of subjecting clinical specimens to enzymatic digestion for 30 min. The isolated cell suspension is allowed to grow and can be used for downstream application including drug screening. The advantage of primary ovarian cancer cell lines over established ovarian cancer cell lines is that they are representative of the original specific clinical specimens they are derived from and can be derived from different sites whether primary or metastatic ovarian cancer.

This study describes a detailed method for isolation and characterization of primary ovarian cancer cells from solid clinical specimens. Ovarian cancer clinical specimens are subjected to enzymatic digestion to obtain viable, fibroblast-free epithelial ovarian cancer (EOC) cells highly suitable for downstream applications.

שיטה לקבלת תאי סרטן השחלות ראשיים מתוך דגימות מוצקים

Reliable tools for investigating ovarian cancer initiation and progression are urgently needed. While the use of ovarian cancer cell lines remains a ...

Assessment of Ovarian Cancer Spheroid Attachment and Invasion of Mesothelial Cells in Real Time

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not accurately model the behaviors of cancer cells within a nonadherent environment, as cancer cells inherently aggregate into multicellular structures which contribute to the metastatic process by attaching to and invading the peritoneal lining to form secondary tumors. To model this important stage of ovarian cancer metastasis, multicellular aggregates, or spheroids, can be generated from established ovarian cancer cell lines maintained under nonadherent conditions. To mimic the peritoneal microenvironment encountered by tumor cells in vivo, a spheroid-mesothelial co-culture model was established in which preformed spheroids are plated on top of a human mesothelial cell monolayer, formed over an extracellular matrix barrier. Methods were then developed using a real-time cell analyzer to conduct quantitative real time measurements of the invasive capacity of different ovarian cancer cell lines grown as spheroids. This approach allows for the continuous measurement of invasion over long periods of time, which has several advantages over traditional endpoint assays and more laborious real time microscopy image analyses. In short, this method enables a rapid, determination of factors which regulate the interactions between ovarian cancer spheroid cells invading through mesothelial and matrix barriers over time.

Ovarian cancer cell invasion into the mesothelial lining of the peritoneum is a dynamic process over time. Utilizing a real time analyzer, the invasive capacity of ovarian cancer cells in a spheroid-mesothelial cell co-culture model can be quantified over prolonged time periods, providing insights into factors regulating the metastatic process.

הערכה של קובץ מצורף סרטן השחלות אליפטית ופלישה של תאי mesothelial בזמן אמת

Ovarian cancers metastasize by shedding into the peritoneal fluid and dispersing to distal sites within the peritoneum. Monolayer cultures do not ...

Murine Model for Non-invasive Imaging to Detect and Monitor Ovarian Cancer Recurrence

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of care consisting of surgical debulking and combination chemotherapy consisting of platinum and taxane compounds, almost 90% of patients recur within a few years. In these patients the development of chemoresistant disease limits the efficacy of currently available chemotherapy agents and therefore contributes to the high mortality. To discover novel therapy options that can target recurrent disease, appropriate animal models that closely mimic the clinical profile of patients with recurrent ovarian cancer are required. The challenge in monitoring intra-peritoneal (i.p.) disease limits the use of i.p. models and thus most xenografts are established subcutaneously. We have developed a sensitive optical imaging platform that allows the detection and anatomical location of i.p. tumor mass. The platform includes the use of optical reporters that extend from the visible light range to near infrared, which in combination with 2-dimensional X-ray co-registration can provide anatomical location of molecular signals. Detection is significantly improved by the use of a rotation system that drives the animal to multiple angular positions for 360 degree imaging, allowing the identification of tumors that are not visible in single orientation. This platform provides a unique model to non-invasively monitor tumor growth and evaluate the efficacy of new therapies for the prevention or treatment of recurrent ovarian cancer.

We describe a non-invasive animal imaging platform that allows the detection, quantification, and monitoring of ovarian cancer growth and recurrence. This intra-peritoneal xenograft model mimics the clinical profile of patients with ovarian cancer.

דגם Murine הדמיה בלתי פולשנית לזיהוי ומעקב סרטן השחלות הישנות

Epithelial ovarian cancer is the most lethal gynecologic malignancy in the United States. Although patients initially respond to the current standard of ...

