우리는 원고의 준비와 자신의 지원과 도움 박사 로저 에릭슨 감사합니다. 이 작품은 국립 보건원의 국립 암 연구소 (National Cancer Institute)에 의해 지원되었다 (허가 번호 RO1CA177984, RO1CA138642), 전립선 암 (BX001604)에 버지니아 프로그램 프로젝트.

포르말린 고정 파라핀 포매 (FFPE) 또는 냉동 전립선 암 샘플 SFVAMC로부터 수득 하였다. 샘플 SFVAMC에서 급진적 인 전립선 절제술을받은 전립선 암 환자에서 있었다. 서면 동의서는 모든 환자에서 얻어진 것으로,이 연구는 인간의 연구에 UCSF위원회에 의해 승인되었다. 또는, 전립선 암 조직 마이크로 어레이는 상업적인 출처의 조달과의 miRNA가 ISH하여 분석에 사용 하였다. 분석 된 전립선 암 환자의 임상 병리학 및 후속 정보를 수집 하였다. 1. 조직 샘플 <ol><li> H &amp; E는 제조 업체의 프로토콜을 다음과 마이크로톰 및 얼룩을 사용하여 10 μm의 섹션으로 전립선 암 조직 샘플을 잘라. </li><li> 전립선 암 병소의 식별을위한 스테인드 슬라이드뿐만 아니라 인접한 정상 선의 상피를 검토합니다. 참고 : 보드 인증 병리학 H &amp; E 염색 슬라이드와 엄마를 검토해야종양 및 정상 영역에 대한 RK. 의 miRNA에 대한 다음 섹션에서 가이드가 정상 영역 대 종양 분석으로 표시된 슬라이드를 사용합니다. </li></ol> 정량 실시간 PCR 2. miRNA의 식 ​​분석 참고 : 레이저 캡처 미세 절제, (의 miRNA와 mRNA를 포함) 총 RNA의 분리, 다음 절에서 설명하는대로의 TaqMan 마이크로 RNA 발현 분석을 사용하여 성숙의 miRNAs의 시금 :이 워크 플로는 다음과 같은 단계를 포함한다. <ol><li> RNA 추출 <ol><li> 전립선 암 FFPE 조직에서의 miRNA의 분리 <ol><li> 레이저 캡처 미세 절제 (LCM) 참고 : 단계를 수행 2.1.1.1.1- 2.1.1.1.4을 화학 물질 흄 후드에서. <ol><li> LCM에 대한 조직 슬라이드 (10 μm의 섹션)을 준비합니다. 10 분마다, (2 배) 크실렌에 침지하여 Deparrafinize 조직 절편 후 증류 하였다 등급 에탄올 (100 %, 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 각각 5 분간 슬라이드를 배양하여 조직을 재수 물(5 분). </li><li> 수분 보충에 이어, 30 초 동안 헤 마톡 실린과 얼룩 섹션은 물 하였다. </li><li> 플레이스 등급 조직 에탄올 (70 %, 95 % 90 %, 80 %, 70 %) (5 분마다), 크실렌 (5 분). </li><li> 다음 드라이 흄 후드 슬라이드 및 미세 절제에 대한 LCM 악기에 배치합니다. </li><li> 제조업체의 지침 (24)에 따라 LCM 시스템과 microdissections을 수행합니다. 사용 병리학 전립선 암 병소의 확인뿐만 아니라, 인접 정상 조직에 대한 가이드로 슬라이드를 표시했다. 70-90의 mW의 전력으로 10 내지 20 μm의 직경 펄스의 레이저 빔을 사용한다. </li><li> LCM 모자 위에 적외선 레이저 펄스와 관심의 캡처 영역. 샘플 당 miRNA의 추출을위한 2-5 캡에서 세포를 결합합니다. 즉시 RNA 추출의 무결성을 보장 miRNA의 추출을위한 세포를 캡쳐 방법에 관한 것이다. </li><li> 대안 적으로, miRNA의 추출 버퍼를 Lyse 세포 (제조사의 프로토콜에 따라)와 STO-80 ºC에서 해물을 다시. </li></ol></li><li> LCM Microdissected 조직에서 miRNA의 추출 및 분석 <ol><li> 제조업체의 지침에 따라 상용 키트를 사용하여 microdissected FFPE 조직에서 전체 RNA를 추출합니다. 참고 : 레이저 캡처 miscrodissection에서 RNA의 수율은 일반적으로 낮다. 