עבודות זו נתמכה באמצעות מענקים ממדעי הטבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה (RGPIN 238,382-2,011) והמכון קנדי ​​לבריאות מחקר (MOP115076). הת&#39;ר פול נתמכה על ידי מלגות לתארים מתקדמים מדעי טבע והנדסת מועצת המחקר של קנדה ומלגת פתרונות בריאות אלברטה מתפתחת. מייגן האלאם נתמכה על ידי מלגה למדעי טבע והנדסת מחקר מועצה שלאחר התואר הראשון, מלגות פרדריק בנטינג וצ&#39;רלס בסט קנדה בוגר, ובית החולים מכון מחקר הדרכת פרס ילדים אלברטה בגנטיקה, התפתחות ילד, ובריאות.

פרוטוקול זה אושר על ידי האוניברסיטה של ועדת טיפול בבעלי חיים קלגרי ותאם את המדריך לטיפול והשימוש בחי מעבדה. 1. סכר נפרד מצאצאים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפרד את הסכר מצאצאיה למינימום של 5 דקות לפני חליבת 12. הערה: הסכר ניתן חלב עד 5-6 שעות לאחר הפרדת 1,6,13, לעומת זאת תקופות של הפרדה יותר מ -4 שעות עשויות לשנות הרכב חלב 14. בעוד זמן הפרדה אינו מופיע להשפיע חלב אוסף 12 נפח, מומלץ כי זמן הפרדה עקבי יישמר לאורך כל תקופת המחקר. הרכב חלב עשוי להשתנות בכל הנקה 15, לכן ניסיונות צריכים להיעשות כדי לשמור על היום של חלב אוסף עקבי. ייצור חלב מרבי הוא הציע להתרחש ביום ההנקה 14 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בתא התחממות, להבטיח את הגורים הם מסוגלים לשמור על טמפרטורות גוף נכוניםמחדש ללא הנוכחות של האמא שלהם למשך הליך החליבה. הערה: במחקר שיוצג להלן, חליבה בוצעה בגמילה, כאשר הסכרים היו כ 22 שבועות ישנים וישנים 21 ימי הצאצאים, ולכן אין תא התחממות היה בשימוש. </li></ol> 2. הגדרה והכנה <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את כל החומרים הנדרשים להליך החליבה. הערה: ניתן למצוא את כל החומרים בטבלת החומרים וציוד. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הנח כרית חימום על הספסל שבי החליבה תתקיים ולכסות את משטח עם ספסל סופג מתחת לכרית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להגדיר את מערכת ההרדמה. ודא שיש במערכת חמצן וisoflurane לפני תחילת מספיק. צרף את מסכת ההרדמה שתשמש לזירוז הרדמה ראשוני למכונה. מניחים את המסכה שתשמש לתחזוקת הרדמה סמוכה אם שונה ממסכת ההרדמה הראשונית. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> צרף מחט 25 G למזרק 1 מיליליטר לאוקסיטוציןהזרקה באמצעות טכניקת aseptic. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הפעל את כרית החימום כך שטמפרטורת גוף אימהית נשמר במהלך הליך החליבה. הערה: צג הטמפרטורה של כרית החימום על מנת להבטיח את הכרית לא להיות חם מדי ולגרום לכוויות. לחלופין, להשתמש במקור חום, כגון שולחן כירורגית מחומם, שניתן להגדיר טמפרטורה מסוימת. </li></ol> 3. להרדים את Isoflurane שימוש דאם <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> פתח את מיכל החמצן ולהפוך את זרימה לL 1 (1,000 סמ&quot;ק) לדקה. הפעל את זרימת isoflurane ולהגדיר עד 5%. זהירות: הימנע משאיפה ישירה של חומר הרדמה ולמנוע הצטברות של אדי חומר הרדמה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להרדים את הסכר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לעבור למסכת התחזוקה אם נדרש, הצבת הסכר פרקדן על משטח הספסל הסופג. לאשר הרדמה על ידי חוסר רפלקס דוושה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להפחית את זרימת isoflurane ל 2-3% עבור תחזוקה של הרדמה. הרף לפקח סכר לאורך ההליך כדי להבטיח דהpression נשימה אינו מתרחש. הערה: לאחר בהרדמה, יש להגן על העיניים של הסכר באמצעות סיכה עין סטרילי כדי למנוע את העיניים מהתייבשות או להיות שרוט. </li></ol> 4. הזרקת אוקסיטוצין <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> ודא אוקסיטוצין (20 USP יחידות / מיליליטר) לא עברו תאריך התפוגה שלה. לחטא את הבקבוקון של אוקסיטוצין עם אלכוהול סטרילי לנגב / כרית ניקוי אלכוהול. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> באמצעות טכניקה האספטי, לערוך 2 IU (0.1 מיליליטר) של אוקסיטוצין לתוך המזרק. שימוש במחט ומזרק חדש עבור כל סכר שיהיה חלב. הערה: מנות אוקסיטוצין בדרך כלל נעות בין זריקות בודדות של 1 עד 5 IU 1,6,12,16. לחלופין, במינון של 4 IU / קילוגרם משקל גוף יכול לשמש 12. מנה אחת של 2 IU ניתן לחזור פעם אחת אם חליבת קושי הוא נתקלה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הזרק אוקסיטוצין intraperitoneally. הכנס את המחט לתוך רבע הימני התחתון של הבטן עם ההצבעה המחט לכיוון הראש, בזוויתשל 15-30 מעלות, כ -0.5 סנטימטרים עמוקים. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> למשוך בחזרה על הבוכנה על מנת להבטיח לחץ שלילי לפני ההזרקה. אם כל נוזל (דם, שתן, תוכן מעיים, וכו &#39;) הוא להישאף לתוך המזרק, להסיר את המחט ולנסות ההזרקה עם מחט ומזרק חדש. אם אין נוזל להישאף להזריק אוקסיטוצין וזורקים את המחט ומזרק מייד למכל Biohazard. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> המתן כ5-15 דקות לאוקסיטוצין כדי לעורר אכזבת חלב. </li></ol> 5. הכנת חליבת האתרים <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בחר את האתרים / פטמות שממנו חלב ייאסף. חלב יכול להיות שנאסף מכל פטמה 12. