פרוטוקול זה שימש במשך 40 שנה ונשאר השיטה האמינה היחידה להשתלת תאי חלב בחולדה. שיטה זו נמצאת בשימוש נרחב כדי לחקור תא חלב אוטונומי לעומת השפעות מארח במחקר רגישות לסרטן השד. על ידי השתלת כרית השומן הבין-שרירית, שיטה זו עוקפת את הצורך לנקות את האפיתל הממברנה הא אנדוגני אשר אינו יעיל בחולדות.
השיטה היא אפוא פחות פולשנית ואת בלוטות החלב אנדוגני יכול לשמש שליטה פנימית. כדי להתחיל בהליך זה, מניחים חולדה נקבה המתת יתד על גבו ולאבטח אותו עם סיכות. לרסס את כל משטח הגחון עם 70% אתנול.
בצע חתך בצורת Y קשתית המאפשר גישה לבלוטות החלב בית החזה, הבטן, ו inguinal. השתמש מספריים כדי לנתח את כל רקמת בלוטת החלב מן החולדה התורם ולהסיר את כל בלוטות הלימפה גלוי. לאחר מכן, השתמש במדפים כדי לחלץ את רקמת הקמרית.
מניחים אותו בצלחת 60 מילימטר שכותרתו המכילה 500 microliters של מדיה DMEM F12 ללא סרום ולשמור אותו על קרח. לאחר מכן השתמש במספריים כדי לטחון דק את רקמת הקמרי. ראשית, סובבו בזהירות את גופת החיה התורמת כדי למקם אותה במצב מועד ולאבטח אותה באמצעות סיכות.
לרסס את הראש ואת הגב העליון עם 70% אתנול. אתר את בסיס הגולגולת ובצע חתך מתחת לתרוח העורפי, הכנס מספריים חדים מתחת לעור וגזור את העור מהגולגולת כולל דפנות הראש. לאחר מכן, השתמש חותכי עצם או מספריים חזקים כדי לחתוך את הגולגולת לאורך קו האמצע מן העורף לעצמות חזיתיות תוך הקפדה לשמור על הלהב שטחי ככל האפשר זווית כלפי מעלה כדי למנוע את ההרס של רקמת המוח הבסיסית.
השתמש Rongeurs או מדפים חזקים לקלף את העצם. הכנס את הכלי לצד השני אל המוח הקטן כדי לשבור את העצם משני הצדדים. לנתק את הקשרים למתן על ידי חשיפה מלאה של תעלת השמיעה.
השתמש מדפים דקים מעוקל כדי להרים את המוח מתוך הגולגולת ולתקליט את משקלו. השתמש בהתחלה חדשה של אספקה למוחות תורמים נוספים. מיד להעביר אותו לצינור 15 מיליליטר המכיל כמות שווה של מדיה המאוחסנת על קרח.
הומוגניזציה של המוח למשך 10 עד 15 שניות במהירות נמוכה. לאחר מכן לסנן את הומוגניט כדי להסיר חתיכות גדולות. יש לאחסן את הנוזל על הקרח עד לצורך.
ראשית, חותכים סנטימטר אחד מקצה קצה פיפטי 1,000 מיקרוליטר וממקמים אותו ידנית על הצינור. השתמש טיפ פיפטה לחתוך להעביר את רקמת התורם טחון מכל צלחת 60 מילימטר לצינור העיכול קולגן. מערבבים בעדינות את הרקמה הטחון על ידי צינורות אותו למעלה ולמטה פעם עד פעמיים.
ואז לאבטח את הדגימות במצב אופקי באינקובטור רועד. אפשר לדגימות לעכל במשך 1.5 עד שעתיים ב-37 מעלות צלזיוס תוך כדי רעידות במהירות שבין 200 ל-220 סל"ד. כאשר רקמת בלוטת החלב התורם מתעכלת במלואה, צנטריפוגה ההשעיה ב 1, 200 פעמים g ו ב 4 מעלות צלזיוס במשך 10 דקות.
לאחר הבטחת גלולה נוצרה, להשתמש פיפטה כדי להסיר את שכבת השומן או בזהירות לשפוך את supernatant. לעכל בעדינות את גלולה ב 10 מיליליטר של מדיה טרייה DMEM F12. חזור על תהליך זה כדי לשטוף ביסודיות את התאים.
הכינו צינור אחד של 50 מיליליטר עם מסננת של 40 מיקרומטר לכל חיה תורמת. הרטב מראש את מסננת עם לפחות מיליליטר אחד של מדיה DMEM F12. לאחר מכן השתמש פיפטה כדי להעביר את ההשעיה התא דרך המסנן כדי לאסוף שברי צינורית או אורגנואידים.
עבור אורגנואידים, שמור רק את התאים שנותרו במסנן. להפוך את מסננת התא על צינור חדש 50 מיליליטר ולשטוף עם כל נפח של מדיה סטרילית הנדרשת כדי לאסוף את כל התאים. לאחר מכן, גלולה התאים שוב resuspend בנפח קטן של מדיה לספירה.
הכן אצוות בודדות של חומר תורם עבור כל מושתלים על ידי שילוב כמויות שוות של ההשעיה התא עם הומוגני המוח 50% עבור כל אתר של השתלה. ראשית, לזהות את הבסיס של הגולגולת ולהתחיל את עמוד החוליות על בעל חיים הנמען. כשליש מהדרך במורד עמוד השדרה, מגלחים אזור של שלושה סנטימטרים בשני סנטימטרים בחלק החזי העליון של הגב.