따라서, RNA는 낮은 볼륨 (20 ~ 30 μL)로 용출 및 제조업체의 지침에 따라 TAQMAN 마이크로 RNA 발현 분석을 사용하여 발현 프로파일 링 (또한 2.2 절에 설명)에 사용됩니다. 성숙한 miRNAs의 실시간 PCR 검출을위한 입력의 RNA 최적화 용출 RNA의 5 μL 각 miRNA에 특이 적 역전사 반응을위한 최적 인 것을 의미한다. 내인성 대조군으로 RNU48 / RNU24가 사용됩니다. 제어 반응 들어, RNA의 용출 2 μL은 역전사 반응에 사용된다. </li></ol></li></ol></li><li> 전립선 암 냉동 조직에서의 miRNA의 분리 <ol><li> Homoge박격포와 유 봉을 사용하여 액체 질소에 조직을 분쇄하여 냉동 절제 전립선 조직을 nize. 냉각 된 주걱을 사용 microcentrifuge 관에 균질 조직을 전송합니다. 쉽게 전송할 수있는 액체 질소 때문에 균질 조직에 침지하여 동일한 온도에서 박격포 / 유 봉 주걱을 유지한다. </li><li> 균질화 된 조직 상용 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 - 페놀 시약 (1 ㎖ 조직 / 0.1 g)을 첨가하고 5 분 동안 실온에서 배양한다. 주 : 상용 구아니딘 이소 티오 시아 네이트 - 페놀 시약 균질화 조직 수개월 -80 ºC에 저장 될 수있다. </li><li> 균질 (0.2 ml의 클로로포름 / ㎖)에 클로로포름을 추가하고 30 초 동안 격렬하게 흔들어. 4 ºC에서 20 분 동안 10,000 XG에서 원심 분리 3-5 분 동안 실온에서 샘플을 인큐베이션. </li><li> 신선한 멸균 된 RNase가없는 1.5 ML 튜브로 위 수성 위상을 전송합니다. </li><li> 이소 프로필 알코올의 동일한 볼륨을 추가합니다. 믹스 10 마일 부화N 실온에서 RNA 펠렛 4 ºC에서 20 분 동안 12,000 XG에서 원심 분리 하였다. </li><li> 뜨는을 기음과 70 % 에탄올 1 mL로 RNA 펠렛을 씻는다. 4 ºC에서 10 분 동안 12,000 XG에 원심 분리기. </li><li> 조심스럽게 뜨는을 대기음. 5 ~ 10 분 동안 실온에서 건조 RNA 펠렛. 50 ~ 100 μL 뉴 클레아없는 물에서 RNA를 녹인다. </li><li> nanodrop 분광 광도계를 사용하여 RNA의 정량을 수행하고 bioanalyzer로 RNA의 무결성을 결정합니다. 10 NG / μL로 RNA 농도를 조정합니다. PCR 분석을 실시간 (2.2 절) 다음 miRNA- 특정 cDNA의 반응에 10 ~ 50 ng의 RNA를 사용합니다. </li></ol></li></ol></li><li> miRNA의 식 ​​분석을위한 정량 실시간 PCR 후술하는 바와 같이 두 단계 RT-PCR 프로토콜을 사용하여 성숙한 miRNAs의 정량법 : 참고. <ol><li> 역전사 (RT) <ol><li> 역 제조업체의 지침에 따라 miRNA의 역전사 키트를 사용하여 RNA로부터 cDNA를을 쓰다.마이크로 RNA 분석 실험 및 RT 키트에서 miRNA의 특정 프라이머 전체 RNA의 10 ~ 50 NG를 사용합니다. 컨트롤로 RNU48 / RNU24 / RNU6B을 사용합니다. (분석의 miRNA의 풍부에 따라 다름) 1:10 (5) 다음 단계에 설명 된대로 실시간 PCR 검출에 사용 된 cDNA 1을 희석. </li></ol></li><li> 성숙한 miRNA의 탐지를위한 실시간 PCR <ol><li> 제조업체의 지시에 따라 빨리 유니버셜 마스터 믹스 마이크로 RNA 세이를 이용하여 cDNA의 샘플들로부터 PCR 증폭 제품. RNU48 / RNU24 / RNU6B 컨트롤에 샘플을 정상화. 빠른 실시간 PCR 시스템에서 유전자 발현의 상대적인 변화를 계산하는 비교 코네티컷 (임계 사이클) 방법을 사용합니다. 세중의 각 샘플을 분석 할 수 있습니다. </li></ol></li></ol></li></ol> 제자리 교잡에서 3.