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הוצא בעדינות את הפרווה סביב הפטמות לחליבה עם סתגלן, כפרווה עלולה לגרום לקושי באיסוף דגימה בשל הפתילה של חלב. להיות עדין - העור סביב הפטמות הוא מאוד רגיש ויכול להיות יבש ובתור שכזו הוא רגישה לסריטות ודמעות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> עיקור שלי הפטמהזה לא הכרחי, אבל אופציונלי, לנקות את הפטמה עם מים פושרים לאחר הפרווה הוסרה. הכן לפחות שני אתרים כמו אתר אחד או יותר עשוי להידרש לאוסף חלב. הערה: אם ניתוח חלב כולל אפיון חיידקים, אזור הפטמה עשוי לדרוש עיקור עם יוד 5. </li></ol> אוסף 6. חלב <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> יש ללחוץ בעדינות את הבסיס של הפטמה, לגרש את חלב לאוסף באופן ידני. הערה: אם ניתוח חלב כולל אפיון חיידקים, כמה הטיפות הראשונות של חלב צריך להיות מושלכות. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף את טיפות חלב לתוך צינור נימים, מילוי צינור הנימים. צינורות נימים שלהכיל כמויות גדולות יותר (לדוגמא, 50 μl) להקל על התהליך. הערה: אם קושי באיסוף חלב הוא נתקל, מנה שנייה של אוקסיטוצין יכולה להינתן. מומלץ המנה לא תעלה על 4 סך IU. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לוותר חלב מצינור הנימים לתוך צינור microcentrifuge סטרילי על ידילגעת בקצה הצינורית ששימשה לצייר חלב מהפטמה לצד השני של צינור microcentrifuge - לבחון את חלב נמשך אל מחוץ לצינור הנימים באמצעות פעולת נימים. הערה: &quot;לפוצץ את&quot; חלב שאינו נמשך לתוך הצינור באמצעות מחט 18 G מצורפת מזרק 1 מיליליטר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הרף לפקח על הסכר לסימנים של כאב או דיכאון בדרכי הנשימה ולהתאים את זרימת isoflurane בהתאם. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> תמשיך לאסוף חלב כפי שתואר בסעיף זה עד חלב מספיק כבר נאסף לניתוח חלב בחר. לקביעת ריכוז creamatocrit והחלבון שתתואר להלן, לאסוף 0.25 מיליליטר של חלב. הערה: השתמש באתר חליבה שונה אם אכזבת חלב מאטה או האתר שנבחר לא מגרש חלב מספיק. מרבי של כ 2.5 מיליליטר של חלב לכל בעל חיים יכולים להיות שנאסף 17, או עד 0.5 מיליליטר לפטמה. החוקרים ממליצים שזמן כולל תחת הרדמה להיות מוגבל לכ 45-60 דקות, or 45 דקות של חליבה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לאסוף חלב לתוך צינור microhematocrit למדידת creamatocrit מדגימות חלב טריים, ולאטום את קצה הצינורית עם איטום חימר. תווית צינור microhematocrit עם זיהוי הסכר ולאחסן את מדגם חלב זקוף. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> כאשר החליבה הושלמה, לכבות את זרימת isoflurane והחמצן. הסר את המסכה מהסכר ותמשיך לעקוב אחר סכר עד ער. מומלץ שאם לא בהכרה מלאה, הסכר צריך להיות ממוקם על משטח ספסל סופג במהלך תקופת ההתאוששות, ולא ישירות על מצעי הכלוב, כדי למנוע את המצעים מלהיות להישאף או מגרדים את עיניו של הסכר במהלך התאוששות. הערה: אל תשאיר את הסכר ללא השגחה עד שהוא חזר להכרה מספיק כדי לשמור recumbancy sternal. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> אם לא ניתוח נוסף נדרש, להקפיא חלב ב -80 ° C. אחרים טענו כי חלב יכול להיות מאוחסן במשך עד 3 שעות על 4 מעלות צלזיוס או 5 חודשים ב -20 ° C. 18. </li></ol> 7. מדידת Creamatocrit <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> להעריך את תכולת השומן בחלב על ידי חישוב creamatocrit חלב (אחוז הקרם במדגם חלב) 19. הערה: מדידות עם חלב אנושי הוכיחו כי חלב אם טרי או קפוא יכול לשמש למדידת creamatocrit, אולם חלב טרי מתואם גבוה יותר (r = 0.92 לעומת r = 0.90) עם ריכוז שומנים בדם 11. השימוש בחלב טרי או קפוא למדידות creamatocrit צריך להישמר עקבי במחקר, כמו חלב מופשר קשור עם ירידה קטנה בcreamatocrit ערכי 11. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> לחלב טרי, לאסוף דגימה של חלב מהפטמה לתוך צינור microhematocrit; למלא לפחות ¾ (כ 15-20 μl) מלא. לחלופין, לצייר חלב טרי מהמדגם שנאסף לתוך צינור הנימים לאחר הערבוב טוב. חותם את הסוף עם איטום חימר. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מניחים את צינור הנימים לטווית המטוקריט, עםהסוף אטום והצביע לעבר בחוץ, הבטחת צנטריפוגה הוא מאוזן. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> בגין ספין המטוקריט (120 שניות ב13,700 XG). הערה: זמן ספין או מהירות עשוי להשתנות בהתאם לדגם של צנטריפוגות בשימוש. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> הסר את הצינור מצנטריפוגות לאחר הספין הוא להשלים ולבצע את המדידות לחישוב creamatocrit. שים לב ההפרדה של המדגם לקרם שכבה ושכבה ברורה. </li><li style=";text-align:right;direction:rtl"> מדוד ורשום את האורך הכולל של נוזל בצינור והאורך של השומן (השמנת) שכבה באמצעות מחוגה או שליט. הערה: creamatocrit מתבטא באחוז קרם השכבה בתוך מדגם חלב 19, מחושב כ( אורך של קרם שכבה / אורך כולל של עמודת חלב) x 100 (איור 1 א). לחשב ערכי ריכוז ואנרגיה שומן ממדידת creamatocrit כדלקמן: ריכוז שומן (גר &#39;/ ל&#39;) = (creamatocrit (%) - 0.59) /0.146 (איור 1) 19; ערך אנרגיה (KCאל / L) = 290 + (66.8 * creamatocrit (%) (איור 1 ג) 19. </li></ol> קביעת ריכוז חלבון 8. <ol style=";text-align:right;direction:rtl"><li style=";text-align:right;direction:rtl"> שימוש בסרום שור אלבומין כסטנדרט חלבון, לקבוע את ריכוז חלבון חלב כולל באמצעות assay חלבון סטנדרטי, כגון assay חלבון לורי 6. הערה: דילול של חלב עשוי להיות נחוץ למדידות חלבון חלב ליפול בתוך העקומה סטנדרטית של assay. </li></ol>