לאחר מכן, הכינו את השדה הסטרילי שישמש לניתוח וסדרו את כל האספקה הדרושה. רוקן את מזרקי המילטון עם מדיית DMEM F12 סטרילית כדי למנוע אובדן תאים. טען את כל נפח חומר התורם למזרק נפרד עבור כל תנאי.
לאחר המזרק טעון במלואו, להפוך אותו ולחץ על הבוכנה מעט כדי להסיר בועות אוויר בקצה המחט. שמור את המזרק על קרח לאורך כל ההליך. ודא שהחיה לא מגיבה לגירויים עמוקים עם קמצוץ בוהן מוצק.
לאחר מכן השתמש בלהב כירורגי חד כדי לבצע חתך בין-שרירי קטן. אתר את כלי הדם המדיקלים להתמצאות ולהשתמש במקלות כדי להרים את העור בצד אחד של החתך. החזק את העור הרחק כרית השומן ולהימנע שומן חום הבסיסית בזמן ההשתלה מבוצעת.
לאחר מכן, הכנס את המחט לאתר השתל. בזהירות להזריק 40 microliters של תערובת התא לתוך רקמת כרית שומן לבן בין-שרירי. הסר את המחט לאט.
החזק את הרקמה במקום ולאפשר לתאים המושתלים להסתפק בשלוש עד חמש שניות. חזור על הליך ההזרקה כולו כפי שתואר קודם לכן באתר השני של ההשתלה. לאחר מכן, לסגור את הפצע הכירורגי באמצעות פצע קליפים או תפרים ולאחר מכן להפסיק את ההרדמה.
לאחר הקרבת החיה, הכינו אותה לפירוק. זהה את כלי הדם המדיקל המפריד בין אתרי השתלים בכריות השומן הבין-שריריות. בלמל את כל הפנקס כחתיכת רקמה אחת.
מניחים את הרקמה על מגלשת מיקרוסקופ טעונה חיובית עבור הרכבה שלמה. מניחים את המגלשות ב 70% אתנול במשך שבעה עד 10 ימים כדי לבטל את השומן של הרקמה. לאחר מכן להכין את כתם קרמיין אלום ולעבד את השקופיות כאשר הרקמה אטומה מספיק.
כאשר העיבוד הושלם והרקמות בשקופית התבהרו, השתמש במיקרוסקופ אור בעל עוצמה נמוכה או בצילום דיגיטלי ברזולוציה גבוהה כדי לרכוש תמונות של השקופיות לניתוח. במחקר זה, תאי אפיתל חלביים מושתלים בטכניקה המותאמת לעבודה עם חולדות שבה אורגנואידים אפיתל חלביים מבודדים של חולדות תורמות מושתלים לתוך כרית השומן הלבנה הבין-שרירית של חולדות הנמען. ניתן להעריך את הנוכחות, ההיעדרות או שפע האפיתל כדי לקבוע את הצלחת הניסוי, כמו גם את האוטונומיה של השפעות הקשורות למשתנים ניסיוניים.
ניסוי השתלת הדדי שבו לכל גורם יש שתי רמות כגון סוג פראי לעומת נוקאאוט ייצור ארבע קבוצות השתלה לבדיקת השערה. כרית השומן הבין-שרירית הרכובה הייצוגית המוצגת כאן מכילה תוצאה חיובית של אפיתל בשני אתרי ההשתלה. בעת ניתוח השקופיות, חוסר אפיתל כרית השומן הבין-שרירית על פני דגימות רבות עשוי להצביע על בעיה טכנית עם ההליך ויש להתייחס אליו כאל תוצאה שלילית.
ניתן להשוות את הצמיחה האפיתל התורם גם בלוטת החלב אנדוגני עשוי להקל על מסקנות נוספות. בדוגמה המוצגת כאן, התוצאות של השתלת הדדית באמצעות סוג פראי וחולדות נוקאאוט CDKN1B הציעו השפעות אוטונומיות של תאים שאינם ממארי על התפתחות בלוטת החלב. זכור תאי אפיתל תורם אורגנואידים חייב להיות מוכן בזהירות נשמר בחיים עד מוזרק לתוך החיה הנמען.
חובה לתכנן מראש ולבצע את ההליך בזהירות וללא הפרעות. בדיקות קרצינוגנזה ראשוניות יכולות להתבצע לאחר ההשתלה כדי לחקור אוטונומיה של תאי חלב באטיולוגיה או בטיפול בסרטן השד. עריכת גנים יכולה גם להיות משולבת כדי להנדס גנטית את התאים התורמים או את החולדה הנמען.
כשיטה היחידה לביצוע השתלת תאי אפיתל החלב בחולדות, הליך זה מקל על התפתחות בלוטת החלב, כמו גם מחקרים מסרטנים. טכניקה זו חשובה במיוחד לחקר אינטראקציות בין תאים סרטניים בשד ו/או תאי אפיתל חלביים עם המיקרו-וירוס המארח. זה מאפשר מחקרים בפיתוח בלוטת החלב, כמו גם מחקר סרטן השד.
אלה המנסים טכניקה זו בפעם הראשונה צריך לייעל את ההכנות תא התורם כדי להבטיח תפוקת תאים מקסימלית וכדאיות, ולאחר מכן לבצע ניסויים פיילוט קטן לתרגל הליכים כירורגיים ולקבוע מספרי תאים להזריק וגם לקבוע את זמני הדגירה שלאחר הניתוח הנדרשים לניסויים.