의 miRNA 발현 분석 (ISH) <ol><li> 조직의 사전 처리 <ol><li> 마이크로톰을 사용 FFPE 전립선 암 조직 블록 5 μm의 단면을 절단. </li><l난&gt; 1 시간 동안 56 ° C에서 슬라이드를 배양하여 조직 절편을 수정합니다. 주 : miRNA의 분석을 위해 슬라이드 몇 주 동안 실온에서 저장 될 수있다. </li><li> 15 분마다, (배) 자일 렌으로 슬라이드를 담가 조직을 Deparrafinize. </li><li> 증류수 (5 분) 하였다 등급 에탄올 (100 % (2 배), 95 %, 90 %, 80 %, 70 %)에서 5 분 동안 각각의 슬라이드를 배양하여 조직을 재수. </li><li> 실온에서 20 분 동안 PBS 중의 4 % 파라 포름 알데하이드 슬라이드를 고정한다. </li><li> 각 5 분 동안 실온에서 PBS (2X)로 슬라이드를 세척한다. </li><li> 예열 테 K 버퍼에 10 분 (5 mM 트리스 - HCL 산도 7.4, 1 mM의 EDTA, 1 mM의 NaCl을) 37 ºC에서 10 μg의 / ㎖ 테 K와 슬라이드를 치료. </li><li> 테-K 처리 후, 30 초 동안 PBS에서 0.2 % 글리신과 슬라이드를 헹군다. </li><li> 5 분 동안 실온에서 PBS (1X)에서 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 15 분 동안 PBS에서 4 % 파라 포름 알데히드와 슬라이드를 수정합니다. </li><li> 와 린스 슬라이드5 분 동안 PBS. </li></ol></li><li> 하이브리드 <ol><li> 가습 실에서 55 ºC에서 3-4 시간 동안 프리 하이브리드 솔루션으로 슬라이드를 사전 하이브리드. 챔버는 가습 유지하기 위해 50 % 포름 아미드 / 50 % 5 배 SSC에 배어 조직 실험실 물티슈를 사용합니다. </li><li> 혼성화 버퍼 20-50 nM의 농도로 5 &#39;제닌 표지 된 프로브를 사용한다. 4 분 90 ºC에서 miRNA의 특정 프로브 (20 ~ 50 ㎚)과 작은 핵 RNA U6 제어 프로브 (20 ㎚), 열을 희석 얼음에 배치, 차가운 하이브리드 버퍼를 얼음 추가 (2-4 NG / μL ). </li><li> 프로브 고유의 하이브리드 온도에서 12 ~ 16 시간 동안 배양, 하이브리드 솔루션 (프로브 + 하이브리드 버퍼, 슬라이드 당 100 μL)를 추가, 사전 하이브리드 솔루션을 제거 (하이브리드 온도 = Tm은 프로브-21 ° C). 가습 실 (50 % 포름 아미드 / 50 % 5 배 SSC)에서 혼성화를 수행합니다. </li></ol></li><li> 세척 단계 <ol><li> 45 ºC에서 10 분 동안 2 배 SSC와 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 워시 T그는 45 ºC에서 10 분 동안 1.5 배의 SSC와 슬라이드. </li><li> 20 분 각 37 ºC에서 0.2 배씩 SSC (2 배)와 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 실온에서 1-2 시간 동안 1X 차단 용액으로 슬라이드 부화 </li></ol></li><li> 검출 <ol><li> 1 슬라이드를 품어 : 100 PBS 1-4 시간 동안 또는 4 박 ºC에서 AP-복합 항 제닌 항체를 희석. </li><li> 10 분 각각 실온에서 PBS (배)와 슬라이드를 씻으십시오. </li><li> 각 5 분 동안 실온에서 알칼리성 포스파타제 완충액 (100 mM 트리스 pH를 9.5의 50 mM의 MgCl 2, 100 mM의 염화나트륨, 0.1 % 트윈 -20)으로 슬라이드 (2 배)를 세척한다. </li><li> 1-20 시간 동안 실온에서 어둠 속에서 BM 보라색 AP 기판에 슬라이드를 품어. </li><li> PBS는 물에 0.1 %를 트윈-20 및 세척 (2 배)를 포함하여 슬라이드를 씻어. </li><li> 수성 설치 미디어를 사용하여 슬라이드를 장착하고 현미경으로 검사합니다. </li></ol></li></ol>

