Dies funktioniert, wurde durch Zuschüsse aus den Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada (RGPIN 238.382-2011) und Canadian Institutes of Health Research (MOP115076) unterstützt. Heather Paul wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council of Canada Postgraduierten-Stipendium und einem Alberta Innovates Health Solutions Stipendium unterstützt. Megan Hallam wurde von einem Natur- und Ingenieurwissenschaften Research Council Postgraduate Stipendium, ein Frederick Banting und Charles Best Kanada Graduate Scholarship und ein Kinderkrankenhaus Alberta Research Institute Trainingspreis in Genetics, Child Development und Health.

Dieses Protokoll wurde von der University of Calgary Animal Care Committee genehmigt und angepasst an den Leitfaden für die Pflege und Verwendung von Labortieren. 1. Separate Dam von Offspring <ol><li> Trennen Sie die Staumauer aus ihren Nachwuchs für mindestens 5 Minuten vor dem Melken 12. HINWEIS: Der Damm kann bis zu 5-6 Stunden nach der Trennung 1,6,13 gemolken werden jedoch Zeiten der Trennung länger als 4 Stunden kann die Zusammensetzung der Milch 14 zu ändern. Während Trennzeit scheint nicht zu beeinflussen Milchsammelvolumen 12, ist es ratsam, dass eine konsequente Trennung der Zeit während der Studie beibehalten werden. Milchzusammensetzung kann während der Stillzeit 15 zu ändern, daher sollte versucht werden, den Tag des Milchsammel konsistent zu halten ist. Maximale Milchproduktion wird vorgeschlagen, auf Still Tag 14 12 erfolgen. </li><li> Unter Verwendung einer Wärmekammer, sicherzustellen, dass die Welpen sind in der Lage, die richtige Körper temperatu pflegenre ohne die Anwesenheit der Mutter für die Dauer des Melkvorganges. HINWEIS: In der Studie wie folgt dar, Melken wurde bei der Entwöhnung, wenn die Dämme waren etwa 22 Wochen alt, und die Nachkommen 21 Tage alt durchgeführt, daher keine Wärmekammer verwendet wurde. </li></ol> 2. Aufbau und Vorbereitung <ol><li> Sammeln Sie alle für den Melkvorgang benötigten Materialien. HINWEIS: Alle Materialien können in den Materialien und Geräte Tabelle. </li><li> Legen Sie ein Heizkissen auf der Bank, wo Melken stattfinden wird und decken Sie das Pad mit einem saugfähigen Bank unter-Pad. </li><li> Einrichten des Narkosesystem. Sicherzustellen, dass das System über ausreichend Sauerstoff und Isofluran vor Beginn. Befestigen Sie den Narkosemaske, die für die erste Narkose an der Maschine verwendet werden. Legen Sie die Maske, die für die Anästhesie Wartung der Nähe, wenn anders als die ersten Narkosemaske verwendet wird. </li><li> Befestigen Sie eine 25 G Nadel in eine 1 ml Spritze für OxytocinInjektion unter aseptischen Bedingungen. </li><li> Einschalten des Heizkissen sodass mütterlichen Körpertemperatur während des Melkvorgangs erhalten bleibt. HINWEIS: Überwachen Sie die Temperatur des Heizungsauflage, um das Kissen zu