פרוטוקול זה מספק שיטה חדשה לטכניקה ישנה, והוא יספק גישה חדשה עבור מספר רב של חוקרי מדע בסיסיים. היתרונות העיקריים של טכניקה זו הם הטבע חסכוני שלה, כמו גם הסתגלות שלה כדי לשמש קהל מדעי רחב יותר. כדי להכין צלחת הגירה, השתמש בסמן קבוע בצבע בהיר כדי למתוח קו לאורך מרכז החלק האחורי של כל באר של צלחת 48 באר ולצייר שלושה סימני Hash לחלק כל באר לשלושה תחומי עניין נפרדים.
ואז צלחת 1.5 עד פעמיים 10 למעבר הרביעי fibroblasts לב לתוך כל באר ותרבות התאים בתנאי תרבות נורמלית במשך 24 עד 48 שעות עד שהם מגיעים 90 עד 95% confluency. כאשר התאים מוכנים, להסיר את supernatant מכל באר ולהשתמש קצה פיפטה P200 סטרילי כדי להפוך אחד לעבור שריטה לאורך הקווים המצויר. לשטוף את בארות עם מדיום סרום נמוך כדי להסיר את כל fibroblasts לב מחובר ולהוסיף 500 microliters של בינוני סרום נמוך לכל באר.
אם נעשה שימוש בסוכנים תרופתיים, הוסף את הסוכנים ל בארות המתאימות. לאחר מכן, השתמש במיקרוסקופ הפוך עם מטרה של 20x כדי ללכוד שתי תמונות של אפס שעות ל הבאר באמצעות הסימונים כדי למקם כל באר כדי לאפשר הדמיה של החצי העליון של הקו שרוט. לאחר מכן להזיז את הצלחת כדי למקם את החצי התחתון של הקו שרוט לתוך התצוגה כדי לאסוף את התמונה השנייה ולמקם את הצלחת באינקובטור תרבות התא במשך 24 שעות.
בסוף הדגירה, לשטוף כל באר עם PVS לא סטרילי ולהוסיף 500 microliters של 4% paraformaldehyde לכל באר במכסה המנוע אדים. לאחר 10 דקות בטמפרטורת החדר, לשטוף כל טוב שלוש פעמים PBS טרי במשך חמש דקות לכל לשטוף. לאחר הכביסה האחרונה, לחלחל את התאים עם 300 microliters של פתרון permeabilizing לגם נדנדה עדינה במשך 30 דקות בטמפרטורת החדר.
בסוף הדגירה, החליפו את הפתרון המחלחל בכתם כחול מבריק של 1% קומאסי למשך 10 דקות דגירה עם נדנדה עדינה בטמפרטורת החדר. ואחריו שלוש, חמש דקות שוטף PBS עם נדנדה. לאחר הכביסה האחרונה, להוסיף 300 microliters של PBS לכל באר בזהירות למקם את הצלחת באותו מיקום כמו עבור תמונת שעת האפס לפני לכידת שתי תמונות 24 שעות ביממה לכל גם הפגינו.
בסוף הניסוי, פתח את התמונות ותוכנת ניתוח הדמיה מתאימה וצור שכבה חדשה על תמונת שעת האפס. לחצו פעמיים לשינוי שם שכבת קו השכבה החדשה ובחרו בכלי המברשת. שנה את גודל הפיקסל ל- 10 ואת הצבע לאדום וצייר שני קווים נפרדים כדי לחלק את הטיוטה לרמות.
הקווים אינם יכולים לגעת בתאים כלשהם. פתחו את התמונה 24 שעות ביממה בתוכנת ההדמיה ובחרו בכלי ההזזה. החזקת לחצן הבקרה לחוץ, לחץ הן על הקווים והן על שכבות הרקע, לחץ במרכז תמונת שעת האפס וגרור את שתי השכבות לאמצע התמונה של 24 שעות.