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The authors have no financial disclosures.

이 글에서, 우리는 보관 FFPE 또는 냉동 전립선 암의 임상 조직에서 프로파일 miRNA의 발현에 대한 단순화 된 워크 플로우를 설명합니다. 전립선 암, 몇몇 연구는 전립선 암의 개시, 진행 및 전이에서 마이크로 RNA의 중요한 역할을 시사한다. 그러나, 충돌 결과는 종종 miRNA의 추출 이후 특정 miRNA의 22에 얻은 방법은 크게 다르다 분석된다. 전립선 암의 예후, 진단 및 치료를위한 대안적인 전립?...

전립선 암은 남성의 암 관련 사망의 주요 원인 중 하나이며 흔히 진단 남성 악성 종양이다. 미국의 경우는 220,800 새로운 사례를 추정하고 27,540 명이 사망 2015 년 1에보고됩니다. 전립선 암은 종양이 나태한 또는 매우 공격적이 될 수 코스 - 매우 다양 질환을 가진 이질적인 질환이다. 전립선 암의 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료 (2) 현재 사용되는 방법 / 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 현재 검사 방법은 전립선 특이 항원 (PSA) 테스트 및 전립선 생검 3이어서 직장 수지 검사 (DRE)을 포함한다. 전립선 특이 항원 (PSA)은 크게 개선 된 임상 관리 생존율 4 혁명에서 가장 널리 사용되는 전립선 암의 표지자이다. 그러나, PSA 포함 락의 본질적인 한계로특이도, PSA 기반 검사의 k는 진단을 통해 질병의 치료를 통해하게되었다. 이러한 관점에서 집중적 인 노력은 대체 전립선 암 바이오 마커에 ​​대한 검색 향해 공격성 질병을 예측하고 더 나은 치료 결정 4,5-를 구동 할 수있는 특히 지시되고있다. 지난 몇 년 동안, 마이크로 RNA (miRNA가)는 유망한 대체 전립선 암 바이오 마커로 등장했다. 마이크로 RNA (miRNA가)는 동족 mRNA의 대상의 3&#39;- 번역되지 않은 지역 (UTRs)와 서열 - 특이 적 상호 작용을 통해 후 전사적으로 유전자 발현을 억제하는 작은 비 코딩 RNA를의 진화 적으로 보존 된 클래스를 구성한다. 그것은의 mRNA의 60 %의 miRNAs 6의 목표를 ​​보존하고 있습니다&gt; 것으로 추정된다. miRNA의 유전자는 유전자 간 지역 또는 인트론 또는 유전자 (7)를 코딩하는 단백질 / 비 단백질의 엑손 내에 위치하고 있습니다. 이 유전자는 우선적으로 주역에 RNA 중합 효소 II에 의해 전사된다공예의 miRNAs (PRI-miRNA가 몇 킬로베이스) 그 형태의 머리 핀의 자형 모양의 줄기 루프 차 구조. 이 PRI-의 miRNAs는 세포질에 수출하고 추가로 8-10 (1,825 염기 길이) 성숙의 miRNAs로 처리되는 전구체의 miRNAs (60-75 염기 긴 사전의 miRNAs)로 처리됩니다. miRNA가 증식, 개발, 분화 및 세포 사멸 (11) 등 주요 세포 과정을 조절한다. 연구는 전립선 암 12 ~ 15 등 다양한 인간의 악성 종양에서의 miRNA 발현 프로파일의 광범위한 조절 곤란을 제안한다. miRNA의 발현 프로파일은 널리 기본 및 전이성 전립선 암에서 이상 조절되는 것으로보고되었다. 변경된 miRNA의 발현의 miRNAs 12,14,16-19의 예후 잠재력을 강조 전립선 암의 진행, 공격성과 재발과 연결되어있다. 증거의 성장 몸은 miRNA가 전립선 암 개시, 개발, 진행에 중요한 기계적인 역할을한다는 것을 나타냅니다이온과 전이. 전반적으로, miRNAs의 전립선 암 (12)의 계층화에 정상 및 암 조직과 원조를 구별 할 수 전립선 암 진단 및 예후 등 유망한 대체 바이오 마커를 부상하고있다. 또한, miRNAs의 전립선 암 (20)에 대한 효과적인 치료제의 개발을위한 중요한 표적이다. 내생의 RNase 활성에 작은 크기와 저항으로 인해, miRNAs의 용이 포르말린 고정 된 조직 (21) 및 전립선 생검 (22)에서 검출 될 수 안정한 바이오 마커이다. 더욱이의 miRNAs의 발현 양상은 고정 냉동과 포르말린 조직에 비해 한 강하게 될 21 개의 상관하는 것으로 밝혀졌다. 그러나 임상 적 전립선 암 조직에서의 miRNA 발현 프로파일들은 전립선 암 등 심하게 RELI에게 효과적 생체 등의 miRNAs의 개발 종양 이질성, 샘플링 오류, 간질 오염으로 인해 도전임상 조직에서 자신의 정확한 검출에 말이지. 여기에 우리가 보관 FFPE 또는 냉동 전립선 암 임상 검체에서 프로파일 miRNA의 발현에 대한 우리의 실험실에서 사용되는 단순화 된 워크 플로우를 설명합니다. 우리는 정량적 실시간 PCR의 조합을 채용하고 miRNA에 대한 계내 혼성화에 전 수득 더 정량적 정보와 조직의 어레이의 잠재적 miRNA의 바이오 마커의 발현 차이를 시각화 후자, 임상 검체 분석. 이 워크 플로우 내에서, 우리는 FFPE 및 냉동 전립선 조직에서 miRNA의 추출을위한 기존의 방법을 최적화, 표현은 프로브 (23)를 기반 잠금 핵산 (LNA)를 사용하여 miRNA의 RT-PCR 및 miRNA의 현장 하이브리드 기술에 기반의 TaqMan 프로브에 의해 분석한다. LNA 기반 프로브는 DNA- 또는 RNA- 기초하여 프로브에 비해 증가 된 민감도 및 특이성을 제공하며, 자신의 GC 함량에 관계없이 모두의 miRNA 서열 강력한 검출을 가능하게하고 또한 discrimina 허용miRNA의 가족의 기. 우리의 최적화 된 miRNA ISH 프로토콜 miRNA의 바이오 마커 발견을 촉진시킬 가능성을 제공하고, 후자와, 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다.