gewährleisten nicht zu heiß werden und Verbrennungen verursachen. Alternativ können Sie auch eine Wärmequelle, wie einen beheizten Operationstisch, die auf eine bestimmte Temperatur eingestellt werden kann. </li></ol> 3. Anesthetize den Dam Mit Isofluran <ol><li> Öffnen Sie den Sauerstofftank und schalten den Strom auf 1 l (1.000 cc) pro min. Schalten Sie den Fluss von Isofluran und auf 5% eingestellt. ACHTUNG: Vermeiden Sie direkte Inhalation von Narkosemittel und verhindern, dass Anhäufung von Narkosedämpfen. </li><li> Betäuben den Damm. </li><li> Schalten Sie um auf die Wartungsmaske, falls erforderlich, indem die Staumauer in Rückenlage auf dem absorbierenden Pad Bank. Anesthetization Bestätigen fehlende Pedalreflex. </li><li> Reduzieren Sie den Fluss von Isofluran auf 2-3% für Aufrechterhaltung von Narkosen. Damm während des gesamten Verfahrens kontinuierlich zu überwachen, um sicherzustellen, depression der Atmung nicht auftritt. HINWEIS: Nachdem unter Anästhesie, sollte die Augen des Damms mit einem sterilen Augen Schmiermittel, um die Augen vor dem Austrocknen oder zu verkratzen geschützt werden. </li></ol> 4. Oxytocin Injection <ol><li> Stellen Sie sicher, das Oxytocin (20 USP-Einheiten / ml) hat seine Ablaufdatum überschritten. Desinfizieren Sie die Fläschchen von Oxytocin mit einem sterilen Alkoholtupfer / Alkohol Reinigung Pad. </li><li> Unter aseptischen Bedingungen aufzustellen 2 IE (0,1 ml) von Oxytocin in die Spritze. Verwenden Sie eine neue Nadel und Spritze für jeden Damm, die gemolken wird. HINWEIS: Oxytocin Dosen reichen im Allgemeinen von Einzelinjektionen von 1 bis 5 IU 1,6,12,16. Alternativ kann eine Dosis von 4 IU / kg Körpergewicht verwendet werden 12. Eine Einzeldosis von 2 IU kann einmal wiederholt werden, wenn Schwierigkeiten Melken angetroffen wird. </li><li> Spritzen Sie die Oxytocin intraperitoneal. Führen Sie die Nadel in den unteren rechten Quadranten des Bauches mit der Nadel zeigt in Richtung des Kopfes, in einem Winkelvon 15-30 °, etwa 0,5 cm tief. </li><li> Ziehen Sie am Kolben, um Unterdruck vor der Injektion zu gewährleisten. Wenn eine Flüssigkeit (Blut, Urin, Darminhalt, etc.) in die Spritze angesaugt, entfernen Sie die Nadel und versuchen, die Injektion mit einer neuen Nadel und Spritze. Wenn keine Flüssigkeit angesaugt injizieren die Oxytocin und entsorgen Sie die Nadel und Spritze sofort in einen Behälter für biologischen. </li><li> Warten Sie ca. 5-15 min für die Oxytocin, Milch zu Enttäuschung zu stimulieren. </li></ol> 5. Herstellung von Milking Seiten <ol><li> Wählen Sie die Websites / Zitzen, von denen Milch werden nicht erhoben. Milch kann aus jeder Zitze 12 gesammelt werden. </li><li> Entfernen Sie vorsichtig das Fell um die Zitzen mit den Trimmern gemolken werden, so Fell kann Schwierigkeiten bei der Probenentnahme führen durch Dochtwirkung der Milch. Seien Sie sanft - die Haut um die