<ol>
	<li>Izumi, H., Kosaka, N., Shimizu, T., Sekine, K., Ochiya, T., Takase, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Time-dependent+expression+profiles+of+microRNAs+and+mRNAs+in+rat+milk+whey.">Time-dependent expression profiles of microRNAs and mRNAs in rat milk whey.</a> PLoS ONE. 9 (2), e0088843 (2014).</li><li>Hsieh, C. C., Hern&#225;ndez-Ledesma, B., Fern&#225;ndez-Tom&#233;, S., Weinborn, V., Barile, D., de Moura Bell, J. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+Proteins,+Peptides,+and+Oligosaccharides:+Effects+against+the+21st+Century+Disorders.">Milk Proteins, Peptides, and Oligosaccharides: Effects against the 21st Century Disorders.</a> BioMed Res. Int. , (2015).</li><li>Rogier, E. W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Lessons+from+mother:+Long-term+impact+of+antibodies+in+breast+milk+on+the+gut+microbiota+and+intestinal+immune+system+of+breastfed+offspring.">Lessons from mother: Long-term impact of antibodies in breast milk on the gut microbiota and intestinal immune system of breastfed offspring.</a> Gut Microbes. 5 (5), 663-668 (2014).</li><li>Keen, C. L., L&#246;nnerdal, B., Clegg, M., Hurley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Developmental+changes+in+composition+of+rat+milk:+trace+elements,+minerals,+protein,+carbohydrate+and+fat.">Developmental changes in composition of rat milk: trace elements, minerals, protein, carbohydrate and fat.</a> J. of Nutr. 111 (2), 226-236 (1981).</li><li>Cabrera-Rubio, R., Collado, M. C., Laitinen, K., Salminen, S., Isolauri, E., Mira, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+human+milk+microbiome+changes+over+lactation+and+is+shaped+by+maternal+weight+and+mode+of+delivery.">The human milk microbiome changes over lactation and is shaped by maternal weight and mode of delivery.</a> Am. J. Clin. Nutr. 96 (3), 544-551 (2012).</li><li>Hallam, M. C., Barile, D., Meyrand, M., German, J. B., Reimer, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+high-protein+or+high-prebiotic-fiber+diets+affect+maternal+milk+composition+and+gut+microbiota+in+rat+dams+and+their+offspring.">Maternal high-protein or high-prebiotic-fiber diets affect maternal milk composition and gut microbiota in rat dams and their offspring.</a> Obesity. 22 (11), 2344-2351 (2014).</li><li>Munch, E. M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Transcriptome+Profiling+of+microRNA+by+Next-Gen+Deep+Sequencing+Reveals+Known+and+Novel+miRNA+Species+in+the+Lipid+Fraction+of+Human+Breast+Milk.">Transcriptome Profiling of microRNA by Next-Gen Deep Sequencing Reveals Known and Novel miRNA Species in the Lipid Fraction of Human Breast Milk.</a> PLoS ONE. 8 (2), e50564 (2013).</li><li>Li, M., Sloboda, D. M., Vickers, M. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+obesity+and+developmental+programming+of+metabolic+disorders+in+offspring:+Evidence+from+animal+models.">Maternal obesity and developmental programming of metabolic disorders in offspring: Evidence from animal models.</a> Exp Diabetes Res. 2011, (2011).</li><li>Ellis, P. J. I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Thrifty+metabolic+programming+in+rats+is+induced+by+both+maternal+undernutrition+and+postnatal+leptin+treatment,+but+masked+in+the+presence+of+both:+implications+for+models+of+developmental+programming.">Thrifty metabolic programming in rats is induced by both maternal undernutrition and postnatal leptin treatment, but masked in the presence of both: implications for models of developmental programming.</a> BMC Genomics. 15, 49 (2014).</li><li>Gomez-Gallago, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=A+method+to+collect+high+volumes+of+milk+from+mice+(Mus+musculus).">A method to collect high volumes of milk from mice (Mus musculus).</a> An. Vet. Murcia. 29, 55-61 (2013).</li><li>Wang, C. D., Chu, P. S., Mellen, B. G., Shenai, J. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creamatocrit+and+the+nutrient+composition+of+human+milk.">Creamatocrit and the nutrient composition of human milk.</a> J. Perinatol. 19 (5), 343-346 (1999).</li><li>Rodgers, C. T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Practical+aspects+of+milk+collection+in+the+rat.">Practical aspects of milk collection in the rat.</a> Lab. Anim. 29 (4), 450-455 (1995).</li><li>Godbole, V. Y., Grundleger, M. L. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Composition+of+rat+milk+from+day+5+to+20+of+lactation+and+milk+intake+of+lean+and+preobese+zucker+pups.">Composition of rat milk from day 5 to 20 of lactation and milk intake of lean and preobese zucker pups.</a> J. Nutr. 111 (3), 480-487 (1981).</li><li>Del Prado, M., Delgado, G., Villalpando, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Maternal+lipid+intake+during+pregnancy+and+lactation+alters+milk+composition+and+production+and+litter+growth+in+rats.">Maternal lipid intake during pregnancy and lactation alters milk composition and production and litter growth in rats.</a> J. Nutr. 127 (3), 458-462 (1997).</li><li>Nicholas, K. R., Hartmann, P. E. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Milk+secretion+in+the+rat:+progressive+changes+in+milk+composition+during+lactation+and+weaning+and+the+effect+of+diet.">Milk secretion in the rat: progressive changes in milk composition during lactation and weaning and the effect of diet.</a> Comp. Biochem. Physiol. A. Comp. Physiol. 98 (3-4), 533-542 (1991).</li><li>Azara, C. R. P., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Ethanol+intake+during+lactation+alters+milk+nutrient+composition+and+growth+and+mineral+status+of+rat+pups.">Ethanol intake during lactation alters milk nutrient composition and growth and mineral status of rat pups.</a> Biol. Res. 41 (3), 317-330 (2008).</li><li>Keen, C. L., L&#246;nnerdal, B., Sloan, M. V., Hurley, L. S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effects+of+milking+procedure+on+rat+milk+composition.">Effects of milking procedure on rat milk composition.</a> Physiol. Behav. 24 (3), 613-615 (1980).</li><li>Romeu-Nadal, M., Castellote, A. I., L&#242;pez-Sabater, M. C. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Effect+of+cold+storage+on+vitamins+C+and+E+and+fatty+acids+in+human+milk.">Effect of cold storage on vitamins C and E and fatty acids in human milk.</a> Food Chem. 106 (1), 65-70 (2008).</li><li>Lucas, A., Gibbs, J. A., Lyster, R. L., Baum, J. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Creamatocrit:+simple+clinical+technique+for+estimating+fat+concentration+and+energy+value+of+human+milk.">Creamatocrit: simple clinical technique for estimating fat concentration and energy value of human milk.</a> Br. Med. J. 1 (6119), 1018-1020 (1978).</li><li>Furtado, K., Andrade, F. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Comparison+of+the+beneficial+and+adverse+effects+of+inhalable+and+injectable+anaesthetics+in+animal+models:+a+mini-review.">Comparison of the beneficial and adverse effects of inhalable and injectable anaesthetics in animal models: a mini-review.</a> OA Anaesthetics. 1 (2), 20 (2013).</li><li>Hausman Kedem, M., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=The+effect+of+advanced+maternal+age+upon+human+milk+fat+content.">The effect of advanced maternal age upon human milk fat content.</a> Breastfeed. Med. 8 (1), 116-119 (2013).</li><li>Mandel, D., Lubetzky, R., Dollberg, S., Barak, S., Mimouni, F. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/entrez/query.fcgi?db=PubMed&cmd=Search&doptcmdl=Citation&defaultField=Title+Word&term=Fat+and+energy+contents+of+expressed+human+breast+milk+in+prolonged+lactation.">Fat and energy contents of expressed human breast milk in prolonged lactation.</a> Pediatrics. 116 (3), e432-e435 (2005).</li></ol>