<table><tbody><tr><td>Microtome</td><td>Leica Biosystems&amp;nbsp;</td><td>RM2255</td><td></td></tr><tr><td>Arcturus Autopix for LCM</td><td>Arcturus/ Life Technologies</td><td>LCM1621/LCM1110</td><td>Alternatively, Arcutus Xt system from Life Technolgies can be used.&amp;nbsp;</td></tr><tr><td>CapSure Macro LCM Caps</td><td>Life Technologies</td><td>LCM0211</td><td></td></tr><tr><td>miRNeasy FFPE Kit&amp;nbsp;</td><td>Qiagen</td><td>217504</td><td></td></tr><tr><td>7500 Fast Real-time PCR System&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4351106</td><td></td></tr><tr><td>Taqman MicroRNA Reverse Transcription kit&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4366596</td><td></td></tr><tr><td>Taqman Fast Universal PCR master mix&amp;nbsp;</td><td>Applied Biosystems/ Life Technologies</td><td>4352042</td><td></td></tr><tr><td>DIG labeled LNA probe for U6</td><td>Exiqon</td><td>99002-01</td><td></td></tr><tr><td>BM Purple AP substrate</td><td>Roche</td><td>11442074001</td><td></td></tr><tr><td>Pre-hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-1&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Hybridization solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-2&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Blocking solution&amp;nbsp;</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-8&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>AP-conjugated anti-digoxigenin antibody</td><td>Biochain</td><td>&lt;a href=&quot;http://www.biochain.com/coa/K21910XXCA.pdf&quot;&gt;K2191050-7&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Aqueous mounting media&amp;nbsp;</td><td>Vector Laboratories&amp;nbsp;</td><td>H-5501&amp;nbsp;&amp;nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Trizol (guanidine isothiocyanate-phenol reagent)&amp;nbsp;</td><td>Life Technologies</td><td>&lt;a href=&quot;https://www.lifetechnologies.com/order/catalog/product/15596018&quot;&gt;15596-018&lt;/a&gt;</td><td></td></tr><tr><td>Harris hematoxylin</td><td>Statlab</td><td>SL200</td><td></td></tr><tr><td>Eosin&amp;nbsp;</td><td>Statlab</td><td>SL201&amp;nbsp;</td><td></td></tr></tbody></table>

mirna expression analyses in prostate cancer clinical tissues

전립선 암 (PCA) 임상 관리에서 중요한 과제는 질병 검사, 진단, 예후 및 치료를 위해 현재 사용되는 바이오 마커의 무능력에 의해 제기된다. 최근, 마이크로 RNA (miRNA에)은 전립선 암의 진단 및 예후에 대한 유망한 대체로서 생체 등장했다. 그러나, 전립선 암에 대한 효과적인 생체 등의 miRNAs의 개발은 주로 임상 조직에서의 정확한 검출에 의존한다. miRNA는 종종 종양의 이질성, 샘플링 오류, 간질 오염 등의 miRNA가 조합을 사용하여 아카이브 FFPE 또는 냉동 전립선 암 임상 검체의 분석은이 문서의 목적은 단순화 된 워크 플로우를 설명하는 것입니다 때문에 도전 전립선 암 임상 검체에서 분석 정량 실시간 PCR (RT-PCR) 및 현장 하이브리드에서 (ISH). 이 워크 플로우 내에서, 우리는 FFPE에서 miRNA의 추출을위한 기존의 방법과 냉동 전립선 tissu을 최적화ES 및 표현은 m​​iRNA의 RT-PCR 기반의 TaqMan 프로브에 의해 분석한다. 기반 프로브 - 또, ISH위한 최적화 방식이 고정 된 핵산 (LNA)를 이용하여 전립선 조직에서 formiRNA 검출 분석 기술한다. 우리의 miRNA ISH 최적화 프로토콜은 전립선 암 조직 슬라이드 또는 전립선 암 조직 마이크로 어레이 (TMA)에 적용될 수있다.

RT-PCR에 의한 LCM 차 전립선 암 임상 검체 미르-203의 발현 프로파일 분석 (그림 1) RT-PCR은 LCM 차 전립선 암 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 분석 대조군으로 사용 하였다 Saini 외. RNU48 15에 기재된 바와 같이 유사한 인접하는 정상 영역을 행했다. 아래 표는 인접한 정상 조직에 대해 전립선 암 종양 조직에서 상대적은 miR-203의 발현을 요약 한 것이다....

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miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

A critical challenge in prostate cancer (PCa) clinical management is posed by the inadequacy of currently used biomarkers for disease screening, ...

mirna-expression-analyses-in-prostate-cancer-clinical-tissues

Research

JoVE Journal

Medicine

10.8K 조회수.  University of California San Francisco. Here we describe a simplified protocol for microRNA (miRNA) expression analyses in archived Formalin-Fixed, Paraffin-Embedded (FFPE) or fresh frozen prostate cancer (PCa) clinical tissues employing quantitative real-time PCR (RT-PCR) and in situ hybridization (ISH).

비디오: miRNA Expression Analyses in Prostate Cancer Clinical Tissues

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR (qPCR)