Zitzen ist extrem empfindlich und kann trocken sein und als solche ist anfällig für Kratzer und Risse. </li><li> Sterilisation des Zitzen iist nicht notwendig, aber optional, reinigen Sie die Zitze mit lauwarmem Wasser, nachdem das Fell entfernt. Bereiten Sie mindestens zwei Gebiete als mehr als einem Standort kann für Milchsammel erforderlich. HINWEIS: Wenn die Milch Analyse umfasst mikrobielle Profilierung kann der Zitzenbereich Sterilisation mit Jod 5 erforderlich. </li></ol> 6. Milchauffang <ol><li> Drücken Sie leicht den Boden der Zitze, manuell Austreiben der Milch für die Sammlung. HINWEIS: Wenn die Milch Analyse umfasst mikrobielle Profilierung, sollten die ersten paar Tropfen Milch verworfen werden. </li><li> Sammeln der Milchtröpfchen in ein Kapillarröhrchen, Füllen der Kapillare. Kapillaren, die größere Mengen (zB 50 ul) erleichtern den Prozess anzupassen. HINWEIS: Wenn Schwierigkeiten, eine Milch festgestellt wird, kann eine zweite Dosis von Oxytocin verabreicht werden. Es wird empfohlen, die Dosis 4 IU insgesamt nicht überschreiten. </li><li> Abgeben der Milch aus der Kapillare in ein steriles Mikrozentrifugenröhrchen durchBerühren des Endes des Rohres, das verwendet wurde, um die Milch aus der Zitze an die Seite des Mikrozentrifugenröhrchens zu ziehen - zu beobachten, die die Milch durch Kapillarwirkung aus dem Kapillarrohr gezogen. HINWEIS: &quot;ausblasen&quot; die Milch, die nicht in das Rohr unter Verwendung einer 18 G-Nadel in eine 1 ml Spritze befestigt gezogen wird. </li><li> Der Damm auf Anzeichen von Schmerzen oder Atemdepression kontinuierlich zu überwachen und die Strömung von Isofluran entsprechend anzupassen. </li><li> Weiterhin Milch zu sammeln, wie in diesem Abschnitt beschrieben, bis genügend Milch für die gewählte Milchanalyse gesammelt. Für das unten beschriebene creamatocrit und Proteinkonzentrationsbestimmung, sammeln 0,25 ml Milch. HINWEIS: Verwenden Sie einen anderen Melkplatz, wenn Milch letdown verlangsamt oder die gewählte Website nicht ausreichend Milch zu vertreiben. Ein Maximum von ungefähr 2,5 ml Milch pro Tier gesammelt werden 17 oder bis zu 0,5 ml pro Zitze. Die Autoren empfehlen, Gesamtzeit unter Narkose auf ca. 45-60 min begrenzt werden, or 45 min nach dem Melken. </li><li> Sammlung der Milch in einen Mikrohämatokritröhrchen für creamatocrit Messung von Frischmilchproben und abzudichten das Ende des Rohres mit Ton Versiegelung. Beschriften Sie die Mikrohämatokritröhrchen mit dem Damm-ID und die Milchprobe aufrecht zu speichern. </li><li> Beim Melken beendet ist, schalten Sie den Strom von Isofluran und Sauerstoff. Entfernen Sie die Maske von der Staumauer und weiter zu Staumauer bis wach zu überwachen. Es wird empfohlen, wenn nicht bei vollem Bewusstsein, der Damm sollte auf einem absorbierenden Pad Bank während der Erholungsphase gelegt werden, anstatt direkt auf dem Käfig Bettwäsche, die