יש המחברים אין ניגודי אינטרסים לחשוף. כל הניסויים בבעלי החיים נערכו בהתאם לפרוטוקולי CCAC אושר.

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health3. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling6. The me...

חלב הוא המקור היחיד לתזונה ליונקים יילוד, לספק אנרגיה וחומרים מזינים לצמיחת תינוק ו1,2 פיתוח. בעוד חלב מורכב בעיקר של תאים, שומנים, וחלבונים 1, הוא מכיל גם שפע של תרכובות ביו לווסת פיתוח חייו המוקדם של צאצאים כוללים אנזימים, פחמימות, הורמונים, נוגדנים, גורמי גדילה, ציטוקינים, exosomes, microvesicles, וRNA הקטן כזה כמייקרו-רנ&quot;א 1,2. התפקיד הבסיסי של חלב אימהי בהקמת צאצאים חיסוניים ובריאות מעיים 3, יחד עם ראיות לכך שהנקת תינוקות הם פחות רגישים למחלה 2, מדגיש את החשיבות של זיהוי מרכיבי חלב הקשורים לתהליכי מחלה בתחילת החיים והמנגנונים המולקולריים מעורבים במעשיהם. עכברוש הפיתוח הוא מודל פופולרי לחקירת ההשפעה של תזונה שונות, פיסיולוגי, והתערבויות כימיות בתחילהפיתוח&#39;החיים 4. הניתוח של חלב חולדה לכן עשוי לספק תובנות רומן לבריאות האם וצאצאים. התקדמות מדעית נוכחית כעת לספק הגדלת הזדמנויות לחקירות מעמיקות של ההשפעות של מרכיבי חלב ספציפיים על בריאות ומחלה. לדוגמא, רצף של פרופילי חיידקי החלב הובהר תפקידם בהתישבות במעי המוקדמת של מעי התינוק 5, ניתוח ספקטרומטר מסה של אוליגוסכרידים חלב סיפק תובנה השינוי של פרופילי oligosaccharide חלב באמצעות דיאטה אימהית 6, ורצף עמוק של microRNA מופרש ב כדוריות השומן של חלב מדגישה תפקידים אפשריים בשעתוק הגנים, חילוף חומרים, ואת תפקוד מערכת חיסון 7. מודלים של עכברים מייצגים את אחד אורגניזמים המודל הפופולריים ביותר בשימוש במחקרים אימהיים 8,9. יתרון אחד הוא תקופות קצרות שלהם להריון והנקה, שנמשכות רק approximatאיליי 21 ימים כל אחד; לכן הזמן הכולל מתחילת ההריון להנקה מייצג פרק זמן קצר שבו יכולים להיות שנוצרו נתונים יקרי ערך. הגודל הגדול יותר של חולדות בהשוואה לעכברים, בהקשר של אוסף חלב, עשוי לספק יתרון משמעותי ביחס להיקף של חלב וקלות אוסף חלב; ייצור חלב בעכבר למשל נראה,, להיות תלוי במשקל גוף כולל עם עכברים כבדים לייצר יותר חלב 10. כאן, תיאור כללי לאיסוף הידני של חלב מחולדות מניקות מסופק. פרוטוקול זה דורש ציוד מינימאלי, אינו פולשני, זול, וניתן להשתמש בם כדי לאסוף כמויות מספיקות של חלב לניתוחים נוספים במורד הזרם. בקיצור, הסכר הוא הרדים עם isoflurane, אכזבת חלב היא מגורה על ידי אוקסיטוצין, וחלב נאסף לתוך צינורות נימים באמצעות ביטוי ידני של חלב. לבסוף, כשני מרכיבים עיקריים של חלב הם שומן וחלבונים, descriptio קצרn של הערכת תכולת שומן חלב באמצעות מדידות creamatocrit 11 וכימות של ריכוז חלבון כולל באמצעות assay חלבון סטנדרטי מוצג.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="829">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Equipment - Milking</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">309602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 G needles</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 G needles</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ul Microdispenser Capillary Tubes</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-169D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxytocin (20 USP Units/ml)</td>
			<td style="width:191px;">Bimeda-MTC</td>
			<td style="width:119px;">1OXY015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml</td>
			<td style="width:191px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:119px;">M60302</td>
			<td>Used on the order of a veterinarian</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Alcohol Prep Pad</td>
			<td style="width:191px;">Dukal</td>
			<td style="width:119px;">853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket</td>
			<td style="width:191px;">Cincinnati Sub-Zero</td>
			<td style="width:119px;">274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Benson Medical Industries Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Subject to individual laboratory needs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">Animal Masks</td>
			<td style="width:191px;">Benson Medical Industries Inc.</td>
			<td style="width:119px;">50100/50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:191px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChroMini Professional Trimmer</td>
			<td style="width:191px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Equipment - Creamatocrit</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-274-914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critoseal Capillary Tube Sealant Tray</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">470161-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter, Inc</td>
			<td style="width:119px;">X00-004999-001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

milk collection in the rat using capillary tubes and estimation of milk fat content by creamatocrit

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

חלב נאסף כמתואר בגמילה מסכרי Wistar (כ 22 שבועות, במשקל של 350-400 ז) שצרך שליטה (AIN-93G, n = 5), חלבון גבוה (40% WT קזאין / WT, n = 5) , או סיבי prebiotic גבוהים (21.6% WT / WT, 1: 1 יחס של אוליגופרוקטוז ואינולין, n = 4) דיאטה במהלך הריון והנקה. מינון האוקסיטוצין היה 2 IU. חלב נאסף באמצעות צינורות נימים, וצינור...