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process including development1, apoptosis2, and cell cycle regulation3. MiRNAs are estimated to regulate the expression of 30% to 90% of human genes4 by binding to their target messenger RNAs (mRNAs)5. Widespread dysregulation of miRNAs has been reported in various diseases and cancer subtypes6. Due to their prevalence and unique structure, these small molecules are likely to be the next generation of biomarkers, therapeutic agents and/or targets.
Methods used to investigate miRNA expression include SYBR green I dye- based as well as Taqman-probe based qPCR. If miRNAs are to be effectively used in the clinical setting, it is imperative that their detection in fresh and/or archived clinical samples be accurate, reproducible, and specific. qPCR has been widely used for validating expression of miRNAs in whole genome analyses such as microarray studies7. The samples used in this protocol were from patients who underwent radical prostatectomy for clinically localized prostate cancer; however other tissues and cell lines can be substituted in. Prostate specimens were snap-frozen in liquid nitrogen after resection. Clinical variables and follow-up information for each patient were collected for subsequent analysis8.
Quantification of miRNA levels in prostate tumor samples. The main steps in qPCR analysis of tumors are: Total RNA extraction, cDNA synthesis, and detection of qPCR products using miRNA-specific primers. Total RNA, which includes mRNA, miRNA, and other small RNAs were extracted from specimens using TRIzol reagent. Qiagen's miScript System was used to synthesize cDNA and perform qPCR (Figure 1). Endogenous miRNAs are not polyadenylated, therefore during the reverse transcription process, a poly(A) polymerase polyadenylates the miRNA. The miRNA is used as a template to synthesize cDNA using oligo-dT and Reverse Transcriptase. A universal tag sequence on the 5' end of oligo-dT primers facilitates the amplification of cDNA in the PCR step. PCR product amplification is detected by the level of fluorescence emitted by SYBR Green, a dye which intercalates into double stranded DNA. Specific miRNA primers, along with a Universal Primer that binds to the universal tag sequence will amplify specific miRNA sequences. 
The miScript Primer Assays are available for over a thousand human-specific miRNAs, and hundreds of murine-specific miRNAs. Relative quantification method was used here to quantify the expression of miRNAs. To correct for variability amongst different samples, expression levels of a target miRNA is normalized to the expression levels of a reference gene. The choice of a gene on which to normalize the expression of targets is critical in relative quantification method of analysis. Examples of reference genes typically used in this capacity are the small RNAs RNU6B, RNU44, and RNU48 as they are considered to be stably expressed across most samples. In this protocol, RNU6B is used as the reference gene.

MicroRNA Detection in Prostate Tumors by Quantitative Real-time PCR qPCR

Quantitative Real Time polymerase chain reaction (qPCR) is a rapid and sensitive method to investigate the expression levels of various microRNA (miRNA) molecules in tumor samples. Using this method expression of hundreds of different miRNA molecules can be amplified, quantified, and analyzed from the same cDNA template.

정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

MicroRNAs (miRNAs) are single-stranded, 18&#x2013;24 nucleotide long, non-coding RNA molecules. They are involved in virtually every cellular process ...

연구

의학

Sequencing Small Non-coding RNA from Formalin-fixed Tissues and Serum-derived Exosomes from Castration-resistant Prostate Cancer Patients

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results in cancer regression. However, in a significant number of cases, the disease progresses to advanced, castration-resistant prostate cancer (CRPC), which has limited therapeutic options and is often aggressive. Distant metastasis is mostly observed at this stage of the aggressive disease. CRPC is treated by a second generation of AR pathway inhibitors that improve survival initially, followed by the emergence of therapy resistance. Neuroendocrine prostate cancer (NEPC) is a rare variant of prostate cancer (PCa) that often develops as a result of therapy resistance via a transdifferentiation process known as neuroendocrine differentiation (NED), wherein PCa cells undergo a lineage switch from adenocarcinomas and show increased expression of neuroendocrine (NE) lineage markers. In addition to the genomic alterations that drive the progression and transdifferentiation to NEPC, epigenetic factors and microenvironmental cues are considered essential players in driving disease progression. This manuscript provides a detailed protocol to identify the epigenetic drivers (i.e., small non-coding RNAs) that are associated with advanced PCa. Using purified microRNAs from formalin-fixed paraffin-embedded (FFPE) metastatic tissues and corresponding serum-derived extracellular vesicles (EVs), the protocol describes how to prepare libraries with appropriate quality control for sequencing microRNAs from these sample sources. Isolating RNA from both FFPE and EVs is often challenging because most of it is either degraded or is limited in quantity. This protocol will elaborate on different methods to optimize the RNA inputs and cDNA libraries to yield most specific reads and high-quality data upon sequencing.

Therapy resistance often develops in patients with advanced prostate cancer, and in some cases, cancer progresses to a lethal subtype called neuroendocrine prostate cancer. Assessing the small non-coding RNA-mediated molecular changes that facilitate this transition would allow better disease stratification and identification of causal mechanisms that lead to development of neuroendocrine prostate cancer.

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

Ablation of androgen receptor (AR) signaling by androgen deprivation is the goal of the first line of therapy for prostate cancer that initially results ...

암 연구학

Microarray-based Identification of Individual HERV Loci Expression: Application to Biomarker Discovery in Prostate Cancer

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, particularly in low dosage values1&#8203;&#8203;. &#8216;How to use PSA&#39; remains a current issue, either for diagnosis as a gray zone corresponding to a concentration in serum of 2.5-10 ng/ml which does not allow a clear differentiation to be made between cancer and noncancer2 or for patient follow-up as analysis of post-operative PSA kinetic parameters can pose considerable challenges for their practical application3,4. Alternatively, noncoding RNAs (ncRNAs) are emerging as key molecules in human cancer, with the potential to serve as novel markers of disease, e.g. PCA3 in prostate cancer5,6 and to reveal uncharacterized aspects of tumor biology. Moreover, data from the ENCODE project published in 2012 showed that different RNA types cover about 62% of the genome. It also appears that the amount of transcriptional regulatory motifs is at least 4.5x higher than the one corresponding to protein-coding exons. Thus, long terminal repeats (LTRs) of human endogenous retroviruses (HERVs) constitute a wide range of putative/candidate transcriptional regulatory sequences, as it is their primary function in infectious retroviruses. HERVs, which are spread throughout the human genome, originate from ancestral and independent infections within the germ line, followed by copy-paste propagation processes and leading to multicopy families occupying 8% of the human genome (note that exons span 2% of our genome). Some HERV loci still express proteins that have been associated with several pathologies including cancer7-10. We have designed a high-density microarray, in Affymetrix format, aiming to optimally characterize individual HERV loci expression, in order to better understand whether they can be active, if they drive ncRNA transcription or modulate coding gene expression. This tool has been applied in the prostate cancer field (Figure 1).