בתדמית של 24 שעות, לחץ על שכבת הרקע של אפס שעות ושנה את האטימות ל- 50%החזקת לחצן הבקרה, לחץ הן על רקע שעת האפס והן על שכבות הקו ולחץ על עריכה ושינוי צורה חופשי כדי לשנות את השכבות באמצעות המרה חופשית, ישר את רקע אפס השעה ותמונות קו לתדמית הרקע של 24 שעות כך שקווי העברת האזור ימקמו כראוי בתדמית של 24 שעות. כששכבת הקו מכוסה בהצלחה, לחצו לחיצה ימנית למחיקת שכבת הרקע של שעת האפס. ניתן להשתמש בשכבת השורה הנותרת כדי לקבוע את מספר התאים שהועברו לאזור האחסון הטיוטה במשך 24 שעות.
לאחר מכן שמרו את תמונת ההעברה החדשה הן כ- Photoshop והן כקובץ TIFF או JPEG. כדי לכמת את מספר התאים הנודדים, פתח את תמונת ההעברה ואת התוכנית המקבלת קבצי TIFF או JPEG וספירה ידנית של מספר התאים הממוקמים בין לבין ונוגע בשני הקווים האדומים עבור שתי התמונות עבור כל באר. לאחר מכן רשום את מספר התאים הנודדים לתמונה.
כדי לקבוע את אזור ההעברה, פתח את התמונה 24 שעות ביממה המכילה את קווי ההעברה בתוכנת ההדמיה ושמור את התמונה כתדמית אזור העברה. לאחר השמירה, לחצו על שכבת הרקע ולחצו לחיצה ימנית למחיקת השכבה. השתמש בכלי המברשת כדי למלא את האזור שבין קווי האחסון, באותו צבע ששימש את הקווים ולחץ על סרגל תמונה, מצב ואפור כדי לשנות את התמונה לשחור-לבן.
שמור את התמונה ופתח את תמונת אזור ההעברה ותוכנית מתאימה לניתוח תמונה. לחץ על ערוך והתהפך. כדי לקבוע את אזור קו ההעברה, לחץ על תמונה, התאם סף.
אזור ההעברה השחורה יהפוך לאדום ואזור האחוזים יצוין בתיבת הסף. לאחר מכן רשום את אזור האחוזים עבור שורת ההעברה ואשר שערך זה משויך למספר התאים הנודדים עבור אותה תמונה. בניתוח זה, 46 פיברובלסטים מלבבות שאינם סוכרתיים ו -129 פיברובלסטים מלבבות סוכרתיים היגרו במהלך תקופת הזמן הניסיונית של 24 שעות.
מדידת אזור ההגירה כפי שהוכח, העלתה כי אזור השריטה הלא סוכרתי היווה 24.78% מכלל השטח שנמדד, בעוד שאזור השריטה של ההגירה הסוכרתית היווה 16.77% מכלל השטח שנמדד. נרמול לתחום ההגירה מספק הערכה טובה וקפדנית יותר של הגירת תאים ושלל טעות אנוש פוטנציאלית. לדוגמה, אם רק מושווים מספר הפיברובלסטים שהועברו, נראה בניתוח זה שמספר התאים שהיגרו באר זו היה כפול מזה של התאים שהועברו באר השנייה.
עם זאת, כאשר נעשה שימוש באזור השריטה כדי לנרמל את הנתונים, היחס בין הפיברובלסטים לאזור הנדידה נצפה כמעט זהה בשתי בארות. הקפד ללכוד מחדש את אזור ההעברה בתמונה של 24 שעות, כפי שלכדת בתדמית של שעת האפס. בעקבות הליך זה, אימונוהיסטוכימיה יכולה להתבצע כדי לבחון ביטוי חלבון בתוך התאים.
אנו מאמינים כי גישה חדשה יותר זו להעברת השריטות תאפשר לפתוח אפיקים נוספים של מחקר מדעי שלא היו זמינים בעבר.