Watch this Scientific Journal Video about Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit at JoVE.com

Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

אוסף חלב בעכברוש שימוש נימי צינורות והערכה של שומן חלב תוכן על ידי Creamatocrit

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also ...

milk-collection-rat-using-capillary-tubes-estimation-milk-fat-content

Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Views.  University of Calgary. Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Video: Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit

A Neuronal and Astrocyte Co-Culture Assay for High Content Analysis of Neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing measurement of multiple cellular phenotypes within a single assay. In this study, we utilized HCA to develop a novel assay for neurotoxicity. Neurotoxicity assessment represents an important part of drug safety evaluation, as well as being a significant focus of environmental protection efforts. Additionally, neurotoxicity is also a well-accepted in vitro marker of the development of neurodegenerative diseases such as Alzheimer's and Parkinson's diseases. Recently, the application of HCA to neuronal screening has been reported. By labeling neuronal cells with &beta;III-tubulin, HCA assays can provide high-throughput, non-subjective, quantitative measurements of parameters such as neuronal number, neurite count and neurite length, all of which can indicate neurotoxic effects. However, the role of astrocytes remains unexplored in these models. Astrocytes have an integral role in the maintenance of central nervous system (CNS) homeostasis, and are associated with both neuroprotection and neurodegradation when they are activated in response to toxic substances or disease states. GFAP is an intermediate filament protein expressed predominantly in the astrocytes of the CNS. Astrocytic activation (gliosis) leads to the upregulation of GFAP, commonly accompanied by astrocyte proliferation and hypertrophy. This process of reactive gliosis has been proposed as an early marker of damage to the nervous system. The traditional method for GFAP quantitation is by immunoassay. This approach is limited by an inability to provide information on cellular localization, morphology and cell number. We determined that HCA could be used to overcome these limitations and to simultaneously measure multiple features associated with gliosis - changes in GFAP expression, astrocyte hypertrophy, and astrocyte proliferation - within a single assay. In co-culture studies, astrocytes have been shown to protect neurons against several types of toxic insult and to critically influence neuronal survival. Recent studies have suggested that the use of astrocytes in an in vitro neurotoxicity test system may prove more relevant to human CNS structure and function than neuronal cells alone. Accordingly, we have developed an HCA assay for co-culture of neurons and astrocytes, comprised of protocols and validated, target-specific detection reagents for profiling &beta;III-tubulin and glial fibrillary acidic protein (GFAP). This assay enables simultaneous analysis of neurotoxicity, neurite outgrowth, gliosis, neuronal and astrocytic morphology and neuronal and astrocytic development in a wide variety of cellular models, representing a novel, non-subjective, high-throughput assay for neurotoxicity assessment. The assay holds great potential for enhanced detection of neurotoxicity and improved productivity in neuroscience research and drug discovery.

This article describes a novel protocol and reagent set designed for sensitive measurement of neurotoxic effects of compounds and treatments on co-cultures of neurons and astrocytes using high content analysis. Results demonstrate that high content analysis represents an exciting novel technology for neurotoxicity assessment.

עצב Astrocyte שותף תרבות Assay לניתוח תכולה גבוהה של neurotoxicity

High Content Analysis (HCA) assays combine cells and detection reagents with automated imaging and powerful image analysis algorithms, allowing ...

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

Liver fibrosis is defined by the excessive deposition of extracellular matrix by activated myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic myofibroblasts, including hepatic stellate cells, portal fibroblasts and bone marrow derived fibroblasts 1. Hepatic stellate cells have been the best studied, but portal fibroblasts are increasingly recognized as important contributors to the myofibroblast pool, particularly in biliary fibrosis 2. Portal fibroblasts undergo proliferation in response to biliary epithelial injury, potentially playing a key role in the early stages of biliary scarring 3-5. A method of isolating portal fibroblasts would allow in vitro study of this cell population and lead to greater understanding of the role portal fibroblasts play in biliary fibrosis.
Portal fibroblasts have been isolated using various techniques including outgrowth 6, 7 and liver perfusion with enzymatic digestion followed by size selection 8. The advantage of the digestion and size selection technique compared to the outgrowth technique is that cells can be studied without the necessity of passage in culture. Here, we describe a modified version of the original technique described by Kruglov and Dranoff 8 for isolation of portal fibroblasts from rat liver that results in a relatively pure population of primary cells.

Isolation of Rat Portal Fibroblasts by In situ Liver Perfusion

A technique for isolating portal fibroblasts from rat liver is described. Livers are perfused and digested in situ with collagenase, followed by ex vivo digestion of the liver slurry and size selection of cells. This method provides a pure population of portal fibroblasts without the need for passage in culture.

הבידוד של Fibroblasts פורטל עכברוש ידי<em&gt; באתרו</em&gt; כבד זלוף

Liver fibrosis is defined  by the excessive deposition of extracellular matrix by activated  myofibroblasts. There are multiple precursors of hepatic ...