Human endogenous retroviruses (HERV), which occupy 8% of the human genome, retain scarce coding capacities but a hundred thousand long terminal repeats (LTRs). A custom Affymetrix microarray was designed to identify individual HERV locus expression and was used on prostate cancer tissues as a proof of concept for future clinical studies.

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

The prostate-specific antigen (PSA) is the main diagnostic biomarker for prostate cancer in clinical use, but it lacks specificity and sensitivity, ...

An Orthotopic Murine Model of Human Prostate Cancer Metastasis

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but rather the formation of distinct metastasis, the ability to effectively model this progression pre-clinically is of high value. In this model, cells are directly implanted into the ventral lobe of the prostate in Balb/c athymic mice, and allowed to progress for 4-6 weeks. At experiment termination, several distinct endpoints can be measured, such as size and molecular characterization of the primary tumor, the presence and quantification of circulating tumor cells in the blood and bone marrow, and formation of metastasis to the lung. In addition to a variety of endpoints, this model provides a picture of a cells ability to invade and escape the primary organ, enter and survive in the circulatory system, and implant and grow in a secondary site. This model has been used effectively to measure metastatic response to both changes in protein expression as well as to response to small molecule therapeutics, in a short turnaround time.

This orthotopic model of human prostate cancer allows for quantification of tumor size, circulating tumor cells, and formation of distinct metastasis to the lung. As cells must escape the primary organ, enter the blood stream, and implant into a secondary site, this model effectively recapitulates the scenario in humans.

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

Our laboratory has developed a novel orthotopic implantation model of  human prostate cancer (PCa). As PCa death is not due to the primary tumor, but  ...

Profiling of Estrogen-regulated MicroRNAs in Breast Cancer Cells

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen receptors (ERs), ER&#945;, and ER&#946;. ER&#945; is frequently upregulated in breast cancer and drives the proliferation of breast cancer cells. The ERs function as transcription factors and regulate gene expression. Whereas ER&#945;&#39;s regulation of protein-coding genes is well established, its regulation of noncoding microRNA (miRNA) is less explored. miRNAs play a major role in the post-transcriptional regulation of genes, inhibiting their translation or degrading their mRNA. miRNAs can function as oncogenes or tumor suppressors&#160;and are also promising biomarkers. Among the miRNA assays available, microarray and quantitative real-time polymerase chain reaction (qPCR) have been extensively used to detect and quantify miRNA levels. To identify miRNAs regulated by estrogen signaling in breast cancer, their expression in ER&#945;-positive breast cancer cell lines were compared before and after estrogen-activation using both the &#181;Paraflo-microfluidic microarrays and Dual Labeled Probes-low density arrays. Results were validated using specific qPCR assays, applying both Cyanine dye-based and Dual Labeled Probes-based chemistry. Furthermore, a time-point assay was used to identify regulations over time. Advantages of the miRNA assay approach used in this study is that it enables a fast screening of mature miRNA regulations in numerous samples, even with limited sample amounts. The layout, including the specific conditions for cell culture and estrogen treatment, biological and technical replicates, and large-scale screening followed by in-depth confirmations using separate techniques, ensures a robust detection of miRNA regulations,&#160;and eliminates false positives and other artifacts. However, mutated or unknown miRNAs, or regulations at the primary and precursor transcript level, will not be detected. The method presented here represents a thorough investigation of estrogen-mediated miRNA regulation.

Molecular signaling through both estrogen and microRNAs are critical in breast cancer development and growth. Estrogen activates the estrogen receptors, which are transcription factors. Many transcription factors can regulate the expression of microRNAs, and estrogen-regulated microRNAs can be profiled using different large-scale techniques.

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

Estrogen plays vital roles in mammary gland development and breast cancer progression. It mediates its function by binding to and activating the estrogen ...