Bettwäsche aus angesaugt oder in die Augen der Mutter Verkratzen während der Wiederherstellung zu verhindern. HINWEIS: Die Staumauer nicht unbeaufsichtigt lassen, bis es ausreichend, das Bewusstsein wiedererlangt, um Brustbeinfestliegen zu halten. </li><li> Wenn keine weitere Analysen erforderlich sind, frieren Milch bei -80 ° C. Andere haben vorgeschlagen, dass die Milch kann für bis zu 3 Stunden bei 4 ° C oder 5 Monate bei -20 ° C 18 gespeichert werden. </li></ol> 7. Creamatocrit Mess <ol><li> Schätzung der Fettgehalt in der Milch, die durch Berechnen der Milch creamatocrit (der Prozentsatz der Creme in der Milchprobe) 19. Hinweis: Messungen mit der Muttermilch haben gezeigt, dass entweder frische oder gefrorene Milch kann für eine creamatocrit Messung verwendet werden, jedoch frischer Milch ist mehr hoch korreliert (r = 0,92 im Vergleich zu r = 0,90) mit Lipidkonzentration 11. Die Verwendung von frischen oder gefrorenen Milch für creamatocrit Messungen sollten in der Studie konsistent gehalten werden, wie es aufgetaut Milch wird mit einem kleinen Rückgang der creamatocrit zugehörigen Werte 11. </li><li> Für Frischmilch, sammeln eine Probe der Milch aus der Zitze in eine Mikrohämatokritröhrchen; füllen Sie mindestens ¾ voll (ca. 15-20 ul). Alternativ ziehen frische Milch von der gesammelten Probe in die Kapillare nach dem Mischen gut. Dichten Sie das Ende mit Lehm Dichtstoff. </li><li> Legen Sie die Kapillare in die Hämatokrit-Spinner, mit derEndverschluß nach außen gerichteten, wodurch die Zentrifuge ausgeglichen ist. </li><li> Beginnen Sie den Hämatokrit Spin (120 sec bei 13.700 xg). HINWEIS: Spin Zeit oder Geschwindigkeit kann je nach dem Modell der Zentrifuge verwendet, ändern. </li><li> Nehmen Sie die Röhre aus der Zentrifuge nach dem Spin abgeschlossen ist, und führen Sie die Messungen für die Berechnung der creamatocrit. Trennung der Probe zu beobachten in eine Creme-Schicht und einer klaren Schicht. </li><li> Messen und aufzeichnen, die Gesamtlänge des Fluids in dem Rohr und der Länge der Fett (Creme) -Schicht mit Bremssätteln oder ein Lineal. HINWEIS: Die creamatocrit ist als der Prozentsatz der Cremeschicht innerhalb der Milchprobe 19, berechnet als (Länge der Creme-Schicht / Gesamtlänge von Milchsäule) x 100 (1A). Berechnen Fettkonzentration und Energiewerte aus dem creamatocrit Messung wie folgt: Fat-Konzentration (g / l) = (creamatocrit (%) - 0,59) /0.146 (1B) 19; Energiewert (kcAl / L) = 290 + (66,8 * creamatocrit (%) (1C) 19. </li></ol> 8. Proteinkonzentationsbestimmung <ol><li> Verwendung von Rinderserumalbumin als Proteinstandard zur Bestimmung des Gesamt- Milchproteinkonzentration unter Verwendung eines Standard-Protein-Assay, wie eine Proteinbestimmung nach Lowry 6. HINWEIS: Die Verdünnung der Milch kann notwendig sein, für die Milchproteinmessungen innerhalb der Standardkurve des Assays fallen. </li></ol>