Enrichment for Chemoresistant Ovarian Cancer Stem Cells from Human Cell Lines

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, invasive, and chemoresistant tumor cells. Therefore, CSCs are an attractive population of cells to target therapeutically. CSCs are predicted to contribute to a number of types of malignancies including those in the blood, brain, lung, gastrointestinal tract, prostate, and ovary. Isolating and enriching a tumor cell population for CSCs will enable researchers to study the properties, genetics, and therapeutic response of CSCs. We generated a protocol that reproducibly enriches for ovarian cancer CSCs from ovarian cancer cell lines (SKOV3 and OVCA429). Cell lines are treated with 20 &#181;M cisplatin for 3 days. Surviving cells are isolated and cultured in a serum-free stem cell media containing cytokines and growth factors. We demonstrate an enrichment of these purified CSCs by analyzing the isolated cells for known stem cell markers Oct4, Nanog, and Prom1 (CD133) and cell surface expression of CD177 and CD133. The CSCs exhibit increased chemoresistance. This method for isolation of CSCs is a useful tool for studying the role of CSCs in chemoresistance and tumor relapse.

Cancer stem cells (CSCs) are&#160;implicated in tumor relapse due to chemoresistance. We have optimized a protocol for selection and expansion of CSCs from ovarian cancer cell lines. By treating cells with the chemotherapeutic cisplatin and culturing&#160;in a stem cell promoting media we enrich for non-adherent CSC cultures.

העשרה לתאי גזע Chemoresistant סרטן השחלות משורות תאים אנושיות

Cancer stem cells (CSCs) are defined as a subset of slow cycling and undifferentiated cells that divide asymmetrically to generate highly proliferative, ...

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same pathway, are likely to fail. Emphasis must be placed upon the inhibition of pathways that are responsible for intrinsic and/or adaptive resistance to therapy. An active field of investigation is the development and testing of DNA repair inhibitors that promote the action of, and prevent resistance to, commonly used chemotherapy and radiotherapy. We used a novel protocol to evaluate the effectiveness of BRCA2 inhibition as a means to sensitize tumor cells to the DNA damaging drug cisplatin. Tumor cell metabolism (acidification and respiration) was monitored in real-time for a period of 72 hr to delineate treatment effectiveness on a minute by minute basis. In combination, we performed an assessment of metastatic frequency using a chicken embryo chorioallantoic membrane (CAM) model of extravasation and invasion. This protocol addresses some of the weaknesses of commonly used in vitro and in vivo methods to evaluate novel cancer therapy regimens. It can be used in addition to common methods such as cell proliferation assays, cell death assays, and in vivo murine xenograft studies, to more closely discriminate amongst candidate targets and agents, and select only the most promising candidates for further development.

Evaluating the Effectiveness of Cancer Drug Sensitization In Vitro and In Vivo

Here, real-time monitoring of tumor cell metabolism, combined with an in vivo chicken embryo chorio-allantoic membrane (CAM) model of metastasis, are used to evaluate novel anti-cancer targets/agents for their ability to sensitize tumor cells to DNA damaging chemotherapeutics.

הערכת היעילות של תרופות למלחמה בסרטן רגישות<em&gt; במבחנה</em&gt; ו<em&gt; In vivo</em

Due to the high level of heterogeneity and mutations inherent in human cancers, single agent therapies, or combination regimens which target the same ...

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of women are alive 5 years after diagnosis. The omentum is a preferred site of HGSC metastasis formation. Despite the clinical importance of this microenvironment, the contribution of omental adipose tissue to ovarian cancer progression remains understudied. Omental adipose is unusual in that it contains structures known as milky spots, which are comprised of B, T, and NK cells, macrophages, and progenitor cells surrounding dense nests of vasculature. Milky spots play a key role in the physiologic functions of the omentum, which are required for peritoneal homeostasis. We have shown that milky spots also promote ovarian cancer metastatic colonization of peritoneal adipose, a key step in the development of peritoneal metastases. Here we describe the approaches we developed to evaluate and quantify milky spots in peritoneal adipose and study their functional contribution to ovarian cancer cell metastatic colonization of omental tissues both in vivo and ex vivo. These approaches are generalizable to additional mouse models and cell lines, thus enabling the study of ovarian cancer metastasis formation from initial localization of cells to milky spot structures to the development of widespread peritoneal metastases.

In Vivo and Ex Vivo Approaches to Study Ovarian Cancer Metastatic Colonization of Milky Spot Structures in Peritoneal Adipose

We outline a protocol that implements both in vivo and ex vivo approaches to study ovarian cancer colonization of peritoneal adipose tissues, particularly the omentum. Furthermore, we present a protocol to quantitate and analyze immune cell-structures in the omentum known as milky spots, which promote metastases of peritoneal adipose.

In vivo לשעבר vivo גישות לחקר סרטן השחלות גרורתי התיישבות של מבני ספוט החלב בהצפק שומני

High-grade serous ovarian cancer (HGSC), the cause of widespread peritoneal metastases, continues to have an extremely poor prognosis; fewer than 30% of ...

בהעשרת מבחנה של תאי ייזום-גידול סרטן השחלות

Summary

Explore More Videos

Chapters in this video