TMEM200A: 위암에서 EMT 및 PI3K/AKT를 조절하는 새로운 종양유전자

Multiomics Analysis of TMEM200A as a Pan-Cancer Biomarker

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in common cancers by multiomics analysis and used in vitro cell cultures of gastric cells to verify the results. The expression of TMEM200A in several human cancer types was assessed using the RNA-seq data from the UCSC Xena database. Bioinformatic analysis revealed a potential role of TMEM200A as a diagnostic and prognostic biomarker. 
Cultures of normal gastric and cancer cell lines were grown and TMEM200A was knocked down. The expression levels of TMEM200A were measured by using quantitative real-time polymerase chain reaction and western blotting. In vitro loss-of-function studies were then used to determine the roles of TMEM200A in the malignant behavior and tumor formation of gastric cancer (GC) cells. Western blots were used to assess the effect of the knockdown on epithelial-mesenchymal transition (EMT) and PI3K/AKT signaling pathway in GC. Bioinformatic analysis showed that TMEM200A was expressed at high levels in GC. 
The proliferation of GC cells was inhibited by TMEM200A knockdown, which also decreased vimentin, N-cadherin, and Snai proteins, and inhibited AKT phosphorylation. The PI3K/AKT signaling pathway also appeared to be involved in TMEM200A-mediated regulation of GC development. The results presented here suggest that TMEM200A regulates the tumor microenvironment by affecting the EMT. TMEM200A may also affect EMT through PI3K/AKT signaling, thus influencing the tumor microenvironment. Therefore, in pan-cancers, especially GC, TMEM200A may be a potential biomarker and oncogene.

저자 스포트라이트: Unveiling Transmembrane Protein Family-Related Markers in Gastric Cancer and Implications for Targeted Therapies (위암에서 막관통 단백질군-관련 마커 발표 및 표적 치료에 대한 시사점) 

Here, a protocol is presented in which multiple bioinformatic tools are combined to study the biological functions of TMEM200A in cancer. In addition, we also experimentally validate the bioinformatics predictions.

범암 바이오마커로서의 TMEM200A 의 멀티오믹스 분석

The transmembrane protein, TMEM200A, is known to be associated with human cancers and immune infiltration. Here, we assessed the function of TMEM200A in ...

Optimization of a Multiplex RNA-based Expression Assay Using Breast Cancer Archival Material

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. Gene amplification and expression diagnostic testing using archival material or material that requires transportation to servicing laboratories, needs a more robust and accurate test adapted to current clinical workflows. Our research team optimized the use of Invitrogen&#8482; QuantiGene&#8482; Plex Assay (Thermo Fisher Scientific) to quantify RNA in archival material using branched-DNA (bDNA) technology on Luminex xMAP&#174; magnetic beads. The gene expression assay described in this manuscript is a novel, quick, and multiplex method that can accurately classify breast cancer into the different molecular subtypes, omitting the subjectivity of interpretation inherent in imaging techniques. In addition, due to the low input of material required, heterogeneous tumors can be laser microdissected using Hematoxylin and Eosin (H&#38;E) stained sections. This method has a wide range of possible applications including tumor classification with diagnostic potential and measurement of biomarkers in liquid biopsies, which would allow better patient management and disease monitoring. In addition, the quantitative measurement of biomarkers in archival material is useful in oncology research with access to libraries of clinically-annotated material, in which retrospective studies can validate potential biomarkers and their clinical outcome correlation.

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic services in pathology laboratories worldwide. This manuscript describes the optimization of a panel of biomarkers using a multiplex magnetic bead assay to classify breast cancers.

유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화

Nucleic acid degradation in archival tissue, tumor heterogeneity, and a lack of fresh frozen tissue specimens can negatively impact cancer diagnostic ...

생체공학

Laser-capture Microdissection of Human Prostatic Epithelium for RNA Analysis

The prostate gland contains a heterogeneous milieu of stromal, epithelial, neuroendocrine and immune cell types. Healthy prostate is comprised of fibromuscular stroma surrounding discrete epithelial-lined secretory lumens and a very small population of immune and neuroendocrine cells. In contrast, areas of prostate cancer have increased dysplastic luminal epithelium with greatly reduced or absent stromal population. Given the profound difference between stromal and epithelial cell types, it is imperative to separate the cell types for any type of downstream molecular analysis. Despite this knowledge, the bulk of gene expression studies compare benign prostate to cancer without micro-dissection, leading to stromal bias in the benign samples. Laser-capture micro-dissection (LCM) is an effective method to physically separate different cell types from a specimen section. The goal of this protocol is to show that RNA can be successfully isolated from LCM-collected human prostatic epithelium and used for downstream gene expression studies such as RT-qPCR and RNAseq.

The goal of this protocol is to use laser-capture micro-dissection as an effective method to isolate pure populations of cell types from heterogeneous prostate tissues for downstream RNA analysis.

전립선 암 임상 조직에서의 miRNA 식 분석

요약

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정량 실시간 PCR (qPCR)에 의한 전립선 종양에 MicroRNA 감지

거세 저항하는 전립선암 환자에게서 포르말린 고정 조직 및 혈청 유래 엑소좀에서 작은 비코딩 RNA를 시퀀싱

전립선 암의 바이오 마커 발견에 신청 : 개인 HERV 궤적 발현 마이크로 어레이 기반의 식별

인간의 전립선 암 전이의 동소 쥐과 모델

유방암 세포에서 에스트로겐 조절 마이크로 RNA의 프로파일

범암 바이오마커로서의 TMEM200A 의 멀티오믹스 분석

범암 바이오마커로서의 TMEM200A 의 멀티오믹스 분석

범암 바이오마커로서의 TMEM200A 의 멀티오믹스 분석

유 방 암 아카이브 자료를 사용 하 여 다중 RNA 기반 식 분석 결과의 최적화

RNA 분석을위한 인간의 전립선 상피 세포의 레이저 캡처 이외에 Microdissection