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich vascularization and high density of mitochondria. BAT plays a major role in energy expenditure and non-shivering thermogenesis in newborn mammals as well as the adults 1. BAT-mediated thermogenesis is highly regulated by the sympathetic nervous system, predominantly via &beta; adrenergic receptor 2, 3. Recent studies have shown that BAT activities in human adults are negatively correlated with body mass index (BMI) and other diabetic parameters 4-6. BAT has thus been proposed as a potential target for anti-obesity/anti-diabetes therapy focusing on modulation of energy balance 6-8. While several cold challenge-based positron emission tomography (PET) methods are established for detecting human BAT 9-13, there is essentially no standardized protocol for imaging and quantification of BAT in small animal models such as mice. Here we describe a robust PET/CT imaging method for functional assessment of BAT in mice. Briefly, adult C57BL/6J mice were cold treated under fasting conditions for a duration of 4 hours before they received one dose of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG). The mice were remained in the cold for one additional hour post FDG injection, and then scanned with a small animal-dedicated micro-PET/CT system. The acquired PET images were co-registered with the CT images for anatomical references and analyzed for FDG uptake in the interscapular BAT area to present BAT activity. This standardized cold-treatment and imaging protocol has been validated through testing BAT activities during pharmacological interventions, for example, the suppressed BAT activation by the treatment of &beta;-adrenoceptor antagonist propranolol 14, 15, or the enhanced BAT activation by &beta;3 agonist BRL37344 16. The method described here can be applied to screen for drugs/compounds that modulate BAT activity, or to identify genes/pathways that are involved in BAT development and regulation in various preclinical and basic studies.

Functional Imaging of Brown Fat in Mice with 18F-FDG micro-PET/CT

A method of functional imaging of mouse brown adipose tissue (BAT) is described in which cold-stimulated uptake of 18F-Fluorodeoxyglucose (FDG) in BAT is non-invasively assessed with a standardized micro-PET/CT protocol. This method is robust and sensitive to detect differences in BAT activities in mouse models.

הדמיה תפקודית של שומן חום בעכברים עם FDG micro-PET/CT

Brown adipose tissue (BAT) differs from white adipose  tissue (WAT) by its discrete location and a brown-red color due to rich  vascularization and high ...

Milk Collection Methods for Mice and Reeves' Muntjac Deer

Animal models are commonly used throughout research laboratories to accomplish what would normally be considered impractical in a pathogen&#8217;s native host. Milk collection from animals allows scientists the opportunity to study many aspects of reproduction including vertical transmission, passive immunity, mammary gland biology, and lactation. Obtaining adequate volumes of milk for these studies is a challenging task, especially from small animal models. Here we illustrate an inexpensive and facile method for milk collection in mice and Reeves&#8217; muntjac deer that does not require specialized equipment or extensive training. This particular method requires two researchers: one to express the milk and to stabilize the animal, and one to collect the milk in an appropriate container from either a Muntjac or mouse model. The mouse model also requires the use of a P-200 pipetman and corresponding pipette tips. While this method is low cost and relatively easy to perform, researchers should be advised that anesthetizing the animal is required for optimal milk collection.

Milk Collection Methods for Mice and Reeves&#039; Muntjac Deer

Milk collection from animal models facilitates various research avenues: understanding passive immunity, identifying pathogens responsible for vertical transmission and, through the use of transgenic mice, even commercial production of proteins found in human breast milk. Here we illustrate a simple method for milk collection in mice and Reeves&#8217; muntjac deer.

שיטות איסוף חלב לעכברים וריבס &#39;Muntjac צביים

Animal models are commonly used throughout research laboratories to accomplish what would normally be considered impractical in a pathogen&#8217;s native ...

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It contains sugars, amino acids, proteins, RNA, lipids and other metabolites. While there is a large interest in understanding the composition and function of the phloem, the role of many of these molecules and thus, their importance in plant development and stress response has yet to be determined. One barrier to phloem analysis lies in the fact that the phloem seals itself upon wounding. As a result, the number of plants from which phloem sap can be obtained is limited. One method that allows collection of phloem exudates from several plant species without added equipment is the EDTA-facilitated phloem exudate collection described here. While it is easy to use, it does lead to the wounding of cells and care has to be taken to remove contents of damaged cells. In addition, several controls to prove purity of the exudate are necessary. Because it is an exudation rather than a direct collection of the phloem sap (not possible in many species) only relative quantification of its contents can occur. The advantage of this method over others is that it can be used in many herbaceous or woody plant species (Perilla, Arabidopsis, poplar, etc.) and requires minimal equipment and training. It leads to reasonably large amounts of exudates that can be used for subsequent analysis of proteins, sugars, lipids, RNA, viruses and metabolites. It is simple enough that it can be used in both a research as well as in a teaching laboratory.

Collection and Analysis of Arabidopsis Phloem Exudates Using the EDTA-facilitated Method

Knowledge of the composition of the phloem sap as well as the mechanism of its loading and long-distance transport is essential for the understanding of long-distance signaling in plant development and stress/pathogen response and of assimilate transport. This manuscript describes the collection of phloem exudates using the EDTA-facilitated method.

איסוף וניתוח של<em&gt; ארבידופסיס</em&gt; השיפה exudates שימוש בשיטת EDTA-הקלה

The plant phloem is essential for the long-distance transport of (photo-) assimilates as well as of signals conveying biotic or abiotic stress. It ...

Cellular Redox Profiling Using High-content Microscopy

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, excessive ROS levels induce a state of oxidative stress, which is accompanied by irreversible oxidative damage to DNA, lipids and proteins. Thus, quantification of ROS provides a direct proxy for cellular health condition. Since mitochondria are among the major cellular sources and targets of ROS, joint analysis of mitochondrial function and ROS production in the same cells is crucial for better understanding the interconnection in pathophysiological conditions. Therefore, a high-content microscopy-based strategy was developed for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, mitochondrial membrane potential (&#916;&#936;m) and mitochondrial morphology. It is based on automated widefield fluorescence microscopy and image analysis of living adherent cells, grown in multi-well plates, and stained with the cell-permeable fluorescent reporter molecules CM-H2DCFDA (ROS) and TMRM (&#916;&#936;m and mitochondrial morphology). In contrast with fluorimetry or flow-cytometry, this strategy allows quantification of subcellular parameters at the level of the individual cell with high spatiotemporal resolution, both before and after experimental stimulation. Importantly, the image-based nature of the method allows extracting morphological parameters in addition to signal intensities. The combined feature set is used for explorative and statistical multivariate data analysis to detect differences between subpopulations, cell types and/or treatments. Here, a detailed description of the assay is provided, along with an example experiment that proves its potential for unambiguous discrimination between cellular states after chemical perturbation.