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Die Autoren haben keine Interessenkonflikte offen zu legen. Alle Tierversuche wurden gemäß CCAC genehmigten Protokollen durchgeführt.

Investigations into maternal milk components have increased as interest in early life development research rises. As the sole source of nutrition during the neonatal period, the bioactive compounds in milk are essential for ideal growth and development, especially in the context of intestinal and immune health3. The method presented here is a simple, non-invasive method of collecting milk from the lactating rat in amounts sufficient for downstream analysis, such as oligosaccharide profiling6. The me...

Milch ist die einzige Nahrungsquelle für neugeborene Säugetiere, die Bereitstellung von Energie und Nährstoffe für das Kinderwachstum und Entwicklung 1,2. Während Milch besteht hauptsächlich aus Zellen, Lipide und Protein-1, es enthält auch eine Vielzahl von bioaktiven Verbindungen, die frühen Lebens Entwicklung der Nachkommenschaft einschließlich Enzyme, Kohlenhydrate, Hormone, Antikörper, Wachstumsfaktoren, Cytokine, Exosomen, Mikrovesikel und kleinen RNAs wie zu modulieren wie microRNA 1,2. Die grundlegende Rolle der Muttermilch in der Gründung der Nachkommen Immun- und Darmgesundheit 3, verbunden mit dem Nachweis, dass gestillte Kinder sind weniger anfällig für Krankheiten 2, unterstreicht die Bedeutung der Identifizierung der Milchbestandteilen mit Krankheitsprozesse in der frühen Leben verbunden und die molekularen Mechanismen beteiligt in ihren Handlungen. Die Entwicklungs Ratte ist ein beliebtes Modell für die Untersuchung der Wirkung von verschiedenen Ernährungs, physiologischen und chemischen Eingriffen an frühen-life Entwicklung 4. Die Analyse von Rattenmilch kann daher bieten neue Einblicke in mütterlichen und Nachkommen Gesundheit. Aktuelle wissenschaftliche Fortschritte bieten jetzt die Verbesserung der Chancen für eine eingehende Untersuchung der Auswirkungen von bestimmten Milchbestandteilen auf Gesundheit und Krankheit. Beispielsweise wurde die Sequenzierung von Milchbakterienprofile ihre Rolle in der frühen Darmbesiedlung des Säuglings gut 5 erläutert, Massenspektrometrieanalyse Milch-Oligosaccharide haben Einblick in die Veränderung der Milch Oligosaccharid-Profile über die Ernährung der Mutter 6 und tiefe Sequenzierung MikroRNA in sezerniert bereitgestellt die Fettkügelchen der Muttermilch unterstreicht möglichen Rollen in Gen-Transkription, den Stoffwechsel und die Immunfunktion 7. Rattenmodelle stellen eine der im mütterlichen Studien 8,9 verwendet beliebtesten Modellorganismen. Ein Vorteil ist die kurze Schwangerschaft und Stillzeiten von nur approximately 21 Tage je; Daher ist die Gesamtzeit vom Beginn der Schwangerschaft bis Laktation für eine kurze Zeitdauer, in der wichtige Daten erzeugt werden. Die größere Größe von Ratten im Vergleich zu Mäusen, im Zusammenhang mit der Milchsammlung kann einen signifikanten Vorteil in Bezug auf Milchvolumen und Leichtigkeit der Milchsammlung bereitzustellen; Milchproduktion in der Maus, zum Beispiel, scheint abhängig von Gesamtkörpergewicht mit schwereren Mäuse produzieren mehr Milch 10 zu sein. Hier wird eine allgemeine Beschreibung für die manuelle Sammlung von Milch von säugenden Ratten wird. Dieses Protokoll erfordert eine Minimalausstattung ist nicht-invasiv, billig und kann verwendet werden, um eine ausreichende Milchmengen zur weiteren Downstream-Analysen zu sammeln. In Kürze wird der Damm mit Isofluran, Milch Reinfall wird durch Oxytocin stimuliert und Milch wird über manuelle Ausdruck der Milch in Kapillarröhrchen gesammelt. Schließlich wird, wie zwei Hauptkomponenten von Milchfett und Proteine ​​sind, eine kurze description der Schätzung Milchfettgehalt unter Verwendung creamatocrit Messungen 11 und Quantifizierung der Gesamtproteinkonzentration unter Verwendung eines Standard-Protein-Assay wird vorgestellt.