This paper presents a high-content microscopy workflow for simultaneous quantification of intracellular ROS levels, as well as mitochondrial membrane potential and morphology &#8211; jointly referred to as mitochondrial morphofunction &#8211; in living adherent cells using the cell-permeant fluorescent reporter molecules 5-(and-6)-chloromethyl-2&#39;,7&#39;-dichlorodihydrofluorescein diacetate, acetyl ester (CM-H2DCFDA) and tetramethylrhodamine methylester (TMRM).

התאוששות נייד באמצעות פרופילים תוכן גבוהה מיקרוסקופית

Reactive oxygen species (ROS) regulate essential cellular processes including gene expression, migration, differentiation and proliferation. However, ...

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in mammals. However, humans cannot oxidize cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid to cytidine monophosphate-N-glycolylneuraminic acid due to a primary exon deletion of the CMAH gene. To understand the effects and implications of the lack of CMAH activity in more detail, a Cmah knock-out model in mice is of keen interest in basic and applied research. The analysis method to determine the phenotype of this mouse model is herein described in detail, and is based on the detection of both N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in the liver and milk of wild-type and Cmah knock-out mice. Endogenous sialic acids are released and derivatized with o-phenylenediamine to generate fluorogenic derivatives, which can be subsequently analyzed by HPLC. The presented protocol can be also applied for the analysis of milk and tissue samples from various other origins, and may be of use to investigate the nutritional and health effects of N-glycolylneuraminic acid.

Determination of Sialic Acids in Liver and Milk Samples of Wild-type and CMAH Knock-out Mice.

We describe a HPLC-based method for the determination of N-acetylneuraminic acid and N-glycolylenuraminic acid in mouse liver and milk.

קביעת חומצות סיאליות בדגימות כבד וחלב של סוג הבר<em&gt; CMAH</em&gt; נוק- out עכברים.

CMAH (cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acid hydroxylase) is responsible for the oxidation of cytidine monophosphate-N-acetylneuraminic acids in ...

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. The malfunction of autophagy is associated with aging and multiple human diseases. The autophagy machinery is highly conserved-from yeast to humans.&#160;The larval fat body of Drosophila melanogaster, an analog for vertebrate liver and adipose tissue, provides a unique model for monitoring autophagy in vivo. Autophagy can be easily induced by nutrient starvation in the larval fat body. Most autophagy-related genes are conserved in Drosophila. Many transgenic fly strains expressing tagged autophagy markers have been developed, which facilitates the monitoring of different steps in the autophagy process. The clonal analysis enables a close comparison of autophagy markers in cells with different genotypes in the same piece of tissue. The current protocol details procedures for (1) generating somatic clones in the larval fat body, (2) inducing autophagy via amino acid starvation, and (3) dissecting the larval fat body, aiming to create a model for analyzing differences in autophagy using an autophagosome marker (GFP-Atg8a) and clonal analysis.

Analyzing Starvation-Induced Autophagy in the Drosophila melanogaster Larval Fat Body

The present protocol describes the induction of autophagy in the Drosophila melanogaster larval fat body via nutrient depletion and analyzes changes in autophagy using transgenic fly strains.

ניתוח אוטופגיה הנגרמת על ידי רעב בגוף השומן של הזחל Drosophila melanogaster

Autophagy is a cellular self-digestion process. It delivers cargo to the lysosomes for degradation in response to various stresses, including starvation. ...

כימות חדירת שומן בשרירי השלד באמצעות דה-צלולריזציה

Decellularization-Based Quantification of Skeletal Muscle Fatty Infiltration

Fatty infiltration is the accumulation of adipocytes between myofibers in skeletal muscle and is a prominent feature of many myopathies, metabolic disorders, and dystrophies. Clinically in human populations, fatty infiltration is assessed using noninvasive methods, including computed tomography (CT), magnetic resonance imaging (MRI), and ultrasound (US). Although some studies have used CT or MRI to quantify fatty infiltration in mouse muscle, costs and insufficient spatial resolution remain challenging. Other small animal methods utilize histology to visualize individual adipocytes; however, this methodology suffers from sampling bias in heterogeneous pathology. This protocol describes the methodology to qualitatively view and quantitatively measure fatty infiltration comprehensively throughout intact mouse muscle and at the level of individual adipocytes using decellularization. The protocol is not limited to specific muscles or specific species and can be extended to human biopsy. Additionally, gross qualitative and quantitative assessments can be made with standard laboratory equipment for little cost, making this procedure more accessible across research laboratories.

מחבר זרקור: כימות מבוסס דה-צלולריזציה של חדירת שומן בשרירי השלד  

The present study describes decellularization-based methodologies for visualizing and quantifying intramuscular adipose tissue (IMAT) deposition through intact muscle volume, as well as quantifying metrics of individual adipocytes that comprise IMAT.