<table border="0" cellpadding="0" cellspacing="0" width="829">
	<tbody>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Equipment - Milking</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td style="width:167px;"></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">1 ml syringes</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">309602</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">25 G needles</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">305122</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">18 G needles</td>
			<td style="width:191px;">BD-Canada</td>
			<td style="width:119px;">305196</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">50 ul Microdispenser Capillary Tubes</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">21-169D</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Oxytocin (20 USP Units/ml)</td>
			<td style="width:191px;">Bimeda-MTC</td>
			<td style="width:119px;">1OXY015</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">PPC Vet Isoflurane Inhalation Anesthetic, 250 ml</td>
			<td style="width:191px;">Fresenius Kabi</td>
			<td style="width:119px;">M60302</td>
			<td>Used on the order of a veterinarian</td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Sterile Alcohol Prep Pad</td>
			<td style="width:191px;">Dukal</td>
			<td style="width:119px;">853</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Absorbent Bench Underpad</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">82020-845</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Maxi-Therm Hyper/Hypothermia Blanket</td>
			<td style="width:191px;">Cincinnati Sub-Zero</td>
			<td style="width:119px;">274</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;">Rodent Anesthesia Machine with Vaporizer</td>
			<td style="width:191px;">Benson Medical Industries Inc.</td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td>Subject to individual laboratory needs</td>
		</tr>
		<tr height="42">
			<td height="42" style="height:42px;width:353px;">Animal Masks</td>
			<td style="width:191px;">Benson Medical Industries Inc.</td>
			<td style="width:119px;">50100/50102</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Microcentrifuge Tubes</td>
			<td style="width:191px;">Axygen</td>
			<td style="width:119px;">MCT-060-C</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">ChroMini Professional Trimmer</td>
			<td style="width:191px;">Wahl</td>
			<td style="width:119px;">-</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;width:353px;">Equipment - Creamatocrit</td>
			<td style="width:191px;"></td>
			<td style="width:119px;"></td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StatSpin SafeCrit Plastic Microhematocrit Tubes (Untreated)</td>
			<td style="width:191px;">Fisher Scientific</td>
			<td style="width:119px;">22-274-914</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">Critoseal Capillary Tube Sealant Tray</td>
			<td style="width:191px;">VWR</td>
			<td style="width:119px;">470161-478</td>
			<td></td>
		</tr>
		<tr height="21">
			<td height="21" style="height:21px;">StatSpin CritSpin Microhematocrit Centrifuge</td>
			<td style="width:191px;">Beckman Coulter, Inc</td>
			<td style="width:119px;">X00-004999-001</td>
			<td></td>
		</tr>
	</tbody>
</table>

milk collection in the rat using capillary tubes and estimation of milk fat content by creamatocrit

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also contains a vast number of bioactive compounds that greatly affect the development of the neonate. The analysis of milk components will help elucidate key factors that link maternal metabolism and health with offspring growth and development. The laboratory rat represents a popular model organism for maternal studies, and rat milk can be used to examine the effect of various maternal physiological, nutritional, and pharmacological interventions on milk components, which may then impact offspring health. Here a simple method of manually collecting milk from the lactating rat that can be performed by a single investigator, does not require specialized vacuum or suction equipment, and provides sufficient milk for subsequent downstream analysis is described. A method for estimating the fat content of milk by measuring the percentage of cream within the milk sample, known as the creamatocrit, is also presented. These methods can ultimately be used to increase insight into maternal-child health and to elucidate maternal factors that are involved in proper growth and development of offspring.

Milch wurde wie bei der Entwöhnung von Wistar Dämme beschrieben gesammelt (ca. 22 Wochen alt, mit einem Gewicht von 350 bis 400 g), das ein Steuerelement, protein verbraucht (AIN-93G-5, n =) (40% Casein wt / wt, n = 5) oder Hoch präbiotische Ballaststoffe (21,6% Gewicht / Gewicht, 1: 1-Verhältnis von Oligofructose und Inulin, n = 4) Ernährung während der Schwangerschaft und Stillzeit. Die Oxytocin-Dosis betrug 2 IU. Milch wurde gesammelt unter Verwendung von Kapillaren und einem Rohr wurde mit einem Hämatokrit Sp...

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Milk Collection in the Rat Using Capillary Tubes and Estimation of Milk Fat Content by Creamatocrit

Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.

Milchsammlung in der Ratte Mit Kapillarröhrchen und Schätzung der Milchfettgehalt von Creamatocrit

Milk, as the sole source of nutrition for the newborn mammal, provides the necessary nutrients and energy for offspring growth and development. It also ...

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Research

JoVE Journal

Biology

12.2K Aufrufe.  University of Calgary. Milk is a primary source of nutrition for the neonate. Analysis of milk components may provide insight into maternal factors that affect offspring health. This protocol describes a manual method of collecting milk samples from the lactating rat, which can then be used for further downstream analysis.